WO2021162521A1 - 외부에서 도입된 세포 신호 조절 인자를 과발현하는 면역 세포 및 이들의 용도 - Google Patents

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes

Definitions

  • the present invention relates to immune cells expressing exogenously introduced cellular signaling mechanism regulatory factors and uses thereof.
  • Cancer is the second leading cause of morbidity and mortality worldwide. Cancers with high incidence are breast cancer, lung and bronchial cancer, prostate cancer, colon and rectal cancer, bladder cancer, melanoma of the skin, non-Hodgkin's lymphoma, thyroid cancer, kidney and renal pelvic cancer, endometrial cancer, leukemia and pancreatic cancer.
  • various methods such as surgery, radiation therapy, and chemotherapy have been tried.
  • immunotherapy using the patient's immune function has recently been developed.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • T cell receptor T cell receptor
  • a chimeric antigen receptor consists of a fragment of an antibody, a hinge region, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain.
  • Immune cells such as T cells (CAR-T cells) expressing the chimeric antigen receptor (CAR-T cells) or natural killer cells (CAR-NK cells) expressing the chimeric antigen receptor are cells in which the antibody fragment expresses a target molecule (cancer cells, etc.) ), it induces apoptosis of target cells by activating the cytotoxicity of immune cells. Therefore, the immune cells expressing the chimeric antigen receptor are being utilized for genetically engineered cell therapy. In particular, it has been reported that chimeric antigen receptor T cells exhibit a very high therapeutic effect against CD19-expressed hematologic cancers.
  • TGF- ⁇ is known as a representative cytokine that suppresses the immune response of CAR-T cells.
  • the signaling pathway of TGF- ⁇ is mediated by two types of receptors on the cell membrane, TGF ⁇ R1 and TGF ⁇ R2.
  • TGF- ⁇ binds to TGF ⁇ R2, it phosphorylates and activates TGF ⁇ R1, and the activated TGF ⁇ R1 phosphorylates SMAD protein.
  • the phosphorylated SMAD protein forms a triplet and moves to the nucleus to induce the expression of specific genes (Andres Rojas et al., Biochimica et Biophysica Acta 1793 (2009) 1165-1173). Therefore, many studies have been made to overcome the problem of suppressing the immune response of CAR-T cells and to prepare immune cells with better activity.
  • the present inventors studied to design a method for preventing the mechanism of suppression of the activity of the transduced immune cells as well as increasing the cellular activity of the transduced immune cells.
  • Experiments were conducted on CAR-T cells corresponding to representative examples of immune cells into which the gene was introduced, and as a result, it was possible to not only block the mechanism of CAR-T cell suppression, but also increase the cellular activity of CAR-T cells.
  • the present invention was completed by devising a method.
  • an antigen-binding domain (i) a transmembrane domain; (iii) an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) self-cleaving peptides; and (v) a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a signaling mechanism regulatory factor.
  • compositions comprising: (i) a polynucleotide encoding an antigen binding domain; (ii) a polynucleotide encoding a transmembrane domain; (iii) a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) a polynucleotide encoding an Internal Ribosome Entry Site (IRES); and (v) a polynucleotide encoding a signaling mechanism regulatory factor.
  • IRS Internal Ribosome Entry Site
  • compositions comprising: (i) an antigen binding domain; (ii) a transmembrane domain; (iii) an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) a signal mechanism regulatory factor; provides a vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising the.
  • compositions comprising: (i) an antigen binding domain; (ii) a transmembrane domain; (iii) an immune cell expressing a chimeric antigen receptor, characterized in that it expresses a fusion protein comprising an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain, and overexpresses an exogenously introduced signaling mechanism regulatory factor provides
  • Another aspect of the present invention provides an immune cell expressing an exogenously introduced signaling mechanism regulatory factor.
  • Immune cells overexpressing the chimeric antigen receptor of the present invention and an exogenously introduced signaling mechanism regulator raises an immune response specifically against a specific cancer cell designated by the chimeric antigen receptor expressed on the cell membrane.
  • the foreign-introduced signaling mechanism regulatory factor is overexpressed in the cytoplasm of the immune cell, it is possible to effectively block the signaling pathway that inhibits the activity of the immune cell.
  • 1 is a diagram showing the domain structure of the 19bbz CAR experimental group manufactured in an embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing the domain structure of the 19bbz CAR experimental group manufactured in an embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing the domain structure of the Hbbz CAR experimental group prepared in an embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing the domain structure of the 43bbz CAR experimental group prepared in an embodiment.
  • 5 is a diagram showing the domain structure of the 47bbz CAR experimental group prepared in an embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing the domain structure of the Pbbz CAR experimental group prepared in an embodiment.
  • FIG. 7 is a view comparing the anticancer activity in the anticancer effect evaluation (II) of the CAR-T cell test group prepared in Example in an animal model of blood cancer.
  • FIG. 8 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz used in one embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#F used in one embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#M used in one embodiment.
  • FIG. 11 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#N used in one embodiment.
  • FIG. 12 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#C used in one embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#S1 used in one embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#S2 used in an embodiment.
  • 15 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#TC used in one embodiment.
  • 16 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#RG used in one embodiment.
  • 17 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing 19bbzT used in an Example.
  • 18 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 19bbz#FCS2 used in an Example.
  • FIG. 19 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing Hbbz used in an embodiment.
  • FIG. 20 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Hbbz#F used in an Example.
  • 21 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Hbbz#C used in an Example.
  • FIG. 22 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Hbbz#S2 used in an embodiment.
  • FIG. 23 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Hbbz#FCS2 used in an Example.
  • 24 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing 43bbz used in one embodiment.
  • 25 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 43bbz#F used in one example.
  • 26 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 43bbz#C used in one embodiment.
  • FIG. 27 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 43bbz#S2 used in one embodiment.
  • FIG. 28 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 43bbz#FCS2 used in an Example.
  • 29 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing 47bbz used in one embodiment.
  • FIG. 30 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 47bbz#F used in one embodiment.
  • 31 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 47bbz#C used in one embodiment.
  • 32 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 47bbz#S2 used in one embodiment.
  • 33 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing 47bbz#FCS2 used in one embodiment.
  • 34 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing Pbbz used in an embodiment.
  • 35 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Pbbz#F used in an embodiment.
  • 36 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Pbbz#C used in an Example.
  • FIG. 37 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Pbbz#S2 used in an embodiment.
  • 38 is a diagram showing a map of a lentivirus vector expressing Pbbz#FCS2 used in an Example.
  • 39 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing a TCR specific for HERV-E used in an Example.
  • FIG. 40 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #F specific for HERV-E used in an Example.
  • 41 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #C specific for HERV-E used in an Example.
  • FIG. 42 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #S2 specific for HERV-E used in an Example.
  • FIG. 43 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #FCS2 specific for HERV-E used in an Example.
  • FIG. 44 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing a TCR specific for NY-ESO-1 used in one embodiment.
  • 45 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #F specific for NY-ESO-1 used in one embodiment.
  • 46 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #C specific for NY-ESO-1 used in one embodiment.
  • 47 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #S2 specific for NY-ESO-1 used in one embodiment.
  • FIG. 48 is a diagram showing a map of a lentiviral vector expressing TCR and #FCS2 specific for NY-ESO-1 used in an Example.
  • 49 is a table summarizing the CAR-T experimental group used in the blood cancer animal model anticancer effect evaluation (I) performed as an example.
  • 50 is a diagram comparing the anticancer activity of CAR-T cells in the evaluation (I) of anticancer effect in an animal model of blood cancer performed as an example.
  • FIG 51 is a view showing the structure of the kinase (Kinase) domain of the TGF- ⁇ type 1 receptor bound to FKBP12.
  • FIG. 52 is a diagram schematically illustrating the quadrant position (Tetrad) of aromatic amino acids (Aromatic Residues), which is an important sequence of FKBP12 involved in binding to the TGF- ⁇ type 1 receptor.
  • FIG. 54 is a view confirming the expression of CD19-specific CAR in the CAR-T cells prepared in Example through flow cytometry.
  • 55 is a view showing the results of observing the surface CAR expression of the CD19-specific CAR-T cells prepared in Example through immunofluorescence staining.
  • 56 is a view showing the result of observing the binding of the CAR-T cells and the target tumor cells prepared in Example through immunofluorescence staining.
  • FIG. 57 is a diagram illustrating an analysis of the T cell subtype (subset) of the in vitro grown CD19-specific CAR-T cells prepared in Example 1 under a CAR(+) cell gate through flow cytometry.
  • 58 is a view showing the results of analyzing the CD19 expression of K562, K562-CD19 and Daudi cells through flow cytometry.
  • 59 is a view showing the protein expression of the N-terminal SH2 domain of FKBP12, cyclophilin A, and SHP2 proteins in CAR-T prepared in Example.
  • Figure 60 is a table showing the RNA expression levels of the N-terminal SH2 domain of FKBP12, cyclophilin A and SHP2 proteins in CAR-T prepared in Example. The expression level of RNA was confirmed through real-time polymerase chain reaction analysis after cDNA was synthesized with the same amount of RNA.
  • FIG. 61 is a graph showing the results of measuring IFN ⁇ secreted by antigen stimulation in CD19-specific CAR-T cells.
  • 62 is a graph showing the measurement result of TNF ⁇ secreted by antigen stimulation in CD19-specific CAR-T cells.
  • 63 is a graph showing the results of measuring IL-2 secreted by antigen stimulation in CD19-specific CAR-T cells.
  • 64 is a graph showing the results of measuring IFN ⁇ secreted by antigen stimulation in the presence of TGF- ⁇ 1 in the CAR-T cells prepared in one example.
  • 65 is a graph showing the measurement result of TNF ⁇ secreted by antigen stimulation in the presence of TGF- ⁇ 1 in the CAR-T cells prepared in Example.
  • FIG. 66 is a graph showing the results of evaluating cell migration in vitro after activating CD19-specific CAR-T cells with anti-CD3/anti-CD28 beads.
  • 67 is a view showing the results of evaluating the intrinsic motility ability of the CAR-T cells prepared in one example by antigen stimulation.
  • 68 is a graph showing the results of evaluating the cell lysis ability of CD19-specific CAR-T cells, target tumor cells, K562-CD19 cells (bottom) and Daui Fluc-eGFP cells (top).
  • 69 is a view confirming the expression of CAR in the Her2-specific CAR-T cells prepared in Example through flow cytometry. Specifically, it is a diagram showing the results of analyzing Her2-specific CAR expression in T cells transduced with Hbbz, Hbbz#F, Hbbz#C, Hbbz#S2 or Hbbz#FCS2 lentiviruses through flow cytometry.
  • 70 is a view showing the results of observing the surface CAR expression of the Her2-specific CAR-T cells prepared in Example through immunofluorescence staining.
  • 71 is a graph showing the results of measuring IFN ⁇ secreted by antigen stimulation in Her2-specific CAR-T cells.
  • 72 is a graph showing the results of measuring TNF ⁇ secreted by antigen stimulation in Her2-specific CAR-T cells.
  • 73 is a graph showing the results of measuring IL-2 secreted by antigen stimulation in Her2-specific CAR-T cells.
  • 74 is a graph showing the results of in vitro cell migration evaluation after activating Her2-specific CAR-T cells with anti-CD3/anti-CD28 beads.
  • SKBR3-Luc cells which are target tumor cells.
  • 76 is a view confirming the anticancer activity of Her2-specific CAR-T cells used in an Example.
  • 77 is a view confirming the expression of PSMA-specific CAR in CAR-T cells prepared in Example through flow cytometry.
  • 78 is a view showing the results of observing the surface CAR expression of PSMA-specific CAR-T cells prepared in Example through immunofluorescence staining.
  • Fig. 79 is a diagram illustrating the analysis of T cell subtypes of PSMA-specific CAR-T cells grown in vitro under CAR(+) cell gates through flow cytometry.
  • FIG. 80 is a view showing the results of analyzing the T cell exhaustion phenotype in the in vitro propagated PSMA-specific CAR-T cells under the CAR(+) cell gate through flow cytometry.
  • 81 is a graph showing the results of in vitro cell migration evaluation after activating PSMA-specific CAR-T cells with anti-CD3/anti-CD28 beads.
  • 82 and 83 are graphs showing the results of evaluating the cell lysis ability of PSMA-specific CAR-T cells to target tumor cells.
  • One aspect of the present invention is, (i) an antigen binding domain; (ii) a transmembrane domain; (iii) an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) self-cleaving peptides; And (v) a signal mechanism regulatory factor; provides a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a.
  • it may further include a spacer between the (i) antigen-binding domain and (ii) the transmembrane domain.
  • polynucleotide may specifically have the following form:
  • a polynucleotide encoding an antigen binding domain (i) a polynucleotide encoding a spacer and a transmembrane domain; (iii) a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) a polynucleotide encoding a self-cleavable peptide; and (v) a polynucleotide encoding a signaling mechanism regulatory factor.
  • a polynucleotide encoding an antigen-binding domain (i) a polynucleotide encoding a transmembrane domain; (iii) a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) a polynucleotide encoding a self-cleavable peptide; and (v) a polynucleotide encoding a signaling mechanism regulatory factor may be in a 5' to 3' combined form.
  • the sequence may be appropriately regulated.
  • a signaling mechanism regulator may be located preceding the antigen binding domain, in which case a self-cleaving sequence may be located downstream of the signaling mechanism regulator.
  • the signaling mechanism modulator is a) a protein located in the immunosuppressive signaling pathway, b) an immunophilin or fragment thereof, c) a protein involved in antigen loss-mediated relapse, d) T It may be any one selected from the group consisting of a protein located in a cell stimulation pathway, e) a protein involved in negative feedback inhibition, and f) a combination thereof.
  • the signaling mechanism regulatory factor is characterized in that it operates in the cytoplasm.
  • Proteins located in the immunosuppressive signaling pathway the TGF- ⁇ /SMAD signaling pathway
  • the protein located in the immunosuppressive signaling pathway may be a protein located in the TGF- ⁇ /SMAD (FKBP12-FK506/rapamycin) signaling pathway or a fragment thereof.
  • the protein located in the TGF- ⁇ /SMAD (FKBP12-FK506/rapamycin) signal pathway is FKBP12 (FK506-binidng protein 12, hereinafter, referred to as #F, SEQ ID NO: 13)
  • the C-terminal MH2 domain of the SMAD4 protein hereinafter, the C-terminal MH2 domain of the SMAD4 protein bound after the self-cleaving peptide is referred to as #M, SEQ ID NO: 20
  • N-SKI hereinafter, self-cleaving It may be any one selected from the group consisting of N-SKI bound after the sex peptide is referred to as #N, SEQ ID NO: 22).
  • transforming growth factor ⁇ (transforming growth factor ⁇ , TGF- ⁇ ) is a member of the transforming growth factor ⁇ superfamily, including cell growth, differentiation, apoptosis, development, and the like. Cytokines that perform a function.
  • TGF- ⁇ /SMAD signaling pathway refers to a signal transduction pathway activated by TGF- ⁇ .
  • TGF- ⁇ In signal transduction by TGF- ⁇ , when ligand binds to a receptor, the formation of a dual complex receptor composed of TGF- ⁇ type 1 and 2 is promoted, and phosphorylation of TGF- ⁇ type 1 receptor by TGF- ⁇ type 2 receptor is inhibited. will wake up When the TGF- ⁇ type 1 receptor is phosphorylated, it becomes possible to phosphorylate SMAD, a signal-mediated protein present in the cytoplasm, thereby enabling subsequent signaling.
  • Phosphorylated SMAD forms a SMAD trimer by the C-terminus, and then moves to the nucleus and binds with other transcriptional regulators (cofactors) and transcription factors (transcription factors) to increase or inhibit the expression of target genes.
  • Activation of the TGF- ⁇ /SMAD signaling pathway in T cells induces inhibition of cytokine production, proliferation of T cells and suppression of immune responses.
  • the protein located in the TGF- ⁇ /SMAD signaling pathway may be FKBP12, the C-terminal MH2 domain of the SMAD4 protein, and N-SKI.
  • FKBP12 is one of the 12 kDa FK506 binding protein family, and is involved in protein folding and transport (trafficking), and intracellular responses such as immune regulation.
  • FKBP12 inhibits the signaling pathway of TGF- ⁇ by binding to the TGF- ⁇ type 1 receptor and interfering with phosphorylation of the TGF- ⁇ type 1 receptor by the TGF- ⁇ type 2 receptor.
  • TGF- ⁇ type 1 receptor and the TGF- ⁇ type 2 receptor form a dual complex receptor composed of TGF- ⁇ type 1 / 2 due to their inherent mutual affinity. have.
  • leaky signaling can occur at all times due to the binding between receptors that occurs regardless of the presence of TGF- ⁇ .
  • FKBP12 which can inhibit phosphorylation of TGF- ⁇ type 1 receptors, consequently "inhibits TGF- ⁇ leaky signaling.” It is known to act as a "safety device”.
  • the immunosuppressants rapamycin and FK506 bind to FKBP12 and competitively block the binding between FKBP12 and the TGF- ⁇ type 1 receptor.
  • rapamycin and FK506 facilitate immunosuppressive signal transduction through TGF- ⁇ type 1 phosphorylation.
  • the FKBP12/FK506 complex formed by the binding of the immunosuppressant FK506 and FKBP12 binds to calcineurin activated by calcium and inhibits its activity.
  • the "calcineurin” is a calcium (Ca 2+ )-dependently activated dephosphorylation enzyme (phosphatase), and serves to activate an inflammatory response by inducing dephosphorylation of NFAT (nuclear factor of activated T-cells).
  • NFAT nuclear factor of activated T-cells
  • the NFAT is a transcription factor and is expressed in most immune cells.
  • the activity of NFAT induces the expression of interleukin-2 (IL-2) in T cells, thereby increasing the immune response of T cells.
  • IL-2 interleukin-2
  • the FKBP12 may be of human origin and may include an amino acid sequence disclosed in NCBI Reference Sequence: NP_000792.1 or NP_001186715.1. Alternatively, the FKBP12 may include the amino acid sequence disclosed in NP_004107 (FKBP12.6).
  • the FKBP12 may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 19. In addition, the FKBP12 may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 19.
  • the nucleotide sequence encoding the FKBP12 may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14. In addition, the nucleotide sequence encoding the FKBP12 may have about 95%, 97%, or 99% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the fragment of FKBP12 may include amino acids 27 to 100 of SEQ ID NO: 13. As shown in FIG. 52 , the 27th amino acid, the 47th amino acid, the 60th amino acid, and the 100th amino acid of SEQ ID NO: 13 are amino acids involved in TGF- ⁇ receptor binding.
  • SMAD is a major signaling mediator protein for the TGF- ⁇ superfamily receptor, and is involved in cell growth, differentiation, apoptosis, development, and the like.
  • SMADs receptor-regulated SMADs
  • Co-SMADs common partner SMADs
  • I-SMADs inhibitory SMADs
  • Receptor modulating SMADs include SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 and SMAD8/9
  • common partner SMAD has SMAD4
  • inhibitory SMADs include SMAD6 and SMAD7.
  • the receptor regulatory/common partner SMAD complex is mainly present in the cytoplasm, but accumulates and acts in the nucleus after receiving TGF- ⁇ signal, and I-SMADs are mainly present in the nucleus and act as transcriptional regulators.
  • SMAD4 is a common partner receptor, as described above, forms a complex with the receptor modulator SMAD to assist the action of the receptor modulator SMAD. Meanwhile, SMAD4 reduces the expression of c-myc in a TGF- ⁇ -dependent manner in T cells, and reduces T cell proliferation and immune response.
  • the "c-myc” is a proto-oncogene, a transcription factor that regulates cell proliferation and growth.
  • SMAD4 may be a protein having the amino acid sequence disclosed in NP_005350.
  • the fragment of SMAD4 (the MH2 domain at the C-terminus of the SMAD4 protein) used in an embodiment of the present invention is a domain involved in "SMAD trimerization".
  • This SMAD4 fragment may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the SMAD4 fragment may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • SKI is a proto-oncogene that increases the expression of a specific gene by acting as a transcriptional regulator present in the cell nucleus.
  • One of several known activities of SKI protein is to block TGF- ⁇ signaling by inhibiting SMAD trimer formation.
  • the N-terminal region of the SKI protein used in one embodiment is involved in the function of the SKI protein to block TGF- ⁇ signaling.
  • the N-terminal region of the SKI protein can inhibit the action of TGF- ⁇ by directly interacting with SMAD to inhibit transcription of the target gene of TGF- ⁇ .
  • the N-terminal site of the SKI protein that binds to SMAD may be referred to as N-SKI.
  • SKI may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed as NP_003027.
  • the fragment of N-SKI used in one embodiment may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the fragment of N-SKI may be one having about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • Proteins located in the immunosuppressive signaling pathway Proteins located in the immune checkpoint pathway
  • the protein located in the immunosuppressive signaling pathway may be a protein located in the inhibitory immune checkpoint pathway or a fragment thereof.
  • the protein located in the inhibitory immune checkpoint pathway binds to the N-SH2 domain of the SHP-1 protein (Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1, hereafter referred to as SHP-1 bound after the self-cleaving peptide # It may be referred to as S1, SEQ ID NO: 26) or the N-SH2 domain of the SHP-2 protein (hereinafter referred to as #S2, SEQ ID NO: 28 for SHP-2 bound after a self-cleaving peptide).
  • inhibitory immune checkpoint pathway refers to an intracellular signal transduction pathway that induces immune tolerance or an immune system inhibition pathway. Proteins involved in the inhibitory immune checkpoint pathway in T cells include programmed cell death protein (PD-1) and cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (T-lymphocyte-associated antigen 4). : CTLA-4), etc.
  • PD-1 programmed cell death protein
  • T-lymphocyte-associated antigen 4 T-lymphocyte-associated antigen 4
  • CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4
  • PD-1 binds to the ligands PD-L1 (PD-1 ligand) and PD-L2
  • ITIM immunoimmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif
  • ITSM immunoimmunoreceptor tyrosine-based
  • CTLA-4 binds to CD80/86, inhibits CD28 signaling, and activates SHP-2 through the YVKM motif present in the cytoplasmic domain to inhibit RAS, thereby inhibiting T cell immune activation signal transduction.
  • SHP-1 is one of the protein tyrosine phosphatase (PTP) family, and is known as tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6).
  • PTP protein tyrosine phosphatase
  • the "PTP” is a signaling molecule that regulates various cellular processes including cell growth, differentiation, mitotic cycle and oncogenic transformation.
  • SHP-1 has two tandem Src homologues (SH2, N-SH2 and C-SH2) domains that act as protein phosphorylation tyrosine binding domains at the N-terminal part and a PTP domain with dephosphorylation activity at the C-terminal part (catalytic domain) domain) is included.
  • the N-SH2 domain regulates the activity of SHP-1, and binds to the PTP domain in an inactive state to inhibit the activity of the enzyme.
  • the Tyr residue of the N-SH2 domain is phosphorylated
  • the N-SH2 domain is separated from the PTP domain, and the free PTP domain interacts with the substrate, thereby converting SHP-1 into a state having dephosphorylation activity. Therefore, when the N-SH2 domain of the SHP-1 protein is overexpressed in immune cells, it binds to the PDP domain of the SHP-1 protein and maintains an inactive state, thereby blocking the inhibitory immune checkpoint signal. Therefore, the overall immune activity of the corresponding immune cells is increased.
  • the SHP-1 may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed in NP_002822.
  • the fragment of SHP-1 used in one embodiment may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.
  • the fragment of SHP-1 may have at least about 80%, 90%, 95%, or 99% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.
  • SHP-2 is one of the PTP family, PTPN11 (tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11), PTP-1D (protein-tyrosine phosphatase 1D), or PTP-2C (protein-tyrosine Also known as phosphatase 2C).
  • SHP-2 is similar to the above SHP-1. Consists of two tandem Src homologue (SH2, N-SH2 and C-SH2) domains acting as protein phosphorylation tyrosine-binding domains at the N-terminal portion and a PTP domain having dephosphorylation activity at the C-terminal portion (catalytic domain) do.
  • the SHP-2 may be a protein having an amino acid sequence disclosed as NP_002825.
  • the fragment of SHP-2 used in one embodiment may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
  • the fragment of SHP-2 may have at least about 80%, 90%, 95%, or 99% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
  • immunophilin refers to a target protein of well-known immunosuppressants such as FK506, Rapamycin, and cyclosporin.
  • FK506, Rapamycin a target protein of well-known immunosuppressants
  • cyclosporin a target protein of well-known immunosuppressants
  • One class of immunophilins known so far is a protein that binds to FK506, and there are 16 kinds, one of which is FKBP12.
  • Another class of immunophyllins known so far is a protein that binds to cyclosporin, and there are 16 types, one of which is cyclophilin A. They all have peptidyl prolyl isomerase (PPI) activity in common. This activity promotes peptide bond isomerization and mediates protein folding. It regulates various intracellular signal transduction pathways.
  • PPI peptidyl prolyl isomerase
  • immunophilin proteins have an important function in immune activity, since immunosuppression is induced when their original function is disrupted by binding to an immunosuppressant.
  • FKBP12 and cyclophilin A CYPA
  • CYPA cyclophilin A
  • CrkII C10 regulator of kinase II
  • CrkII C10 regulator of kinase II
  • the "Crk” is one of the adapter proteins that mediate signal transduction by transmitting a signal formed in a T cell antigen receptor (TCR) in response to an external stimulus to a subprotein of the receptor, and there are CrkI and CrkII.
  • CrkII binds to ZAP70, a protein located below the TCR signal transduction pathway, and transmits a signal to C3G (Crk SH3 domain-binding guanine-nucleotide releasing factor). induce activity.
  • the TCR is a receptor located on the surface of the T cell, and activates the immune response of the T cell by recognizing an antigen presented by the major histocompatibility complex (MHC) of the antigen presenting cell.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the "ZAP70” is a constituent protein of the TCR, and induces T cell activation by transmitting the TCR activation signal to a sub-protein.
  • the “RAP1” is a small GTPase and belongs to the Ras superfamily. GTPase is activated when bound to GTP and inactivated when bound to GDP. GTPase activity is regulated by GTPase activating proteins (GAPs) and guanine nucleotide exchange factor (GEF). GAP promotes the formation of GDP-bound GTPase, and GEF promotes GTP-bound GTPase formation.
  • the “C3G” is a type of GEF, and by increasing GTP-bound RAP1 in T cells, induces the activity of lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1), thereby increasing T cell adhesion.
  • LFA-1 lymphocyte function-associated antigen 1
  • the "LFA-1” is one of the integrins expressed in T cells, and binds to ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), a ligand expressed in target cells in the process of moving from the blood into the tissues of the body, and binds to the target cells. Mediates the adhesion of T cells.
  • immunophilins such as FKBP12 and CYPA, increase T cell adhesion regulated by LFA-1 by binding to CrkII and increasing the binding of CrkII and C3G, thereby increasing the activity of C3G sub-signaling pathways.
  • FKBP series may be FKBP12.
  • sequences of the FKBP12 protein and fragment are as described above in "Proteins located in the immunosuppression signal pathway".
  • cyclophilin may be cyclophilin A.
  • the protein located in the cyclophilin A-mediated signaling pathway may be CYPA (cyclophilin A, hereinafter, CYPA bound to a self-cleaving peptide is referred to as #C, SEQ ID NO: 24).
  • cyclosproine is an immunosuppressive agent derived from a natural product. Administered by mouth or intravenous injection, it is used as a drug to prevent rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, nephrotic syndrome, and organ transplant rejection.
  • the cyclophilin A is a cytoplasmic binding protein that binds to CsA, and the CsA/CYPA complex inhibits the dephosphorylation enzyme (phosphatase) activity of calcineurin, thereby suppressing the immune response of lymphocytes.
  • CYPA It is involved in protein folding through peptidyl prolyl isomerase (PPI) activity, and through this activity, it regulates intracellular signal transduction, transcription, biological processes such as inflammation and apoptosis. In addition to its intracellular role, CYPA can be secreted in response to inflammatory stimuli, hypoxia, infection and oxidative stress, which acts as a chemoattractant in viral infections, periodontitis, and atherosclerosis, promoting inflammatory responses.
  • cyclophilin A used in one embodiment is a protein comprising the amino acid sequence disclosed as NP_066953.
  • cyclophilin A may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In this case, the cyclophilin A may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the protein involved in antigen loss-mediated recurrence may be a protein involved in Trogocytosis or a fragment thereof.
  • the protein involved in trogocytosis is TC21 (teratocarcinoma oncogene 21, hereinafter, TC21 coupled to the back of the self-cleaving peptide is referred to as #TC, SEQ ID NO: 32) or RhoG (Ras homology growth-related, hereinafter) , RhoG bound after the self-cleaving peptide is referred to as #RG, SEQ ID NO: 34).
  • TC21 also known as R-Ras2
  • R-Ras2 is one of the Ras GTPases superfamily. Binds to cell membranes and mediates signal transduction related to cell proliferation. In addition, it is known to mediate transduction of membrane molecules by inducing internalization of immune synapses by binding to TCR and activating phosphoinositide 3-kinase (PI3K), a subprotein on the signal transduction pathway.
  • the TC21 may be a protein having the amino acid sequence disclosed in NP_036382.
  • the TC21 may be a mutant, and TC21 used in one embodiment may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.
  • the TC21 may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.
  • RhoG is a monomeric GTP binding protein (G protein), and is involved in the regulation of cell motility, transcription, endocytosis, neurite outgrowth, and the like. It is also known to be activated by TC21 and PI3K to mediate TCR-induced transmembrane transport.
  • the RhoG may be a protein having the amino acid sequence disclosed in NP_001656.
  • the RhoG may be a mutant, and the fragment of RhoG used in one embodiment may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34.
  • the RhoG fragment may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34.
  • the term “membrane molecule transfer” refers to a phenomenon in which a surface molecule of one cell is separated and delivered to another cell in a state in which T cells and antigen-presenting cells are combined through an immune synapse. say It is known as a phenomenon that occurs to control the suppression or amplification of an immune response.
  • the "immune synapse” is a molecular structure formed in the process of adhesion and recognition of T cells and antigen-presenting cells.
  • the protein located in the T cell stimulation pathway may be an adapter protein of the TCR/ZAP70 pathway or a fragment thereof.
  • the adapter protein of the TCR/ZAP70 pathway is NCK1 (hereinafter, NCK1 bound to the self-cleaving peptide is referred to as #K), LAT (linker for activation of T cells, hereinafter, the self-cleaving peptide is linked to the back) It may be any one selected from the group consisting of LAT (referred to as #L) and NEMO (NF- ⁇ B essential modulator, hereinafter, NEMO bound after a self-cleaving peptide is referred to as #I).
  • TCR/ZAP70 pathway refers to a signal transduction pathway that occurs when a T cell antigen receptor of an naive T cell binds to an MHC/antigen complex of an antigen presenting cell and activates the immune response of the T cell.
  • TCR gamma
  • delta ⁇
  • epsilon ⁇
  • zeta ⁇ chains of the TCR accessory protein CD3
  • ZAP70 binds to the phosphorylated CD3 ⁇ chain.
  • LCK bound to CD4 or CD8 a co-receptor of T cells, phosphorylates ZAP70.
  • Activated ZAP70 phosphorylates LAT and SLP-76 (SH2 domain-containing leukocyte protein 76 kDa) to induce NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), AP-1 (activator protein 1) and Induces a signal response that activates transcription factors such as NFAT.
  • the NF- ⁇ B is a transcription factor that regulates inflammatory response, immune modulation, apoptosis, cell proliferation and differentiation, etc.
  • p50, p52, RelA (p65), RelB, c-Rel and v-Rel is composed of AP-1 is a transcription factor that regulates inflammatory response regulation, apoptosis, cell proliferation, and differentiation. act regulating.
  • Transcription factors such as NF- ⁇ B, AP-1 and NFAT activate T cell division, differentiation and immune response by promoting the expression of interleukin-2.
  • NCK1 refers to a signal transduction mediating protein including SH2 and SH3 domains, which mediates signal transduction of tyrosine kinase receptors.
  • NCK1 can bind to the WASP/Arp2/3 complex and regulate cytoskeletal rearrangement.
  • the "WASP/Arp2/3 complex” is a protein that induces the formation of an actin filament, which is a cytoskeleton. In T cells, NCK promotes immune synapse formation induced by TCR activation.
  • the NCK1 may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed in NP_006144.
  • LAT is a 34 kDa transmembrane protein, which is phosphorylated by ZAP70/Syk (spleen-associated tyrosine kinase) according to activation of the TCR signal transduction pathway.
  • Adapter proteins including the SH2 domain involved in the TCR signal transduction pathway directly/indirectly bind to phosphorylated LAT to mediate signal transduction.
  • the adapter protein is PLC ⁇ 1 (phospholipase C ⁇ 1), Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2), Gads (Grb2-related adapter protein downstream of Shc), Grap (Grb2-related adapter protein), SH3BP2 (SH3 domain-binding protein) 2), Shb (SH2 domain-containing adapter protein B), SOS1 (son of sevenless homolog 1), c-Cbl (casitas B lymphoma), VAV, SLP-76 (SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa) and Itk (IL-2 inducible T cell kinase) and the like.
  • the LAT may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed as NP_055202.
  • NEMO is known as IKK ⁇ (I ⁇ B kinase ⁇ ), and forms a complex with IKK ⁇ /IKK ⁇ to induce phosphorylation and degradation of I ⁇ B (inhibitor of nuclear factor ⁇ -B kinase), thereby inducing NF- Promotes the activity of ⁇ B.
  • the NEMO may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed as NP_001093326.
  • Proteins located in the T cell stimulation pathway Proteins located in the TNFR/TLR receptor pathway
  • the protein located in the T cell stimulation pathway may be a protein located in the TNFR/TLR receptor (TRAF/NF-kB) pathway or a fragment thereof.
  • the TNFR / TLR receptor (TRAF / NF-kB) pathway protein may be TLR4, and preferably, an intracellular signaling domain of TLR4 protein (hereinafter referred to as a self-cleavable peptide followed by an intracellular TLR4 protein binding protein).
  • the signaling domain may be referred to as #T, SEQ ID NO: 30).
  • TNFR tumor necrosis factor receptor
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • the TNF ⁇ is an inflammatory cytokine mainly produced in activated macrophages, helper T cells, natural killer cells, and the like, and regulates various biological activities such as cell growth, differentiation and apoptosis, and inflammatory response.
  • TNFR signaling pathway refers to an intracellular signaling pathway induced by binding of TNFR to a ligand.
  • TNF ⁇ binds to TNFR1
  • TRADD TNF receptor-associated death domain
  • RIP1 receptor-interacting protein kinase 1
  • TRAF tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factors
  • TRAF5 TRAF5
  • cIAP1 Apoptosis Inhibitor 1
  • cIAP2 Activated transforming growth factor- ⁇ -activated kinase 1 (TAK1) can induce NF- ⁇ B activity by phosphorylating IKK ⁇ and inducing I ⁇ B phosphorylation and proteolysis.
  • TLR Toll-like receptor
  • TLR Toll-like receptor
  • TLR is a protein that plays an important role in innate immunity.
  • TLR is a non-catalytic single protein receptor embedded in the cell membrane, and is mainly expressed on the surface of macrophages and dendritic cells, mucosal epithelial cells, and neutrophils in the process of innate immunity.
  • TLR signaling pathway is an intracellular signaling pathway induced by binding of TLRs to ligands, and TLRs are generally MyD88 (myeloid differential factor 88) and TRIF (Toll/IL-1R domain- Signal transduction is activated through the containing adapter inducing IFN- ⁇ .
  • MyD88 binds to the TIR (Toll/IL-1R) domain of TLRs and induces the activity of IL-1 receptor-associate kinase 4 (IRAK-4), and the activated IRAK-4 phosphorylates IRAK-1 to induce TRAF6 phosphorylation.
  • IRAK-4 IL-1 receptor-associate kinase 4
  • Phosphorylated TRAF6 activates IKK, leading to phosphorylation and proteolysis of I ⁇ B, thereby inducing the activity of NF- ⁇ B.
  • the "TLR4" is a receptor belonging to the TLR family, and is activated by recognizing LPS (lipopolysaccharide).
  • LPS lipopolysaccharide
  • endotoxin is a molecule composed of lipids and polysaccharides, and is a component of the outer membrane of Gram-negative bacteria.
  • the TLR4 may be a protein having an amino acid sequence disclosed as NP_003257.
  • the fragment of TLR4 used in one embodiment may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the TLR4 fragment may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • Proteins located in the T cell stimulation pathway Proteins located in the cytokine receptor (JAK-STAT) pathway
  • the protein located in the T cell stimulation pathway may be a protein located in the cytokine receptor (JAK-STAT) pathway or a fragment thereof.
  • cytokine is a polypeptide or glycoprotein secreted by various types of cells in vivo and involved in cell proliferation, differentiation, activation, etc., and plays an important role in immune and inflammatory responses.
  • cytokine receptor signal transduction pathway refers to an intracellular signal transduction pathway induced by cytokines. Compared to the various types of cytokines, intracellular signal transduction passes through similar pathways. When cytokines bind to each receptor, dimerization of the receptor is induced, and JAKs (janus kinases) located in the receptor are phosphorylated and activated.
  • Tyrosine residues in the cytoplasmic domain of the receptor are phosphorylated by activated JAKs and bind to STATs (signal transducers and activators of transcription).
  • STATs signal transducers and activators of transcription
  • receptor-bound STATs are activated through phosphorylation by JAKs and are dissociated from the receptor.
  • Activated STAT forms a homodimer or heterodimer in the cytoplasm, and then enters the nucleus to induce expression of a target gene.
  • Proteins located in the T cell stimulation pathway Proteins located in the MAP kinase pathway
  • the protein located in the T cell stimulation pathway may be a protein located in the mitogen-activated protein kinase (MAP) pathway or a fragment thereof.
  • MAP mitogen-activated protein kinase
  • the protein located in the MAP kinase pathway is GADD45 ⁇ (growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45 ⁇ , hereinafter, GADD45 ⁇ coupled to the self-cleavable peptide is referred to as #A), CDC42 (cell division cycle 42, hereinafter) , CDC42 bound after the self-cleaving peptide is referred to as #B) and HRAS (hereinafter, HRAS bound after the self-cleavable peptide is referred to as #H).
  • MAPK signal transduction pathway refers to a signal transduction pathway that is activated by various mitogens such as growth factors, cytokines or hormones, and is involved in various cellular functions including cell proliferation, differentiation and migration.
  • This pathway includes many proteins, including MAPK, named extracellular signal regulated kinase (ERK), and phosphorylates adjacent proteins to transmit signals.
  • MAPK signaling pathways regulate cellular responses including inflammation, cellular stress response, cell differentiation, cell division, cell proliferation, metabolism, motility and apoptosis.
  • MAPKs are divided into four groups: ERK-1/2, JNK1/2/3 (jun amino-terminal kinases 1, 2, 3), p38 proteins (p38 ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ), and ERK5.
  • GADD45 is a protein present in the nucleus, and there are three types of GADD45 ⁇ , ⁇ , and ⁇ . It acts as a sensor of environmental and physiological stress, and binds to or modulates the activity of proteins involved in the cell cycle, cell survival, apoptosis, maintenance of genome stability and DNA repair. GADD45 ⁇ inhibits the G2/M transition of the cell cycle, induces apoptosis, and stabilizes the genome through DNA-demethylation. It is also known to inhibit T cell activity by binding to p38MAPK in type 1 helper T cells (Th1) and dendritic cells and inhibiting p38MAPK phosphorylation (Tyr323).
  • the GADD45 may be a protein having the amino acid sequence disclosed in NP_001915.
  • CDC42 is a GTPase belonging to the Rho family that regulates cell shape, migration, endocytosis, and cell cycle.
  • the activity of CDC42 promotes cytoskeletal rearrangement, leading to cell adhesion and migration.
  • it is activated by signaling proteins downstream of the TCR and promotes the activation of JNK and p38MAPK, thereby inducing the production of inflammatory cytokines and proliferation of T cells.
  • the CDC42 may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed as NP_001782.
  • HRAS is a GTPase also known as transforming protein 21, which regulates cell division by growth factors. Activated HRAS activates signaling proteins such as c-Raf and PI3K, which are subproteins in the signal transduction pathway. HRAS is inactivated by binding to GTP in the active state and converting it to GDP by cleaving phosphate at the nucleotide terminus.
  • the HRAS may be a protein comprising the amino acid sequence disclosed in NP_005334.
  • the protein involved in negative feedback inhibition may be a protein or fragment thereof involved in negative feedback of cytokine signaling pathway inhibition.
  • the signal regulator involved in the negative feedback inhibition of the cytokine signaling pathway is the C-terminal domain of the SOCS1 protein (suppressor of cytokine signaling 1, hereinafter, the C-terminal domain of the SOCS1 protein bound to the back of the self-cleaving peptide). may be referred to as #Q, NP_003736).
  • cytokine signaling pathway is as described in the above cytokine receptor signaling pathway.
  • the JAK-STAT signaling pathway includes a negative feedback regulatory mechanism, which is achieved by three types of regulatory protein groups, PIAS (protein inhibitors of activated STAT), PTPs, and SOCS.
  • PIAS inhibits STAT activity by binding SUMO (small ubiquitin-like modifier) to STAT or by inhibiting STAT-DNA binding.
  • the PIAS may be PIAS1, PIAS3, PIASx and PIAS ⁇ .
  • the "SUMO” is a protein that is covalently attached and detached to a protein, and binds to a target protein to regulate the function of the target protein.
  • PTPs mainly performs nuclear-cytoplasmic transport, transcriptional regulation, and protein stability regulation.
  • PTPs bind to cytokine receptors, JAK and STAT, removing their phosphate groups, thereby inhibiting cytokine signaling pathways.
  • the PTPs may be SHP-1, SHP-2 and CD45.
  • SOCS is a protein family comprising a SOCS box motif having a SH2 domain at the C-terminus and a 40 amino acid region.
  • This family includes eight proteins: cytokine-inducible SH2 domain-containing protein (CISH), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6, and SOCS7.
  • CISH cytokine-inducible SH2 domain-containing protein
  • SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6, and SOCS7 The SOCS and JAB (JAK-binding protein), CIS (cytokine-inducible STAT inhibitor) and SSI (STAT-induced STAT inhibitor) are the same protein family.
  • Activation of the JAK-STAT signaling pathway by cytokines induces the expression of CISH, SOCS1 and SOCS3, and these proteins interfere with the activation of JAK or bind to the phosphorylation domain of the receptor to block STAT binding. inhibits activation.
  • SOCS-1 binds to phosphorylated JAK and induces proteolysis of phosphorylated JAK.
  • the C-terminal domain of the SOCS1 protein can bind to Elongin B/C, which competitively mediates ubiquitin ligase with intact SOCS1. Therefore, when the C-terminal domain of the SOCS1 protein is overexpressed, even if the intact SOCS1 protein binds to the phosphorylated JAK, the phosphorylated JAK protein is rescued without degradation because it does not accompany ubiquitination. Therefore, it is possible to increase the immune activity of immune cells by this mechanism.
  • the signal regulator involved in the negative feedback suppression may be a protein having an amino acid sequence disclosed as NP_003736 as the C-terminal domain of the SOCS1 protein.
  • the signaling mechanism modulator may include one or more signaling mechanism modulators.
  • a self-cleaving peptide may be included between each signaling mechanism regulatory factor.
  • the signaling mechanism modulating factor may include two signaling mechanism modulating factors.
  • the signaling mechanism modulating factor may include three signaling mechanism modulating factors.
  • the signaling mechanism modulating factor may have a structure of the following structural formula (I).
  • the N' is the N-terminus of the fusion protein
  • the C' is the C-terminus of the fusion protein
  • X and Y are each a) a protein or fragment thereof located in an immunosuppressive signaling pathway; b) an immunophilin or fragment thereof; c) a protein or fragment thereof involved in antigen loss-mediated relapse; d) a protein or fragment thereof located in the T cell stimulation pathway; And e) it may be any one selected from the group consisting of a protein or fragment thereof involved in negative feedback suppression.
  • the L1 may be a self-cleaving peptide or an Internal Ribosome Entry Site (IRES).
  • IRS Internal Ribosome Entry Site
  • X may be selected from proteins located in immunosuppressive signaling pathways.
  • X is FKBP12 protein or a fragment thereof; the C-terminal MH2 domain of SMAD4 or a fragment thereof; N-SKI or a fragment thereof; N-SH2 domain of SHP-1 protein or fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof.
  • X may be an immunophilin.
  • X is FKBP12 protein or a fragment thereof; or cyclophilin A (CYPA) or a fragment thereof.
  • X may be selected from proteins involved in antigen loss-mediated relapse.
  • X is TC21 or a fragment thereof; It may be any one selected from the group consisting of RHOG or a fragment thereof.
  • X may be selected from proteins located in the T cell stimulation pathway.
  • X is NCK1 or a fragment thereof; LAT or a fragment thereof; NEMO or a fragment thereof; TLR4 intracellular domain or fragment thereof; GADD45 ⁇ or a fragment thereof; CDC42 or a fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of HRAS or a fragment thereof.
  • X can be selected from proteins involved in negative feedback suppression.
  • X may be a C-terminal domain of the SOCS1 protein or a fragment thereof.
  • Y may be selected from proteins located in immunosuppressive signaling pathways.
  • Y is FKBP12 protein or a fragment thereof; C-terminal MH2 domain of SMAD4 protein or fragment thereof; N-SKI or a fragment thereof; N-SH2 domain of SHP-1 protein or fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof.
  • Y may be an immunophilin.
  • Y is FKBP12 protein or a fragment thereof; or cyclophilin A (CYPA) or a fragment thereof.
  • CYPA cyclophilin A
  • Y may be selected from proteins involved in antigen loss-mediated relapse.
  • Y is TC21 or a fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of RhoG or a fragment thereof.
  • Y may be selected from proteins located in the T cell stimulation pathway.
  • Y is NCK1 or a fragment thereof; LAT or a fragment thereof; NEMO or a fragment thereof; an intracellular domain of TLR4 or a fragment thereof; GADD45 ⁇ or a fragment thereof; CDC42 or a fragment thereof; It may be any one selected from the group consisting of HRAS or a fragment thereof.
  • Y can be selected from proteins involved in negative feedback suppression.
  • Y may be the C-terminal domain of the SOCS1 protein or a fragment thereof.
  • the two signaling mechanism regulatory factors may include immunophilin. Specifically, FKBP12 protein or a fragment thereof; or cyclophilin A.
  • the combination of the two signaling mechanism regulatory factors may be FKBP12 protein or a fragment thereof and cyclophilin A. Also, in one embodiment, it may be a FKBP12 protein or a fragment thereof and an N-SH2 domain of the SHP-1 protein or a fragment thereof. Also, in one embodiment, the FKBP12 protein or fragment thereof and the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof may be used. In addition, in one embodiment, it may be a C-terminal domain of the FKBP12 protein or a fragment thereof and a SOCS1 protein or a fragment thereof. Also, in one embodiment, it may be the N-SH2 domain of cyclophilin A and SHP-1 protein or a fragment thereof. Also, in one embodiment, it may be the N-SH2 domain of cyclophilin A and SHP-2 protein or a fragment thereof.
  • the signaling mechanism regulator may have a structure of the following structural formula (II).
  • the N' is the N-terminus of the fusion protein
  • the C' is the C-terminus of the fusion protein
  • X, Y and Z are each a) a protein or fragment thereof located in an immunosuppressive signaling pathway; b) an immunophilin or fragment thereof; c) a protein or fragment thereof involved in antigen loss-mediated relapse; d) a protein or fragment thereof located in the T cell stimulation pathway; And e) it may be any one selected from the group consisting of a protein or fragment thereof involved in negative feedback suppression.
  • the L1 and L2 may each be a self-cleaving peptide or an IRES.
  • X may be selected from proteins located in immunosuppressive signaling pathways.
  • X is FKBP12 protein or a fragment thereof; the C-terminal MH2 domain of SMAD4 or a fragment thereof; N-SKI or a fragment thereof; N-SH2 domain of SHP-1 protein or fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof.
  • X may be an immunophilin.
  • X is FKBP12 protein or a fragment thereof; or cyclophilin A (CYPA) or a fragment thereof.
  • X may be selected from proteins involved in antigen loss-mediated relapse.
  • X is TC21 or a fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of RhoG or a fragment thereof.
  • X may be selected from proteins located in the T cell stimulation pathway.
  • X is NCK1 or a fragment thereof; LAT or a fragment thereof; NEMO or a fragment thereof; TLR4 intracellular domain or fragment thereof; GADD45 ⁇ or a fragment thereof; CDC42 or a fragment thereof; It may be any one selected from the group consisting of HRAS or a fragment thereof.
  • X can be selected from proteins involved in negative feedback suppression.
  • X may be a C-terminal domain of the SOCS1 protein or a fragment thereof.
  • Y may be selected from proteins located in immunosuppressive signaling pathways.
  • Y is FKBP12 protein or a fragment thereof; C-terminal MH2 domain of SMAD4 protein or fragment thereof; N-SKI or a fragment thereof; N-SH2 domain of SHP-1 protein or fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof.
  • Y may be an immunophilin.
  • Y is FKBP12 protein or a fragment thereof; or cyclophilin A (CYPA) or a fragment thereof.
  • CYPA cyclophilin A
  • Y may be selected from proteins involved in antigen loss-mediated relapse.
  • Y is TC21 or a fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of RhoG or a fragment thereof.
  • Y may be selected from proteins located in the T cell stimulation pathway.
  • Y is NCK1 or a fragment thereof; LAT or a fragment thereof; NEMO or a fragment thereof; an intracellular domain of TLR4 or a fragment thereof; GADD45 ⁇ or a fragment thereof; CDC42 or a fragment thereof; It may be any one selected from the group consisting of HRAS or a fragment thereof.
  • Y can be selected from proteins involved in negative feedback suppression.
  • Y may be the C-terminal domain of the SOCS1 protein or a fragment thereof.
  • Z may be selected from proteins located in immunosuppressive signaling pathways.
  • Z is FKBP12 protein or a fragment thereof; C-terminal MH2 domain of SMAD4 protein or fragment thereof; N-SKI or a fragment thereof; N-SH2 domain of SHP-1 protein or fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof.
  • Z may be an immunophilin.
  • Z is FKBP12 protein or a fragment thereof; or cyclophilin A (CYPA) or a fragment thereof.
  • Z can be selected from proteins involved in antigen loss-mediated relapse.
  • Z is TC21 or a fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of RhoG or a fragment thereof.
  • Z may be selected from proteins located in the T cell stimulation pathway.
  • Z is NCK1 or a fragment thereof; LAT or a fragment thereof; NEMO or a fragment thereof; an intracellular domain of TLR4 or a fragment thereof; GADD45 ⁇ or a fragment thereof; CDC42 or a fragment thereof; It may be any one selected from the group consisting of HRAS or a fragment thereof.
  • Z can be selected from proteins involved in negative feedback suppression.
  • Z may be the C-terminal domain of the SOCS1 protein or a fragment thereof.
  • the three signal pre-existing regulatory factors are possible in various combinations.
  • at least one of the three signaling mechanism modulators may be an immunophilin.
  • the combination of the three signal mechanism regulatory factors may be FKBP12 protein or a fragment thereof, N-SH2 domain of cyclophilin A and SHP-2 protein, or a fragment thereof.
  • it may be FKBP12 protein or a fragment thereof, N-SH2 domain of cyclophilin A and SHP-1 protein, or a fragment thereof.
  • the term “antigen binding domain” refers to a region of an antibody that binds to an antigen.
  • the antigen-binding domain may be an antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the antigen binding domain may be an antigen binding fragment.
  • the antigen-binding fragment may be a fragment having one antigen-binding site in which one heavy chain and one light chain are linked by a disulfide bond in the antibody.
  • the antigen-binding fragment may be any one selected from the group consisting of scFv, Fab, and Fab'.
  • the antigen-binding fragment may be an scFv. In one embodiment, scFv was used as the antigen binding domain.
  • the antigen-binding domain is alpha folate receptor (eg target tumor: ovarian cancer, stomach cancer, etc.), 5T4 (kidney cancer, prostate cancer, etc.), ⁇ v ⁇ 6 integrin (ovarian cancer, pancreatic cancer, etc.), BCMA (multiple myeloma), B7-H3 ( Brain cancer, osteosarcoma, etc.), B7-H6 (lymphoma, melanoma, etc.), CAIX (kidney cancer, glioblastoma, etc.), CD16 (IgG-opsonized tumor), CD19 (leukemia, lymphoma), CD20 (leukemia, lymphoma), CD22 (leukemia, lymphoma), CD30 (leukemia, lymphoma), CD33 (leukemia), CD43 (leukemia), CD44 (liver cancer), CD44v6 (leukemia, multiple myeloma, ovarian cancer, etc.), CD44v7/8 (uterine cancer), CD47
  • the CD19 specific antigen binding domain may comprise a fragment of an antibody that specifically binds to CD19.
  • the CD19-specific antigen binding domain comprises a light chain variable region comprising L-CDR1 (SEQ ID NO: 73), L-CDR2 (SEQ ID NO: 74) and L-CDR3 (SEQ ID NO: 75). can do.
  • the CD19-specific antigen binding domain may include a heavy chain variable region comprising H-CDR1 (SEQ ID NO: 76), H-CDR2 (SEQ ID NO: 77) and H-CDR3 (SEQ ID NO: 78).
  • the CD19-specific antigen binding domain may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • the nucleotide sequence encoding the CD19-specific antigen-binding domain may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the Her2 specific antigen binding domain may comprise a fragment of an antibody that specifically binds Her2.
  • the antigen binding domain specific to Her2 comprises a light chain variable region comprising L-CDR1 (SEQ ID NO: 79), L-CDR2 (SEQ ID NO: 80) and L-CDR3 (SEQ ID NO: 81). can do.
  • the antigen binding domain specific to Her2 may include a heavy chain variable region comprising H-CDR1 (SEQ ID NO: 82), H-CDR2 (SEQ ID NO: 83) and H-CDR3 (SEQ ID NO: 84).
  • the Her2-specific antigen binding domain may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45.
  • the nucleotide sequence encoding the Her2-specific antigen-binding domain may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 46.
  • the PSMA specific antigen binding domain may comprise a fragment of an antibody that specifically binds PSMA.
  • the PSMA-specific antigen binding domain comprises a light chain variable region comprising L-CDR1 (SEQ ID NO: 85), L-CDR2 (SEQ ID NO: 86) and L-CDR3 (SEQ ID NO: 87). can do.
  • the PSMA-specific antigen binding domain may include a heavy chain variable region comprising H-CDR1 (SEQ ID NO: 88), H-CDR2 (SEQ ID NO: 89) and H-CDR3 (SEQ ID NO: 90).
  • the PSMA-specific antigen binding domain may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54.
  • the nucleotide sequence encoding the PSMA-specific antigen-binding domain may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 55.
  • the CD43 specific antigen binding domain may comprise a fragment of an antibody that specifically binds to CD43.
  • the CD43-specific antigen binding domain comprises a light chain variable region comprising L-CDR1 (SEQ ID NO: 91), L-CDR2 (SEQ ID NO: 92) and L-CDR3 (SEQ ID NO: 93) can do.
  • the CD43-specific antigen binding domain may include a heavy chain variable region comprising H-CDR1 (SEQ ID NO: 94), H-CDR2 (SEQ ID NO: 95) and H-CDR3 (SEQ ID NO: 96).
  • the CD43 specific antigen binding domain may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47.
  • the nucleotide sequence encoding the CD43-specific antigen-binding domain may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 48.
  • the CD47 specific antigen binding domain may comprise a fragment of an antibody that specifically binds to CD47.
  • the CD47-specific antigen binding domain comprises a light chain variable region comprising L-CDR1 (SEQ ID NO: 100), L-CDR2 (SEQ ID NO: 101) and L-CDR3 (SEQ ID NO: 102). can do.
  • the CD47-specific antigen binding domain may include a heavy chain variable region comprising H-CDR1 (SEQ ID NO: 97), H-CDR2 (SEQ ID NO: 98) and H-CDR3 (SEQ ID NO: 99).
  • the CD47 specific antigen binding domain may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50.
  • the nucleotide sequence encoding the CD47-specific antigen-binding domain may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 51.
  • transmembrane domain refers to a region that connects an antigen-binding domain and a domain that transmits intracellular signals in the structure of a protein located in the cell membrane and penetrates the cell membrane. and to allow proteins located in the cell membrane to be fixed to the cell membrane.
  • the transmembrane domain is a T-cell receptor, CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, It may be derived from any one selected from the group consisting of CD152, CD154, AMN and PD-1. Specifically, the transmembrane domain may be derived from CD8 ⁇ .
  • a spacer and a transmembrane domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 derived from CD8 ⁇ were used.
  • the nucleotide sequence encoding the spacer and the transmembrane domain may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the antigen binding domain and the transmembrane domain may be linked via a spacer.
  • the spacer refers to a linker, and may be a protein or a peptide. In addition, it may consist of 1 to 1,000 amino acids, and may consist of 10 to 300 amino acids. In addition, it may consist of 15 to 100 amino acids, and may consist of 15 to 60 amino acids. In addition, the spacer may be composed of 15 to 45 amino acids.
  • the linker may be a fragment of a protein in the human body, such as an Fc region.
  • the linker is CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMN And it may be derived from any one selected from the group consisting of PD-1.
  • the spacer may include an amino acid sequence derived from the hinge of CD8 ⁇ .
  • intracellular signaling domain refers to cell activation, cytotoxicity factor release, cytokine production, proliferation, etc. when an antigen receptor (antigen-binding domain) present on the cell surface recognizes an extracellular antigen. It refers to a site that transmits a signal into the cell to induce a response. Also, in general, a signal transmitted through one antigen receptor (antigen binding domain) is insufficient for cell activation, so a secondary or costimulatory signal is required. Accordingly, the intracellular signaling domain may comprise a primary signaling domain and a secondary signaling domain and/or a costimulatory domain. Specifically, the intracellular signaling domain may include a costimulatory domain and a primary signaling domain.
  • the costimulatory domain is TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40) , CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM, and may be derived from at least one molecule selected from the group consisting of ZAP70. Specifically, the costimulatory domain may be derived from CD137 (4-1BB).
  • a costimulatory domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 derived from CD137 (4-1BB) was used.
  • the nucleotide sequence encoding the co-stimulatory domain may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the primary signaling domain may be derived from FcR ⁇ , FcR ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD22, CD79a, CD79b or CD66d.
  • signals are transmitted within the cells through the ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains of CD3.
  • the primary signaling domain , ⁇ , ⁇ , ⁇ chains can be used.
  • the primary signaling domain may be derived from CD3 ⁇ .
  • the primary signaling domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 derived from CD3 ⁇ was used.
  • the nucleotide sequence encoding the primary signaling domain may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the intracellular signaling domains may be appropriately combined.
  • the intracellular signaling domain may include CD137 (4-1BB) and CD3 ⁇ .
  • self-cleavage peptide refers to 10 to 50, 12 to 42, 14 to 34 that can induce cleavage of proteins synthesized in cells.
  • Dog refers to a peptide consisting of 16 to 26 or 18 to 22 amino acids.
  • the self-cleaving peptide may be derived from region 2A of a viral gene.
  • the self-cleaving peptide may be derived from P2A, E2A, F2A or T2A.
  • the self-cleavable peptide may be derived from P2A.
  • a peptide cleaved by a degrading enzyme present in the cytoplasm may be used instead of the self-cleavable peptide.
  • a self-cleavable peptide consisting of amino acids represented by SEQ ID NO: 11 or 56 derived from P2A was used.
  • the nucleotide sequence encoding the self-cleavable peptide may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • fusion protein may be as follows:
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor FKBP12 or fragment thereof
  • FKBP12 N-terminal - signaling mechanism regulatory factor
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor (cyclophilin A) - self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - costimulatory domain - C-terminus;
  • N-terminal - signaling mechanism regulator N-SH2 domain of SHP-1 protein
  • self-cleaving peptide N-SH2 domain of SHP-1 protein
  • self-cleaving peptide N-SH2 domain of SHP-1 protein
  • self-cleaving peptide N-SH2 domain of SHP-1 protein
  • self-cleaving peptide N-SH2 domain of SHP-1 protein
  • self-cleaving peptide N-SH2 domain of SHP-1 protein
  • N-terminal - signaling mechanism regulator N-SH2 domain of SHP-2 protein
  • N-SH2 domain of SHP-2 protein self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C-terminus
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor C-terminal MH2 domain of SMAD4 protein or fragment thereof - self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C-terminus;
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor (N-SKI or fragment thereof) - self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C -end;
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor N-SKI or fragment thereof
  • cyclophilin A self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C-terminus
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor FKBP12 or fragment thereof
  • FKBP12 self-cleaving peptide - signaling mechanism regulatory factor
  • N-SH2 domain of SHP-2 protein self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C-terminus
  • N-terminal - signaling mechanism regulator cyclophilin A
  • N-SH2 domain of SHP-2 protein self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C-terminus
  • N-terminal - signaling mechanism regulatory factor FKBP12 or fragment thereof
  • cyclophilin A self-cleaving peptide - signaling mechanism regulatory factor
  • SHP-2 protein N-SH2 domain self-cleaving peptide - signal peptide - antigen binding domain - hinge - transmembrane domain - costimulatory domain - primary signaling domain - C-terminus.
  • the antigen binding domain, the hinge, the transmembrane domain, the costimulatory domain, the primary signaling domain, the self-cleaving peptide and the signaling mechanism regulator are as described above.
  • the antigen-binding domain may be a scFv specific for CD19, a scFv specific for Her2, a scFv specific for PSMA, an scFv specific for CD43, or an scFv specific for CD47
  • the transmembrane domain may be derived from CD8 ⁇
  • the costimulatory domain may be derived from CD137(4-1BB)
  • the primary signaling domain may be derived from CD3 ⁇
  • the sex peptide may be derived from P2A.
  • an antigen binding domain CD19 scFv
  • a transmembrane domain CD8 ⁇
  • an intracellular signaling domain 4-1BB and CD3 ⁇
  • P2A self-cleaving peptide
  • FKBP12 FKBP12.
  • polynucleotide refers to deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), and a DNA/RNA hybrid. Polynucleotides are single-stranded or double-stranded and can be recombinant, synthetic, or isolated. Polynucleotides include pre-messenger RNA (pre-mRNA), messenger RNA (mRNA), RNA, genomic RNA (gRNA), plus-stranded RNA (RNA(+)), minus-stranded RNA (RNA(-)), synthetic RNA, synthetic mRNA, genomic DNA (gDNA), PCR amplified DNA, complementary DNA (cDNA), synthetic DNA or recombinant DNA.
  • pre-mRNA pre-messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • gRNA genomic RNA
  • RNA(+) plus-stranded RNA
  • RNA(-) minus-stranded RNA
  • synthetic RNA synthetic mRNA
  • genomic DNA gDNA
  • the polynucleotide may be codon-optimized.
  • codon-optimized refers to substituting codons in a polynucleotide encoding a polypeptide to increase the expression, stability and/or activity of the polypeptide.
  • Factors influencing codon optimization include (i) variations in the degree of codon bias within an organism, gene or gene set, (ii) systematic modification of codons, including context, (iii) modification of codons according to their decoding tRNAs; (iv) modification of codons according to GC% at either position globally or in triplicate, (v) modification in degree of similarity to a reference sequence, e.g., a naturally occurring sequence, (vi) modification in codon frequency cutoff, ( vii) structural properties of the mRNA transcribed from the DNA sequence, (viii) prior knowledge of the function of the DNA sequence based on the design of the set of codon substitutions, (ix) systematic modifications of the set of codons for each amino acid, and/or (x) ) isolated removal of illogical translation initiation sites.
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein
  • Another aspect of the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • polynucleotide is as described above. Such polynucleotides may be prepared, engineered, expressed and delivered using any of a variety of established techniques known and available in the art. In order to express a desired fusion protein, a polynucleotide encoding the fusion protein may be inserted into an appropriate vector.
  • the vector a variety of vectors known in the art may be used, and expression control sequences such as promoter, terminator, enhancer, etc., depending on the type of host cell to produce the antigen receptor, Sequences for membrane targeting or secretion can be appropriately selected and variously combined according to the purpose.
  • the vector of the present invention includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector.
  • Suitable vectors include a signal peptide or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the vector may be a viral vector
  • the viral vector is one derived from retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, poxvirus, baculovirus, papillomavirus and parvovirus.
  • a lentiviral vector was used.
  • the vector may further include a sequence encoding a signal peptide to expose the antigen-binding domain to the outside of the cell membrane, wherein the sequence encoding the signal peptide may be inserted before the sequence encoding the antigen-binding domain.
  • the signal peptide may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence encoding it may be the sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the virus may be a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpesvirus, a poxvirus, a baculovirus, a papillomavirus or a parvovirus.
  • Another aspect of the present invention provides an immune cell into which the vector is introduced.
  • the vector is as described above.
  • the immune cells may be T cells or natural killer cells.
  • Methods of introducing the vector into immune cells may use methods known in the art, for example, transient transfection (transient transfection), microinjection, transduction (transduction), cell fusion, calcium phosphate precipitation method, Liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, gene It can be introduced into cells by a gene gun or other known methods for introducing nucleic acids into cells (Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). However, it is not limited thereto.
  • the transduced or transfected immune cells are proliferated ex vivo after vector introduction.
  • the transfected immune cells are allowed to proliferate for at least about 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, It may be cultured for 13 days or 14 days, preferably for 12 to 14 days.
  • Methods for confirming that the vector has been well introduced into the immune cells include, for example, molecular biological assays well known to those skilled in the art, such as Southern and Northern blotting, RT-PCR and PCR; biochemical assays, such as, for example, detection of the presence or absence of a particular peptide by immunological methods (eg, ELISAs and Western blots).
  • molecular biological assays well known to those skilled in the art, such as Southern and Northern blotting, RT-PCR and PCR
  • biochemical assays such as, for example, detection of the presence or absence of a particular peptide by immunological methods (eg, ELISAs and Western blots).
  • signal mechanism regulators e.g., FKBP12 or a fragment thereof
  • FKBP12 When the fusion protein is expressed in immune cells, signal mechanism regulators (e.g., FKBP12 or a fragment thereof) is isolated, and in the case of a chimeric antigen receptor, it is immobilized on a cell membrane to recognize an extracellular antigen and to transmit a signal into the cell.
  • signaling mechanisms regulatory factors such as FKBP12, can bind to TGF ⁇ R1 and block the signaling pathway of TGF- ⁇ .
  • compositions comprising: (i) a polynucleotide encoding an antigen binding domain; (ii) a polynucleotide encoding a transmembrane domain; (iii) a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) a polynucleotide encoding an Internal Ribosome Entry Site (IRES); and (v) a polynucleotide encoding a signaling mechanism regulatory factor.
  • IRS Internal Ribosome Entry Site
  • a polynucleotide encoding a spacer may be further included between the polynucleotide encoding the antigen-binding domain and the polynucleotide encoding the transmembrane domain.
  • the antigen binding domain, transmembrane domain, intracellular signaling domain and signaling mechanism regulatory factors are as described above.
  • IRES is an abbreviation for internal ribosome entry site.
  • the IRES is a nucleic acid used to simultaneously express two genes.
  • Another aspect of the present invention is to provide an expression vector containing the polynucleotide.
  • the vector and the configuration included therein are as described above.
  • Another aspect of the present invention is to provide a virus containing the polynucleotide.
  • the virus and the configuration included therein are as described above.
  • Another aspect of the present invention provides an immune cell into which the polynucleotide is introduced.
  • the method for introducing immune cells and polynucleotides is as described above.
  • compositions comprising: (i) an antigen binding domain; (ii) a transmembrane domain; (iii) an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) to provide a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a signaling mechanism regulatory factor.
  • the fusion protein may further include a spacer between (i) the antigen-binding domain and (ii) the transmembrane domain.
  • the signaling mechanism regulator may be a protein located in the T cell stimulation pathway.
  • the protein located in the T cell stimulation pathway may be a protein located in the TNFR / TLR receptor pathway or a fragment thereof.
  • the protein located in the TNFR/TLR receptor pathway may be a TLR4 intracellular domain (hereinafter, the TLR4 intracellular domain is referred to as T).
  • the protein located in the T cell stimulation pathway may be a protein located in the cytokine receptor (JAK-STAT) pathway or a fragment thereof.
  • the protein located in the cytokine receptor (JAK-STAT) pathway may be ⁇ c (hereinafter, ⁇ c is ⁇ ).
  • the intracellular signal can be regulated in a state in which the signaling mechanism regulator is bound to the CAR.
  • the expression vector is as described above.
  • the vector may further include a sequence encoding a signal peptide to expose the antigen-binding domain to the outside of the cell membrane, wherein the sequence encoding the signal peptide may be inserted before the sequence encoding the antigen-binding domain.
  • the signal peptide is as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a virus containing the polynucleotide.
  • the virus is as described above.
  • Another aspect of the present invention provides an immune cell into which the polynucleotide is introduced.
  • the immune cells are as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a transformed immune cell characterized in that it expresses a signal mechanism regulatory factor introduced exogenously.
  • the immune cells may be T cells or NK cells.
  • the immune cells may be transformed T cells or NK cells.
  • the transformed T cells may be CAR-T cells or TCR-T cells.
  • the signaling mechanism regulatory factors are as described above.
  • the signaling mechanism regulatory factor is FKBP12 protein or a fragment thereof; C-MH2 domain of SMAD4 protein or fragment thereof; N-SKI or a fragment thereof; cyclophilin A (CYPA) or a fragment thereof; N-SH2 domain of SHP-1 protein or fragment thereof; and the N-SH2 domain of the SHP-2 protein or a fragment thereof; TC21 or a fragment thereof; and RhoG or a fragment thereof; NCK1 or a fragment thereof; LAT or a fragment thereof; NEMO or a fragment thereof; TLR4 intracellular domain or fragment thereof; GADD45 ⁇ or a fragment thereof; CDC42 or a fragment thereof; HRAS or a fragment thereof; And it may be any one selected from the group consisting of the C-terminal domain of the SOCS1 protein or a fragment thereof.
  • the signaling mechanism regulatory factor is characterized in that it operates in the cytoplasm.
  • the polynucleotide encoding the signaling mechanism regulator is expressed in the cytoplasm, and the signaling mechanism regulator is not secreted out of the cell. Accordingly, the signaling mechanism regulator is located in immune cells and can regulate intracellular signaling mechanisms.
  • the chimeric antigen receptor is made based on the single chain variable fragment (scFv) sequence of a monoclonal antibody that recognizes a characteristic antigen expressed on the surface of cancer cells. Therefore, the T cells expressing it are able to specifically bind to the tumor antigen, thereby eliminating only the tumor cells. Looking at the structure of CAR, it consists of a receptor site that binds to a tumor antigen, a co-stimulatory domain that activates T cells after the receptor binds an antigen, and a spacer and transmembrane domain that connects these two sites.
  • scFv single chain variable fragment
  • the CAR-T cell comprises (i) an antigen binding domain; (ii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain.
  • the transformed CAR-T immune cell comprises (i) a polynucleotide encoding an antigen-binding domain; (ii) a polynucleotide encoding a spacer and a transmembrane domain; (iii) a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain; (iv) a polynucleotide encoding a self-cleavable peptide; And (v) a polynucleotide encoding a signaling mechanism regulatory factor; can be prepared by transducing a polynucleotide comprising a.
  • the transformed immune cell comprises (i) an antigen binding domain; (ii) spacers and transmembrane domains; (iii) a first polynucleotide comprising an intracellular signaling domain comprising at least one costimulatory domain and a second polynucleotide comprising a signaling mechanism modulator, respectively, may be prepared by transducing.
  • the first polynucleotide and the second polynucleotide may be introduced through one virus, but may also be introduced into immune cells through different viruses.
  • the signaling mechanism regulator is a) a protein located in the immunosuppressive signaling pathway, b) an immunophilin, c) a protein involved in antigen loss-mediated relapse, d) a protein located in the T cell stimulation pathway, e) It may be any one selected from the group consisting of a protein involved in negative feedback suppression and f) a combination thereof. Details of the signaling mechanism regulators and combinations are the same as described above.
  • the immune cell may be a cell overexpressing immunophilin.
  • it may be a CAR-T cell overexpressing FKBP12 or a fragment thereof and/or cyclophilin A.
  • the polynucleotide is as described above.
  • the vector loaded with the polynucleotide can be introduced using the various methods described above.
  • the TCR-T cell refers to a T cell receptor expressing T cell (T cell receptor-engineered T cell, TCR-T).
  • TCR-T introduces a T cell receptor gene that recognizes a tumor-specific antigen peptide presented on the surface of a tumor cell, such as an MHC molecule, into T cells, and a TCR that recognizes a specific tumor antigen and selects an attack target is performed on the T cell surface. It is an immunomodulatory cell therapy product that is manufactured to be expressed in a cell, proliferated, and then administered in vivo.
  • a TCR generally comprises two polypeptide chains, eg, the ⁇ -chain of a TCR, the ⁇ -chain of a TCR, the ⁇ -chain of a TCR, the ⁇ -chain of a TCR, or a combination thereof.
  • Polypeptide chains of such TCRs are known in the art.
  • TCR-T may express antigen-recognizable ⁇ -chain and ⁇ -chain.
  • the ⁇ -chain or the ⁇ -chain may comprise any amino acid sequence as long as it can specifically bind to and immunologically recognize a disease-associated antigen or epitope thereof.
  • a viral vector can be used as a method for introducing the TCR gene into T cells.
  • the viral vector is as described above.
  • the transformed TCR-T immune cell comprises (i) a polynucleotide encoding the ⁇ -chain of the TCR; (ii) a polynucleotide encoding a self-cleavable peptide; (iii) a polynucleotide encoding the ⁇ -chain of the TCR; (iv) a polynucleotide encoding a self-cleavable peptide; And (v) a polynucleotide encoding a signaling mechanism regulatory factor; can be prepared by transducing a polynucleotide comprising a.
  • the transformed immune cell comprises (i) a polynucleotide encoding the ⁇ -chain of the TCR; (ii) a polynucleotide encoding a self-cleavable peptide; (iii) a first polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the ⁇ -chain of TCR and a second polynucleotide comprising a signal mechanism modulator, respectively, may be prepared by transducing.
  • the first polynucleotide and the second polynucleotide may be introduced into immune cells through different viruses.
  • the signaling mechanism regulator is a) a protein located in the immunosuppressive signaling pathway, b) an immunophilin, c) a protein involved in antigen loss-mediated relapse, d) a protein located in the T cell stimulation pathway, e) It may be any one selected from the group consisting of a protein involved in negative feedback suppression and f) a combination thereof. Details of the signaling mechanism regulators and combinations are the same as described above.
  • the immune cell may be a cell overexpressing immunophilin.
  • it may be a TCR-T cell overexpressing FKBP12 or a fragment thereof and/or cyclophilin A.
  • the vector loaded with the polynucleotide as described above may be introduced using the various methods described above.
  • composition comprising immune cells expressing exogenously introduced signaling mechanism regulatory factors
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising, as an active ingredient, immune cells expressing the foreign-introduced signaling mechanism regulatory factor.
  • the immune cells may be T cells or NK cells, preferably CD8+ T cells or CD4+ T cells, or a mixture of these cells at a certain ratio.
  • the immune cells may be prepared by transducing the vector containing the exogenously introduced signal mechanism regulatory factor.
  • the cancer is stomach cancer, liver cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, leukemia, acute myeloid leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer , lymphoma, kidney cancer, melanoma, multiple myeloma, brain cancer, osteosarcoma, glioblastoma, IgG-opsonized tumor, lymphoma, may be any one selected from the group consisting of neuroma, mesothelioma and esophageal cancer.
  • the type of cancer may be determined according to the antigen-binding domain.
  • CD19-specific immune cells can be used for the treatment of hematologic cancer.
  • the hematologic cancer may be leukemia.
  • the cancer can be targeted.
  • the Her2-specific CAR-T cells can be utilized for the treatment of Her2 overexpressed cancer, and in particular, can be effectively utilized for Her2(+) breast cancer.
  • PSMA-specific CAR-T cells can be effectively utilized for the treatment of prostate cancer.
  • a “pharmaceutical composition” for immunotherapy in a human patient described herein comprises immune cells.
  • other pharmaceutically acceptable salts, carriers, excipients, vehicles and other additives capable of further improving the immune response may be added to the pharmaceutical composition.
  • the CAR-T cells may include 1X10 2 to 1X10 10 , 1X10 3 to 1X10 8 , 1X10 4 to 1X10 6 cells when administered once, but is not limited thereto.
  • the cell therapy composition of the present invention may be administered in a conventional manner through rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, topical, intracerebral, intraocular or intradermal routes.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating or preventing cancer, comprising administering to a subject an immune cell overexpressing an exogenously introduced signaling mechanism regulatory factor.
  • the signaling mechanism regulatory factors are as described above.
  • the immune cells are as described above.
  • the immune cells may include CAR-T cells and TCR-T cells.
  • Another aspect of the present invention provides the use of an immune cell overexpressing an exogenously introduced signaling mechanism regulatory factor for the treatment or prevention of cancer.
  • the signaling mechanism regulatory factors are as described above.
  • the immune cells are as described above.
  • the immune cells may include CAR-T cells and TCR-T cells.
  • the present inventors have designed a signaling mechanism modulator that acts as a useful small-sized immune regulator, capable of regulating the signaling pathways of various inhibitory immune checkpoint molecules.
  • a protein predicted to effectively inhibit tyrosine dephosphorylation which occurs commonly in an upper step of signaling by various inhibitory immune checkpoint molecules, was designed.
  • CAR-T cells (19bbz#S2) overexpressing the N-terminal SH2 domain (12kDa) of SHP-2 in the CAR-T cytoplasm were prepared.
  • SHP2 protein (Src homology-2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2), along with SHP1 protein, plays an important role as a common factor in mediating over 100 inhibitory immune checkpoint signals that neutralize immune cells.
  • the N-terminal SH2 domain of the SHP2 protein a tyrosine dephosphorylation enzyme, actually “a kind of lid that blocks the accessibility of the catalytic active site” Focusing on the role, the present inventors prepared a CAR-T cell (19bbz#S2) overexpressing a small-sized N-terminal SH2 domain in the cytoplasm.
  • CAR-T cells (19bbz#FCS2) that simultaneously overexpress small-sized signaling mechanism regulators possessing these different immune activation mechanisms were prepared, they were also used in immunosuppressive environments through complementary synergies of these different regulators. It was confirmed whether super-armed CAR-T cells capable of exhibiting anticancer activity could be prepared.
  • non-transduction mock T cells that is, non-transduction mock T cells
  • CAR(-)-T cells obtained through the same culture process without lentivirus treatment as peripheral blood cell-derived T cells of the same donor were appropriately added, and in all CAR-T cell samples, “T cell count ” and “Total T cell number” were adjusted to the same level, and then the reaction was performed with cancer cells.
  • CAR-T cell_19bbz#F CAR-T cell_19bbz#C, CAR-T cell_19bbz#M, CAR-T cell_19bbz#N, CAR-T cell_19bbz#S1, CAR-T cell_
  • the anticancer efficacy of 19bbz#S2, CAR-T cells_19bbz#TC, CAR-T cells_19bbz#RG and CAR-T cells_19bbzT was evaluated.
  • the group treated with the second-generation control CAR-T cells (19bbz) did not effectively inhibit the rapidly progressing tumor growth at all three doses.
  • the group treated with CAR-T cells (19bbz#F) overexpressing FKBP12 and the C-terminal MH2 domain of the SMAD4 protein Excellent efficacy in inhibiting tumor progression was observed in the group treated with CAR-T cells overexpressing (19bbz#M) and in the group treated with CAR-T cells overexpressing N-SKI (19bbz#N). Therefore, these results suggest that overexpressing modulators that can block the signaling pathway of immunosuppressive cytokines is a very useful technique for doubling the anticancer activity of immune cells.
  • CAR-T cells_19bbz and CAR-T cells_19bbz#F were evaluated at various doses (1x10 6 , 3x10 6 , 1x10 7 ).
  • the group treated with the second-generation control CAR-T cells (19bbz) did not effectively inhibit the rapidly progressing tumor growth.
  • a CAR-T dose-dependent anticancer effect was observed in the group treated with CAR-T cells (19bbz#F) overexpressing immunophilin FKBP12 as a cytoplasmic immune modulator.
  • an excellent anticancer effect of suppressing rapidly growing tumors was observed. Therefore, these results suggest that overexpression of immunophilin FKBP12 is a very useful technique for doubling the anticancer activity of immune cells.
  • FIG. 51 is a view showing "FKBP12" bound to the "receptor kinase domain” revealed in the protein co-crystal structural study of the complex between three types of TGF- ⁇ type 1 receptors and FKBP12.
  • the figure is based on the following Protein Data Bank data: TGF ⁇ R1 (PDB ID: 1b6c), ACVR1A (PDB ID: 3h9r) and BMPR1B (PDB ID: 3mdy).
  • the gray-tone surface structure represents the kinase domain of the TGF- ⁇ type 1 receptor, and the red ribbon skeleton structure corresponds to the FKBP12 protein. As shown in FIG.
  • the FKBP12-binding site is structurally very well conserved. This is a good explanation of the mechanism of action in which signaling through the seven known types of TGF- ⁇ type 1 receptors is commonly inhibited by FKBP12 binding. It is a form in which FKBP12 binds and blocks the site to be phosphorylated by the TGF- ⁇ type 2 receptor.
  • FIG. 52 is a view showing four aromatic amino acids of FKBP12 involved in protein binding revealed in the protein co-crystal structure study of a complex between three types of TGF- ⁇ type 1 receptors and FKBP12.
  • the aromatic amino acids of FKBP12 presumed to play the most important role in these binding, are tyrosine at position 27, phenylalanine at position 47, tryptophan at position 60, and phenylalanine at position 100, and their positions are very well conserved in the three-dimensional structure.
  • CAR-T the function of selecting target cancer cells depends on the "surface expression amount" of a CAR molecule to which specificity is intentionally added so as to recognize a cancer antigen.
  • CAR does not show a uniform expression distribution on the cell surface and shows a discontinuity that repeats aggregation and absence (punctate phenotype). It has been known that this phenomenon eventually induces antigen-independent T cell signaling, resulting in an exhausted T cell phenotype in which anticancer activity is inhibited.
  • T memory stem cells Tscm, CD45RA + CCR7 +
  • certain T cell subtypes such as central memory T cells (CD45RA - CCR7 + ) have been shown to be particularly important. Therefore, in the process of manufacturing CAR-T cells for anticancer treatment, interest in technology for inducing cells with high stem cell ability as described above using IL-7, IL-15, IL-21, etc. rather than IL-2, is increasing. became
  • the CAR-T cells prepared in Example 1 can maintain high effector T cell activity through overexpression of cytoplasmic immune modulators, while maintaining T cell stem cell ability, which is important for long-term persistence of anticancer immunity.
  • functional analyzes such as tumor cell killing activity, cytokine release activity, and T cell mobility of the prepared CAR-T cells are performed, and in parallel with this, T cell stem
  • phenotypic analysis was performed.
  • T cells derived from the same donor were subjected to the same immunobead stimulation and T cell proliferation culture process as non-transduced control T cells (NTDs) without contact with a lentiviral vector. was used as a negative control.
  • NTDs non-transduced control T cells
  • the effector population corresponding to the differentiated cells with the lowest stem cell potential (renew potential) corresponds to about half (49%), and the Tscm subtype is about 47%. appear.
  • the Tscm ratio was 76%, which is 6 more than that of the second-generation Control CAR-T cells (19bbz). % was found to be high.
  • the Tscm ratio was about 80%, which was maintained at least 10% higher than that of the second-generation Control CAR-T. It was confirmed that it has the highest stem cell ability.
  • the overexpression of the cell signaling mechanism regulator introduced in the present invention is not accompanied by a decrease in the stemness of T cells, which is a desirable property for the anticancer efficacy of CAR-T cells.
  • CD19-expressing tumor cell lines necessary for the evaluation of the in vitro tumor cell killing ability and cytokine secretion activity of the prepared CD19-specific CAR-T were cultured.
  • CD19-specific CAR-T in order to compare the expression level of CD19, it was analyzed by flow cytometry after staining with APC-labeled mouse anti-CD19 antibody.
  • the CD19 antigen expression was found to be about twice that of Nalm6 in Daudi's case.
  • Nalm6 showed approximately 3 times higher expression of CD19 antigen than K562-CD19 (CD19 expression level: Daudi > Nalm6 > K562-CD19).
  • the emerald green fluorescent protein (eGFP) gene was expressed, so it was used as a target cell when analyzed under a fluorescence microscope.
  • firefly luciferase (Fluc) gene was expressed, so it was used for in vitro tumor cell killing activity analysis through bioluminescence measurement.
  • Daudi-Fluc-Puro cells were used as target cells in the evaluation of the in vivo CAR-T efficacy of the hematological cancer model previously performed.
  • K562-CD19 which can be easily distinguished from T cells under a microscope and flow cytometry, was mainly used for experiments because the size of the cells was much larger than that of T cells.
  • the degree of overexpression of the foreign gene encoding the immune modulator introduced into the cell through lentiviral vector transduction was compared with the corresponding intracellular protein in each CAR-T cell. Specifically, qRT-PCR analysis and immunoblot analysis using antibodies were performed.
  • the amount of each protein in T cells revealed through previously published T lymphocyte proteomic data was 1,623,586 copies/cell for FKBP12, and 28,065,984 copies/cell for cyclophilin A.
  • Cell, SHP2 is 23,530 copies/cell. That is, there are many copies in the order of Cyclophilin A>> FKBP12 >> SHP2, and among them, it was confirmed that the SHP2 protein involved in the signaling of inhibitory immune checkpoints was present in the smallest amount.
  • the signaling mechanism regulator was expressed through the same promoter as the CAR gene, the expression level of the signaling mechanism regulator was different. Specifically, in the case of CAR-T cells overexpressing FKBP12 (19bbz#F), FKBP12 was expressed about 6 times more than endogenous expression. In addition, in the case of CAR-T cells overexpressing cyclophilin A (19bbz#C), cyclophilin A was expressed twice as much as the endogenous expression. On the other hand, in the case of CAR-T cells overexpressing the N-terminal SH2 domain of SHP2 (19bbz#S2), it was confirmed that the N-terminal SH2 domain of SHP2 was expressed about 38 times higher than that of endogenous SHP2 expression.
  • the anticancer effect of CAR-T is i) perforin/granzyme secreted after CAR-T forms an immune synapse with an antigen-positive target tumor cell (Ag-positive target tumor cell) Granzyme granule-dependent oncolytic activity, ii) Fas ligand-dependent tumor cell killing and bystander killing activity with increased expression on the surface of activated CAR-T cells, and iii) cytokine production It is known to be due to tumor cell killing activity based on an indirect mechanism (secondary mechanism) through
  • IFN ⁇ one of the important cytokines secreted from activated CAR-T, has the following effects. i) IFN ⁇ receptor expression on the surface of stroma cells is increased to induce increased secretion of chemokines such as IP10 (CXCL10) and MIC (CXCL9) to tumor tissues, T cells, NK cells, DC, monocytes/macrophages It causes the effect of increasing the immune cell infiltration (immune cell infiltration). In addition, ii) directly induces tumor stroma cell destruction. In addition, iii) it is known to exhibit a growth inhibitory effect (Cytostatic effect) that inhibits proliferation by acting on tumor cells.
  • chemokines such as IP10 (CXCL10) and MIC (CXCL9)
  • iv) induces polarization of tumor-associated macrophage and tumor-resident T cells in an immunosuppressed state.
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor alpha
  • i) induces tumor cell killing ability directly through TNF ⁇ receptor expressed on the tumor cell surface.
  • TNF ⁇ activates effector T cells and NK cells by inhibiting regulatory T cells.
  • iii) TNF ⁇ acts on endothelial cells to induce tumor microvasculature collapse and inhibits angiogenesis.
  • iv) TNF ⁇ has an activity of inducing polarization of M2 macrophages having no anticancer activity to M1 macrophages having anticancer activity.
  • TNF ⁇ acts to have anticancer activity by attracting and activating neutrophils and monocytes to the tumor tissue.
  • TNF ⁇ is known to have an action to inhibit the differentiation of monocytes into immunosuppressive cells by inhibiting IL-13 expression by eosinophilic-like cells in cancer tissues.
  • IL-2 Interleukin-2
  • cytokines of CAR-T (19bbz#F), CAR-T (19bbz#C), CAR-T (19bbz#S2), and CAR-T (19bbz#FCS2) prepared by the present invention secretory activity was compared after superior activity compared to the existing 2 nd generation of CAR-T.
  • the N-terminal SH2 domain of SHP2 that can overexpress immunophilin, which is known to be involved in the basal immune activity of T cells, or inhibit tyrosine dephosphorylation by immune checkpoint signals
  • immunophilin which is known to be involved in the basal immune activity of T cells, or inhibit tyrosine dephosphorylation by immune checkpoint signals
  • CAR-T cells (19bbz#F), CAR-T cells (19bbz#C), and CAR-T cells (19bbz#S2) all of the existing Control CAR-T cells ( 19bbz), it was confirmed that it exhibited a relatively slightly higher activity.
  • TME immune suppressive tumor microenvironment
  • CAR-T (19bbz#FCS2) secreted a fairly large amount of cytokines even in an immunosuppressive environment. Therefore, since the CAR-T can convert the immunosuppressive environment in the tumor to a favorable environment by secreting a large amount of cytokines, it is likely that it can exert considerable anticancer effect.
  • TGF- ⁇ which is present in high concentrations in cancer tissues, activates and proliferates and differentiates T cells in cancer tissues through immune-suppressive signals through TGF ⁇ receptors (TGF ⁇ RI, TGF ⁇ RII) expressed on the surface of T cells. is known to significantly impair its function.
  • TGF- ⁇ signaling of naive T cells causes autoimmune diseases. Therefore, even if the TGF- ⁇ signal is inhibited for doubling the anticancer efficacy of CAR-T cells, in order not to accompany the risk of autoimmunity, it is recommended to design the TGF- ⁇ signal in a somewhat weakened form to work. desirable.
  • the concentration range of TGF- ⁇ 1 used in this example was considered to have a half maximal effective concentration (EC50) of 0.04-0.2 ng/ml in which a concentration-dependently significant reaction in vivo occurs.
  • the test concentration was set in a wide range so as to sufficiently exceed the upper limit of the high concentration that can be accumulated in the pathological environment.
  • CAR-T activity was tested on three types of cancer cells with significant differences in “Ag CD19 expression level” and “cell size” (cell size order: K562-CD19> > Nalm6, Daudi; Ag expression level: Daudi> Nalm6> K562-CD19).
  • the difference in CAR-T cell activity caused by overexpression of FKBP12 is, in particular, higher than the reaction with Daudi, which can induce CAR-T cell activation relatively easily due to the high antigen expression level on the target surface.
  • a large difference was observed in the case of Nalm6 or K562-CD19, where activation induction is predicted to proceed relatively slowly.
  • one of the immune-evasive mechanisms of malignant tumors occurring in cancer tissues is “evasion through a mechanism that inhibits antigen expression level”.
  • a small-sized regulatory protein such as FKBP12 It is very useful to design it so that it can accumulate in cells.
  • T-cell basal activity is low regulated by tonic signaling (TGF ⁇ -independent dimerization-mediated signaling) in which TGF ⁇ RII, which remains active even in the absence of TGF ⁇ , binds to TGF ⁇ RI and induces TGF ⁇ signaling.
  • TGF ⁇ -independent dimerization-mediated signaling TGF ⁇ -independent dimerization-mediated signaling
  • FKBP12 a competitive inhibitor of receptor dimerization
  • CAR-T After CAR-T is injected in vivo.
  • the ability to efficiently migrate to the tumor site is an important consideration for the activity of CAR-T.
  • TME tumor microenvironment
  • integrin-mediated T cell adhesion and T cell migration are known to be sensitively affected by immunophilins such as FKBP12 and cyclophilin A.
  • CAR-T in order to compare the in vitro migration activity of CAR-T, CAR-T was activated and cultured using anti-CD3/CD28 Dynabeads, cells were harvested, washed, and 0.25% human serum albumin (human serum) was used. albumin) was suspended in a serum-free medium, and transwell migration was performed.
  • human serum albumin human serum
  • the migration ability of CAR(+) T cells was compared by comparing the CAR(+)% of the cells moved to the lower chamber for 1 hour. Although the set initial total T cell concentration and CAR(+) T cell concentration were all the same, it was confirmed that a specific CAR-T cell (19bbz#FCS2) exhibited significantly higher mobility compared to other CAR-T cells.
  • EGF a known cytokine that interferes with T cell infiltration
  • CAR-T cells (19bbz#FCS2) which simultaneously overexpress three types of cytoplasmic modulators, showed superior mobility, which was obtained after co-culture with target cells on a 96-well plate for 48 hours. It was also clearly observed in the photograph (FIG. 60).
  • the mobility of the CAR-T cells was most active in co-culture with K562-CD19, which is expected to have sufficient activation signals by expressing the antigen CD19 on the surface.
  • TDA (2,2':6',2"-terpyridine-6,6) secreted into the medium by cell lysis "-dicarboxylic acid) was quantified by TRF (Time-Resolved Fluorometry).
  • CAR-T cells (19bbz#F), CAR-T cells (19bbz#C), and CAR-T cells (19bbz#S2) overexpressing the N-terminal SH2 domain of SHP2 all conventional control CAR-T cells (19bbz) showed relatively slightly higher tumor cell killing activity than that of (19bbz).
  • CAR-T cells (19bbz#FCS2) it was confirmed that the E:T ratio exhibited the highest activity over the entire section.
  • Hbbz Her2- CAR-specific T cells
  • Hbbz#F FKBP12 (12 kDa
  • Cyclophilin A 18 kDa
  • CAR-T cells Hbbz#S2 overexpressing the N-terminal SH2 domain of SHP2 capable of inhibiting tyrosine dephosphorylation by immune checkpoint signals were also prepared.
  • CAR-T cells Hbbz#FCS2 in which these three types of signaling mechanisms were simultaneously overexpressed were also prepared.
  • the CAR expression rate measured 4 days after transduction with lentivirus is shown in FIG. 69 . After culturing, it was observed that the ratio of CAR(+)-T cells to CAR-T cells (Hbbz#FCS2) reached the level of 40-50%.
  • CAR-T cells Hbbz#F
  • CAR-T cells Hbbz#C
  • CAR-T cells Hbbz#S2
  • CAR-T cells Hbbz#FCS2
  • Daudi does not express Her2, but expresses a costimulatory molecule as a B lymphocyte. That is, since Daudi acts as an antigen-presenting cell derived from another person, it is presumed that it is possible to induce T cell activation with respect to some T cells having a TCR capable of responding to a specific histocompatibility antigen.
  • CAR-T cells were activated and cultured using anti-CD3/CD28 Dynabeads, the cells were harvested, washed, and 0.25% Transwell transfer was performed by suspending in a serum-free medium supplemented with human serum albumin.
  • SKBR3-Luc cells (2x10 6 cells per subject) were injected into immunocompromised NSGA mice to induce intraperitoneal xenograft tumors for 14 days.
  • each designated CAR-T cell was intravenously administered in an equal amount (1x10 6 CAR(+)-T cells). Thereafter, the tumor burden was monitored by bioluminescence imaging using IVIS equipment at weekly intervals.
  • the group treated with the second-generation control CAR-T cells did not effectively inhibit the growth of established tumors in the abdominal cavity.
  • the group treated with CAR-T cells Hbbz#F
  • immunophilin FKBP12 as a signaling mechanism regulator
  • CAR-T cells Hbbz#FCS2
  • CAR-T cells Hbbz#FCS2
  • Hbbz#FCS2 overexpressing three types of signaling mechanism regulators at the same time showed superior anticancer efficacy
  • signaling mechanism-mediated enhancement based on other mechanisms ( potentiation) is suggested to be due to the complementary effect.
  • CAR-T cells targeted at the tumor cells overexpressing PSMA was prepared "PSMA- CAR-specific T cells (Pbbz)" that represents the 2 nd generation CAR CAR form of T-cells .
  • Pbbz# F, Pbbz#C two types of CAR-T cells
  • CAR-T cells (Pbbz#S2) overexpressing the N-terminal SH2 domain of SHP2 capable of inhibiting tyrosine dephosphorylation by immune checkpoint signals were also prepared.
  • CAR-T cells (Pbbz#FCS2) in which these three types of signaling mechanisms were simultaneously overexpressed were also prepared.
  • the CAR expression rate measured 4 days after lentivirus transduction is shown in FIG. 77 . After culturing, it was observed that the proportion of CAR(+)-T cells in CAR-T cells (Pbbz#FCS2) reached the level of 40-50%.
  • NTD Non-transduced control T cells
  • the effect group corresponding to the differentiated cells with the lowest renew potential corresponds to almost half (47%), and the Tscm subtype is about 45%.
  • 2 nd generation only in the case of CAR CAR Control-T cells (Pbbz) expressing showed that the proportion of high-level Tscm 8% than degree 53% NTD.
  • T cell stem cell ability which is a desirable property of therapeutic CAR-T cells, is impaired. It didn't work, and it's still holding up well.
  • the proportion of PD-1 positive cells was within the range of 10+/-3%, and the proportion of LAG-3 positive cells is within 3%, the proportion of TIGIT-positive cells is within the range of 12+/-3%, and the proportion of CTLA-4 positive cells is also at 2-3%, indicating that the expression rate of T-cell exhaustion markers is not very high. Therefore, it was confirmed that overexpression of the cell signaling mechanism regulator introduced in the present invention does not accompany CAR-T cell exhaustion.
  • the motility of CAR(+)-T cells was compared by measuring the number of cells moved to the lower chamber and the CAR(+)% of the migrated cells for 1 hour. Although the set initial total T cell concentration and CAR(+)-T cell concentration were the same for all CAR-T samples, specific CAR-T cells (Pbbz#FCS2) migrated significantly higher than other CAR-T cells. was found to be competent.
  • the structure of the fusion protein comprising the chimeric antigen receptor and FKBP12 was designed to include a signal peptide, an antigen binding domain, a hinge and transmembrane domain, an intracellular signaling domain, a self-cleaving peptide and FKBP12.
  • signal peptide (ss), antigen binding domain (CD19 scFv), hinge and transmembrane domain (H+TM), intracellular signaling domains (4-1BB and CD3Z) designed to contain a self-cleaving peptide (P2A) and FKBP12, which was named "19bbz#F”.
  • a chimeric antigen receptor comprising a signal peptide (ss), an antigen binding domain (CD19 scFv), a hinge and transmembrane domain (H+TM) and an intracellular signaling domain (4-1BB and CD3 ⁇ ) is designated as "19bbz”. named.
  • the CD19-specific CAR comprises i) a nucleotide sequence derived from the CD8 signal peptide (Uniprot: P01732-1, 1-21 aa, SEQ ID NO: 1) and ii) a CD19-specific FMC63 antibody (Nichoison et al, 1997).
  • Example 1.2 Design of vector structure including other signaling mechanism regulatory factors
  • Cyclophilin A instead of FKBP12, C-terminal MH2 domain (#M) of SMAD4 protein, N-SKI (#N), N-terminal SH2 domain of SHP-1 protein (# S1), N-terminal NH2 domain of SHP-2 protein (#S2), TC21 (#TC), RhoG (#RG), FKBP12/Cyclophilin A/ N-terminal SH2 domain of SHP-2 protein (#F#C) #S2, or simply #FCS2) was designed to be included.
  • the pPVLV5 vector a third-generation self-inactive lentiviral vector, containing the human elongation factor ⁇ (EF1 ⁇ : 531 bp or 212 bp) promoter was used.
  • a signal peptide (ss) a single chain variable fragment that specifically binds to CD19 (CD19 scFv), a hinge and transmembrane domain (H+TM) of human CD8, and an intracellular signaling domain (4-1BB) and CD3 ⁇
  • a chimeric antigen receptor a gene encoding a self-cleaving peptide (P2A) and FKBP12 were inserted. This was named "p_19bbz#F".
  • ss signal peptide
  • CD19 scFv single chain variable fragment that specifically binds to CD19
  • H+TM hinge and transmembrane domain
  • p_19bbz A gene encoding a chimeric antigen receptor including -1BB and CD3 ⁇
  • amino acid sequence and nucleotide sequence of the chimeric antigen receptor used in the experiment are shown in ⁇ Table 1>, and the amino acid sequence and nucleotide sequence of FKBP12 (#F) are shown in ⁇ Table 2>.
  • the vector was a third-generation lentiviral vector modified with pLenti-EF1a-Backbone (NG) (Addgene, #27963), and the CAR-encoding gene was loaded into the vector using the DNA assembly Master Mix (NEB, #E2621).
  • NG pLenti-EF1a-Backbone
  • the immunomodulatory protein was FKBP12 (#F, SEQ ID NO: 14).
  • Example 2.2 Construction of vectors containing other signaling mechanism regulatory factors
  • cyclophilin A (#C, SEQ ID NO: 25), the C-terminal MH2 domain of the SMAD4 protein (#M, SEQ ID NO: 21), N-SKI (#N , SEQ ID NO: 23), N-SH2 domain of SHP-1 protein (#S1, SEQ ID NO: 27), N-SH2 domain of SHP-2 protein (#S2, SEQ ID NO: 29), TC21 (#TC, SEQ ID NO: 33) ), RhoG (#RG, SEQ ID NO: 35), or the N-SH2 domain of FKBP12/cyclophilin A/SHP2 protein (#FCS2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29).
  • Proteins or fragments thereof used in the preparation of the p_19bbz#C, p_19bbz#M, p_19bbz#N, p_19bbz#S1, p_19bbz#S2, “p_19bbz#TC”, p_19bbz#RG, p_19bbz#F#C#S2 and p_19bbzT vectors The amino acid sequences and base sequences corresponding to ⁇ Table 3> to ⁇ Table 10> are shown below. In addition, structural diagrams of each plasmid are shown in FIGS. 8 to 18 .
  • LV-MAX Lentiviral Production System (Gibco, #A35684) was used.
  • the lentiviral envelope plasmid and packaging plasmid modified from the 3rd generation lentiviral transfer plasmid prepared above with pMD2.G (Addgene, #12259), pMDLg/pRRE (Addgene, #12251) and pRSV-Rev (Addgene, #12253) Lentiviruses were prepared by co-transfection with HEK293F adapted to serum-free medium After transducing the vector into cells and culturing for 50 to 54 hours, the culture medium containing the virus is collected. Concentration was performed using a Lenti-X concentrator (Takara, #631232). The concentrated virus was stored at -80°C until use. The lentivirus produced in this way was named "Lenti_19bbz#F".
  • Example 3.2 Production of lentiviruses containing other signaling mechanism regulators
  • T cells Two days later, the two types of lentiviruses (Lenti_19bbz#F, Lenti_19bbz) produced in Example 3.1. were respectively treated in the activated T cells. The next day, centrifugation was performed to remove the supernatant containing the lentivirus. T cells were resuspended at 3x10 5 cells/ml in X-VIVO 15 medium containing 200 IU/ml of rhIL-2 and cultured for 3 days. After that, anti-CD3/CD28 Dynabeads were removed and cultured, and T cells were proliferated while changing to a new medium containing rhIL-2 every 2 or 3 days.
  • CAR-T cells prepared using Lenti_19bbz#F were named “CAR-T cells_19bbz#F”, and CAR-T cells prepared using Lenti_19bbz were named “CAR-T cells_19bbz”. did.
  • CAR-T cells which were respectively "CAR-T cells_19bbz#C", “CAR-T cells_19bbz#M”, “CAR-T cells_19bbz#N", “CAR-T cells_19bbz#S1", “CAR-T cells_19bbz#S2", “CAR-T cells_ 19bbz#TC", “CAR-T cell_19bbz#RG”, “CAR-T cell_19bbz#FCS2", and “CAR-T cell_19bbzT”.
  • Her2-specific CAR-T was prepared in the same manner as in Examples 1 to 4. However, the antigen binding domain was constructed by changing the CD19 scFv to the Her2 scFv.
  • the Her2-specific CAR is i) a nucleotide sequence derived from the CD8 signal peptide (Uniprot: P01732-1, 1-21 aa, SEQ ID NO: 1) and ii) a Her2-specific antibody, trastuzumab (IMGT database) After ligating the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 46) to the derived scFv fragment (SEQ ID NO: 45), iii) CD8 hinge-transmembrane domain (SEQ ID NO: 5), iv) human 4-1BB costimulator domain cytoplasmic region (SEQ ID NO: 7) and v) human CD3 ⁇ intracellular domain (SEQ ID NO: 9) was prepared by linking the nucleotide sequences (Table 11).
  • Her2-specific CAR-T expressing FKBP12 protein, cyclophilin A and SHP2-nSH2 was prepared, respectively.
  • CAR-T expressing all of FKBP12 protein, cyclophilin A, and SHP2-nSH2 was prepared. The vectors used at this time are as shown in FIGS. 19 to 23 .
  • PSMA-specific CAR-T was prepared in the same manner as in Examples 1 to 4. However, the antigen-binding domain was constructed by changing from CD19 scFv to PSMA-scFv.
  • the PSMA-specific CAR comprises i) a nucleotide sequence derived from a signal peptide derived from Ig heavy chain (GenBank AAA51634.1, 1-19 aa, SEQ ID NO: 52) and ii) a PSMA-specific J591 antibody (WO2002/098897A2) ), after ligating the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 55) to the fragment of the scFv derived from iii) CD8 hinge-transmembrane domain (SEQ ID NO: 5), iv) human 4-1BB costimulator domain cytoplasmic region (SEQ ID NO: 5) 7) and human v) human CD3 ⁇ intracellular domain (SEQ ID NO: 9) was prepared by linking the nucleotide sequences (Table 12).
  • PSMA-specific CAR-T expressing FKBP12 protein, cyclophilin A and SHP2-nSH2 were prepared, respectively.
  • CD43-specific CAR-T was prepared in the same manner as in Examples 1 to 4. However, the antigen-binding domain was constructed by changing the CD19 scFv to the CD43 scFv. In this case, the sequences used are shown in Table 13 below. In addition, various signaling mechanism regulatory factors expressed together with CD43-specific CARs were also prepared. Specifically, CD43-specific CAR-T cells expressing FKBP12 protein, cyclophilin A and SHP2-nSH2 were prepared, respectively. In addition, CAR-T expressing all of FKBP12 protein, cyclophilin A, and SHP2-nSH2 was prepared. The vectors used at this time are as shown in FIGS. 24 to 28 .
  • CD47-specific CAR-T was prepared in the same manner as in Examples 1 to 4. However, the antigen-binding domain was constructed by changing the CD19 scFv to the CD47 scFv. In this case, the sequences used are shown in Table 14 below. In addition, various regulatory factors of the signaling mechanism expressed together with the CD47-specific CAR were prepared. Specifically, CD47-specific CAR-T cells expressing FKBP12 protein, cyclophilin A and SHP2-nSH2 were prepared, respectively. In addition, CAR-T expressing all of FKBP12 protein, cyclophilin A, and SHP2-nSH2 was prepared. The vectors used at this time are as shown in FIGS. 29 to 33 .
  • HERV-E-specific TCR-T targeting cancer cells expressing the HLA-A11-restricted HERV-E epitope was prepared. However, the CAR part was changed to TCR and manufactured. Various regulatory factors for signaling mechanisms expressed together with HERV-E-specific TCRs were also prepared. Specifically, HERV-E-specific TCR-T expressing FKBP12 protein, cyclophilin A and SHP2-nSH2 were prepared, respectively. In addition, TCR-T expressing all of FKBP12 protein, cyclophilin A, and SHP2-nSH2 was prepared. In this case, the sequences used are shown in Tables 15 to 24 below. The vectors used at this time are as shown in FIGS. 39 to 43 .
  • NY-ESO-1-specific TCR-T targeting cancer cells expressing the HLA-A2-restricted NY-ESO-1 epitope was prepared.
  • the CAR part was changed to TCR and manufactured.
  • Various regulatory factors for signaling mechanisms expressed together with NY-ESO-1-specific TCR were also prepared.
  • NY-ESO-1-specific TCR-T expressing FKBP12 protein, cyclophilin A and SHP2-nSH2 were prepared, respectively.
  • TCR-T expressing all of FKBP12 protein, cyclophilin A, and SHP2-nSH2 was prepared.
  • the sequences used are shown in Tables 25 to 34 below. The vectors used at this time are as shown in FIGS. 44 to 48 .
  • CAR-T cells were treated with FITC-labeled recombinant human CD19 (Acro, #CD9- HF2H2) to analyze the CD19-specific CAR (FIG. 54).
  • Her2-specific CAR expression was confirmed by staining with Alexa-Fluor 488-labeled AffiniPure F(ab') 2 fragment goat anti-human IgG(H+L) antibody (Jackson ImmunoResearch, #109-546-003). was confirmed (FIG. 69).
  • PSMA-specific CAR was detected by Biotin-labeled AffiniPure F(ab') 2 fragment goat anti-mouse IgG antibody (F(ab') 2 fragment specific antibody) (Jackson ImmunoResearch, #115-066-006) ) and PE-labeled streptavidin (BD Pharmingen, #554061) was confirmed by staining (FIG. 77).
  • CD19 expression was stained with APC-labeled anti-human CD19 antibody (BD Pharmingen, #555415) (FIG. 58). Expression in each stained cell was measured using flow cytometry. CytoFLEX S (Beckman Coulter) was used for flow cytometry (FACS), and the results were analyzed using CytExpert software.
  • the CD19-specific CAR-T cells prepared in Example 4 were stained with Cyanine 3-labeled goat-anti-mouse IgG antibody (Invitrogen, #A10521) (FIG. 55), and The Her-specific CAR-T cells constructed in Example 5 were Alexa-Fluor 488-labeled AffiniPure F(ab') 2 fragment goat anti-human IgG(H+L) antibody (Jackson ImmunoResearch, #109-546-003). ) (FIG. 70). In addition, the PSMA-specific CAR-T cells prepared in Example 6 were stained with Cyanine 3-labeled goat-anti-mouse IgG antibody (Invitrogen, #A10521) (FIG.
  • CAR-stained cells were fixed and permeabilized in eBioscience solution (eBioscience, #00-5123) for 20 minutes. After that, the sample was mounted and the nucleus was stained with ProLong Gold Antifade Mountant solution (Invitrogen, #P36931) containing DAPI.
  • CD19-specific CAR-T cells were co-cultured with Daudi-Fluc-eGFP cells at a 1:1 ratio for 1 hour, followed by Cyanine 3 labeled goat-anti-mouse. Stained using IgG antibody and DAPI. Cell images were taken at a magnification of 400X using an Optinity KI-2000 microscope equipped with an Optinity HDMI 4K C-Mount Camera KCX-80 (FIG. 56). Daudi-Fluc-EGFP cells were observed by green fluorescence of EGFP in the cytoplasm.
  • the CAR-T cells prepared in Example 8 were analyzed for T cell subtypes using a flow cytometer: according to the expression of CD45RA and CCR7, stem cell-like memory T cells (T memory stem cells) , CD45RA + CCR7 + , central memory T cells (CD45RA - CCR7 + ), effector memory T cells (CD45RA - CCR7 - ) and effector T cells (CD45RA + CCR7 -) ) were classified.
  • CD19-specific CAR(+) cells were analyzed, FITC-labeled recombinant human CD19 protein (Acro, #CD9-HF2H2) was used to stain the CAR.
  • FITC-labeled recombinant human PSMA protein (Acro, #PSA-HF244) was used to stain the CAR.
  • the T cell subtype was analyzed after staining using the antibody specified in Table 35 below (FIG. 57).
  • the CAR-T cells were lysed with a PROPREP protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, #17081) containing a protease inhibitor to obtain protein. extracted. Protein concentration was quantified using the BCA Protein Assay kit (Pierce).
  • RNA was isolated from the CAR-T cells using the ISOLATEII RNA Mini kit (Bioline, #52072). . Then, it was quantified with a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Scientific). After synthesizing cDNA using 0.5 ⁇ g or 1 ⁇ g RNA, real-time quantitative PCR (Q-PCR) was performed using SensiFAST Probe Hi-ROX One-Step Kit (Bioline, #77001). carried out.
  • the GAPDH gene was used as an internal reference. All experiments were repeated twice. Gene expression was analyzed by the ⁇ Ct method ( FIG. 60 ). The primers and TaqMan probes used in Q-PCR are shown in Table 37 below.
  • human CD19 protein was stably stabilized in human myeloid leukemia K562 cells (ATCC, #CCL-243) using lentivirus. was expressed as (K562-CD19).
  • K562 negative cells were used as a negative control.
  • human B lymphoblastic Daudi cells (GFP, Imanis, #CL158) stably expressing firefly luciferase and emerald green fluorescent protein were used for in vitro functional analysis of CD19-specific CAR-T cells.
  • human B lymphoblastic Daudi cells stably expressing firefly luciferase were used for in vivo anticancer efficacy analysis of CD19-specific CAR-T cells.
  • the human B cell precursor leukemia cell line Nalm6 (ATCC, #CCL-3273) was used for in vitro functional analysis of CD19-specific CAR-T cells.
  • the human breast cancer cell line SKBR3 (JCRB, #1627.1) stably expressing firefly luciferase was used for in vitro functional analysis and in vivo anticancer efficacy analysis of Her2-specific CAR-T cells.
  • the human prostate cancer cell line LNCaP (ATCC, #CRL-1740-LUC2) stably expressing firefly luciferase was used for in vitro functional analysis of PSMA-specific CAT-T cells.
  • K562, K562-CD19, Nalm6 and Daudi-Fluc-eGFP target tumor cell lines were in RPMI-1640 medium (Gibco, # 11875-085).
  • SKBR3-Luc cells were cultured in McCoy's 5a medium (Gibco, #16600-082) containing 10% FBS and antibiotic-antibacterial agent.
  • LnCap-Luc cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS, antibiotic-antibacterial agent, and 2 ⁇ g/mL Blasticidin (Gibco, #A1113903).
  • the CAR-T cells (4 ⁇ 10 4 ) prepared in the above example were co-cultured with the target tumor cells at a 1:1 ratio for 24 hours. Thereafter, the culture medium was obtained and the concentrations of cytokines such as IFN ⁇ , TNF ⁇ and IL-2 in the medium were measured using an ELISA (R&D Systems) method. The results are shown as average values after two experiments ( FIGS. 61 to 63/ FIGS. 71 to 73 ).
  • the experiment was performed after adjusting the number of transduced CAR-T cells and the total number of T cells to be the same using non-transduced T cells.
  • the apoptosis activity of the CD19-specific CAR-T cells prepared in the above example against target tumor cells was evaluated by measuring EuTDA released for 4 hours with a DELFIA cytotoxicity measurement kit (PerkinElmer, #AD0116). Specifically, the target tumor cells were reacted with DELFIA BATDA reagent at 37° C. for 15 minutes, and then washed three times with RPMI 1640 medium. Thereafter, the target tumor cells were resuspended in the culture medium to a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells/ml. CAR-T cells were co-cultured with the target tumor cells (5 ⁇ 10 3 ) at a predetermined ratio in a 96-well V-bottom plate. Then, the culture medium (20 ⁇ l) was transferred to a white bottom plate, mixed with Europium solution (200 ⁇ l), and reacted with gentle stirring for 15 minutes.
  • a DELFIA cytotoxicity measurement kit PerkinElmer, #AD0116.
  • TDA released into the medium was evaluated by measuring fluorescence using a SpectraMax iD5 MultiMode microplate reader (Molecular Device). Each experiment was performed in triplicate, and solubility was calculated using the following equation using fluorescence measurement:
  • % solubility ⁇ (experimental group emission value-basic emission value)/(maximum emission value-basic emission value) ⁇ x100;
  • the basic release value is a value measured in spontaneous release of the target tumor cells
  • the maximum release value is a value measured after the target tumor cells are completely lysed with DELFIA lysis buffer.
  • the CAR-T cells prepared in the above example and the target tumor cells expressing firefly luciferase (3 ⁇ 10 4 ) were co-cultured in a 96-well U-bottom plate at a predetermined ratio. Each experiment was repeated twice. Specifically, 75 ⁇ g/ml D-Luciferin potassium salt (PerkinElmer, #122799) was added and cultured at 37° C. for an optimized time for each target tumor cell. Thereafter, the luciferase activity of the living cells was measured using a SpectraMax iD5 MultiMode microplate reader (Molecular Device).
  • the target tumor cell lysis ability by CAR(+)-T cells is the luciferase activity value induced by CAR-T cells at each E:T (effector(CAR-T cell):target(target tumor cell)) ratio.
  • the difference in luciferase activity values induced by T cells and non-transduced T cells was compared and evaluated. The results are shown as average values for two experiments (Fig. 68 (top), Fig. 75). In each experiment, in order to correct for the difference in efficiency at the time of transduction, the experiment was performed after the same correction for the number of CAR-T cells and the total number of T cells using non-transduced T cells.
  • the migration ability of the CAR-T cells prepared in the above example was measured using a transwell (24 well, Corning, #3422) equipped with an 8 ⁇ m pore membrane insert. After removing beads from CAR-T cells reacted with anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads, 0.2 ⁇ g/ml recombinant human EGF (Sino Biological, #10605-HNAE) was added to serum-free RPMI1640 medium (0.25% human serum albumin). (GreenCross)) resuspended CAR-T cells. The CAR-T cells were loaded into the upper chamber of the transwell, and RPMI1640 medium containing 0.25% human serum albumin (GreenCross) was treated in the lower chamber. After culturing for 1 hour, the number of cells moved to the lower chamber was measured using flow cytometry and trypan blue staining ( FIGS. 66 and 74 ).
  • CAR-T cells and target tumor cells were cultured at a 1:1 ratio at 37°C for 48 hours (using 96-well U-bottom plate). , cell images were taken. At this time, the CAR-T alone cultured experimental group was used as a negative control (FIG. 67).
  • the number of transduced CAR-T cells (CAR(+)-T cells) and the total number of T cells were equally corrected using non-transduced T cells. was performed.
  • the media 1 and the media 2 were not treated with cytokines, and the serum composition of the media 1 and the media 2 was different.
  • a 1 ml syringe (BD REF328820, 31G) was injected into 100 ⁇ l of CAR-T cells at a specified dose (1x10 6 , 3x10 6 , 1x10 7 ) into the left and right veins of the mouse tail. was used for administration.
  • D-Luciferin solution was intraperitoneally injected in the same way as above on the 14th, 21st, 28th, 35th, and 42th days, respectively, and tumor growth was followed by IVIS imaging (FIG. 50).
  • CAR-T cells_19bbz were set as controls.
  • CAR-T cell_19bbz#F CAR-T cell_19bbz#F
  • CAR-T cell_19bbz#M CAR-T cell_19bbz#N
  • CAR-T cell_19bbz# The anticancer efficacy of S1, CAR-T cells_19bbz#S2, CAR-T cells_19bbz#TC, CAR-T cells_19bbz#RG and CAR-T cells_19bbzT was evaluated.
  • a Daudi cancer cell line Daudi-Fluc
  • CAR-T cells prepared in 100 ⁇ l were administered to the left and right veins of the mouse tail using a 1 ml syringe (BD REF328820, 31G).
  • D-Luciferin solution was intraperitoneally injected in the same way as above on the 14th, 17th, 21st, 28th and 35th days, respectively, and tumor growth was followed by IVIS imaging (FIG. 7).
  • CAR-T cells_19bbz were set as controls. As a result, it was confirmed that the anticancer effect of CAR-T overexpressing cell signaling factors was excellent.
  • CAR-T cells_Hbbz, CAR-T cells_Hbbz#F and CAR-T cells_Hbbz#FCS2 was evaluated through the following method.
  • the SKBR3 cancer cell line (SKBR3-Luc) into which the firefly luciferase gene was introduced was used as a solid cancer cell model expressing Her2, the SKBR3 cancer cell line (SKBR3-Luc) into which the firefly luciferase gene was introduced was used.

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Abstract

본 발명은 외부에서 도입된 세포 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 면역세포 및 이들의 용도에 관한 것이다. 그 구체적 일 예로서, 키메라 항원 수용체 및 세포 신호 기전 조절 인자를 포함하는 융합단백질을 발현하는 면역세포는 세포막에 발현된 키메라 항원 수용체에 의해 대상 암세포를 선별하여 면역반응을 수행한다. 이때, 세포질에서 세포 신호 기전 조절 인자가 과발현되어 면역세포의 활성을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체 및 세포 신호 기전 조절 인자를 포함하는 융합단백질 및 세포 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 면역세포는 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

외부에서 도입된 세포 신호 조절 인자를 과발현하는 면역 세포 및 이들의 용도
본 발명은 외부에서 도입된 세포 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역 세포 및 이들의 용도에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 이환율 및 사망률의 두 번째 주된 원인이다. 발병율이 높은 암은 유방암, 폐 및 기관지암, 전립선암, 결장 및 직장암, 방광암, 피부의 흑색종, 비호지킨 림프종, 갑상선암, 신장 및 신우암, 자궁내막암, 백혈병 및 췌장암이다. 암을 치료하기 위해, 외과적 수술, 방사선 치료, 화학요법 등 다양한 방법이 시도되었다. 그러나, 여러 부작용이 보고되면서 최근 환자의 면역기능을 이용한 면역치료법이 개발되고 있다. 특정 암세포를 인지할 수 있는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 T 세포 수용체(T cell receptor)를 바이러스 벡터를 통해 면역세포에 발현시킨 다음 암환자에 이식하는 치료법 연구(CAR-T-based/TCR T-based Adoptive cell therapy)가 활발히 이루어지고 있다.
구체적으로, 키메라 항원 수용체는 항체의 단편, 힌지 영역, 막통과 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 구성된다. 상기 키메라 항원 수용체가 발현된 T 세포(CAR-T 세포) 또는 키메라 항원 수용체가 발현된 자연살해세포(CAR-NK 세포)와 같은 면역세포는, 항체의 단편이 표적분자를 발현하는 세포(암세포 등)를 특이적으로 인지하여 면역세포의 세포독성을 활성화시킴으로써 표적세포의 세포사멸을 유도한다. 따라서, 상기 키메라 항원 수용체가 발현된 면역세포는 유전자이입 세포 치료요법(genetically engineered cell therapy)에 활용되고 있다. 특히, 키메라 항원 수용체 T 세포는 CD19가 발현된 혈액암에 대해 매우 높은 치료 효과를 나타냄이 보고되었다.
하지만, 혈액암과 달리 고형암의 경우, CAR-T 세포와 같은 유전자가 도입된 면역세포가 암세포 성장이 이루어지는 종양조직으로 이동하는 것이 용이하지 않다. 또한, 면역세포가 종양조직으로 침투를 하더라도, 암세포 또는 암세포 주변의 세포들에서 발현되는 여러 종류의 면역관문 단백질들과 다양한 사이토카인들로 인해 CAR-T 세포의 면역반응이 저하되어 아직까지 고형암에서 치료 효능을 보이지 못하고 있다.
그 중, TGF-β는 CAR-T 세포의 면역반응을 억제하는 대표적인 사이토카인으로 알려져 있다. TGF-β의 신호전달 경로는 세포막에 존재하는 2 종류의 수용체인 TGFβR1 및 TGFβR2에 의해 매개된다. 먼저, TGF-β가 TGFβR2에 결합하면, TGFβR1을 인산화시켜서 활성화시키고, 활성화된 TGFβR1은 SMAD 단백질을 인산화시킨다. 인산화된 SMAD 단백질은 삼중결합체를 이루어 핵으로 이동하여 특정 유전자의 발현을 유도한다(Andres Rojas et al., Biochimica et Biophysica Acta 1793 (2009) 1165-1173). 따라서, 이와 같은 CAR-T 세포의 면역반응 억제에 대한 문제를 극복하고 활성이 더 좋은 면역세포를 제조하기 위해 많은 연구가 이루어 지고 있다.
이에, 본 발명자들은 유전자 도입된 면역세포의 활성이 억제되는 기작을 막을 뿐만 아니라, 유전자 도입된 면역세포가 세포 활성을 증가시킬 수 있는 방법을 고안하기 위해 연구하였다. 유전자가 도입된 면역세포의 대표적인 예에 해당하는 CAR-T 세포를 대상으로 하여 실험하였고, 그 결과, CAR-T 세포가 억제되는 기작을 막을 뿐만 아니라, CAR-T 세포의 세포 활성을 증가시킬 수 있는 방법을 고안함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; (iv) 자가-절단성 펩타이드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, (i) 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; (iv) 신호 기전 조절 인자;를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질을 발현하며, 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 면역세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역세포를 제공한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 및 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 면역세포는 세포막에 발현된 키메라 항원 수용체에 의해 지정되는 특정 암세포에 대해 특이적으로 면역반응을 일으킨다. 뿐만 아니라, 상기 면역세포의 세포질에서 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자가 과발현되기 때문에, 면역세포의 활성을 저해하는 신호전달 경로를 효과적으로 차단시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 면역세포의 활성을 조절하여 종양살상 능력을 극대화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체 및 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 면역세포는 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에서 제작한 19bbz CAR 실험군의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 실시예에서 제작한 19bbz CAR 실험군의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 실시예에서 제작한 Hbbz CAR 실험군의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 일 실시예에서 제작한 43bbz CAR 실험군의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 일 실시예에서 제작한 47bbz CAR 실험군의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 실시예에서 제작한 Pbbz CAR 실험군의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 혈액암 동물모델에서 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포 시험군의 항암효과 평가(II)에서 항암활성을 비교한 도면이다.
도 8은 일 실시예에서 사용한 19bbz를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 9는 일 실시예에서 사용한 19bbz#F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 10은 일 실시예에서 사용한 19bbz#M을 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 11은 일 실시예에서 사용한 19bbz#N을 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 12는 일 실시예에서 사용한 19bbz#C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 13은 일 실시예에서 사용한 19bbz#S1을 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 14는 일 실시예에서 사용한 19bbz#S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 15는 일 실시예에서 사용한 19bbz#TC를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 16은 일 실시예에서 사용한 19bbz#RG를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 17은 일 실시예에서 사용한 19bbzT를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 18은 일 실시예에서 사용한 19bbz#FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 19는 일 실시예에서 사용한 Hbbz를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 20은 일 실시예에서 사용한 Hbbz#F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 21은 일 실시예에서 사용한 Hbbz#C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 22는 일 실시예에서 사용한 Hbbz#S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 23은 일 실시예에서 사용한 Hbbz#FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 24는 일 실시예에서 사용한 43bbz를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 25는 일 실시예에서 사용한 43bbz#F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 26은 일 실시예에서 사용한 43bbz#C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 27은 일 실시예에서 사용한 43bbz#S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 28은 일 실시예에서 사용한 43bbz#FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 29는 일 실시예에서 사용한 47bbz를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 30은 일 실시예에서 사용한 47bbz#F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 31은 일 실시예에서 사용한 47bbz#C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 32는 일 실시예에서 사용한 47bbz#S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 33은 일 실시예에서 사용한 47bbz#FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 34는 일 실시예에서 사용한 Pbbz를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 35는 일 실시예에서 사용한 Pbbz#F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 36은 일 실시예에서 사용한 Pbbz#C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 37은 일 실시예에서 사용한 Pbbz#S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 38은 일 실시예에서 사용한 Pbbz#FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 39는 일 실시예에서 사용한 HERV-E에 특이적인 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 40은 일 실시예에서 사용한 HERV-E에 특이적인 TCR 및 #F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 41은 일 실시예에서 사용한 HERV-E에 특이적인 TCR 및 #C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 42는 일 실시예에서 사용한 HERV-E에 특이적인 TCR 및 #S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 43은 일 실시예에서 사용한 HERV-E에 특이적인 TCR 및 #FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 44는 일 실시예에서 사용한 NY-ESO-1에 특이적인 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 45는 일 실시예에서 사용한 NY-ESO-1에 특이적인 TCR 및 #F를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 46은 일 실시예에서 사용한 NY-ESO-1에 특이적인 TCR 및 #C를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 47은 일 실시예에서 사용한 NY-ESO-1에 특이적인 TCR 및 #S2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 48은 일 실시예에서 사용한 NY-ESO-1에 특이적인 TCR 및 #FCS2를 발현하는 렌티바이러스 벡터 맵을 나타낸 도면이다.
도 49는 일 실시예로서 수행한 혈액암 동물모델 항암효과 평가(I)에서 사용한 CAR-T 실험군을 정리한 표이다.
도 50은 일 실시예로서 수행한 혈액암 동물모델 항암효과 평가(I)에서 CAR-T 세포의 항암 활성을 비교한 도면이다.
도 51은 FKBP12와 결합한　TGF-β 1형 수용체의 키나아제(Kinase) 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 52는 TGF-β 1형 수용체와의 결합에 관여하는 FKBP12의 중요 서열인 방향족 아미노산(Aromatic Residues)의 사분면 위치(Tetrad)를 도식화한 도면이다.
도 53은 TGF-β 1형 수용체와의 결합에 관여하는 FKBP12 및 결합에 관여하는 주요 방향족 아미노산을 나타낸 것이다.
도 54는 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포의 CD19-특이적 CAR의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 55는 일 실시예에서 제작한 CD19-특이적 CAR-T 세포의 표면 CAR 발현을 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 56은 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포와 타겟종양세포의 결합을 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 57은 일 실시예에서 제작한 체외증식된 CD19-특이적 CAR-T 세포의 T 세포 아형(subset)을 유세포 분석을 통해 CAR(+) 세포 게이트하에서 분석한 도면이다.
도 58은 K562, K562-CD19 및 Daudi 세포의 CD19 발현을 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 59는 일 실시예에서 제작한 CAR-T에서 FKBP12, 사이클로필린 A 및 SHP2 단백질의 N-말단 SH2 도메인의 단백질 발현을 나타낸 도면이다.
도 60은 일 실시예에서 제작한 CAR-T에서 FKBP12, 사이클로필린 A 및 SHP2 단백질의 N-말단 SH2 도메인의 RNA 발현량을 나타낸 표이다. RNA의 발현량은 동량의 RNA로 cDNA를 합성 후, 실시간 중합효소 연쇄반응 분석을 통해 확인한 것이다.
도 61은 CD19-특이적 CAR-T 세포에서, 항원 자극에 의해 분비되는 IFNγ를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 62는 CD19-특이적 CAR-T 세포에서, 항원 자극에 의해 분비되는 TNFα를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 63은 CD19-특이적 CAR-T 세포에서, 항원 자극에 의해 분비되는 IL-2를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 64는 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포에서 TGF-β1 존재 시, 항원 자극에 의해 분비되는 IFNγ를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 65는 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포에서 TGF-β1 존재 시, 항원 자극에 의해 분비되는 TNFα를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 66은 CD19-특이적 CAR-T 세포를 항 CD3/항 CD28 비드로 활성화한 다음 in vitro에서의 세포 이동(migration)을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 67은 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포의 항원 자극에 의한 내인성 이동(intrinsic motility) 능력을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 68은 CD19-특이적 CAR-T 세포의 타겟종양세포인 K562-CD19 세포(하)와 Daui Fluc-eGFP 세포(상)에 대한 세포 용해능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 69는 일 실시예에서 제작한 Her2-특이적 CAR-T 세포의 CAR의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 도면이다. 구체적으로, Hbbz, Hbbz#F, Hbbz#C, Hbbz#S2 또는 Hbbz#FCS2 렌티바이러스를 형질도입한 T 세포에서 Her2-특이적 CAR 발현을 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 70은 일 실시예에서 제작한 Her2-특이적 CAR-T 세포의 표면 CAR 발현을 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 71은 Her2-특이적 CAR-T 세포에서, 항원 자극에 의해 분비되는 IFNγ를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 72는 Her2-특이적 CAR-T 세포에서, 항원 자극에 의해 분비되는 TNFα를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 73은 Her2-특이적 CAR-T 세포에서, 항원 자극에 의해 분비되는 IL-2를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 74는 Her2-특이적 CAR-T 세포를 항 CD3/항 CD28 비드로 활성화한 다음 in vitro에서의 세포 이동을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 75는 Her2-특이적 CAR-T 세포의 타겟종양세포인 SKBR3-Luc 세포에 대한 세포 용해능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 76은 일 실시예에서 사용한 Her2-특이적 CAR-T 세포의 항암 활성을 확인한 도면이다.
도 77은 일 실시예에서 제작한 CAR-T 세포의 PSMA-특이적 CAR의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 78은 일 실시예에서 제작한 PSMA-특이적 CAR-T 세포의 표면 CAR 발현을 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 79는 체외 증식된 PSMA-특이적 CAR-T 세포의 T 세포 아형을 유세포 분석을 통해 CAR(+) 세포 게이트하에서 분석한 도면이다.
도 80은 체외 증식된 PSMA-특이적 CAR-T 세포에서 T 세포 탈진(exhaustion) 표현형을 유세포 분석을 통해 CAR(+) 세포 게이트하에서 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 81은 PSMA-특이적 CAR-T 세포를 항 CD3/항 CD28 비드로 활성화한 다음 in vitro에서의 세포 이동을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 82 및 도 83은 PSMA-특이적 CAR-T 세포의 타겟종양세포에 대한 세포 용해능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
자가-절단성 펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 일 측면은, (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; (iv) 자가-절단성 펩타이드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자;를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이때, 상기 (i) 항원 결합 도메인과 (ii) 막관통 도메인 사이에 스페이서를 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 다음과 같은 형태 일 수 있다:
(a) (i) 항원 결합 도메인; (ii) 스페이서 및 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는,
(b) (i) 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 스페이서 및 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
이때, 상기 (i) 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 순으로 결합된 형태일 수 있다. 다만, 신호 기전 조절 인자가 세포질에서 발현될 수 있는 한 배열 순서는 적절히 조절될 수 있다. 예를 들어, 신호 기전 조절 인자가 항원 결합 도메인 전단에 위치할 수 있으며, 이러한 경우 자가-절단성 서열이 신호 기전 조절 인자 후단에 위치할 수 있다.
외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자
또한, 상기 신호 기전 조절 인자는 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질, b) 이뮤노필린 또는 이의 단편, c) 항원 손실-매개 재발(antigen loss-mediated relapse)에 관여하는 단백질, d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질, e) 네거티브 피드백(negative feedback) 억제에 관여하는 단백질 및 f) 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
이때, 상기 신호 기전 조절 인자는 세포질 내에서 작동하는 것을 특징으로 한다.
면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질: TGF-β/SMAD 신호 경로
상기 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질은 TGF-β/SMAD(FKBP12-FK506/rapamycin) 신호 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 TGF-β/SMAD(FKBP12-FK506/rapamycin) 신호 경로에 위치하는 단백질은 FKBP12(FK506-binidng protein 12, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 FKBP12를 #F라 함, 서열번호 13), SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인(이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인을 #M라 함, 서열번호 20) 및 N-SKI(이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 N-SKI를 #N라 함, 서열번호 22)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "형질전환 성장인자 β(transforming growth factor β, TGF-β)"는 형질전환 성장인자 β 슈퍼패밀리의 구성원으로, 세포성장, 분화, 세포사멸, 발생 등을 포함하여 다양한 세포 기능을 수행하는 사이토카인을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "TGF-β/SMAD 신호 경로"는 TGF-β에 의해 활성화되는 신호 전달 경로를 의미한다. TGF-β에 의한 신호 전달은 리간드가 수용체에 결합하면 TGF-β 1형/2형으로 이루어진 이중 복합 수용체의 형성이 촉진되고, TGF-β 2형 수용체에 의해 TGF-β 1형 수용체의 인산화가 일어나게 된다. TGF-β 1형 수용체가 인산화되면, 세포질에 존재하는 신호 매개 단백질인 SMAD를 인산화할 수 있게 되어, 이후의 신호전달 진행이 가능하게 된다. 인산화된 SMAD는 C-말단에 의해 SMAD 삼량체를 형성한 다음, 핵으로 이동하여 다른 전사조절인자(cofactor) 및 전사인자(transcription factor)와 결합하여 표적 유전자들의 발현을 증가시키거나 억제한다. T 세포에서 TGF-β/SMAD신호 전달 경로의 활성은 사이토카인 생성 억제, T 세포의 증식 및 면역반응 억제를 유도한다. 구체적으로 상기 TGF-β/SMAD 신호 경로에 위치한 단백질은 FKBP12, SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인 및 N-SKI 등 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "FKBP12"는 12 kDa의 FK506 결합 단백질 패밀리의 하나로, 단백질의 접힘(folding)과 이동(trafficking), 면역 조절 등의 세포내 반응에 관여한다. 특별히, FKBP12는 TGF-β 1형 수용체에 결합하여, TGF-β 2형 수용체에 의한 TGF-β 1형 수용체의 인산화를 방해함으로써, TGF-β의 신호 전달 경로를 억제한다. 흥미롭게도, TGF-β 부재하에서도, TGF-β 1형 수용체와 TGF-β 2형 수용체는 내재된 상호 친화력으로 인해 TGF-β 1형/2형으로 이루어진 이중 복합 수용체를 어느 정도 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, TGF-β 존재 여부와 상관없이 일어나는 수용체간의 결합에 의해 상시 leaky signaling이 발생할 수 있게 되는데, TGF-β 1형 수용체의 인산화를 억제할 수 있는 FKBP12는 결과적으로 "TGF-β leaky signaling을 억제하는 안전장치" 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 반면, 면역억제제인 라파마이신(rapamycin)과 FK506은 FKBP12에 결합하여, 경쟁적으로 FKBP12와 TGF-β 1형 수용체간의 결합을 방해한다. 이로써, 라파마이신과 FK506은 TGF-β 1형 인산화를 통한 면역억제 신호 전달을 용이하게 한다.
또한, 면역억제제인 FK506와 FKBP12의 결합으로 형성된 FKBP12/FK506 복합체는 칼슘에 의해 활성화되는 칼시뉴린(calcineurin)에 결합하여 이의 활성을 억제한다. 상기 "칼시뉴린"은 칼슘(Ca2+)-의존적으로 활성화되는 탈인산화효소(phosphatase)로서, NFAT(nuclear factor of activated T-cells)의 탈인산화를 유도하여 염증반응을 활성화시키는 역할을 한다. 상기 NFAT(Nuclear factor of activated T-cells)는 전사인자로서, 대부분의 면역세포에서 발현되어 있다. 특히, NFAT의 활성은 T 세포에서 인터루킨-2(IL-2)의 발현을 유도하여 T 세포의 면역반응을 증가시킨다.
상기 FKBP12는 인간 유래일 수 있으며, NCBI Reference Sequence: NP_000792.1 또는 NP_001186715.1에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는 상기 FKBP12는 NP_004107(FKBP12.6)에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 FKBP12는 서열번호 13 또는 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 FKBP12는 서열번호 13 또는 19의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 FKBP12를 코딩하는 염기서열은 서열번호 14로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 FKBP12를 코딩하는 염기서열은 서열번호 14로 표시되는 염기서열과 약 95%, 97% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다. 또한, FKBP12의 단편은 서열번호 13의 27번 아미노산부터 100번째 아미노산을 포함할 수 있다. 도 52에서 나타낸 바와 같이, 서열번호 13의 27번째 아미노산, 47번째 아미노산, 60번째 아미노산, 100번째 아미노산이 TGF-β 수용체의 결합에 관여하는 아미노산이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "SMAD"는 TGF-β 슈퍼패밀리 수용체에 대한 주요 신호전달 매개 단백질로서, 세포성장, 분화, 세포사멸, 발생 등에 관여한다. SMAD에는 수용체 조절 SMADs(R-SMADs), 공통 파트너 SMAD(Co-SMAD) 및 억제 SMADs(I-SMADs)의 세 가지 유형이 있으며, 두 개의 수용체 조절 SMAD와 공통 파트너 SMAD의 삼량체는 특정 유전자의 발현을 조절하는 전사인자로 작용한다. 수용체 조절 SMAD에는 SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 SMAD8/9가 있고, 공통 파트너 SMAD에는 SMAD4가 있으며, 억제 SMAD에는 SMAD6 및 SMAD7이 있다. 수용체 조절/공통 파트너 SMAD 복합체는 주로 세포질에 존재하지만, TGF-β 신호를 받은 후 핵에 축적되어 작용하고, I-SMADs는 주로 핵에 존재하며 전사조절인자 역할을 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "SMAD4"는 상기 기술한 바와 같이 공통 파트너 수용체로서, 수용체 조절 SMAD와 복합체를 형성하여 수용체 조절 SMAD의 작용을 돕는다. 한편, SMAD4는 T 세포에서 TGF-β 의존적으로 c-myc의 발현을 감소시키며, T 세포의 증식 및 면역반응을 감소시킨다. 상기 "c-myc"은 원발암 유전자(proto-oncogene)로서, 세포의 증식과 생장을 조절하는 전사인자이다. 구체적으로, SMAD4는 NP_005350에 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 사용된 SMAD4의 단편(SMAD4 단백질의 C-말단의 MH2 도메인)은 "SMAD Trimerization"에 관여한 도메인이다. 따라서, 면역세포내에서 이 단편의 과발현시에는, DNA 결합능력이 결여되어 전사인자로서 작용할 수 없는 SMAD 삼중복합체가 형성되기 때문에, TGF-β에 의한 면역억제 신호전달이 차단됨으로서 전체적으로 면역활성을 높이게 된다. 이 SMAD4 단편은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 이 SMAD4 단편은 서열번호 20의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "SKI"는 세포핵 내에 존재하는 전사조절인자로 작용하여 특정 유전자의 발현을 증대하는 원발암 유전자이다. SKI 단백질의 알려진 여러 활성 중 하나가 SMAD 삼량체 형성을 저해하여 TGF-β신호를 차단하는 것이다. 일 실시예에서 사용된 SKI 단백질의 N-말단 부위는 TGF-β 신호를 차단하는 SKI 단백질 기능에 관여한다. 구체적으로, SKI 단백질의 N-말단 부위는 SMAD와 직접 상호 결합하여 TGF-β의 표적 유전자의 전사를 억제함으로써 TGF-β의 작용을 억제할 수 있다. 이때, SMAD에 결합하는 SKI 단백질의 N-말단 부위를 N-SKI로 지칭할 수 있다. 이 N-SKI는 SMAD 단백질의 Trimerization 도메인에 결합하여, 전사인자인 SMAD 삼량체의 형성을 방해한다. 따라서, 면역세포내에서 이 단편의 과발현시에는, TGF-β에 의한 면역억제 신호전달을 차단함으로서 전체적으로 면역활성을 높이게 된다. 구체적으로, SKI는 NP_003027로 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 일 실시예에서 사용된 N-SKI의 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, N-SKI의 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질: 면역체크포인트 경로에 위치하는 단백질
상기 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질은 억제성 면역체크포인트 경로(inhibitory immune checkpoint pathway)에 위치하는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 억제성 면역체크포인트 경로에 위치하는 단백질은 SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인(Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 SHP-1을 #S1이라 함, 서열번호 26) 또는 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인(이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 SHP-2를 #S2라 함, 서열번호 28)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "억제성 면역체크포인트 경로(inhibitory immune checkpoint pathway)"는 면역관용(immune tolerance)을 유도하거나 면역계 저해경로를 유도하는 세포내 신호 전달 경로를 의미한다. T 세포에서 상기 억제성 면역체크포인트 경로에 관여하는 단백질에는 프로그램된 세포 사멸 단백질(programmed cell death protein 1: PD-1), 세포독성 T-림프구-연관 항원 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4: CTLA-4) 등이 있다.
구체적으로, PD-1이 리간드인 PD-L1(PD-1 ligand) 및 PD-L2와 결합하면 PD-1의 세포질 도메인에 존재하는 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 및 ITSM(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)의 인산화를 통해 SHP-2/SHP-1이 활성화되어 T 세포의 면역활성 신호 전달을 억제한다. CTLA-4는 CD80/86과 결합하여 CD28 신호 전달을 억제하고, 세포질 도메인에 존재하는 YVKM 모티프를 통해 SHP-2를 활성화시켜 RAS를 억제함으로써, T 세포의 면역활성 신호 전달을 억제한다.
본 명세서에 사용된 용어, "SHP-1"은 PTP(protein tyrosine phosphatase) 패밀리 중 하나이며, PTPN6(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6)로 알려져 있다. 상기 "PTP"는 세포 성장, 분화, 유사분열주기(mitotic cycle) 및 발암성 형질전환(oncogenic transformation)을 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 신호 분자이다. SHP-1는 N-말단 부분에 단백질 인산화 티로신 결합 도메인으로 작용하는 2개의 직렬 Src 상동체(SH2, N-SH2 및 C-SH2) 도메인 및 C-말단 부분에 탈인산화 활성을 가지는 PTP 도메인(catalytic domain)을 포함한다. 상기 N-SH2 도메인은 SHP-1의 활성을 조절하는데, 불활성 상태에서 PTP 도메인에 결합하여 효소의 활성을 억제한다. 하지만, N-SH2 도메인의 Tyr 잔기가 인산화되면, PTP 도메인에서 N-SH2 도메인이 분리되어, 자유로운 PTP 도메인이 기질과 상호 작용함으로써 SHP-1가 탈인산화 활성을 갖는 상태로 전환된다. 따라서, 면역세포내에서 SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인의 과발현시에는, SHP-1 단백질의 PDP 도메인에 결합하여 불활성 상태를 유지시킴으로써, 억제성 면역체크포인트 신호를 차단하게 된다. 따라서 해당 면역세포의 전체적인 면역활성이 높아지게 된다. 상기 SHP-1은 NP_002822에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 일 실시예에서 사용된 SHP-1의 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 상기 SHP-1의 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "SHP-2"는 PTP 패밀리 중 하나이며, PTPN11(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11), PTP-1D(protein-tyrosine phosphatase 1D) 또는 PTP-2C(protein-tyrosine phosphatase 2C)로도 알려져 있다. SHP-2도 상기 SHP-1와 유사하게 N-말단 부분에 단백질 인산화 티로신 결합 도메인으로 작용하는 2개의 직렬 Src 상동체(SH2, N-SH2 및 C-SH2) 도메인 및 C-말단 부분에 탈인산화 활성을 가지는 PTP 도메인(catalytic domain)으로 구성된다. SHP-2가 불활성화 상태인 경우에는, SHP-2의 N-SH2 도메인과 PTP 도메인이 결합된 상태로 존재하며, SH2 도메인의 Tyr 인산화가 인산화되면 PTP 도메인과의 결합이 분리되면서 효소 활성이 유도된다. 따라서, 면역세포내에서 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인의 과발현시에는, SHP-2 단백질의 PDP 도메인에 결합하여 불활성 상태를 유지시킴으로써, 억제성 면역체크포인트 신호를 차단하게 된다. 따라서 해당 면역세포의 전체적인 면역활성이 높아지게 된다. 상기 SHP-2는 NP_002825로 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 일 실시예에서 사용된 SHP-2의 단편은 서열번호 28의 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 상기 SHP-2의 단편은 서열번호 28의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
이뮤노필린: FKBP12 및 사이클로필린 A
본 명세서에서 사용된 용어 "이뮤노필린"은 FK506, Rapamycin, 사이클로스포린과 같은 잘 알려진 면역억제제의 타겟 단백질을 일컫는다. 이제까지 알려진 이뮤노필린의 한 부류는 FK506에 결합하는 단백질로서 16여종이며, 그 중 하나가 FKBP12 이다. 이제까지 알려진 이뮤노필린의 또 다른 부류는 사이클로스포린에 결합하는 단백질로서 16여종이며, 그 중 하나가 사이클로필린 A이다. 이들은 모두 공통적으로 펩티딜 프롤릴 이소머라제(peptidyl prolyl isomerase, PPI) 활성을 가진다. 이러한 활성은 펩타이드 결합 이성질화를 촉진하고 단백질 폴딩을 매개한다. 이를 통해 다양한 세포 내 신호 전달 경로를 조절한다. 이들이 면역억제제와 결합하여 본래의 기능을 방해받게 되면 면역억제가 유도되기 때문에, 이들 이뮤노필린 단백질은 면역활성에 중요한 기능을 갖는 것으로 이해되고 있다. 그러한 면역관련 기능의 일례로서 FKBP12와 사이클로필린 A(CYPA)가 수행하는 알려진 기능 중 하나는 T 세포의 부착(adhesion) 및 이동(migration)을 조절하는 것이다.
T 세포에서 이뮤노필린은 CrkII(CT10 regulator of kinase II)와 결합하여 CrkII의 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 상기 "Crk"는 외부 자극과 반응한 T 세포 항원 수용체(T cell antigen receptor, TCR)에서 형성된 신호를 수용체의 하위 단백질에 전달하여 신호 전달을 매개하는 어댑터 단백질의 하나로, CrkI과 CrkII가 있다.
T 세포에서 "CrkII"는 TCR의 신호 전달 경로의 하위에 위치한 단백질인 ZAP70과 결합하여 C3G(Crk SH3 domain-binding guanine-nucleotide releasing factor)에 신호를 전달함으로써, RAP1(Ras-related protein 1)의 활성을 유도한다. 상기 TCR은 T 세포의 표면에 위치한 수용체로서, 항원제시세포(antigen presenting cell)의 주조직 적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC)에 의해 제시되는 항원을 인식하여 T 세포의 면역반응을 활성화시킨다.
상기 "ZAP70"은 TCR의 구성 단백질로서, TCR의 활성화 신호를 하위 단백질에 전달하여 T 세포의 활성을 유도한다. 상기 "RAP1"은 small GTPase로서, Ras 슈퍼패밀리에 속한다. GTPase는 GTP와 결합하였을 때 활성화되고, GDP와 결합하였을 때 불활성화된다. 이러한 GTPase의 활성은 GTPase 활성 단백질(GAPs)와 GEF(guanine nucleotide exchange factor)에 의해 조절되는데, GAP은 GDP가 결합된 GTPase 형성을 촉진하고, GEF는 GTP가 결합된 GTPase 형성을 촉진한다.
상기 "C3G"는 GEF의 한 종류로서, T 세포에서 GTP가 결합된 RAP1를 증가시킴으로써 LFA-1(lymphocyte function-associated antigen 1)의 활성을 유도하여, T 세포 부착을 증가시킨다. 상기 "LFA-1"은 T 세포에서 발현되는 인테그린 중 하나로서, 혈액으로부터 체내 조직 내로 이동하는 과정에서 표적세포에 발현되어 있는 리간드인 ICAM-1(intercellular adhesion molecule 1)과 결합하여 표적세포에 대한 T 세포의 부착(adhesion)을 매개한다. FKBP12 및 CYPA와 같은 이뮤노필린은 CrkII와 결합하여 CrkII와 C3G의 결합을 증가시킴으로써, C3G의 하위 신호 전달 경로의 활성을 증가시켜 LFA-1에 의해 조절되는 T 세포 부착을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
이때, FKBP 계열의 일 구체예는 FKBP12 일 수 있다. 또한, 상기 FKBP12 단백질과 단편의 서열은 앞에서"면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질"에서 기술한 바와 같다. 또한, 사이클로필린의 일 구체예는 사이클로필린 A 일 수 있다. 상기 사이클로필린 A 매개 신호 경로에 위치하는 단백질은 CYPA(cyclophilin A, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 CYPA를 #C라 함, 서열번호 24)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "사이클로스포린(cyclosproine, CsA)"은 천연물 유래의 면역억제제이다. 구강으로 섭취하거나 정맥 주사를 통해 투여되며, 류머티스 관절염, 건선, 크론병, 신증후군 및 장기 이식 거부 반응을 예방하는 약물로 사용된다. 상기 사이클로필린 A는 CsA와 결합하는 세포질 결합 단백질로서, CsA/CYPA 복합체는 칼시뉼린(calcineurin)의 탈인산화효소(phosphatase) 활성을 억제함으로써, 림프구의 면역반응을 억제한다. 또한, CYPA는 펩티딜 프롤릴 이소머라제(peptidyl prolyl isomerase, PPI) 활성을 통해 단백질 폴딩에 관여하며, 이러한 활성을 통해 세포 내 신호 전달, 전사, 염증 및 세포사멸 등의 생물학적 과정을 조절한다. 세포 내 역할 외에도 CYPA는 염증 자극, 저산소증(hypoxia), 감염 및 산화 스트레스에 반응하여 분비될 수 있으며, 이는 바이러스 감염, 치주염, 죽상동맥경화증에서 주화성 물질(chemoattractant)로 작용하여, 염증반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 일 실시예에서 사용된 사이클로필린 A는 NP_066953로 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 구체적으로 사이클로필린 A는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 사이클로필린 A는 서열번호 24의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질
상기 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질은 트로고사이토시스(Trogocytosis)에 관여하는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 트로고사이토시스에 관여하는 단백질은 TC21(teratocarcinoma oncogene 21, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 TC21을 #TC라 함, 서열번호 32) 또는 RhoG(Ras homology growth-related, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 RhoG를 #RG라 함, 서열번호 34)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "TC21"은 R-Ras2로도 알려져 있으며, Ras GTPases 슈퍼패밀리 중 하나이다. 세포막과 결합하고, 세포 증식에 관련된 신호 전달을 매개한다. 또한, TCR에 결합하여 신호 전달 경로 상의 하위 단백질인 PI3K(phosphoinositide 3-kinase)를 활성화시킴으로써 면역 시냅스의 내재화(internalization)를 유도하여 막분자전달을 매개하는 것으로 알려져 있다. 상기 TC21는 NP_036382에 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 TC21은 변이체일 수 있으며, 일 실시예에서 사용된 TC21은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 TC21은 서열번호 32의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "RhoG"는 단량체 GTP 결합 단백질(G 단백질)로, 세포 운동성, 전사, 세포 내 이입(endocytosis), 신경 돌기 성장 등의 조절에 관여한다. 또한, TC21 및 PI3K에 의해 활성화되어 TCR에 의해 유도되는 막분자전달을 매개하는 것으로 알려져 있다. 상기 RhoG는 NP_001656에 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 RhoG는 변이체일 수 있으며, 일 실시예에서 사용된 RhoG의 단편은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 RhoG의 단편은 서열번호 34의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막분자전달"은 면역 시냅스(immunological synapse)를 통해 T 세포와 항원제시세포가 결합한 상태에서 한 세포의 표면 분자(surface molecule)가 떨어져 나와 다른 세포에게 전달되는 현상을 말한다. 면역반응의 억제 또는 증폭을 조절하기 위하여 발생하는 현상으로 알려져 있다. 상기 "면역 시냅스"는 T 세포와 항원제시세포의 부착 및 인식 과정에서 형성되는 분자 구조체이다.
면역세포 내에서 상기 TC21 및 RhoG 단백질의 과발현시에는, 암세포와의 반응에서 트로고사이토시스가 방해되므로, 암세포의 항원손실로 인한 면역회피 기전을 억제할 수 있다.
T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질: TCR/ZAP70 경로의 어댑터 단백질
상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 TCR/ZAP70 경로의 어댑터 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 TCR/ZAP70 경로의 어댑터 단백질은 NCK1(이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 NCK1을 #K라 함), LAT(linker for activation of T cells, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 LAT을 #L라 함) 및 NEMO(NF-κB essential modulator, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 NEMO를 #I라 함)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "TCR/ZAP70 경로"는 미접촉 T 세포의 T 세포 항원 수용체가 항원제시세포의 MHC/항원 복합체와 결합하여 발생하는 신호 전달 경로로서 T 세포의 면역반응을 활성화시킨다. 구체적으로, 미접촉 T 세포(naive T cell)의 TCR이 MHC/항원 복합체와 결합하면 TCR의 보조 단백질 CD3의 감마(γ), 델타(δ), 엡실론(ε) 및 제타(ζ) 사슬이 인산화 되고, 인산화된 CD3ζ 사슬에 ZAP70이 결합한다. 이후, T 세포의 보조 수용체인 CD4 또는 CD8과 결합된 LCK는 ZAP70을 인산화한다.
활성화된 ZAP70은 LAT와 SLP-76(SH2 domain-containing leukocyte protein 76 kDa)을 인산화하여 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), AP-1(activator protein 1) 및 NFAT 등의 전사인자를 활성화하는 신호 반응을 유도한다. 상기 NF-κB는 염증반응 조절, 면역체계 조절(immune modulation), 세포사멸, 세포증식 및 분화 등을 조절하는 전사인자로, p50, p52, RelA(p65), RelB, c-Rel 및 v-Rel로 구성되어 있다. AP-1은 염증반응 조절, 세포사멸, 세포증식 및 분화 등을 조절하는 전사인자로서, c-Fos, c-Jun, ATF(activating transcription factor) 및 JDP 등의 다른 전사인자와 이량체를 이루어 전사조절 작용을 한다. NF-κB, AP-1 및 NFAT와 같은 전사인자들은 인터루킨-2의 발현을 촉진함으로써 T 세포의 분열, 분화 및 면역반응을 활성화시킨다.
본 명세서에서 사용된 용어, "NCK1"는 SH2 및 SH3 도메인을 포함하는 신호 전달 매개 단백질로서, 티로신 카이나아제(tyrosine kinase) 수용체의 신호 전달을 매개한다. 또한, NCK1은 WASP/Arp2/3 복합체와 결합하여 세포 골격 재배열을 조절할 수 있다. 상기 "WASP/Arp2/3 복합체"는 세포 골격인 액틴 필라멘트 형성을 유도하는 단백질이다. T 세포에서 NCK는 TCR의 활성에 의해 유도되는 면역 시냅스 형성을 촉진한다. 상기 NCK1는 NP_006144에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "LAT"는 34 kDa의 세포막 관통(transmembrane) 단백질로서, TCR의 신호 전달 경로의 활성화에 따라 ZAP70/Syk(spleen-associated tyrosine kinase)에 의해 인산화 된다. 인산화된 LAT에 TCR의 신호 전달 경로에 관여하는 SH2 도메인을 포함하는 어댑터 단백질들(adaptor protein)이 직/간접적으로 결합하여 신호 전달을 매개한다. 상기 어댑터 단백질은 PLCγ1(phospholipase C γ1), Grb2(growth factor receptor-bound protein 2), Gads(Grb2-related adapter protein downstream of Shc), Grap(Grb2-related adaptor protein), SH3BP2(SH3 domain-binding protein 2), Shb(SH2 domain-containing adapter protein B), SOS1(son of sevenless homolog 1), c-Cbl(casitas B lymphoma), VAV, SLP-76(SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa) 및 Itk(IL-2 inducible T cell kinase) 등을 포함할 수 있다. 상기 LAT는 NP_055202로 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "NEMO"는 IKKγ(IκB kinase γ)로 알려져 있으며, IKKα/IKKβ와 함께 복합체를 형성하여 IκB(inhibitor of nuclear factor κ-B kinase)의 인산화 및 분해를 유도함으로써 NF-κB의 활성을 촉진한다. 상기 NEMO는 NP_001093326 로 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질: TNFR/TLR 수용체 경로에 위치한 단백질
상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 TNFR/TLR 수용체(TRAF/NF-kB) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 TNFR/TLR 수용체(TRAF/NF-kB) 경로 단백질은 TLR4일 수 있으며, 바람직하게는 TLR4 단백질의 세포내 신호전달 도메인(이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 TLR4 단백질의 세포내 신호전달 도메인을 #T라 함, 서열번호 30)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "TNFR(tumor necrosis factor receptor)"는 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor α, TNFα)의 수용체이다. 상기 TNFα는 활성화된 대식세포, 보조 T 세포, 자연살해세포 등에서 주로 생성되는 염증성 사이토카인으로, 세포의 성장, 분화 및 세포사멸, 염증반응 등의 다양한 생체활성을 조절한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "TNFR 신호 전달 경로"는 TNFR가 리간드와 결합하여 유도되는 세포 내 신호 전달 경로를 의미한다. TNFR1에 TNFα가 결합하면 TRADD(TNF receptor-associated death domain), RIP1(receptor-interacting protein kinase 1), TRAF(tumor necrosis factor receptor(TNFR)-associated factors) 2 또는 TRAF5(TRAF2/5), cIAP1(apoptosis Inhibitor 1) 및 cIAP2가 복합체를 형성하여 TAK1의 활성화를 촉진한다. 활성화된 TAK1(transforming growth factor-β-activated kinase 1)은 IKKβ를 인산화 하여 IκB의 인산화 및 단백질 분해를 유도시킴으로써 NF-κB의 활성을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "TLR(Toll-like receptor)"는 선천 면역에서 중요한 역할을 하는 단백질이다. TLR은 세포막에 박혀 있는 비촉매성 단일 단백질 수용체로, 선천 면역의 과정에서 주로 대식세포, 수지상세포 등의 표면이나 점막상피세포, 중성구 등에 발현된다. TLR은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 및 TLR13과 같이 총 13가지 종류가 있다. 이 중 TLR11, TLR12 및 TLR13은 인간에서 발현되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "TLR 신호 전달 경로"는 TLRs가 리간드와 결합하여 유도되는 세포내 신호 전달 경로로, TLRs는 일반적으로 MyD88(myeloid differential factor 88)과 TRIF(Toll/IL-1R domain-containing adaptor inducing IFN-γ)를 통해 신호전달이 활성화된다. MyD88은 TLRs의 TIR(Toll/IL-1R) 도메인 결합하여 IRAK-4(IL-1 receptor-associate kinase 4)의 활성을 유도하고, 활성화된 IRAK-4는 IRAK-1을 인산화시켜 TRAF6의 인산화를 유도한다. 인산화된 TRAF6는 IKK를 활성화시켜, IκB의 인산화 및 단백질 분해를 유도시킴으로써 NF-κB의 활성을 유도한다.
상기 "TLR4"는 TLR 패밀리에 속하는 수용체로서, LPS(lipopolysaccharide)를 인식하여 활성화된다. "LPS"는 내독소(endotoxin)로도 일컬어지며, 지질과 다당류로 구성된 분자로서, 그람 음성균의 외막 구성성분이다. 상기 TLR4는 NP_003257로 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 일 실시예에서 사용된 TLR4의 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 TLR4의 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질: 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질
상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "사이토카인"은 생체 내 여러 종류의 세포에서 분비하여 세포증식, 분화, 활성화 등에 관여하는 폴리펩타이드 또는 당단백질로, 면역 및 염증반응에 중요한 역할을 한다. 본 명세서에서 사용된 용어, "사이토카인 수용체 신호 전달 경로"는 사이토카인에 의해 유도되는 세포 내 신호 전달 경로를 의미한다. 다양하게 존재하는 사이토카인 종류에 비하여 세포 내 신호 전달 과정은 유사한 경로를 거친다. 사이토카인이 각각의 수용체에 결합하면 수용체의 이량화(dimerization)가 유도되고, 수용체에 위치한 JAKs(janus kinases)가 인산화되어 활성화된다. 활성화된 JAKs에 의해 수용체의 세포질 도메인의 티로신 잔기가 인산화되어 STAT(signal transducers and activators of transcription)과 결합한다. 또한, 수용체와 결합된 STAT은 JAKs에 의한 인산화를 통해 활성화되어 수용체에서 분리된다. 활성화된 STAT은 세포질 내에서 동형이량체(homodimer) 또는 이형이량체(heterodimer)를 형성한 후, 핵 내로 들어가 표적 유전자의 발현을 유도한다.
T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질: MAP 키나제 경로에 위치한 단백질
상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 MAP 키나제(mitogen-activated protein kinase) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 MAP 키나제 경로에 위치한 단백질은 GADD45α(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45α, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 GADD45α를 #A라 함), CDC42(cell division cycle 42, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 CDC42를 #B라 함) 및 HRAS(이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 HRAS를 #H라 함)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "MAPK 신호 전달 경로"는 성장인자, 사이토카인 또는 호르몬 등의 각종 마이토겐(mitogen)에 활성화되어, 세포 증식, 분화 및 이동을 포함한 다양한 세포 기능에 관여하는 신호 전달 경로를 의미한다. 이 경로는 ERK(extracellular signal regulated kinase)로 명명된 MAPK를 포함하여 많은 단백질을 포함하며, 인접 단백질을 인산화 하여 신호를 전달한다. MAPK 신호 전달 경로는 염증, 세포 스트레스 반응, 세포 분화, 세포 분열, 세포 증식, 대사, 운동성 및 세포 사멸 등 세포 반응을 조절한다. 포유류에서 MAPK는 ERK-1/2, JNK1/2/3(jun amino-terminal kinases 1, 2, 3), p38 단백질(p38α, β, γ, δ) 및 ERK5의 4 그룹으로 나뉜다.
본 명세서에서 사용된 용어, "GADD45"는 핵에 존재하는 단백질로서, GADD45α, β 및 γ의 3 종류가 있다. 환경 및 생리적 스트레스의 센서 역할을 하며, 세포주기, 세포 생존, 세포 사멸, 게놈 안정성 유지 및 DNA 복구와 관련된 단백질과 결합하거나 활성을 조절한다. GADD45α는 세포주기의 G2/M 전환을 억제하고 세포 사멸을 유도하며, DNA-탈메틸화를 통해 유전체를 안정화시킨다. 또한, 1형 보조 T 세포(Th1) 및 수지상세포에서 p38MAPK와 결합하여 p38MAPK의 인산화(Tyr323)를 억제하여 T 세포의 활성을 억제한다고 알려져 있다. 상기 GADD45는 NP_001915에 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CDC42"는 세포 모양, 이동, 엔도사이토시스(endocytosis) 및 세포 주기 등을 조절하는 Rho 패밀리에 속하는 GTPase이다. CDC42의 활성은 세포 골격 재배열을 촉진하여, 세포 부착 및 이동을 유도한다. 또한, TCR의 하위 신호 전달 단백질에 의해 활성화되어 JNK 및 p38MAPK의 활성화를 촉진함으로써 염증성 사이토카인의 생산 및 T 세포의 증식을 유도한다. 상기 CDC42는 NP_001782로 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "HRAS"는 transforming protein 21로도 알려져 있는 GTPase로서, 성장인자(growth factor)에 의한 세포 분열을 조절한다. 활성화된 HRAS는 신호 전달 경로 상의 하위 단백질인 c-Raf 및 PI3K 등 신호 전달 단백질들을 활성화시킨다. HRAS는 활성상태에서 GTP에 결합하고 뉴클레오티드 말단의 인산염을 절단하여 GDP로 전환되면서 불활성화된다. 상기 HRAS는 NP_005334에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질
또한, 상기 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질은 사이토카인 신호 경로의 네거티브 피드백(Negative feedback of cytokine signaling pathway) 억제에 관여하는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 사이토카인 신호 경로의 네거티브 피드백 억제에 관여하는 신호 조절 인자는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인(suppressor of cytokine signaling 1, 이하, 자가-절단성 펩타이드 뒤에 결합된 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인을 #Q라 함, NP_003736)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "사이토카인 신호 경로"는 상기 사이토카인 수용체 신호 전달 경로에 기술한 바와 같다. 상기 JAK-STAT 신호 전달 경로는 네거티브 피드백 조절 기전을 포함하며, 이는 PIAS(protein inhibitors of activated STAT), PTPs 및 SOCS의 3종류의 조절 단백질 그룹에 의해 이루어진다. PIAS는 STAT에 SUMO(small ubiquitin-like modifier)를 결합시키거나, STAT과 DNA 결합을 저해하여 STAT의 활성을 억제시킨다. PIAS는 PIAS1, PIAS3, PIASx 및 PIASγ일 수 있다. 상기 "SUMO"는 단백질에 공유결합으로 탈부착되는 단백질로, 표적단백질과 결합하여 표적단백질의 기능을 조절한다. 주로 핵-세포질 수송, 전사조절, 단백질 안정성 조절 기능을 수행한다. PTPs는 사이토카인 수용체, JAK 및 STAT과 결합하여 이들의 인산기를 제거함 사이토카인 신호 전달 경로를 저해한다. PTPs는 SHP-1, SHP-2 및 CD45일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "SOCS"는 C-말단에 SH2 도메인과 40개의 아미노산 영역을 가진 SOCS box motif를 포함하는 단백질 패밀리이다. 상기 패밀리는 CISH(cytokine-inducible SH2 domain-containing protein), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6, 및 SOCS7의 8개 단백질을 포함한다. 상기 SOCS와 JAB(JAK-binding protein), CIS(cytokine-inducible STAT inhibitor) 및 SSI(STAT-induced STAT inhibitor)는 동일한 단백질 패밀리이다. 사이토카인에 의한 JAK-STAT 신호 전달 경로의 활성은 CISH, SOCS1 및 SOCS3의 발현을 유도하며, 이들 단백질들은 JAK의 활성화를 방해하거나 수용체의 인산화 도메인에 결합하여 STAT의 결합을 차단하는 방식으로 STAT의 활성화를 저해한다. 특히, "SOCS-1"은 인산화된 JAK에 결합하여 인산화된 JAK의 단백질 분해를 유도한다.
SOCS1 단백질의 C-말단 도메인은 온전한 SOCS1과 경쟁적으로 유비퀴틴 리가아제(Ubiquitin ligase)를 매개하는 Elongin B/C에 결합할 수 있다. 따라서, SOCS1 단백질의 C-말단 도메인을 과발현하면, 온전한 SOCS1 단백질이 인산화된 JAK에 결합하더라도, 유비퀴티네이션(Ubiquitination)을 동반하지 않기 때문에 인산화된 JAK 단백질이 분해가 되지 않고 구제된다. 따라서 이러한 기전으로 면역세포의 면역활성을 증가시킬 수 있다. 상기 네거티브 피드백 억제에 관여하는 신호 조절 인자는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인으로서 NP_003736으로 개시된 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
신호 기전 조절 인자의 조합
상기 신호 기전 조절 인자는 하나 이상의 신호 기전 조절 인자를 포함할 수 있다. 이때 각각의 신호 기전 조절 인자 사이에는 자가-절단성 펩타이드를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 신호 기전 조절 인자는 두 개의 신호 기전 조절 인자를 포함한 것일 수 있다. 또한, 상기 신호 기전 조절 인자는 세개의 신호 기전 조절 인자를 포함할 수 있다.
두 개의 신호 기전 조절 인자의 조합
신호 기전 조절 인자는 하기 구조식 (I)의 구조를 가지는 것일 수 있다.
N'-X-L1-Y-C' (I)
이때, 상기 구조식(I)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X 및 Y는 각각 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; b) 이뮤노필린 또는 이의 단편; c) 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질 또는 이의 단편; d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; 및 e) 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 L1은 자가-절단성 펩타이드 또는 IRES(Internal Ribosome Entry Site) 일 수 있다.
구체적으로, X는 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, X는 이뮤노필린일 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; 또는 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, X는 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 TC21 또는 이의 단편; RHOG 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, X는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; 및 HRAS 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, X는 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편일 수 있다.
구체적으로, Y는 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Y는 이뮤노필린일 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; 또는 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, Y는 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 TC21 또는 이의 단편; 및 RhoG 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Y는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4의 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; HRAS 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Y는 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 두 개의 신호 기전 조절 인자는 이뮤노필린을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, FKBP12 단백질 또는 이의 단편; 또는 사이클로필린 A를 포함할 수 있다.
상기 두 개의 신호 기전 조절 인자의 조합의 구체적인 예시로는, FKBP12 단백질 또는 이의 단편 및 사이클로필린 A 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 FKBP12 단백질 또는 이의 단편 및 SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 FKBP12 단백질 또는 이의 단편 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 FKBP12 단백질 또는 이의 단편 및 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 사이클로필린 A 및 SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 사이클로필린 A 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다.
세 개의 신호 기전 조절 인자의 조합
신호 기전 조절 인자는 하기 구조식 (II)의 구조를 가지는 것일 수 있다.
N'-X-L1-Y-L2-Z-C' (II)
이때, 상기 구조식 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X, Y 및 Z는 각각 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; b) 이뮤노필린 또는 이의 단편; c) 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질 또는 이의 단편; d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; 및 e) 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 L1 및 L2는 각각 자가-절단성 펩타이드 또는 또는 IRES 일 수 있다.
구체적으로, X는 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, X는 이뮤노필린일 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; 또는 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, X는 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 TC21 또는 이의 단편; 및 RhoG 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, X는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; HRAS 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, X는 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 X는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편일 수 있다.
구체적으로, Y는 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Y는 이뮤노필린일 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; 또는 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, Y는 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 TC21 또는 이의 단편; 및 RhoG 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Y는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4의 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; HRAS 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Y는 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Y는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편일 수 있다.
구체적으로, Z는 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Z는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Z는 이뮤노필린일 수 있다. 일 구체예로는 상기 Z는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; 또는 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, Z는 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Z는 TC21 또는 이의 단편; 및 RhoG 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Z는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Z는 NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4의 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; HRAS 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, Z는 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질에서 선택될 수 있다. 일 구체예로는 상기 Z는 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 세 개의 신호 기존 조절 인자는 다양한 조합으로 가능하다. 바람직하게는 상기 세 개의 신호 기전 조절 인자 중 적어도 하나는 이뮤노필린일 수 있다.
상기 세 개의 신호 기전 조절 인자의 조합의 구체적인 예시로는, FKBP12 단백질 또는 이의 단편, 사이클로필린 A 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 FKBP12 단백질 또는 이의 단편, 사이클로필린 A 및 SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편 일 수 있다.
키메릭 항원 수용체
본 발명에서 사용하는 용어 "항원 결합 도메인(antigen binding domain)"이란, 항원과 결합하는 항체의 부위를 의미한다. 상기 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 결합 도메인은 항원 결합 단편일 수 있다. 또한, 상기 항원 결합 단편은 항체에서 하나의 중쇄와 하나의 경쇄가 이황화 결합으로 연결되어 하나의 항원 결합 부위를 갖는 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 scFv, Fab 및 Fab'로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 결합 단편은 scFv일 수 있다. 일 실시예에서는 항원 결합 도메인으로 scFv를 사용하였다.
상기 항원 결합 도메인은 알파 엽산 수용체(타겟종양 예시: 난소암, 위암 등), 5T4(신장암, 전립선암 등), αvβ6 인테그린(난소암, 췌장암 등), BCMA(다발 골수종), B7-H3(뇌암, 골육종 등), B7-H6(림프종, 흑색종 등), CAIX(신장암, 교모세포종 등), CD16(IgG-opsonized tumor), CD19(백혈병, 림프종), CD20(백혈병, 림프종), CD22(백혈병, 림프종), CD30(백혈병, 림프종), CD33(백혈병), CD43(백혈병), CD44(간암), CD44v6(백혈병, 다발 골수종,난소암 등), CD44v7/8(자궁암), CD47(백혈병, 림프종, 난소암, 췌장암 등) CD70(백혈병,림프종,신경종), CD79a(백혈병,림프종), CD79b(백혈병,림프종), CD123(백혈병), CD138(다발 골수종), CD171(신경모세포종), CEA(대장암, 위암, 폐암), CSPG4(백혈병, 교모세포종), EGFR(유방암, 폐암), ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 패밀리(교모세포종, 육종), EGFRvIII(교모세포종), EGP2(대장암), EGP40(대장암), EPCAM(대장암), EphA2(식도암), FAP(중피종, 폐암, 대장암), 태아 AchR(횡문육종), FRα(난소암, 유방암), GD2(신경모세포종), GD3(흑색종, 신경종 등), 글리피칸-3(GPC3)(간암), HLA-A1+MAGE1(흑색종), HLA-A2+MAGE1(흑색종), HLA-A3+MAGE1(흑색종), HLA-A1+NY-ESO-1(활막육종, 흑색종), HLA-A2+NY-ESO-1(활막육종, 흑색종), HLA-A3+NY-ESO-1(활막육종, 흑색종), IL-11Rα(골육종), IL-13Rα2(신경종), 람다, 루이스-Y, 카파(림프종), 메소텔린(중피종, 췌장암 등), Muc1(유방암), Muc16(난소암), NCAM(신경모세포종, 폐암), NKG2D 리간드(백혈병, 다발 골수종), NY-ESO-1(다발 골수종), PRAME(수질세포종), PSCA(전립선암), PSMA(전립선암), ROR1(폐암, 유방암), SSX(활막육종), 서바이빈(폐암), TAG72(난소암), TEMs, VEGFR2(흑색종, 신장암) 및 WT-1(백혈병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항원 결합 도메인이 CD19, HER2, PSMA, CD43, 및 CD47에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
키메릭 항원 수용체: CD19
CD19 특이적 항원 결합 도메인은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 CD19에 특이적 항원 결합 도메인은 L-CDR1(서열번호 73), L-CDR2(서열번호 74) 및 L-CDR3(서열번호 75)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD19에 특이적 항원 결합 도메인은 H-CDR1(서열번호 76), H-CDR2(서열번호 77) 및 H-CDR3(서열번호 78)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, CD19 특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD19 특이적 항원 결합 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다.
키메릭 항원 수용체: HER2
Her2 특이적 항원 결합 도메인은 Her2에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 Her2에 특이적 항원 결합 도메인은 L-CDR1(서열번호 79), L-CDR2(서열번호 80) 및 L-CDR3(서열번호 81)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 Her2에 특이적 항원 결합 도메인은 H-CDR1(서열번호 82), H-CDR2(서열번호 83) 및 H-CDR3(서열번호 84)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, Her2 특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 Her2 특이적 항원 결합 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 46로 표시되는 염기서열일 수 있다.
키메릭 항원 수용체: PSMA
PSMA 특이적 항원 결합 도메인은 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 PSMA에 특이적 항원 결합 도메인은 L-CDR1(서열번호 85), L-CDR2(서열번호 86) 및 L-CDR3(서열번호 87)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PSMA에 특이적 항원 결합 도메인은 H-CDR1(서열번호 88), H-CDR2(서열번호 89) 및 H-CDR3(서열번호 90)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, PSMA 특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PSMA 특이적 항원 결합 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 55로 표시되는 염기서열일 수 있다.
키메릭 항원 수용체: CD43
CD43 특이적 항원 결합 도메인은 CD43에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 CD43에 특이적 항원 결합 도메인은 L-CDR1(서열번호 91), L-CDR2(서열번호 92) 및 L-CDR3(서열번호 93)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD43에 특이적 항원 결합 도메인은 H-CDR1(서열번호 94), H-CDR2(서열번호 95) 및 H-CDR3(서열번호 96)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, CD43 특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 47 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD43 특이적 항원 결합 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 48 표시되는 염기서열일 수 있다.
키메릭 항원 수용체: CD47
CD47 특이적 항원 결합 도메인은 CD47에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 CD47에 특이적 항원 결합 도메인은 L-CDR1(서열번호 100), L-CDR2(서열번호 101) 및 L-CDR3(서열번호 102)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD47에 특이적 항원 결합 도메인은 H-CDR1(서열번호 97), H-CDR2(서열번호 98) 및 H-CDR3(서열번호 99)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, CD47 특이적 항원 결합 도메인은 서열번호 50 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD47 특이적 항원 결합 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 51 표시되는 염기서열일 수 있다.
막관통 도메인
본 발명에서 사용하는 용어 "막관통 도메인(trans membrane domain)"이란, 세포막에 위치하는 단백질의 구조 중에서 항원이 결합하는 도메인과 세포내 신호를 전달하는 도메인을 연결하며 세포막을 관통하고 있는 부위를 의미하며, 상기 세포막에 위치하는 단백질이 세포막에 고정될 수 있도록 한다. 상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMN 및 PD-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, CD8α로부터 유래된 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 스페이서 및 막관통 도메인을 사용하였다. 또한, 상기 스페이서 및 막관통 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
스페이서
상술한 바와 같이 항원 결합 도메인과 막관통 도메인은 스페이서를 통해 연결될 수 있다. 상기 스페이서는 링커를 의미하며, 단백질 또는 펩타이드 일 수 있다. 또한, 1 내지 1,000개의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 10 내지 300개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 15 내지 100개의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 15 내지 60개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 스페이서는 15 내지 45의 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 링커는 Fc 영역과 같은 인체내 단백질의 단편일 수 있다. 또한, 상기 링커는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMN 및 PD-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 것일 수 있다. 또한, 상기 스페이서는 CD8α의 힌지에서 유래된 것인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
세포내 신호전달 도메인
본 발명에서 사용하는 용어 "세포내 신호전달 도메인"이란, 세포 표면에 존재하는 항원 수용체(항원 결합 도메인)가 세포외 항원을 인지하면 세포의 활성화, 세포독성 인자 방출, 사이토카인 생산, 증식 등의 반응을 유도하기 위하여 세포 내부로 신호를 전달하는 부위를 의미한다. 또한, 일반적으로, 하나의 항원 수용체(항원 결합 도메인)를 통해 전달되는 신호로는 세포의 활성화에 불충분하므로, 2차 또는 공자극 신호가 필요하다. 따라서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인과 2차 신호전달 도메인 및/또는 공자극 도메인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
상기 공자극 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 분자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 공자극 도메인은 CD137(4-1BB)로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, CD137(4-1BB)로부터 유래된 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 공자극 도메인을 사용하였다. 또한, 상기 공자극 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 8로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 1차 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d로부터 유래된 것일 수 있다. 특히, T 세포의 경우 CD3의 γ, δ, ε, ζ 사슬을 통해 세포 내에 신호를 전달하며, CAR-T 세포(Chimeric antigen receptor T cell)를 제작하는 경우, 1차 신호전달 도메인으로 CD3의 γ, δ, ε, ζ 사슬을 이용할 수 있다. 구체적으로, 상기 1차 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, CD3ζ로부터 유래된 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 1차 신호전달 도메인을 사용하였다. 또한, 상기 1차 신호전달 도메인을 코딩하는 염기서열은 서열번호 10으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 세포내 신호전달 도메인은 적절히 조합될 수 있다. 일 구체예로서, 세포내 신호전달 도메인은 CD137(4-1BB) 및 CD3ζ를 포함할 수 있다.
자가-절단성 펩타이드
본 발명에서 사용하는 용어 "자가-절단성 펩타이드(self-cleavage peptide)"란, 세포 내에서 합성되는 단백질의 절단을 유도할 수 있는 10개 내지 50개, 12개 내지 42개, 14개 내지 34개, 16개 내지 26개 또는 18개 내지 22개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 의미한다. 상기 자가-절단성 펩타이드는 바이러스 유전자의 2A 영역(region)에서 유래된 것일 수 있다. 상기 자가-절단성 펩타이드는 P2A, E2A, F2A 또는 T2A로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 자가-절단성 펩타이드는 P2A로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 자가-절단성 펩타이드 대신 세포질 내 존재하는 분해효소에 의해 절단되는 펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, P2A로부터 유래된 서열번호 11 또는 56으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 자가-절단성 펩타이드를 사용하였다. 또한, 상기 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 12로 표시되는 염기서열일 수 있다.
융합단백질의 구체적인 예시
상기 융합단백질의 구체적인 예시는 하기와 같을 수 있다:
(1) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12 또는 이의 단편) - C-말단;
(2) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 공자극 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - C-말단;
(3) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인) - C-말단;
(4) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인) - C-말단;
(5) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편) - C-말단;
(6) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(N-SKI 또는 이의 단편) - C-말단;
(7) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A)- C-말단;
(8) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인)- C-말단;
(9) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인)- C-말단;
(10) N-말단 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인) - C-말단;
(11) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(12) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - 공자극 도메인 - C-말단;
(13) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(14) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(15) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(16) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(N-SKI 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(17) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(N-SKI 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(18) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(19) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단;
(20) N-말단 - 신호 기전 조절 인자(FKBP12 또는 이의 단편) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(사이클로필린 A) - 자가-절단성 펩타이드 - 신호 기전 조절 인자(SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인) - 자가-절단성 펩타이드 - 시그널 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 힌지 - 막관통 도메인 - 공자극 도메인 - 1차 신호전달 도메인 - C-말단.
이때, 상기 (1) 내지 (20)의 식에서, 항원 결합 도메인, 힌지, 막관통 도메인, 공자극 도메인, 1차 신호전달 도메인, 자가-절단성 펩타이드 및 신호 기전 조절 인자는 상술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 (1) 내지 (20)의 식에서, 항원 결합 도메인은 CD19에 특이적인 scFv, Her2에 특이적인 scFv, PSMA에 특이적인 scFv, CD43에 특이적인 scFv, CD47에 특이적인 scFv 일 수 있으며, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된 것일 수 있고, 공자극 도메인은 도메인은 CD137(4-1BB)로부터 유래된 것일 수 있으며, 1차 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된 것일 수 있고, 상기 자가-절단성 펩타이드는 P2A로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 항원 결합 도메인(CD19 scFv), 막관통 도메인(CD8α), 세포내 신호전달 도메인(4-1BB 및 CD3ζ), 자가-절단성 펩타이드(P2A) 및 FKBP12를 포함하도록 설계하였으며, 이를 "19bbz#F"로 명명하였다. 그 외의 신호 기전 조절 인자 및 표기법은 상술한 바와 같다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"란, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 혼성체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 재조합, 합성이거나, 또는 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 전-전령 RNA(전-mRNA), 전령 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 합성 RNA, 합성 mRNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭된 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 합성 DNA 또는 재조합 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈-최적화된"란, 폴리펩타이드의 발현, 안정성 및/또는 활성을 증가시키기 위해 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내 코돈을 치환하는 것을 의미한다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 인자는 (i) 유기체, 유전자 또는 유전자 세트 내에서 코돈 편향 정도의 변형, (ii) 맥락을 포함하는 코돈의 체계적 변형, (iii) 그들의 탈암호 tRNA에 따른 코돈의 변형, (iv) 전반적으로 또는 삼중 중 하나의 위치에서 GC%에 따른 코돈의 변형, (v) 기준 서열, 예를 들어 천연 유래 서열과의 유사성 정도의 변형, (vi) 코돈 빈도 컷오프에서의 변형, (vii) DNA 서열로부터 전사된 mRNA의 구조적 특성, (viii) 코돈 치환 세트의 설계에 기반한 DNA 서열의 기능에 관한 사전 지식, (ix) 각각의 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적 변형, 및/또는 (x) 비논리적 번역 개시 부위의 단리된 제거를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같다. 상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지되고 이용가능한 임의의 다양한 확립된 기법을 이용하여 제조되거나, 조작되고, 발현되어 전달될 수 있다. 목적으로 하는 융합단백질을 발현시키기 위해, 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다.
상기 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오 파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 펩타이드 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
바람직하게는, 상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파보바이러스로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 렌티바이러스 벡터를 이용하였다.
상기 벡터는 항원 결합 도메인의 세포막 바깥쪽에 노출시키기 위해 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있으며, 이때, 상기 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열은 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열 앞에 삽입될 수 있다. 상기 시그널 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 이를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 서열일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같다. 상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 또는 파보바이러스 일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 면역세포를 제공한다. 이때, 상기 벡터는 상술한 바와 같다. 상기 면역세포는 T 세포 또는 자연살해세포일 수 있다.
상기 벡터를 면역세포 내로 도입하는 방법은 당해 분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 또는 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 하지만, 이에 제한하는 것은 아니다.
형질도입된 또는 형질감염된 면역세포는 벡터 도입 후, 탈체에서 증식된다. 일 구체예에서, 형질감염된 면역세포는 증식하도록 최소한 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 동안 배양될 수 있으며, 바람직하게는 12일 내지 14일 동안 배양될 수 있다.
상기 면역세포에서 벡터가 잘 도입되었는지 확인하는 방법은 예로서, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학적 검정, 예를 들면, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 예를 들면, 예로서 면역학적 방법(가령, ELISAs 및 웨스턴 블롯)에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
상기 융합단백질이 면역세포에서 발현되는 경우, (iv)의 자가-절단성 펩타이드로 인해 세포질에서 키메라 항원 수용체(CAR)에 해당하는 부분인 (i) 내지 (iii)에서 신호 기전 조절 인자(예, FKBP12 또는 이의 단편)가 분리되고, 키메라 항원 수용체의 경우 세포막에 고정되어 세포외 항원을 인지하고, 세포 내로 신호를 전달할 수 있다. 또한, 신호 기전 조절 인자, 예를 들어, FKBP12는 TGFβR1과 결합하여 TGF-β의 신호전달 경로를 차단할 수 있다.
IRES를 포함하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
이때, 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 더 포함될 수 있다.
상기 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인 및 신호 기전 조절 인자는 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용한 용어, "IRES"는 internal ribosome entry site의 약자이다. 상기 IRES는 두가지 유전자를 동시에 발현시키고자 이용하는 핵산이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터를 제공하는 것이다. 이때, 상기 벡터 및 이에 포함되는 구성은 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스를 제공하는 것이다. 이때, 상기 바이러스 및 이에 포함되는 구성은 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 면역세포를 제공한다. 이때, 면역세포 및 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 상술한 바와 같다.
자가-절단 서열 또는 IRES를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; (iv) 신호 기전 조절 인자를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
이때, 상기 융합단백질은 (i) 항원 결합 도메인과 (ii) 막관통 도메인 사이에는 스페이서를 더 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 신호 기전 조절 인자는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질 일 수 있다. 이때, 상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 TNFR/TLR 수용체 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 TNFR/TLR 수용체 경로에 위치한 단백질은 TLR4 세포내 도메인(이하, TLR4 세포내 도메인을 T라 함)일 수 있다.
이때, 상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질은 γc(이하, γc를 γ)일 수 있다.
이때, 자가-절단성 펩타이드를 포함하지 않는 경우에는 신호 기전 조절 인자가 CAR에 결합된 상태로 세포내 신호를 조절할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 상술한 바와 같다. 상기 벡터는 항원 결합 도메인의 세포막 바깥쪽에 노출시키기 위해 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있으며, 이때, 상기 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열은 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열 앞에 삽입될 수 있다. 상기 시그널 펩타이드는 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스를 제공한다. 상기 바이러스는 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 면역세포를 제공한다. 이때, 면역세포는 상술한 바와 같다.
외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역세포
본 발명의 또 다른 측면은, 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 면역세포를 제공한다.
이때, 상기 면역세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 또한, 상기 면역세포는 형질전환된 T 세포 또는 NK 세포 일 수 있다. 이때, 형질전환된 T 세포는 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포일 수 있다.
상기 신호 기전 조절 인자는 상술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 신호 기전 조절 인자는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4 단백질의 C-MH2 도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편; SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; 및 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 또는 이의 단편; TC21 또는 이의 단편; 및 RhoG 또는 이의 단편; NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; HRAS 또는 이의 단편; 및 SOCS1 단백질의 C-말단 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이때, 상기 신호 기전 조절 인자는 세포질 내에서 작동하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포질 내에서 발현되며, 상기 신호 기전 조절 인자는 세포밖으로 분비되지 않는다. 따라서, 상기 신호 기전 조절 인자는 면역세포 내에서 위치하며, 세포내 신호 기전을 조절할 수 있다.
또한, 신호 기전 조절 인자 두 개 또는 세 개를 발현할 수 있다.
CAR-T 면역세포
키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)는 암세포 표면에 발현하는 특징적인 항원을 인지하는 단클론항체의 scFv(single chain variable fragment) 염기서열을 기반으로 만들어진다. 따라서 이를 발현하는 T 세포는 종양 항원과 특이적으로 결합하게 되어 종양 세포만을 제거할 수 있게 된다. CAR의 구조를 보면 종양 항원과 결합하는 수용체 부위, 수용체가 항원과 결합한 후 T 세포를 활성화시키는 공자극 인자(co-stimulatory domain), 그리고 이 두 부위를 연결하는 스페이서 및 막관통 도메인으로 이루어져 있다.
이때, 상기 CAR-T 세포는 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구체예로, 상기 형질전환된 CAR-T 면역세포는 상술한 (i) 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 스페이서 및 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) 자가-절단성 펩타이드을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 형질도입하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 형질전환된 면역세포는 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 스페이서 및 막관통 도메인; (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 신호 기전 조절인자를 포함하는 제2 폴리뉴클레이드를 각각 형질도입하는 방식으로 제조할 수 있다. 이때, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 하나의 바이러스를 통해 도입될 수 있으나, 서로 다른 바이러스를 통해서도 면역세포에 도입될 수 있다.
이때, 상기 신호 기전 조절인자는 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질, b) 이뮤노필린, c) 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질, d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질, e) 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질 및 f) 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 상기 신호 기전 조절인자 및 조합에 대한 사항은 상술한 바와 같다.
일 실시예로서, 상기 면역세포는 이뮤노필린을 과발현하는 세포일 수 있다. 바람직하게, FKBP12 또는 이의 단편 및/또는 사이클로필린 A를 과발현하는 CAR-T 세포 일 수 있다.
이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 적재한 벡터를 상술한 다양한 방법을 이용하여 도입할 수 있다.
TCR-T 면역세포
상기 TCR-T 세포는 T 세포 수용체 발현 T 세포(T cell receptor-engineered T cell, TCR-T)를 의미한다. TCR-T는 종양 세포 표면에 MHC 분자와 같이 제시되는 종양 특이적인 항원 펩타이드를 인지하는 T 세포 수용체의 유전자를 T 세포내에 도입하여, 특정 종양 항원을 인지하여 공격대상을 선별하는 TCR이 T 세포 표면에 발현하도록 제조하여 이를 증식한 다음 생체내로 투여하는 면역조절 세포치료제이다.
TCR은 일반적으로 2개의 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 TCR의 α-사슬, TCR의 β-사슬, TCR의 γ-사슬, TCR의 δ-사슬, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기와 같은 TCR의 폴리펩타이드 사슬들은 당해 분야에 공지되어 있다. 구체적으로, TCR-T는 항원 인지 가능한 α-사슬 및 β-사슬을 발현한 것일 수 있다.
예를 들어 질환-관련 항원 또는 그의 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기를 면역학적으로 인식할 수 있는 한, α-사슬 또는 β-사슬은 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, TCR 유전자를 T 세포 내로 도입방법으로 바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 이때, 바이러스 벡터는 상술한 바와 같다.
일 구체예로, 상기 형질전환된 TCR-T 면역세포는 상술한 (i) TCR의 α-사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) TCR의 β-사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iv) 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 형질도입하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 형질전환된 면역세포는 (i) TCR의 α-사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 자가-절단성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) TCR의 β-사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 신호 기전 조절인자를 포함하는 제2 폴리뉴클레이드를 각각 형질도입하는 방식으로 제조할 수 있다. 이때, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로 다른 바이러스를 통해 면역세포에 도입될 수 있다.
이때, 상기 신호 기전 조절인자는 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질, b) 이뮤노필린, c) 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질, d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질, e) 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질 및 f) 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 상기 신호 기전 조절인자 및 조합에 대한 사항은 상술한 바와 같다.
일 실시예로서, 상기 면역세포는 이뮤노필린을 과발현하는 세포일 수 있다. 바람직하게, FKBP12 또는 이의 단편 및/또는 사이클로필린 A를 과발현하는 TCR-T 세포일 수 있다.
이때, 상기 폴리뉴클레오티드를 형질도입하는 방법은 상술한 바와 같이 상기 폴리뉴클레오티드를 적재한 벡터를 상술한 다양한 방법을 이용하여 도입할 수 있다.
외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역세포를 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 상기 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포일 수 있으며, 바람직하게는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포 또는 이들이 일정 비율로 혼합된 세포일 수 있다. 또한, 상기 면역세포는 상술한 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 포함하는 벡터를 형질도입하여 제조된 것일 수 있다.
이때, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종, 신장암, 흑색종, 다발 골수종, 뇌암, 골육종, 교모세포종, IgG-opsonized tumor, 림프종, 신경종, 중피종 및 식도암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
암의 종류는 항원 결합 도메인에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예로, CD19-특이적 면역세포는 혈액암 치료에 이용될 수 있다. 바람직하게 상기 혈액암은 백혈병일 수 있다.
항원 결합 도메인이 암에 특이적으로 과발현되는 단백질에 특이적으로 결합할 경우, 상기 암을 표적으로 할 수 있다. 특히, 고형암에 특이적으로 과발현되는 단백질을 인지할 경우, 다양한 고형암 치료에 적용될 수 있다. 일 구체예로, Her2-특이적 CAR-T 세포는 Her2 과발현된 암의 치료에 활용될 수 있으며, 특히, Her2(+)인 유방암에 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, PSMA-특이적 CAR-T 세포는 전립선암 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.
본원에 기재된 인간 환자에서 면역 요법을 위한 "약학 조성물"은 면역 세포를 포함한다. 세포 이외에 면역 반응을 추가로 개선시킬 수 있는 다른 약학적으로 허용가능한 염, 담체, 부형제, 비히클 및 기타 첨가제 등이 약학 조성물에 첨가될 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제제, 재료 또는 조성물, 예컨대, 면역세포 세포의 양을 지칭한다. 일 구체예로, CAR-T 세포는 1회 투여시 1X102 내지 1X1010, 1X103 내지 1X108, 1X104 내지 1X106 세포를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 세포치료제 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 뇌내, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역세포를 이용한 암 치료 또는 예방 방법
본 발명의 또 다른 측면은 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 면역세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
이때, 신호 기전 조절 인자는 상술한 바와 같다. 또한, 면역세포는 상술한 바와 같다. 특히, 상기 면역세포는 CAR-T 세포 및 TCR-T 세포를 포함할 수 있다.
외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 면역세포의 용도
본 발명의 또 다른 측면은 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 면역세포의 암 치료 또는 예방용 용도를 제공한다.
이때, 신호 기전 조절 인자는 상술한 바와 같다. 또한, 면역세포는 상술한 바와 같다. 특히, 상기 면역세포는 CAR-T 세포 및 TCR-T 세포를 포함할 수 있다.
이하 일 실시예에서 제조된 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 CAR-T의 특징에 대해 상세히 설명한다.
신호 기전 조절 인자가 발현되는 CD19-타겟팅 CAR-T 세포의 제조(도 2 및 도 54)
일반적으로 임상에서 유용성이 확인되어 현재 가장 보편적으로 사용되고 있는 2nd 세대 CAR 형태의 CAR-T 세포를 대표하는 "CD19-특이적 CAR-T(19bbz)"를 제조하여 실험에 이용하였다. 또한, CAR-T 세포안에 과발현 시켰을 때, CAR-T 세포의 항암기능을 향상시킬 수 있을 것으로 예측되는 면역-조절 세포질 소분자 단백질(immune-regulatory cytoplasmic small-sized protein)(이하, 신호 기전 조절 인자)을 상기 CAR 유전자와 함께 렌티바이러스를 통해 발현시켰다. 구체적인 예로서, 두 개의 이뮤노필린(immunophilin)인 FKBP12(12kDa), 사이클로필린 A(18kDa)을 각각 발현하는 두 종류의 CAR-T 세포(19bbz#F, 19bbz#C)를 각각 제조하였다.
본 발명자는 다양한 억제성 면역관문 분자의 신호 전달 경로를 조절할 수 있는, 유용한 작은 크기의 면역 조절자(small-sized immune regulator)로 작동하는 신호 기전 조절 인자를 설계하였다. 일 실시예로서, 다양한 억제성 면역관문 분자에 의한 신호 전달(signaling)의 상위단계에서 공통적으로 일어나는 티로신 탈인산화를 효과적으로 억제할 것으로 예측되는 단백질을 고안하였다. 구체적으로, 작은 사이즈의 도메인(small sized-domain)으로서 SHP-2의 N-말단 SH2 도메인(12kDa)을 CAR-T 세포질에 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#S2)를 제조하였다.
SHP2 단백질(Src homology-2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2)은 SHP1 단백질과 함께, 면역세포를 무력화하는 100 여종의 다양한 억제성 면역관문 신호를 매개하는 데 공통적 인자로서 중요한 역할을 담당하고 있다. 이미 1998년에 밝혀진 SHP2 단백질의 결정구조 데이터로부터 티로신 탈인산화 효소인 SHP2 단백질의 N-말단 SH2 도메인이 실제 “촉매활성부위(catalytic active site)의 접근성(accessibility)을 차단하는 일종의 병마개(lid)”역할을 하고 있음에 착안하여, 본 발명자는 작은 크기의 N-말단 SH2 도메인을 세포질에 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#S2)를 제조하였다.
아울러, 이러한 다른 면역활성기전을 보유한 작은 크기의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)를 제조하였을 때, 이들 다른 기전의 조절자들의 상보적 시너지를 통해 면역억제 환경에서도 항암활성을 발휘할 수 있는 Super-armed CAR-T 세포를 제조할 수 있는지 확인하였다.
FACS 분석에서 나타난 바와 같이, 렌티바이러스 형질도입 후 4일째의 CAR-T 세포에 대하여 FITC가 표지된 재조합 CD19 단백질의 결합을 통해 세포 표면상의 CAR 발현을 확인하였을 때, 모든 CAR-T 세포에서 CAR가 의도한 바와 같이 만들어질 수 있음이 확인되었다. 일반적으로 렌티바이러스 벡터를 통한 유전체 전달은 전달하려는 형질전환 유전자(transgene) 크기가 클수록 그 효율성이 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세 종류의 신호 기전 조절 인자 유전자를 CAR 유전자와 함께 전달하는 렌티바이러스 형질도입의 경우, 한 종류의 조절 인자(modulator)를 CAR 유전자와 전달하는 형질도입과 비교하여, 상대적으로 낮은 비율의 형질 도입율을 보이는 것으로 관찰되었다. 그러나, 이후 세포 배양을 통해, 19bbz#FCS2의 경우, CAR(+)-T 세포의 비율은 40-50% 수준까지 도달하는 것으로 관찰되었다.
본 실시예에서 관찰된 바와 같이, 각 CAR-T 세포 제조상의 형질 도입율의 차이를 보정하기 위하여, in vitro 기능 분석 수행 직전에 형질도입을 하지 않은 T 세포(non-transduction mock T cells)(즉, 동일한 donor의 말초혈액세포유래 T 세포로서 렌티바이러스만 처리하지 않고 동일 배양공정을 통해 얻어진, CAR(-)-T 세포)를 적절히 추가하여, 모든 CAR-T 세포 시료에 있어서, “T 세포수” 및 “Total T 세포수”를 동일하게 조정한 다음에 암세포와 반응을 수행하였다.
CD19-특이적 CAR-T 세포의 CAR-T 세포의 항암 효과(II): In vivo (도 7)
CAR-T 세포_19bbz#F, CAR-T 세포_19bbz#C, CAR-T 세포_19bbz#M, CAR-T 세포_19bbz#N, CAR-T 세포_19bbz#S1, CAR-T 세포_19bbz#S2, CAR-T 세포_19bbz#TC, CAR-T 세포_19bbz#RG 및 CAR-T 세포_19bbzT의 항암효능을 평가하였다.
그 결과, 도 7에서 나타났듯이, 2 세대 대조군 CAR-T 세포(19bbz)를 처치한 군은 세가지 용량 모두에서 급격히 진행되는 종양의 성장을 효과적으로 저지하지 못하는 것으로 나타났다.
반면, 세포 신호 기전 조절로서 이뮤노필린인 FKBP12를 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#F)를 처치한 군 및 이뮤노필린인 사이클로필린 A를 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#C)를 처치한 군은 종양진행을 억제하는 우수한 효능이 관찰되었다. 이러한 결과는 이뮤노필린의 과발현이 면역세포의 항암활성을 배가하는 데 매우 유용한 기술임을 시사한다.
또한, TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 세포질 면역 조절자(Cytoplasmic immune modulator)로서, FKBP12을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#F)를 처치한 군과, SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#M)를 처치한 군과, N-SKI를 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#N)를 처치한 군에서도 종양진행을 억제하는 우수한 효능이 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과는 면역억제 사이토카인의 신호전달 경로를 차단할 수 있는 조절인자를 과발현하는 것이 면역세포의 항암활성을 배가하는 데 매우 유용한 기술임을 시사한다.
다양한 면역억제체크포인트 신호전달 경로를 차단할 수 있는 세포질 면역 조절자로서, SHP1 단백질의 N-SH2 도메인을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#S1)를 처치한 군과, SHP2 단백질의 N-SH2 도메인을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#S2)를 처치한 군에서도 종양진행을 억제하는 우수한 효능이 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과는 관련한 조절인자의 과발현을 통해서 다양한 면역억제체크포인트 신호를 매개하는 티로신 탈인산화 효소를 억제하는 기술이 면역세포의 항암활성을 배가하는 데 매우 유용한 기술임을 시사한다.
암세포의 항원손실을 유발하는 트로고사이토시스를 억제할 수 있는 Cytoplasmic immune modulator로서, TC21을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#TC)를 처치한 군과, RG를 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#RG)를 처치한 군에서도 종양진행을 억제하는 우수한 효능이 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과는 관련한 조절인자의 과발현을 통해서 트로고사이토시스를 억제하는 기술이 면역세포의 항암활성을 배가하는 데 매우 유용한 기술임을 시사한다.
면역 증강 신호전달계에 속하는 조절인자의 일례로서, TIR 도메인(Toll/IL-1 Receptor homology domain)을 보유한 TLR4 단백질의 세포내 도메인을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbzT)를 처치한 군에서도 종양진행을 억제하는 우수한 효능이 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과는 면역 증강 신호 전달을 매개하는 조절인자를 과발현하는 기술이 면역세포의 항암활성을 배가하는 데 매우 유용한 기술임을 시사한다.
CD19-특이적 CAR-T 세포의 CAR-T 세포의 항암 효과(I): In vivo (도 49 및 도 50)
CAR-T 세포_19bbz와 CAR-T 세포_19bbz#F의 항암효능을 여러 용량(1x106, 3x106, 1x107)에서 평가하였다.
그 결과, 도 50에서 나타났듯이, 2 세대 대조군 CAR-T 세포(19bbz)를 처치한 군은 급격히 진행되는 종양의 성장을 효과적으로 저지하지 못하는 것으로 나타났다. 반면, 세포질 면역 조절자로서 이뮤노필린 FKBP12를 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#F)를 처치한 군에서 CAR-T 용량의존적인 항암효과가 관찰되었다. 특별히 CAR-T 세포(19bbz#F)를 고용량(1x107) 처치한 군에서 급격히 성장하는 종양을 억제하는 탁월한 항암효과가 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과는 이뮤노필린 FKBP12의 과발현이 면역세포의 항암활성을 배가하는 데 매우 유용한 기술임을 시사한다.
FKBP12와 TGF-β 수용체간의 결합(도 51 내지 도 53)
도 51은 세 종류의 TGF-β 1형 수용체와 FKBP12간 결합체의 Protein Co-crystal 구조연구에서 밝혀진 "수용체의 키나제 도메인"에 결합한 "FKBP12"를 보여주는 도면이다. 상기 도면은 다음의 단백질 데이터 뱅크 자료에 근거하고 있다: TGFβR1(PDB ID: 1b6c), ACVR1A(PDB ID: 3h9r) 및 BMPR1B(PDB ID: 3mdy). 회색톤의 표면 구조는 TGF-β 1형 수용체의 키나아제 도메인을 나타내며, 빨간 리본식 뼈대 구조는 FKBP12 단백질에 해당한다. 도 51에서 나타낸 바와 같이, 이들 세 가지 TGF-β 1형 수용체 단백질에서 FKBP12와 결합하는 부위는 구조적으로 매우 잘 보존되어 있다. 이것은 이제까지 알려진 총 일곱 종의 TGF-β 1형 수용체들을 통한 신호전달이 모두 공통적으로, FKBP12 결합에 의하여 억제되고 있는 그 작용기전을 잘 설명하는 것이다. TGF-β 2형 수용체에 의하여 인산화되어야 하는 부위를 공통적으로 FKBP12 가 결합하여 막고 있는 형태이다.
도 52는 세 종류의 TGF-β 1형 수용체와 FKBP12간 결합체의 Protein Co-crystal 구조연구에서 밝혀진 단백질 결합에 관여하는 FKBP12의 방향성 아미노산 4개를 표시한 도면이다. 이들 결합에 가장 중요한 역할을 담당할 것으로 추정되는, FKBP12의 방향성 아미노산들은 27번째 타이로신과 47번째 페닐알라닌과 60번째 트립토판과 100번째 페닐알라닌이며, 그들의 위치는 삼차원 구조상 매우 잘 보존되어 있다.
도 53은 FKBP12 단백질의 아미노산서열상에서 TGF-β 1형 수용체 결합에 중요한 방향성 아미노산(27번째 타이로신과 47번째 페닐알라닌과 60번째 트립토판과 100번째 페닐알라닌)의 위치를 표시한 것이다.
면역형광분석에 의한 CD19-특이적 CAR-T 세포의 CAR 발현 관찰(도 55)
CAR-T의 경우, 대상 암세포를 선별하는 기능은, 암항원을 인지할 수 있도록 특이성을 의도적으로 부가한 CAR 분자의 "표면발현양"에 의존한다. 그러나 적절한 수준 이상으로 지나치게 CAR 발현이 높게 유도되는 경우, "항원(Ag) 부재하에서 과도한 CAR clustering"이 일어나고 응집(Aggregation)을 형성한다. 따라서, CAR가 세포 표면상에 균일한 발현 분포를 보이지 않고, 뭉침과 부재를 반복하는 discontinuity를 보인다(punctate phenotype). 이 현상이 결국 항원-비의존적인 T 세포 신호 전달을 유발하여, 항암활성이 저해된 탈진된 T 세포 표현형(Exhausted T Cell phenotype)을 나타낸다고 알려진 바 있다.
본 실시예에서는 CAR 유전자와 세포질 면역 조절 인자 유전자를 렌티바이러스를 이용해 동시에 전달하였을 때, 항원 발현양이 과도하여“항원 부재하에서 과도한 CAR clustering”이 일어나, CAR 분포형태가 불균일한 비정상적 분포특성(punctate phenotype)이 유도되는지를 확인하였다. 이를 위해, CD19-특이적 CAR에 결합하는 Cy3이 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체를 사용한 면역 형광염색 분석을 수행하였다. 염색은 Initial stimulation 후 7 일째 배양에서 얻어진 CAR-T 세포에 대하여 수행하였다. 따라서, 충분히 CAR 발현이 안정화된 상태의 분포를 반영한다고 생각되며, 결과에서 보듯이, 제조된 각 CAR-T에서 세포표면에 발현된 CAR 분자가 세포 표면에 균일하게 발현되고 있음을 확인하였다.
면역형광분석에 의한 CAR-T 세포와 타겟종양세포간의 CAR-매개 상호작용 관찰(도 56)
본 실시예에서는 제조된 CAR-T가 CD19를 발현하는 암세포와의 상호작용을, CAR-T 세포 표면의 CAR 분자를 통해 수행하는지를 확인하기 위하여, eGFP를 발현하여 녹색 형광을 띄는 Daudi 세포와 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스상에서 Cy3이 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체를 이용한 CAR 분자의 면역염색을 수행하여 형광현미경으로 관찰하였다.
도면에서 나타난 바와 같이, CAR-T 세포 표면에 존재하는, Cyanine 3 형광(red)으로 염색된 CAR 분자를 통해서, eGFP 형광을 띄는 타겟종양세포(green)를 인식하고 긴밀한 접촉을 이루고 있음을 확인하였다. 또한, CAR-T 세포와 긴밀한 상호작용을 진행하는 Daudi 세포의 녹색형광은, 자유로운 Daudi 세포의 녹색 형광에 비하여 다소 밝기가 감소된 것이 관찰되었다.
CAR-T 세포의 아형 분석(도 57)
최근 환자를 대상으로 한 CAR-T 세포의 임상적 적용 및 비임상 동물효력모델을 통해서 밝혀진 사실은, 종양 재발을 방지하기 위해서는 CAR-T 세포 이식후에 유도된 항암면역의 지속성이 보장되어야 한다는 점이다. 이러한 이유로, CAR-T 세포 아형 분석이 이루어지면서, 생체내에서 장기적으로 증식할 수 있는 T 세포 줄기세포능(stemness)을 보유한 줄기세포 유사 기억 T 세포(T memory stem cell, Tscm, CD45RA+CCR7+), 중심 기억 T 세포(central memory T cell, CD45RA-CCR7+)와 같은 특정 T 세포 아형이 특히 중요하다는 사실이 밝혀진 바 있다. 따라서, 항암 치료용 CAR-T 세포를 제조하는 과정에서, IL-2 보다 IL-7, IL-15, IL-21 등을 사용하여 이와 같이 줄기세포능이 높은 세포를 유도하는 기술에 대한 관심이 높아지게 되었다.
최근 문헌을 보면, 친화력을 조절한 어떠한 GD2-specific CAR-T 세포(HA-28z)의 경우에, 의도했던 바와 다르게 T 세포 탈진이 유도되어서 T 세포 아형 분석을 수행하였을 때, T 세포 줄기세포능이 상당히 감소된 특징을 보이는 것으로 밝혀진 바 있다.
따라서, 일 실시예에서 제조한 CAR-T 세포가 세포질 면역 조절자의 과발현을 통해 높은 Effector T 세포활성을 보유하면서도, 항암면역의 장기적 지속성에 중요한 T 세포 줄기세포능을 잘 유지할 수 있는지를 확인하였다. 이를 위해서, 제조한 CAR-T 세포의 종양세포 살해능(tumor cell killing activity) 및 사이토카인 분비(cytokine release) 활성, T 세포 이동성(motility) 등의 기능적 분석을 수행하고, 이와 병행하여 T 세포 줄기세포능을 확인하기 위해, 표현형 분석을 수행하였다.
이를 위해, 동일한 도너(donor)에서 유래한 T 세포를 렌티바이러스 벡터와의 접촉만 이루어지지 않았을 뿐 동일한 이뮤노비드 자극(immunobead stimulation), T 세포 증식 배양과정을 거친 NTD(Non-transduced control T cells)를 음성 대조군으로 하였다. 상기 음성 대조군 T 세포의 경우에는 줄기세포능(renew potential)이 가장 적은, 분화된 세포에 해당하는 효과 집단(effector population)이 절반정도(49%)에 해당하고, Tscm 아형이 47% 정도인 것으로 나타났다.
반면, 2 세대 CAR만 발현하는 Control CAR-T(19bbz)의 경우, Tscm 비율이 70% 정도로서 NTD 보다 20% 이상 높게 유지되는 것으로 나타났다. SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#S2)의 경우는, 2 세대 CAR만 발현하는 Control CAR-T 세포(19bbz)와 가장 유사한 T 세포 집단(population)을 갖고 있는 것으로 나타났다.
반면, FKBP12 또는 사이클로필린 A와 같은 이뮤노필린 단백질을 과발현시킨 CAR-T 세포(19bbz#F, 19bbz#C)의 경우, Tscm 비율이 76%로서 2세대 Control CAR-T 세포(19bbz)보다 6% 정도 높게 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 두 종류의 이뮤노필린과 SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 동시에 발현하는 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)의 경우, Tscm 비율이 80% 정도로서 2세대 Control CAR-T보다 10% 이상 높게 유지되는 것으로 나타나 가장 높은 줄기세포능을 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에서 도입한 세포 신호 기전 조절 인자의 과발현이, CAR-T 세포의 항암효능에 바람직한 성질인 T 세포의 줄기세포능(stemness)의 감소를 동반하지 않음을 확인하였다.
종양 세포에서 CD19 발현을 분석(도 58)
제조한 CD19-특이적 CAR-T의 in vitro 종양세포 살해능 및 사이토카인 분비 활성 평가에 필요한 CD19 발현 종양 세포주들을 배양하였다. 또한, CD19의 발현양을 비교하기 위해 APC가 표지된 마우스 항-CD19 항체로 염색한 후 유세포 분석을 통해 분석하였다.
그 결과, CD19 발현양을 평균 형광 강도로 비교하였을 때, Daudi의 경우가 Nalm6 보다 대략 2배 정도 CD19 항원의 발현이 높은 것으로 나타났다. 또한, Nalm6은 K562-CD19 보다 CD19 항원의 발현이 대략 3배 정도 높은 것으로 나타났다(CD19 발현 수준: Daudi > Nalm6 > K562-CD19).
특히 Daudi의 경우,　에메랄드 녹색 형광 단백질(Emerald green fluorescent protein, eGFP) 유전자를 발현하고 있어서 형광 현미경으로 분석시 표적세포로 사용되었다. 뿐만 아울러 반딧불 루시퍼라아제(firefly luciferase, Fluc) 유전자를 발현하고 있어서, 생물발광(Bioluminescence) 측정을 통한 in vitro 종양세포 살해 활성 분석에 사용되었다. 이외에 앞서 실시되었던 혈액암 모델의 in vivo CAR-T 효능 평가에서도 표적세포로 Daudi-Fluc-Puro 세포를 사용하였다.
CD19-특이적 CAR-T 세포 관련 그 외의 여러 in vitro 기능 분석 실험에서는, CD19 발현이 없는 변형되지 않은 K562 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 또한, 세포의 크기가 T 세포보다 훨씬 커서 현미경 상에서와 유세포 분석 상에서 T 세포와 구분이 용이한 K562-CD19를 주로 실험에 사용하였다.
CAR-T에서 FKBP12, 사이클로필린 A 및 SHP2 단백질의 N-말단 SH2 도메인의 발현의 수준을 확인(도 59 및 도 60))
렌티바이러스 벡터 형질도입를 통해서 세포내 유입된 면역 조절자를 코딩하는 외부유전자가 실제 각 CAR-T 세포 내에서 해당 세포내 단백질과 비교하여 과발현 된 정도를 확인하였다. 구체적으로, qRT-PCR 분석과 항체를 이용한 면역블랏 분석을 수행하였다.
도 60에 명시한 바와 같이, 앞서 발표된 T lymphocyte proteomic data(Hukelmann et al., Nature Immunology, 2015)를 통해 밝혀진 T 세포내 각 단백질의 양은, FKBP12는 1,623,586 카피/세포, 사이클로필린 A는 28,065,984 카피/세포, SHP2는 23,530 카피/세포이다. 즉, Cyclophilin A>> FKBP12 >> SHP2 순으로 카피가 많으며, 이들 중 억제성 면역체크포인트들의 신호에 관여하는 SHP2 단백질의 경우가 가장 소량 존재하는 것으로 확인되었다.
따라서, CAR 유전자와 동일한 프로모터를 통해 신호 기전 조절 인자가 발현되었음에도 불구하고, 신호 기전 조절 인자의 발현 정도는 상이하였다. 구체적으로, FKBP12를 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#F) 경우, FKBP12가 내인성 발현(endogenous expression) 대비 6배 정도 많이 발현되었다. 또한, 사이클로필니 A를 과발현하는 CAR-T세포(19bbz#C) 경우, 사이클로필린 A가 내인성 발현 대비 2배 정도 많이 발현되었다. 반면, SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#S2) 경우에는 SHP2의 N-말단 SH2 도메인이 내인성 SHP2 발현 대비 38배 정도 많이 발현되는 것으로 확인되었다.
상기 언급한 바와 같이, 내인성 단백질(endogenous protein)의 양적 차이가 존재한다. CAR(+)-T 세포 비율이 40% 정도인 CAR-T 세포의 시료를 분석하였다. 면역블랏 이미지 상에서, 내인성 단백질 발현 수준 대비 상대적 과발현을 정성적으로 분석하였을 때, 그 분석값이 상이하였다. 즉, SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#S2)의 경우, 과발현된 양이 비교적 확실하게 관찰되었다(endogenous SHP2 양 대비 30배 이상). 또한, FKBP12를 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#F)의 경우에는, 그보다 낮은 수준으로서 내인성 FKBP12 대비 2-7배 범위수준의 과발현이 관찰되었다. 사이클로필린 A를 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#C) 경우에는 내인성 단백질 수준이 너무 많고, 그 차이가 일반적 분석오차 범위안에 놓이게 되어 정량적 분석이 용이하지 않은 것으로 나타났다.
세 종류의 신호 기전 조절 인자를 동시에 발현하는 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)의 경우, FKBP12 과발현 정도는 CAR-T 세포(19bbz#F)와 유사한 수준인 것으로 관찰되었다. 그러나, 세 차례의 P2A 자가절단 활성에 의존하는 SHP2의 N-말단 SH2 도메인의 과발현 정도는, SHP2의 N-말단 SH2 도메인의 과발현이 한 차례의 P2A 자가절단 활성에 의존하는 CAR-T 세포(19bbz#S2)에서 관찰된 발현량의 1/3 수준인 것으로 관찰되었다.
항원 자극시 CAR-T 세포에서 분비되는 IFNγ, TNFα 및 IL-2 측정 결과(도 61 내지 도 63)
일반적으로 CAR-T의 항암효과는 i) CAR-T 가 항원-양성 타겟 종양 세포(Ag-positive target tumor cell)와 면역 시냅스(Immune Synapse)를 형성한 후 분비하는 퍼포린(perforin)/그랜자임 그래뉼(granzyme granule)에 의존한 종양 세포 살상 활성, ii) 활성화된 CAR-T 세포 표면에서 발현이 증가된 Fas 리간드에 의존한 종양 세포 살상 및 방관자 살상(Bystander killing) 활성, 및 iii) 사이토카인 생성을 통해 이루어지는 간접적인 기전(이차적 기전)에 의거한 종양 세포 살상 활성에 기인하는 것으로 알려져 있다.
활성화된 CAR-T에서 분비되는 중요한 사이토카인 중 하나인 IFNγ는 다음과 같은 효과를 나타낸다. i) 기질세포(Stroma cell) 표면에 IFNγ 수용체 발현을 증가시켜서, 증가된 IP10(CXCL10), MIC(CXCL9) 등의 chemokine 분비를 유도하여 종양 조직으로의 T 세포, NK 세포, DC, 단핵구/마크로파지 등의 면역 세포 침투(immune cell infiltration)를 증가시키는 효과를 유발한다. 또한, ii) 직접적으로 종양 기질 세포 파괴(tumor stroma cell destruction)를 유발하기도 한다. 또한, iii) 종양 세포에 작용하여 증식을 억제하는 성장 억제 효과(Cytostatic effect)를 보이는 것으로 알려져 있다. 아울러, iv) 면역 억제상태의 종양 연관 마크로파지(tumor-associated macrophage) 및 종양 위치 T 세포(tumor-resident T cell) 들의 분극화(polarization)을 유도한다. 이로서, 종양 세포를 살해할 수 있는 항암활성을 간접적으로 부여하고, 이들을 통해 이차적 항암효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.
활성화된 CAR-T에서 분비되는 또 다른 중요한 사이토카인인 종양 TNFα(Tumor necrosis factor alpha)는 i) 종양 세포 표면에 발현된 TNFα 수용체를 통해 직접적으로 종양 세포 살해능을 유도한다. 또한, ii) TNFα는 조절 T 세포(Regulatory T cells)를 억제하여 효과기 T 세포(effector T cells) 및 NK 세포를 활성화시킨다. 또한, iii) TNFα는 내피 세포(endothelial cell)에 작용하여 종양 미세혈관계 붕괴(tumor microvasculature collapse)를 유발하고, 신생혈관생성을 억제하는 작용을 한다. 또한, iv) TNFα는 항암 활성이 없는 M2 마크로파지를 항암 활성을 갖는 M1 마크로파지로 분극화(polarization)하는 유도하는 활성을 갖는다. 또한, v) TNFα는 호중구(neutrophils)와 단핵구(monocytes)를 종양 조직으로 유인하고 활성화하여 항암활성을 갖도록 하는 작용을 한다. 마지막으로, vi) TNFα는 암조직에 있는 호산구 유사 세포(eosinophilic-like cells)에 의한 IL-13 발현을 억제하여 단핵구가 면역억제 세포로 분화되는 것을 방해하는 작용을 갖는 것으로 알려져 있다.
활성화된 CAR-T에서 분비되는 또 다른 중요한 사이토카인인 IL-2(Interleukin-2)는 현재 항암면역치료에서 이미 성공적으로 사용되고 있다. 이와 같이, T 세포 증식을 증진시키는 잘 알려진 활성 이외에도 NK 세포 및 림포카인-활성화 킬러 세포(lymphokine-activated killer cells)의 세포용해성 활성(Cytolytic Activity)을 크게 증진시키는 역할을 통해서, 항암면역에 기여하는 것으로 잘 알려져 있다.
따라서, 본 실시예에서는 본 발명에 의해서 제조된 CAR-T(19bbz#F), CAR-T(19bbz#C), CAR-T(19bbz#S2), CAR-T(19bbz#FCS2)의 사이토카인 분비 활성이 기존의 2nd 세대 CAR-T의 활성 대비 우수한지 비교 평가하였다.
도면에서 보듯이, 세 종류 사이토카인(IFNγ(도 61), TNFα(도 62), IL-2(도 63))의 분비활성을 평가하였을 때, 모든 CAR-T 분석에서 공통적으로, 타겟 항원인 CD19를 발현하지 않는 K562 세포와 CAR-T를 24시간 동안 배양한 배양액 내에서는 유의한 수준의 사이토카인 분비가 감지되지 않았다.
반면, CAR-T의 타겟 항원인 CD19를 발현하도록 재조합한 K562-CD19 세포와 CAR-T를 24시간 동안 배양한 배양액내에서는 각 CAR-T 배양액에서 상당히 많은 양의 사이토카인이 분비되었음을 관찰하였다.
의도한 바와 같이, T 세포의 기저 면역활성에 관여되는 것으로 알려진 이뮤노필린을 과발현 시키거나, 면역 체크포인트 시그널에 의한 티로신 탈인산화(Tyrosine dephosphorylation)를 억제할 수 있는 SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현 시킨 CAR-T 세포(19bbz#F), CAR-T 세포(19bbz#C), CAR-T 세포(19bbz#S2)의 경우, 사이토카인 분비 활성에 있어서, 모두 기존의 Control CAR-T 세포(19bbz)보다 상대적으로 약간 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
흥미롭게도, 이러한 세 종류의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)의 경우에는 타겟 종양 세포 자극에 의존한 사이토카인 분비 활성이, 기존의 음성 대조군 CAR-T 세포(19bbz)에 비하여 월등히 향상된 활성을 나타냄을 확인하였다.
이제까지의 사람을 대상으로한 CAR-T 임상경험에 의하면, 고형암의 경우 혈액암보다 종양 부위로 접근이 어렵다. 설령, 종양 부위에 도달하더라도 여러 기전으로 면역 억제 종양 미세 환경(immune suppressive tumor microenvironment, TME)에서 방어되고 있다. 따라서, 이러한 TME에 존재하는 면역 억제 신호 하에서도 견딜 수 있는 Super-armed CAR-T를 설계할 필요가 있었다.
본 실시예의 결과에 의하면, CAR-T(19bbz#FCS2)는 면역억제 환경에서도 상당히 많은 양의 사이토카인을 분비함을 확인하였다. 따라서, 상기 CAR-T는 많은 양의 사이토카인을 분비함을 통해 종양내의 면역억제환경을 우호적 환경으로 전환시킬 수 있기 때문에, 적지 않은 항암효능을 발휘할 수 있을 것으로 보인다.
TGF-β1 존재 시, 항원 자극에 의해 CAR-T 세포에서 분비되는 IFNγ 및 TNFα 측정(도 64 및 도 65)
일반적으로, 암조직에 높은 농도로 존재하는 TGF-β는 T 세포 표면에 발현된 TGFβ 수용체(TGFβRI, TGFβRII)를 통한 면역-억제 신호를 통해, 암조직내에서의 T 세포 활성화 및 증식, 분화 등의 기능을 크게 저해할 수 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 마우스 실험에서 naive T 세포의 TGF-β 신호를 방해하면, 자가면역질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서, CAR-T 세포의 항암효능 배가를 위해 TGF-β 신호를 억제하더라도, 자가 면역의 위험성을 동반하지 않도록 하기 위해, 어느 정도는 약화된 형태의 TGF-β 신호가 작동할 수 있도록 설계하는 것이 바람직하다.
본 실시예에 사용된 TGF-β1의 농도 범위는 생체내에서 농도의존적으로 유의한 반응이 일어나는 half maximal effective concentration(EC50)가 0.04-0.2 ng/㎖ 임을 고려하였다. 또한, 병리적 환경에서 축적될 수 있는 고농도의 상한을 충분히 초과하도록 광범위한 구간으로 시험 농도를 설정하였다.
또한, 종양진행과정에서 암세포의 다양성(microheterogeneity of tumor cells)이 빈번하게 발생하고 있음을 고려하였다. 따라서, 그러한 상황을 대변할 수 있도록“Ag인 CD19 발현양” 및 “세포 크기"에 있어서 크게 차이가 있는 세 종류의 암세포를 대상으로 CAR-T 활성을 시험하였다(세포크기 순서: K562-CD19>> Nalm6, Daudi; Ag 발현양 순서: Daudi> Nalm6> K562-CD19).
평가 방법으로서, CAR-T의 항암면역기전에서 중요한 기능으로 알려진 사이토카인의 분비활성을 평가하고자 하였다. 그 결과, CAR-T 세포가 배양액에 존재하는 TGFβ1 농도에 의존적으로 영향을 받는 정도는 타겟 세포 및 분비되는 사이토카인에 따라 약간씩 다르게 나타났다.
그러나, TGFβ1의 광범위한 농도 구간 전반에 걸쳐(0 ng/㎖-5 ng/㎖), FKBP12 과발현 CAR-T 세포(19bbz#F)의 경우가, FKBP12 과발현이 없는 기본 2nd 세대 CAR-T 세포(19bbz) 보다 높은 활성 내지 동등 이상의 활성을 보이는 것이, 세 종류의 타겟 세포반응에서 모두 공통적으로 관찰되었다.
FKBP12 과발현에 의한 CAR-T 세포 활성차이는 특히 Target 표면상에 항원 발현량이 높아 CAR-T 세포의 활성화 유도가 비교적 용이하게 일어날 수 있는 Daudi와의 반응보다, 항원 발현량이 상대적으로 낮아 CAR-T 세포의 활성화 유도가 상대적으로 느리게 진행될 것으로 예측되는 Nalm6 또는 K562-CD19의 경우에 그 차이가 크게 관찰되었다.
따라서, 암조직에서 발생하는 악성종양의 면역회피기전(Immune-evasive mechanism) 중 하나가 “항원 발현양을 저해하는 기전을 통한 회피”이다. 이러한 점을 고려할 때, 항원이 낮은 종양 세포(Ag-low tumor cells)에 의한 암진행 억제력이 보다 향상된 CAR-T 세포를 설계할 때, FKBP12와 같이 작은 사이즈의 조절 단백질(small-sized regulatory protein)을 세포내에 축적할 수 있도록 설계하는 것은 매우 유용하다.
TGFβ가 존재하지 않는 상황에서도 활성상태를 유지하는 TGFβRII가 TGFβRI과 결합하여 TGFβ 신호를 유도하는 토닉 신호(tonic signaling)(TGFβ-independent dimerization-mediated signaling)에 의해 T 세포 기저 활성은 낮게 조절된다. 그러나, 수용체 이량화(receptor dimerization)의 경쟁적 억제제(competitive inhibitor)인 FKBP12가 과발현이 될 경우, 그러한 T 세포의 기저 활성이 높게 유지될 수 있다. 따라서, 항원 발현량이 낮은 암세포와의 반응에서도 활성화가 비교적 용이하게 이루어지는 것으로 예상된다.
CAR-T 세포의 이동능 확인(도 66 및 도 67)
CAR-T가 생체내에 주입된 이후. 종양 부위로 효과적으로 이동하는 능력은 CAR-T의 활성에 중요한 고려 요인이다.
일반적으로 TME(tumor microenvironment)로 T 세포의 이동은 여러 단계의 연속적인 과정을 통해 이루어지게 된다. T 세포의 이동 단계 중, 특히 인테그린 매개 T 세포 부착(Integrin-mediated T cell adhesion )과 T 세포 이동은 FKBP12, 사이클로필린 A와 같은 이뮤노필린에 의하여 민감하게 영향을 받는 것으로 알려져 있다.
본 실시예에서는, CAR-T의 in vitro 이동 활성을 비교하기 위해서, CAR-T를 anti-CD3/CD28 Dynabeads를 이용한 활성화 배양한 후, 세포를 수거하여 세척하고, 0.25% 인간 혈청 알부민(human serum albumin)이 첨가된 무혈청(serum-free) 배지에 현탁하여, 트랜스웰 이동(transwell migration)을 수행하였다. 3D 상에서, 일반적으로, 동물 세포들은 바이오매트릭스의 구멍(pore)을 아메바 운동(amoeboid motion)으로 통과하는 것으로 알려져 있다.
하단 그래프에 나타난 바와 같이, 1 시간동안 하부 챔버로 이동된 세포의 CAR(+) %를 비교하여 CAR(+) T 세포의 이동능을 비교하였다. 설정된 초기 총 T 세포 농도와 CAR(+) T 세포 농도가 모두 동일하였음에도 불구하고, 특정 CAR-T 세포(19bbz#FCS2) 경우, 다른 CAR-T에 비하여 월등히 높은 이동능을 보이는 것으로 확인되었다.
또한, T 세포 침투를 방해하는 사이토카인 알려진 EGF가 상부 챔버에 첨가된 상태에서 T 세포 이동을 분석하였다. 이 경우에도, 중간 그래프에 나타난 바와 같이, 하부 챔버로 이동한 CAR(+) 세포수를 비교하였을 때, 특정 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)가 다른 CAR-T에 비하여 월등히 우월한 이동능을 보이는 것으로 나타났다.
반면, 상단 그래프에서 나타난 바와 같이, 동일한 시간 이동한 CAR(-) 세포수에 있어서는 CAR-T 세포(19bbz#FCS2) 시료가 상대적으로 높은 이동능을 보이지 않는 것으로 나타났다(하단). 따라서, 이러한 CAR-T 세포(19bbz#FCS2) 시료가 보이는 높은 이동능이 세 종류의 세포질 조절인자를 과발현하는 CAR(+) 세포에 국한된 활성임을 확인하였다.
세 종류의 세포질 조절인자(cytoplasmic modulators)를 동시에 과발현하는 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)가 월등히 우월한 높은 이동능을 보이는 것은 96 웰 플레이트 상에서 표적 세포와 공배양을 48시간 수행한 다음에 촬영한 사진에서도 명확하게 관찰되었다(도 60).
사진에서 나타난 바와 같이, 해당 CAR-T 세포의 이동성은 항원인 CD19를 표면에 발현하여 활성화 신호가 충분히 많을 것으로 예상되는 K562-CD19와의 공배양에서 가장 활발한 것으로 나타났다.
CD19-특이적 CAR-T 세포의 종양 세포 살해능 확인: In vitro (도 68)
본 실시예에서는 CAR-T 세포의 종양 세포 살해 활성을 평가하기 위해서 다음과 같이 두 가지 분석법을 사용하였다.
K562-CD19 세포를 대상으로 한 평가에서는, 종양 세포 용해를 관찰하는 방법으로서, 세포 용해(cell lysis)에 의해 배지로 분비된 TDA(2,2':6',2"-terpyridine-6,6"-dicarboxylic acid)를 TRF(Time-Resolved Fluorometry)로 정량하는 방법을 사용하였다.
그 결과, 그림의 하단 그래프에 나타난 바와 같이, CAR(+)-T 세포에 의한 종양 세포 살해 활성을 평가한 결과는 앞서 기술한 사이토카인 분비 활성 평가 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
T 세포의 기저 면역활성에 관여되는 것으로 알려진 이뮤노필린을 과발현 시키거나, 면역 체크포인트 신호에 의한 티로신 탈인산화를 억제할 수 있는 SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현 시킨 CAR-T 세포(19bbz#F), CAR-T 세포(19bbz#C), CAR-T 세포(19bbz#S2)의 경우, 종양 세포 살해 활성에 있어서, 모두 기존의 음성 대조군 CAR-T 세포(19bbz)보다 상대적으로 약간 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
반면, 이러한 세 종류의 small-sized cytoplasmic immune modulator 들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(19bbz#FCS2)의 경우에는 기존의 대조군 CAR-T 세포(19bbz)에 비하여 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
한편, 루시퍼라제를 발현하는 Daudi 세포를 대상으로 CAR-T 세포의 종양 세포 살해 활성을 측정하는 실험을 수행하였다. CAR(+)-T 세포에 의한 종양 세포 용해(tumor cell lysis)를 Bioluminescence 감소량으로 비교하였다. 상단 그래프에서 보면, Eu-TDA release에 의한 평가와 유사한 결과를 나타내었다.
SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현 시킨 CAR-T 세포(19bbz#F), CAR-T 세포(19bbz#C), CAR-T 세포(19bbz#S2)의 경우, 모두 기존의 대조군 CAR-T 세포(19bbz)보다 상대적으로 약간 높은 종양 세포 살해 활성을 나타내었다. 특히, CAR-T 세포(19bbz#FCS2)의 경우에는 E:T ratio 전 구간에 걸쳐 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
Her2-특이적 CAR-T 세포 제조(도 3 및 도 69)
본 발명의 또 다른 예로서, Her2를 과발현하는 암세포를 겨냥한 CAR-T 로서 2nd 세대 CAR 형태의 CAR-T를 대표하는 “Her2-특이적 CAR-T 세포(Hbbz)”를 제조하였다. 또한, CAR-T 세포의 항암기능을 향상시킬 수 있을 것으로 예측되는 두 개의 이뮤노필린인 FKBP12(12 kDa), Cyclophilin A(18 kDa)을 각각 발현하는 두 종류의 CAR-T 세포(Hbbz#F, Hbbz#C)를 각각 제조하였다.
또한 면역 체크포인트 시그널에 의한 티로신 탈인산화(Tyrosine dephosphorylation)를 억제할 수 있는 SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현 시킨 CAR-T 세포(Hbbz#S2)도 제조하였다. 그리고 이러한 세 종류의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)도 제조하였다. 렌티바이러스로 형질도입 후 4일째 측정한 CAR 발현율은 도 69에 나타난 바와 같다. 이후 배양을 통해 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)의 CAR(+)-T 세포의 비율은 40-50% 수준까지 도달하는 것으로 관찰되었다.
면역형광분석에 의한 Her2-특이적 CAR-T 세포의 CAR의 발현 관찰(도 70)
결과에서 알 수 있듯이, 제조된 각 CAR-T 세포에서 세포표면에 발현된 CAR 분자가 세포 표면에 균일하게 발현되고 있음을 확인하였다.
항원 자극 시, Her2-특이적 CAR-T 세포에서 분비되는 IFNγ, TNFα 및 IL-2 측정 결과(도 71 내지 도 73)
본 실시예에서는 본 발명에 의해서 제조된 CAR-T 세포(Hbbz#F), CAR-T 세포(Hbbz#C), CAR-T 세포(Hbbz#S2), CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)의 사이토카인 분비활성이 기존의 2nd 세대 CAR-T 세포(H)의 활성 대비 어떠한 지를 비교 평가하였다.
그림에서 보듯이, 상기 세 종류 사이토카인(IFNγ, TNFα, IL-2)의 분비활성을 평가하였을 때, 모든 CAR-T 세포 분석에서 공통적으로, 타겟 항원인 Her2를 발현하지 않는 음성 대조군로 사용된 Daudi 세포와 CAR-T 세포를 24시간 동안 배양한 배양액내에서, TNFα와 IL-2의 사이토카인 분비는 거의 감지되지 않았다. 그러나, IFNγ의 경우에는, TNFα와 IL-2 사이토카인과 달리, 타겟 항원인 Her2를 발현하는 SKBR3 세포와의 배양에서 분비된 사이토카인 양의 1/3이내에 해당하는 IFNγ분비가 감지되었다. 이러한 원인은 Daudi가 Her2는 발현하지 않지만, B 림포사이트로서 Costimulatory molecule을 발현하고 있기 때문인 것으로 여겨진다. 즉, Daudi가 타인유래 항원제시세포로서 작용하기 때문에, 특정 조직적합성 항원에 반응할 수 있는 TCR을 보유한 일부 T 세포에 대하여, T 세포 활성화를 유도할 수 있기 때문인 것으로 추정된다.
반면, CAR-T 세포의 타겟 항원인 Her2를 발현하는 SKBR3 세포와 CAR-T 세포를 24시간동안 배양한 배양액내에서는 각 CAR-T 세포 배양액에서 그에 비해 확실히 많은 양의 사이토카인이 분비되었음을 관찰하였다.
결과적으로, CAR-T 세포(Hbbz#F), CAR-T 세포(Hbbz#C), CAR-T 세포(Hbbz#S2)의 경우, cytokine 분비활성에 있어서, 기존의 2세대 대조군 CAR-T 세포(Hbbz) 수준과 거의 같거나 약간 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
특히, CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)의 경우에는, 타겟종양세포 자극에 의존한 Cytokine 분비활성이, 기존의 2세대 Control CAR-T 세포(Hbbz)에 비하여 향상된 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
Her2-특이적 CAR-T의 세포 이동 평가(도 74)
본 실시예에서는, Her2-특이적 CAR-T 세포의 in vitro migration 활성을 비교하기 위해서, CAR-T 세포를 항-CD3/CD28 Dynabeads를 이용한 활성화 배양한 후, 세포를 수거하여 세척하고, 0.25% 인간 혈청 알부민이 첨가된 무혈청 배지에 현탁하여, 트랜스웰 이동을 수행하였다.
그 결과, 설정된 초기 전체 T 세포 농도와 CAR(+)-T 세포 농도가 모두 동일하였음에도 불구하고, 특정 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2) 경우, 다른 CAR-T 세포에 비하여 월등히 높은 이동능을 보이는 것으로 확인되었다.
Her2-특이적 CAR-T 세포의 종양 살해능 확인: In vitro (도 75)
CAR-T 세포(Hbbz#F), CAR-T 세포(Hbbz#C), CAR-T 세포(Hbbz#S2)의 경우, 종양 세포 살해 활성에 있어서, 모두 기존의 2세대 Control CAR-T 세포(Hbbz) 보다 상대적으로 약간 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
반면, 이러한 세 종류의 조절 인자들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)의 경우에는 월등히 높은 활성을 E:T ratio 전 구간에 걸쳐 나타냄을 확인할 수 있었다.
Her2-특이적 CAR-T 세포의 항암 효과: In vivo (도 76)
본 발명에서 도입된 CAR-T 세포 기술의 유용성을 고형암 모델에서 확인하였다. 면역부전 NSGA 마우스에 SKBR3-Luc 세포(개체당 2x106 세포)를 주입하여, 14일동안 복강내 xenograft tumor를 유도하였다. 각 군별 10마리 개체에, 각각 지정된 CAR-T 세포를 정맥으로 동량(1x106 CAR(+)-T 세포)으로 투여하였다. 그 후, 일주일 간격으로 Tumor burden을 IVIS 장비를 이용한 bioluminescence imaging으로 모니터링하였다.
그 결과, 그림에서 보듯이, 2 세대 대조군 CAR-T 세포(Hbbz)를 처치한 군은 복강에 확립된 종양의 성장을 효과적으로 저지하지 못하는 것으로 나타났다. 반면, 신호 기전 조절 인자로서 이뮤노필린 FKBP12를 과발현시킨 CAR-T 세포(Hbbz#F)를 처치한 군과, 세 종류의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)를 투여한 군에서는 복강에서 성장하던 고형암에 대한 억제 및 퇴치효과가 신속하고 뚜렷하게 관찰되었다.
또한, 본 결과는 다른 실시예로서 수행된 여러 in vitro CAR-T 세포 활성(사이토카인 분비활성, 이동(migration) 활성, 종양 세포 살해능) 평가에서 관찰된 것과 일치하는 것으로서, in vivo 모델을 이용한 고형암 대상의 항암활성에 있어서도 세 종류의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현시킨 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)가 월등히 우월한 성능을 in vivo에서도 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 본 결과는 다른 실시예로서 수행된 혈액암 모델의 항암효능평가에서 관찰된 것과 일치하는 것으로서, 고형암 모델의 항암효능평가에서도, 이뮤노필린 FKBP12만 과발현한 CAR-T 세포(Hbbz#F)를 주입한 군이 2세대 대조군 CAR-T 세포(Hbbz)보다 우수한 항암활성을 보이는 것으로 확인되었다.
또한, 본 실시예의 고형암 모델 결과에서, 세 종류의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현시킨 CAR-T 세포(Hbbz#FCS2)가 월등히 우월한 항암효능을 보이는 것은, 다른 기전에 근거한 신호 기전 조절 인자 매개 강화(potentiation)의 상보적 효과에 기인한 것으로 시사된다.
PSMA-표적 CAR-T 세포 제조(도 6 및 도 77)
본 발명의 또 다른 예로서, PSMA를 과발현하는 종양세포를 겨냥한 CAR-T 세포로서 2nd 세대 CAR 형태의 CAR-T 세포를 대표하는 "PSMA-특이적 CAR-T 세포(Pbbz)"를 제조하였다. 또한, 이때, CAR-T 세포의 항암기능을 향상시킬 수 있을 것으로 예측되는 두 개의 이뮤노필린인 FKBP12(12kDa), 사이클로필린 A(18kDa)를 각각 발현하는 두 종류의 CAR-T 세포(Pbbz#F, Pbbz#C)를 각각 제조하였다.
또한 면역 체크포인트 시그널에 의한 티로신 탈인산화(Tyrosine dephosphorylation)를 억제할 수 있는 SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현 시킨 CAR-T 세포(Pbbz#S2)도 제조하였다. 그리고 이러한 세 종류의 신호 기전 조절 인자들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(Pbbz#FCS2)도 제조하였다. 렌티바이러스 형질도입 후 4일째 측정한 CAR 발현율은 도 77에 나타난 바와 같다. 이후 배양을 통해 CAR-T 세포(Pbbz#FCS2)의 CAR(+)-T 세포의 비율은 40-50% 수준까지 도달하는 것으로 관찰되었다.
면역형광분석에 의한 PSMA-특이적 CAR-T 세포 표면의 CAR 발현 관찰(도 70)
도면에서 보듯이, 제조된 각 CAR-T 세포에서 세포표면에 발현된 CAR분자가 세포 표면에 균일하게 발현되고 있음을 확인하였다.
PSMA-특이적 CAR(+)-T 세포의 아형 분석(도 79)
NTD(Non-transduced control T cells)의 경우에는 줄기세포능(renew potential)이 가장 적은, 분화된 세포에 해당하는 효과 집단이 거의 절반정도(47%)에 해당하고, Tscm 아형이 45% 정도인 것으로 나타났다. 그와 달리, 2nd 세대 CAR만 발현하는 Control CAR-T 세포(Pbbz)의 경우, Tscm 비율이 53% 정도로서 NTD보다 8% 정도 높은 수준인 것으로 나타났다.
SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 과발현하는 CAR-T 세포(Pbbz#S2)의 경우는, 2nd 세대 CAR만 발현하는 Control CAR-T세포(Pbbz)와 비교적 가장 유사한 T 세포 집단을 갖고 있는 것으로 나타났다.
반면, FKBP12 또는 사이클로필린 A와 같은 이뮤노필린 단백질을 과발현 시킨 CAR-T 세포(Pbbz#F, Pbbz##C)의 경우, Tscm 비율이 각각 63%, 64%로서 2nd 세대 대조군 CAR-T 세포(Pbbz)보다 약 10% 정도 높게 유지되는 것으로 나타났으며, 두 종류의 이뮤노필린과 SHP2의 N-말단 SH2 도메인을 동시에 발현하는 CAR-T 세포(Pbbz#FCS2)의 경우, Tscm 비율이 66% 정도로서 2nd 세대 대조군 CAR-T 세포보다 10%이상 높게 유지되는 것으로 나타나 가장 높은 줄기세포능을 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
본 실시예의 T 세포 아형 분석결과에서 볼 때, 세포 신호 기전 조절 인자의 과발현을 통해 CAR-T 세포의 기능적 활성을 배가시키는 경우에도, 치료용 CAR-T 세포의 바람직한 성질인 T 세포 줄기세포능이 손상되지 않고, 여전히 잘 유지되는 것으로 나타났다.
T 세포 탈진 표현형 분석 결과(도 80)
항체를 이용한 유세포 형광분석 결과, 분석된 모든 CAR-T 세포의 CAR(+)-T 세포 게이트 하에서, PD-1 양성세포의 비율은 10+/-3 % 범위이내, LAG-3 양성세포의 비율은 3% 이내, TIGIT 양성세포의 비율은 12+/-3 %범위이내, CTLA-4 양성세포의 비율 역시 2-3% 수준으로서, T 세포 탈진 마커들의 발현율은 그다지 높지 않은 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에서 도입한 세포 신호 기전 조절 인자의 과발현이 CAR-T 세포 탈진을 동반하지 않음을 확인하였다.
PSMA-특이적 CAR-T 세포의 In vitro 이동능을 평가(도 81)
하단 그래프에 나타난 바와 같이, 1 시간동안 하부 챔버로 이동된 세포수와 이동된 세포의 CAR(+) %를 측정하여, CAR(+)-T 세포의 motility를 비교하였다. 설정된 초기 total T 세포 농도와 CAR(+)-T 세포 농도가 모든 CAR-T 시료에서 모두 동일하였음에도 불구하고, 특정 CAR-T 세포(Pbbz#FCS2) 경우, 다른 CAR-T 세포에 비하여 월등히 높은 이동능을 보이는 것으로 확인되었다.
반면 동일한 시간동안 하부 챔버로 이동한 CAR(-)-T 세포수에 있어서는 CAR-T 시료 간에 이러한 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타나(상단), 이러한 CAR-T 세포(Pbbz#FCS2) 시료가 보이는 높은 이동능이 세 종류의 신호 기전 조절 인자를 과발현하는 CAR(+) 세포에 국한된 활성임을 시사하고 있다.
PSMA-특이적 CAR-T 세포의 타겟종양세포 살해능 평가: In vitro (도 82 및 83)
반응 2시간 시점(도 82)과 3시간 시점(도 83)에 각각 평가한 결과에서 잘 나타났듯이, CAR-T 세포(Pbbz#F), CAR-T 세포(Pbbz#C), CAR-T 세포(Pbbz#S2)의 경우, 타겟종양세포 살해 활성에 있어서, 모두 기존의 2 세대 대조군 CAR-T 세포(Pbbz)보다 확실히 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
반면, 이러한 세 종류의 small-sized cytoplasmic immune modulator 들을 동시에 과발현 시킨 CAR-T 세포(Pbbz#FCS2)의 경우에는 월등히 향상된 높은 활성을 E:T ratio 전 구간에 걸쳐 나타냄을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
I. 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T의 제조
실시예 1. 융합단백질의 구조 설계
실시예 1.1. FKBP12 구조 설계
키메라 항원 수용체 및 FKBP12를 포함하는 융합단백질의 구조는 시그널 펩타이드, 항원 결합 도메인, 힌지 및 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 자가-절단성 펩타이드 및 FKBP12를 포함하도록 설계하였다.
일 실시예로서, 도 1에 나타난 바와 같이, 시그널 펩탕이드(ss), 항원 결합 도메인(CD19 scFv), 힌지 및 막관통 도메인(H+TM), 세포내 신호전달 도메인(4-1BB 및 CD3Z), 자가-절단성 펩타이드(P2A) 및 FKBP12를 포함하도록 설계하였으며, 이를 "19bbz#F"로 명명하였다. 또한, 시그널 펩타이드(ss), 항원 결합 도메인(CD19 scFv), 힌지 및 막관통 도메인(H+TM) 및 세포내 신호전달 도메인(4-1BB 및 CD3ζ)을 포함하는 키메라 항원 수용체를 "19bbz"로 명명하였다.
구체적으로, CD19-특이적 CAR는 i) CD8 시그널 펩타이드(Uniprot: P01732-1, 1-21 aa, 서열번호 1)에서 유래된 염기서열과 ii) CD19-특이적 FMC63 항체(Nichoison et al, 1997)에서 유래된 scFv의 단편에 대한 염기서열(서열번호 3)을 연결한 다음, iii) CD8 힌지-막 관통 도메인(Uniprot: P01732-1, 138-206 aa, 서열번호 5), iv) 인간 4-1BB 공동자극인자 도메인 세포질 영역(Uniprot: Q07011, 214-255 aa, 서열번호 7) 및 v) 인간 CD3ζ 세포내 도메인(GenBank: NP 000725.1, 52-163 aa, 서열번호 9)에서 유래된 염기서열을 연결하여 제작하였다.
실시예 1.2. 그 외 신호 기전 조절 인자가 포함된 벡터 구조 설계
실시예 1.1.과 동일하게, FKBP12 대신 Cyclophilin A(#C), SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인(#M), N-SKI(#N), SHP-1 단백질의 N-말단 SH2 도메인(#S1), SHP-2 단백질의 N-말단 NH2 도메인(#S2), TC21(#TC), RhoG(#RG),FKBP12/Cyclophilin A/ SHP-2 단백질의 N-말단 SH2 도메인(#F#C#S2, 또는 간략히 #FCS2)이 포함되도록 설계하였다. 이를 각각 "19bbz#C", "19bbz#M", "19bbz#N", "19bbz#S1", "19bbz#S2","19bbz#TC","19bbz#RG" 및 "19bbz#FCS2"로 명명하였다. 또한, 실시예 1.1.과 동일하게 자가-절단 서열이 없는 컨스트럭트에 FKBP12 대신 TLR4 세포내 도메인(T)이 포함되도록 설계하였으며, 이를 "19bbzT"로 명명하였다(도 1 내지 도 2).
실시예 2. 융합단백질을 코딩하는 벡터 제작
실시예 2.1. FKBP12가 포함된 벡터 제작
벡터는 인간 신장 인자 α(EF1α: 531 bp 또는 212 bp) 프로모터를 포함하고 있는 3세대 자가 불활성 렌티바이러스 벡터인 pPVLV5 벡터를 사용하였다. 상기 pPVLV5 벡터 내에 시그널 펩타이드(ss), CD19에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 가변 단편(CD19 scFv), 인간 CD8의 힌지 및 막 통과 도메인(H+TM)과, 세포내 신호전달 도메인(4-1BB 및 CD3ζ)를 포함하는 키메라 항원 수용체와 자가-절단성 펩타이드(P2A) 및 FKBP12를 코딩하는 유전자를 삽입하였다. 이를 "p_19bbz#F"로 명명하였다.
또한, 상기 pPVLV5 벡터 내에 시그널 펩타이드(ss), CD19에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 가변 단편(CD19 scFv), 인간 CD8의 힌지 및 막 통과 도메인(H+TM)과, 세포내 신호전달 도메인(4-1BB 및 CD3ζ)를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 삽입하였다. 이를 "p_19bbz"로 명명하였다.
실험에 사용된 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열 및 염기서열을 하기 <표 1>에 나타내었으며, FKBP12(#F)의 아미노산 서열 및 염기서열을 하기 <표 2>에 나타내었다.
<표 1>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000001
<표 2>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000002
벡터는 pLenti-EF1a-Backbone(NG)(Addgene, #27963)를 변형한 3 세대 렌티바이러스 벡터를 사용하였고, DNA assembly Master Mix(NEB, #E2621)를 이용하여 CAR 암호화 유전자를 벡터에 적재하였다.
또한, 면역 조절 단백질을 세포질 내에서 발현시키기 위하여, CAR 서열 후단에 면역 조절 단백질을 코딩하는 염기서열을 삽입하였다. 상기 면역 조절 단백질은 FKBP12(#F, 서열번호 14)이었다.
실시예 2.2. 그 외 신호 기전 조절 인자가 포함된 벡터 제작
실시예 2.1.과 동일한 방법으로 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 사이클로필린 A(#C, 서열번호 25), SMAD4 단백질의 C-말단 MH2 도메인(#M, 서열번호 21), N-SKI(#N, 서열번호 23), SHP-1 단백질의 N-SH2도메인(#S1, 서열번호 27), SHP-2 단백질의 N-SH2도메인(#S2, 서열번호 29), TC21(#TC, 서열번호 33), RhoG(#RG, 서열번호 35), 또는 FKBP12/cyclophilin A/SHP2 단백질의 N-SH2 도메인(#FCS2, 서열번호 14, 서열번호 25, 서열번호 29)를 포함되도록 벡터를 제작하였으며, 이를 각각 "p_19bbz#F" "p_19bbz#C", "p_19bbz#M", "p_19bbz#N", "p_19bbz#S1", "p_19bbz#S2", "p_19bbz#TC" "p_19bbz#RG", 및 "p_19bbz#F#CS#2", 로 명명하였다. 또한, 실시예 2.1.과 동일한 방법으로 자가-절단 서열이 없고, FKBP12 대신 TLR4 세포질내 도메인(T, 서열번호 31)가 포함되도록 벡터를 제작하였으며, 이를 "p_19bbzT"로 명명하였다.
상기 p_19bbz#C, p_19bbz#M, p_19bbz#N, p_19bbz#S1, p_19bbz#S2, "p_19bbz#TC", p_19bbz#RG, p_19bbz#F#C#S2 및 p_19bbzT 벡터의 제조에 사용된 단백질 또는 이의 단편에 해당되는 아미노산 서열 및 염기서열을 하기 <표 3> 내지 <표 10>에 나타내었다. 또한, 각 플라스미드의 구조도를 도 8 내지 도 18에 나타내었다.
<표 3>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000003
<표 4>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000004
<표 5>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000005
<표 6>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000006
<표 7>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000007
<표 8>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000008
<표 9>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000009
<표 10>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000010
실시예 3. 렌티바이러스 생산
실시예 3.1. FKBP12가 포함된 렌티바이러스 생산
각 렌티바이러스를 생산하기 위해, 최적화된 렌티바이러스 생산 키트인 LV-MAX Lentiviral Production System(Gibco, #A35684)을 이용하였다. 상기에서 제작된 3세대 렌티바이러스 전달 플라스미드를 pMD2.G(Addgene, #12259), pMDLg/pRRE(Addgene, #12251) 및 pRSV-Rev(Addgene, #12253)를 변형한 렌티바이러스 엔벨로프 플라스미드 및 패키징 플라스미드와 공-형질감염시켜 렌티바이러스를 제조하였다. 무혈청 배지에 적응된 HEK293F 세포에 상기 벡터를 형질 도입시키고 50~54시간 배양한 후, 바이러스가 포함되어 있는 배양배지를 수거하여 Lenti-X concentrator(Takara, #631232)를 이용하여 농축하였다. 농축된 바이러스는 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 이와 같이 생산된 렌티바이러스를 "Lenti_19bbz#F"로 명명하였다.
실시예 3.2. 그 외 신호 기전 조절 인자가 포함된 렌티바이러스 생산
실시예 3.1.과 동일한 방법으로, 실시예 2.2에서 제조한 p_19bbz#C, p_19bbz#M, p_19bbz#N, p_19bbz#S1, p_19bbz#S2, p_19bbz#TC, p_19bbz#RG, "p_19bbz#F#CS#2", 및 p_19bbzT 렌티바이러스 전달 플라스미드를 이용하여 렌티바이러스를 생산하였으며, 이를 각각 "Lenti_19bbz#C", "Lenti_19bbz#M", "Lenti_19bbz#N", "Lenti_19bbz#S1", "Lenti_19bbz#S2", "Lenti_19bbz#TC", "Lenti_19bbz#RG" , "Lenti_19bbz#F#C#S2" 및 "Lenti_19bbzT"로 명명하였다.
실시예 4. CAR-T 세포 제작
실시예 4.1. FKBP12가 도입된 CAR-T 세포 제작
CAR-T 세포는 건강한 공여자 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 이용하여 제작하였다. PBMC에서 부착성 세포(adherent cells)를 제거한 다음, 200 IU/㎖의 rhIL-2(BMI Korea) 및 항-CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies)가 포함된 X-VIVO 15 배지(Lonza)배지에서 배양하여 T 세포의 활성화를 유도하였다(bead:CD3+T 세포=1:1).
2일 후 실시예 3.1.에서 생산한 2 종류의 렌티바이러스(Lenti_19bbz#F, Lenti_19bbz)를 활성화된 T 세포에 각각 처리하였다. 다음날 원심분리하여 렌티바이러스를 포함한 상등액을 제거하였다. T 세포를 200 IU/㎖의 rhIL-2를 함유하는 X-VIVO 15 배지에 3x105 세포/㎖로 재현탁 시키고 3일 동안 배양하였다. 그 이후에는 항-CD3/CD28 Dynabeads를 제거한 상태에서 배양하였으며, 2일 또는 3일마다 rhIL-2를 포함하는 새로운 배지로 바꿔주면서 T세포를 증식시켰다. 이때, Lenti_19bbz#F를 이용하여 제조한 CAR-T 세포를 "CAR-T 세포_19bbz#F"로 명명하였으며, Lenti_19bbz를 이용하여 제조한 CAR-T 세포를 "CAR-T 세포_19bbz"로 명명하였다.
실시예 4.2. 그 외 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T 세포 제작
실시예 4.1.과 동일한 방법으로, 실시예 3.2.에서 생산한 "Lenti_19bbz#C", "Lenti_19bbz#M", "Lenti_19bbz#N", "Lenti_19bbz#S1", "Lenti_19bbz#S2", "Lenti_19bbz#TC", "Lenti_19bbz#RG" , "Lenti_19bbz#F#C#S2" 및 "Lenti_19bbzT" 렌티바이러스를 이용하여 형질전환시켜 CAR-T 세포를 제작하였으며, 이를 각각 "CAR-T 세포_19bbz#C", "CAR-T 세포_19bbz#M", "CAR-T 세포_19bbz#N", "CAR-T 세포_19bbz#S1", "CAR-T 세포_19bbz#S2", "CAR-T 세포_19bbz#TC", "CAR-T 세포_19bbz#RG", "CAR-T 세포_19bbz#FCS2", 및 "CAR-T 세포_19bbzT"로 명명하였다.
실시예 5. Her2-특이적 CAR-T의 제조
실시예 1 내지 4의 방법과 동일하게 Her2-특이적 CAR-T를 제조하였다. 다만, 항원 결합 도메인을 CD19 scFv에서 Her2 scFv로 바꾸어 제작하였다.
구체적으로, Her2-특이적 CAR는 i) CD8 시그널 펩타이드(Uniprot: P01732-1, 1-21 aa, 서열번호 1)에서 유래된 염기서열과 ii) Her2-특이적 항체인 trastuzumab(IMGT database)에서 유래된 scFv의 단편(서열번호 45)에 대한 염기서열(서열번호 46)을 연결한 다음, iii) CD8 힌지-막 관통 도메인(서열번호 5), iv) 인간 4-1BB 공동자극인자 도메인 세포질 영역(서열번호 7) 및 v) 인간 CD3ζ 세포내 도메인(서열번호 9)에서 유래된 염기서열을 연결하여 제작하였다(표 11).
또한, Her2-특이적 CAR와 함께 발현되는 신호 기전 조절 인자도 다양하게 제조하였다. 구체적으로, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A 및 SHP2-nSH2이 발현되는 Her2 특이적인 CAR-T를 각각 제조하였다. 또한, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A, 및 SHP2-nSH2이 모두 발현되는 CAR-T를 제조하였다. 이때 사용한 벡터는 도 19 내지 도 23에 나타낸 바와 같다.
<표 11>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000011
실시예 6. PSMA-특이적 CAR-T의 제조
실시예 1 내지 4의 방법과 동일하게 PSMA-특이적 CAR-T를 제조하였다. 다만, 항원 결합 도메인을 CD19 scFv에서 PSMA-scFv로 바꾸어 제작하였다.
구체적으로, PSMA-특이적 CAR는 i) Ig 중쇄 유래의 시그널 펩타이드(GenBank AAA51634.1, 1-19 aa, 서열번호 52)에서 유래된 염기서열과 ii) PSMA-특이적 J591 항체(WO2002/098897A2)에서 유래된 scFv의 단편에 대한 염기서열(서열번호 55)을 연결한 다음, iii) CD8 힌지-막 관통 도메인(서열번호 5), iv) 인간 4-1BB 공동자극인자 도메인 세포질 영역(서열번호 7) 및 인간 v) 인간 CD3ζ 세포내 도메인(서열번호 9)에서 유래된 염기서열을 연결하여 제작하였다(표 12).
또한, PSMA-특이적 CAR와 함께 발현되는 신호 기전 조절 인자도 다양하게 제조하였다. 구체적으로, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A 및 SHP2-nSH2이 발현되는 PSMA-특이적 CAR-T를 각각 제조하였다. 또한, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A, 및 SHP2-nSH2이 모두 발현되는 CAR-T를 제조하였다. 이때 사용한 벡터는 도 34 내지 도 38에 나타낸 바와 같다.
<표 12>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000012
실시예 7. CD43-특이적 CAR-T의 제조
실시예 1 내지 4의 방법과 동일하게 CD43-특이적 CAR-T를 제조하였다. 다만, 항원 결합 도메인을 CD19 scFv에서 CD43 scFv로 바꾸어 제작하였다. 이때, 사용된 서열은 하기 표 13에 나타내었다. 또한, CD43-특이적 CAR와 함께 발현되는 신호 기전 조절 인자도 다양하게 제조하였다. 구체적으로, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A 및 SHP2-nSH2이 발현되는 CD43-특이적 CAR-T 세포를 각각 제조하였다. 또한, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A, 및 SHP2-nSH2이 모두 발현되는 CAR-T를 제조하였다. 이때 사용한 벡터는 도 24 내지 도 28에 나타낸 바와 같다.
<표 13>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000013
실시예 8. CD47-특이적 CAR-T의 제조
실시예 1 내지 4의 방법과 동일하게 CD47-특이적 CAR-T를 제조하였다. 다만, 항원 결합 도메인을 CD19 scFv에서 CD47 scFv로 바꾸어 제작하였다. 이때, 사용된 서열은 하기 표 14에 나타내었다. 또한, CD47-특이적 CAR와 함께 발현되는 신호 기전 조절 인자도 다양하게 제조하였다. 구체적으로, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A 및 SHP2-nSH2이 발현되는 CD47-특이적 CAR-T 세포를 각각 제조하였다. 또한, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A, 및 SHP2-nSH2이 모두 발현되는 CAR-T를 제조하였다. 이때 사용한 벡터는 도 29 내지 도 33에 나타낸 바와 같다.
<표 14>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000014
실시예 9. HERV-E TCR-T의 제조
실시예 1 내지 4의 방법과 동일하게, HLA-A11-제한적 HERV-E 에피토프를 발현하는 암세포를 타겟팅하는 HERV-E-특이적 TCR-T를 제조하였다. 다만, CAR 부분을 TCR로 바꾸어 제작하였다. HERV-E-특이적 TCR과 함께 발현하는 신호 기전 조절 인자도 다양하게 제조하였다. 구체적으로, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A 및 SHP2-nSH2이 발현되는 HERV-E-특이적 TCR-T를 각각 제조하였다. 또한, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A, 및 SHP2-nSH2이 모두 발현되는 TCR-T를 제조하였다. 이때, 사용된 서열은 하기 표 15 내지 표 24에 나타내었다. 이때 사용한 벡터는 도 39 내지 도 43에 나타낸 바와 같다.
<표 15>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000015
<표 16>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000016
<표 17>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000017
<표 18>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000018
<표 19>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000019
<표 20>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000020
<표 21>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000021
<표 22>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000022
<표 23>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000023
<표 24>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000024
실시예 10. NY-ESO-1-특이적 TCR-T의 제조
실시예 1 내지 4의 방법과 동일하게, HLA-A2-제한적 NY-ESO-1 에피토프를 발현하는 암세포를 타겟팅하는 NY-ESO-1-특이적 TCR-T를 제조하였다. 다만, CAR 부분을 TCR로 바꾸어 제작하였다. NY-ESO-1-특이적 TCR과 함께 발현되는 신호 기전 조절 인자도 다양하게 제조하였다. 구체적으로, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A 및 SHP2-nSH2이 발현되는 NY-ESO-1-특이적 TCR-T를 각기 제조하였다. 또한, FKBP12 단백질, 사이클로필린 A, 및 SHP2-nSH2이 모두 발현되는 TCR-T를 제조하였다. 이때, 사용된 서열은 하기 표 25 내지 표 34에 나타내었다. 이때 사용한 벡터는 도 44 내지 도 48에 나타낸 바와 같다.
<표 25>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000025
<표 26>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000026
<표 27>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000027
<표 28>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000028
<표 29>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000029
<표 30>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000030
<표 31>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000031
<표 32>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000032
<표 33>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000033
<표 34>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000034
II. 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T의 활성 확인: In vitro
실험예 1. CAR-T 세포의 항원 수용체 발현 확인
실험예 1.1. 유세포 분석을 통한 CAR 발현 평가
CAR-T 세포에서 발현되는 세포 표면의 CAR의 발현 및 타겟종양세포의 항원 발현을 확인하기 위하여, 바이러스 감염 후 4일 후에, CAR-T 세포를 FITC가 표지된 재조합 인간 CD19(Acro, #CD9-HF2H2)로 염색하여 CD19-특이적 CAR를 분석하였다(도 54). 또한, Alexa-Fluor 488이 표지된 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L) 항체(Jackson ImmunoResearch, #109-546-003)로 염색하여, Her2-특이적 CAR 발현을 확인하였다(도 69).
또한, PSMA-특이적 CAR의 발현은 Biotin이 표지된 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG 항체(F(ab')2 단편 특이적 항체)(Jackson ImmunoResearch, #115-066-006) 및 PE가 표지된 streptavidin(BD Pharmingen, #554061)로 염색하여 확인하였다(도 77).
타겟종양세포의 경우, CD19의 발현은 APC가 표지된 항-인간 CD19 항체(BD Pharmingen, #555415)로 염색하였다(도 58). 각각 염색된 세포에서의 발현은 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 유세포 분석기(FACS)는 CytoFLEX S(Beckman Coulter)를 사용하였고, 결과는 CytExpert software를 이용하여 분석하였다.
실험예 1.2. 면역형광염색법을 이용한 CAR 발현 평가
자극을 주기 시작한 8일 후, 실시예 4에서 제작된 CD19-특이적 CAR-T 세포는 Cyanine 3이 표지된 염소-항-마우스 IgG 항체(Invitrogen, #A10521)로 염색하고(도 55), 실시예 5에서 제작된 Her-특이적 CAR-T 세포는 Alexa-Fluor 488가 표지된 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(H+L) 항체(Jackson ImmunoResearch, #109-546-003)(도 70)로 염색하였다. 또한 실시예 6에서 제작된 PSMA-특이적 CAR-T 세포는 Cyanine 3이 표지된 염소-항-마우스 IgG 항체(Invitrogen, #A10521)로 염색하였다(도 78). CAR가 염색된 세포를 eBioscience 용액(eBioscience, #00-5123)에서 20분 간 고정(fixation) 및 투과처리(permeabilization)하였다. 그 후, 시료를 마운팅하고 DAPI가 포함된 ProLong Gold Antifade Mountant 용액(Invitrogen, #P36931)로 핵을 염색하였다.
또 다른 예에서, 자극을 주기 시작한 9일 후, CD19-특이적 CAR-T 세포를 Daudi-Fluc-eGFP 세포와 1:1 비율로 1시간 공배양 후, Cyanine 3이 표지된 염소-항-마우스 IgG 항체 및 DAPI를 이용하여 염색하였다. 세포 이미지는 Optinity HDMI 4K C-Mount Camera KCX-80이 장착된 Optinity KI-2000 현미경을 이용하여 400X배 비율로 촬영하였다(도 56). Daudi-Fluc-EGFP 세포는 세포질내 EGFP의 녹색형광으로 관찰하였다.
실험예 2. T 세포 아형 분석
자극을 주기 시작한 8일 후, 실시예 8에서 제작된 CAR-T 세포에 대하여 유세포 분석기를 이용하여 T 세포 아형을 분석하였다: CD45RA 및 CCR7 발현 여부에 따라 줄기세포 유사 기억 T 세포(T memory stem cells, CD45RA+CCR7+), 중심 기억 T 세포(central memory T cells, CD45RA-CCR7+), 효과 기억 T 세포(effector memory T cells CD45RA-CCR7-) 및 효과 T 세포(effector T cells, CD45RA+CCR7-)로 분류하였다. CD19-특이적 CAR(+) 세포를 분석하는 경우, CAR를 염색하기 위해서 FITC가 표지된 재조합 인간 CD19 단백질(Acro, #CD9-HF2H2)을 사용하였다. 또한, PSMA-특이적 CAR(+) 세포를 분석하는 경우, CAR를 염색하기 위해서, FITC가 표지된 재조합 인간 PSMA 단백질(Acro, #PSA-HF244)을 사용하였다. 상기의 두 경우 모두 공통적으로, 아래 표 35에 명기된 항체를 이용하여 염색한 후 T 세포 아형을 분석하였다(도 57).
<표 35>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000035
실험예 3. 신호 기전 조절 인자의 발현 확인
실험예 3.1. 웨스턴 블롯팅을 통한 단백질 발현 평가
상기 실시예에서 제작된 CAR-T 세포의 단백질 발현을 확인하기 위하여, CAR-T 세포를 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)가 포함된 PROPREP 단백질 추출용액(iNtRON Biotechnology, #17081)으로 용해하여 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 BCA Protein Assay 키트(Pierce)를 이용하여 정량하였다.
동량의 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동한 후, XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System and XCell II Blot Module(Invitrogen)을 통해 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 그 후, 멤브레인을 블로킹 용액(5% 탈지분유 용액)으로 블로킹하고, 1차 항체 및 2차 항체와 순차적으로 반응시켜 단백질 발현을 확인하였다. 2차 항체는 염소-항-마우스 IgG HRP(Invitrogen, #62-6520) 또는 염소-항-래빗 IgG HRP(Abcam, #ab6721)을 사용하였다.
단백질 발현에 대한 이미지는 Azure C400 Gel Imaging System을 이용하여 촬영하였으며, AzureSpot Analysis 소프트웨어(Azure Biosystems)로 분석하였다(도 59). 실험에 사용된 1차 항체는 아래 표 36과 같다.
<표 36>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000036
실험예 3.2. 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 mRNA 발현 평가
상기 실시예에서 제작된 CAR-T 세포에서 mRNA의 발현을 확인하기 위하여, 자극을 주기 시작한 8일 후, ISOLATEII RNA Mini 키트(Bioline, #52072)를 이용하여, CAR-T 세포에서 RNA를 분리하였다. 그 후, Nanodrop 1000 분광 광도계(Thermo Scientific)로 정량하였다. 0.5 ㎍ 또는 1 ㎍ RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후, SensiFAST Probe Hi-ROX One-Step 키트(Bioline, #77001)를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time quantitative PCR, Q-PCR)을 수행하였다.
GAPDH 유전자를 내부 대조군(internal reference)으로 사용하였다. 모든 실험은 2회 반복 진행하였다. 유전자 발현은 ΔΔCt 방법으로 분석하였다(도 60). Q-PCR에 사용된 프라이머(primer)와 TaqMan 프로브(probe)는 아래 표 37과 같다.
<표 37>
Figure PCTKR2021001904-appb-I000037
실험예 4. CAR-T 세포의 활성 확인
실험예 4.1. 타겟종양세포주 및 이의 배양
CD19-특이적 CAR-T 세포의 in vitro 수준에서의 기능 분석에 사용할 타겟종양세포를 제작하기 위하여, 인간 골수성 백혈병 K562 세포(ATCC, #CCL-243)에 렌티바이러스를 이용하여 인간 CD19 단백질을 안정적으로 발현시켰다(K562-CD19). CD19 특이적 CAR-T 세포의 기능 분석을 위해, in vitro 기능 분석을 위해, 음성 대조군으로 K562 음성 세포를 사용하였다.
또한 반딧불 루시퍼라아제(firefly luciferase)와 에메랄드 그린 형광단백질을 안정적으로 발현하는 인간 B 림프모세포 Daudi 세포(GFP, Imanis, #CL158)를 CD19-특이적 CAR-T 세포의 in vitro 기능 분석에 사용하였다. 또한, 반딧불 루시퍼라아제(firefly luciferase)를 안정적으로 발현하는 인간 B 림프모세포 Daudi 세포를 CD19-특이적 CAR-T 세포의 in vivo 항암효능 분석에 사용하였다. 또한 인간 B　세포　전구체 백혈병 세포주 Nalm6(ATCC, #CCL-3273)을 CD19-특이적 CAR-T 세포의 in vitro 기능분석에 사용하였다.
반딧불 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 인간 유방암 세포주 SKBR3(JCRB, #1627.1)를 Her2-특이적 CAR-T 세포의 in vitro 기능 분석과 in vivo 항암효능 분석에 사용하였다. 반딧불 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 인간 전립선암 세포주 LNCaP(ATCC, #CRL-1740-LUC2)은 PSMA-특이적 CAT-T 세포의 in vitro 기능 분석에 사용하였다.
K562, K562-CD19, Nalm6 및 Daudi-Fluc-eGFP 타겟종양세포주는 각각의 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum)와 항생제-항균제(Gibco, #15240096)가 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco, #11875-085)에서 배양하였다. SKBR3-Luc 세포는 10% FBS와 항생제-항균제가 포함된 McCoy's 5a 배지(Gibco, #16600-082)에서 배양하였다. LnCap-Luc 세포는 10% FBS, 항생제-항균제 및 2μg/mL Blasticidin(Gibco, #A1113903)가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
실험예 4.2. CAR-T 세포의 사이토카인 분비능 평가
상기 실시예에서 제작된 CAR-T 세포(4×104)를 타겟종양세포와 1:1 비율로 24시간 공배양하였다. 그 후, 배양배지를 수득하여 배지 내의 IFNγ, TNFα 및 IL-2와 같은 사이토카인의 농도를 ELISA(R&D Systems) 방법을 이용하여 측정하였다. 결과는 2회 실험 후 평균값으로 나타내었다(도 61 내지 도 63/도 71 내지 도 73).
또한 TGF-β1가 존재하는 조건에서 분비능을 평가하는 경우, 지정된 농도(0 ng/㎖~5 ng/㎖)의 TGF-β1가 첨가된 배지를 사용하였으며, CAR-T 세포(1x105)와 타겟종양세포를 1:1 비율로 24시간 공배양하였다. 결과는 2회 실험 후 평균값으로 나타내었다(도 64 및 도 65).
형질 도입 시 효율의 차이를 보정하기 위해, 형질도입 되지 않은 T 세포를 사용하여 형질 도입된 CAR-T 세포수와 T 세포의 총 수를 동일하게 조정한 후 실험을 수행하였다.
실험예 5. CAR-T 세포의 세포사멸 활성 확인
실험예 5.1. EuTDA 기반으로 한 CAR-T 세포의 세포사멸 측정
상기 실시예에서 제작된 CD19-특이적 CAR-T 세포의 타겟종양세포에 대한 세포사멸 활성은 4시간 동안 방출된 EuTDA를 DELFIA 세포독성 측정 키트(PerkinElmer, #AD0116)로 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 타겟종양세포를 DELFIA BATDA 시약과 15분간 37℃에서 반응시킨 후, RPMI 1640 배지로 3회 세척하였다. 그 후, 타겟종양세포를 5×104 세포/㎖이 되도록 배양배지에 재현탁하였다. CAR-T 세포를 상기 타겟종양세포(5×103)와 96웰 V-bottom plate에서 소정의 비율로 공배양하였다. 그 후, 배양배지(20 ㎕)를 white bottom plate에 옮겨 Europium 용액(200 ㎕)와 섞고 15분 동안 약하게 교반하면서 반응시켰다.
배지로 방출된 TDA는 SpectraMax iD5 MultiMode 마이크로 플레이트 리더(Molecular Device)를 이용하여 형광을 측정하여 평가하였다. 각 실험은 삼중(triplication)으로 진행하였고, 용해도는 형광 측정치를 이용하여 다음의 식을 통해 산출하였다:
<수학식 1>
% 용해도 = {(실험군의 방출값-기본 방출값)/(최대 방출값-기본 방출값)}x100;
이때, 기본 방출값은 타겟종양세포의 자발적 방출에서 측정된 값이며, 최대 방출값은 타겟종양세포를 DELFIA 용해버퍼로 완전용해시킨 후 측정한 값이다.
실험예 5.2. 루시퍼라아제를 기반으로 한 CAR-T 세포의 세포사멸 활성 측정
상기 실시예에서 제작한 CAR-T 세포와 반딧불 루시퍼라아제가 발현되는 타겟종양세포(3×104)를 96웰 U-bottom plate에서 소정의 비율로 공배양하였다. 각각의 실험은 2회 반복 실시하였다. 구체적으로, 75 ㎍/㎖ D-Luciferin potassium salt(PerkinElmer, #122799)를 첨가하고 37℃에서 타겟종양세포별 최적화한 시간동안 배양하였다. 그 후, SpectraMax iD5 MultiMode 마이크로 플레이트 리더기(Molecular Device)를 이용하여 살아있는 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. CAR(+)-T 세포에 의한 타겟종양세포 용해능은 각각의 E:T(effector(CAR-T 세포):target(타겟종양세포)) 비율에서 CAR-T 세포에 의해 유도된 루시퍼레이즈 활성값과 형질 도입되지 않은 T 세포에 의해 유도된 루시퍼레이즈 활성값의 차이를 비교하여 평가하였다. 결과는 2회 실험에 대한 평균값으로 나타내었다(도 68(상단), 도 75). 각 실험에 있어서, 형질 도입 시 효율의 차이를 보정하기 위해, 형질도입 되지 않은 T 세포를 사용하여 CAR-T 세포수와 T 세포의 총 수를 동일하게 보정한 후 실험을 수행하였다.
실험예 6. 세포 이동 측정
상기 실시예에서 제작된 CAR-T 세포의 이동능은 8 μm pore의 멤브레인 인서트를 갖춘 트랜스웰(24웰, Corning, #3422)을 이용하여 측정하였다. 항-CD3/항-CD28 Dynabeads와 반응시킨 CAR-T 세포에서 bead를 제거한 후, 0.2 ㎍/㎖ 재조합 인간 EGF(Sino Biological, #10605-HNAE)가 첨가된 무혈청 RPMI1640 배지(0.25% 인간 혈청 알부민(GreenCross) 포함)에 CAR-T 세포를 재현탁하였다. 상기 CAR-T 세포를 트랜스웰의 상부 챔버에 로딩하고, 하부 챔버에는 0.25% 인간 혈청 알부민(GreenCross)을 포함한 RPMI1640 배지를 처리하였다. 1시간 배양 후, 하부 챔버로 이동한 세포수를 유세포 분석 및 트리판 블루 염색 방법을 이용하여 측정하였다(도 66, 도 74).
또한, CAR-T 세포의 항원 자극에 의한 내인성 이동능을 비교평가하기 위하여, CAR-T 세포와 타겟종양세포를 1:1비율로 37℃에서 48시간 배양 후(96웰 U-bottom plate 이용), 세포 이미지를 촬영하였다. 이때, CAR-T 단독 배양한 실험군을 음성 대조군으로 사용하였다(도 67).
형질 도입 시 효율의 차이를 보정하기 위해, 형질도입 되지 않은 T 세포를 사용하여 형질 도입된 CAR-T 세포(CAR(+)-T 세포)수와 T 세포의 총 수를 동일하게 보정한 후 실험을 수행하였다. 배지 1 및 배지 2에 사이토카인을 처리하지 않았으며, 배지 1과 배지 2의 혈청 조성은 상이하다.
II. 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T의 활성 확인: In vivo
실험예 7. 혈액암 세포 모델을 이용한 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T 세포의 항암효능 평가(I)
하기와 같은 방법을 통해, CAR-T 세포_19bbz와 CAR-T 세포_19bbz#F의 항암효능을 용량별(1x106, 3x106, 1x107) 비교 평가하였다. 혈액암 세포 모델로 firefly luciferase 유전자가 도입된 Daudi 암세포주(Daudi-Fluc)를 사용하였다.
혈액암을 유도하기 위해서, 일정기간 순화기간을 거친 건강한 NPG(NOD-Prkdcscid IL2rgnull)(Vital Star, China) 암컷 마우스(7 주령)의 꼬리 좌우측 정맥에 100 ㎕에 제조된 1Х106 Daudi-Fluc 세포를 주입하였다. Daudi-Fluc 암세포주 이식 후, 10일 차에 D-luciferin(PerkinElmer,USA) 용액을 복강주사하고, 10분 후 IVIS 이미징 장비(PerkinElmer, USA)를 이용하여 촬영하였다. 이후 IVIS Lumina Series Software로 개체별 Luciferase 발현도를 측정한 뒤, 평균값을 계산하여 군분리를 수행하였다. 각각의 CAR-T 세포의 항암효능 평가를 위해서, 100 ㎕에 지정용량(1x106, 3x106, 1x107)의 CAR-T 세포를 마우스 꼬리의 좌우측 정맥에 1 ㎖ 주사기(BD REF328820, 31G)를 사용하여 투여하였다. 암세포 주입 후, 각기 14일, 21일, 28일, 35일, 42일차에 상기와 같은 방법으로 D-Luciferin용액을 복강주사하고, IVIS 이미징을 통해 종양 성장을 추적 관찰하였다(도 50). CAR-T 세포_19bbz를 대조군으로 설정하였다.
그 결과, 도 50에서 나타낸 바와 같이, CAR-T 세포를 고용량으로 투여시 CAR-T_19bbz#F를 처리한 군에서만 종양의 억제가 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 8. 혈액암 세포 모델을 이용한 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T 세포의 항암효능 평가(II)
하기와 같은 방법을 통해, CAR-T 세포_19bbz#F, CAR-T 세포_19bbz#C, CAR-T 세포_19bbz#M, CAR-T 세포_19bbz#N, CAR-T 세포_19bbz#S1, CAR-T 세포_19bbz#S2, CAR-T 세포_19bbz#TC, CAR-T 세포_19bbz#RG 및 CAR-T 세포_19bbzT의 항암효능을 평가하였다. 혈액암 세포 모델로 firefly luciferase 유전자가 도입된 Daudi 암세포주(Daudi-Fluc)를 사용하였다.
혈액암을 유도하기 위해서, 일정기간 순화기간을 거친 건강한 NPG(NOD-Prkdcscid IL2rgnull)(Vital Star, China) 암컷 마우스(7 주령)의 꼬리 좌우측 정맥에 100 ㎕에 제조된 1Х106 Daudi-Fluc 세포를 주입하였다. Daudi-Fluc 암세포주 이식 후, 10일 차에 D-luciferin(PerkinElmer, USA)용액을 복강주사하고, 10분 후 IVIS 이미징 장비(PerkinElmer, USA)를 이용하여 촬영하였다. 이후 IVIS Lumina Series Software로 개체별 Luciferase 발현도를 측정한 뒤, 평균값을 계산하여 군분리를 수행하였다.
군분리 후 각각의 CAR-T 세포의 항암효능 평가를 위해서, 100 ㎕에 제조된 1Х107 CAR-T 세포를 마우스 꼬리의 좌우측 정맥에 1 ㎖ 주사기(BD REF328820, 31G)를 사용하여 투여하였다. 암세포 주입 후, 각기 14일, 17일, 21일, 28일과 35일 차에 상기와 같은 방법으로 D-Luciferin용액을 복강주사하고, IVIS 이미징을 통해 종양 성장을 추적 관찰하였다(도 7). CAR-T 세포_19bbz를 대조군으로 설정하였다. 그 결과, 세포 신호 인자를 과발현하는 CAR-T의 항암 효과가 우수함을 확인하였다.
실험예 9. 고형암 모델을 이용한 신호 기전 조절 인자가 도입된 CAR-T 세포의 항암효능 평가
하기와 같은 방법을 통해, CAR-T 세포_Hbbz, CAR-T 세포_Hbbz#F 및 CAR-T 세포_Hbbz#FCS2의 항암효능을 평가하였다. Her2를 발현하는 고형암 세포 모델로 firefly luciferase 유전자가 도입된 SKBR3암세포주(SKBR3-Luc)를 사용하였다.
일정기간 순화기간을 거친 건강한 NSGA(NOD-Prkdcscid IL2rgnull)(JA Bio, Korea) 암컷 마우스(7 주령)의 복강에 200 ㎕에 제조된 2Х106 SKBR3-Luc 세포를 주입하였다. SKBR3-Luc 암세포주 이식 후, 14일 차에 D-luciferin(PerkinElmer, USA)용액을 복강주사하고, 10분 후 IVIS 이미징 장비(PerkinElmer, USA)를 이용하여 촬영하였다. 이후 IVIS Lumina Series Software로 개체별 Luciferase 발현도를 측정한 뒤, 평균값을 계산하여 군분리를 수행하였다.
군분리 후 각각의 CAR-T 세포의 항암효능 평가를 위해서, 100 ㎕에 제조된 CAR T 세포(용량: 1x106 CAR(+)-T 세포)를 마우스 꼬리의 좌우측 정맥에 1 ㎖ 주사기(BD REF328820, 31G)를 사용하여 투여하였다. 암세포 주입 후, 21일차(1 주 Post-CAR T injection), 28일차(2 주 Post-CAR T injection), 35일차(3 주 Post-CAR T injection)에 상기와 같은 방법으로 D-Luciferin용액을 복강주사하고, IVIS 이미징을 통해 종양 성장을 추적 관찰하였다. 정량적 이미지 데이터는 Lumina Series Software를 통해 확보하였다. PBS 투여군을 대조군으로 설정하였다.
그 결과를 도 76에 나타내었다. 그림에서 나타낸 바와 같이, 일 실시예에서 제조된 CAR-T 세포가 고형암에서도 효과가 우수함을 확인하였다.

Claims (71)

  1. 하기 (i) 내지 (v)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드:
    (i) 항원 결합 도메인;
    (ii) 막관통 도메인;
    (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인;
    (iv) 자가-절단성 펩타이드; 및
    (v) 신호 기전 조절 인자;를
    포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 항원 결합 도메인과 (ii) 막관통 도메인 사이에는 스페이서를 더 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질, b) 이뮤노필린, c) 항원 손실-매개 재발(antigen loss-mediated relapse)에 관여하는 단백질, d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질, e) 네거티브 피드백(negative feedback) 억제에 관여하는 단백질 및 f) 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 세포질 내에서 작동하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질은 TGF-β/SMAD(FKBP12-FK506/rapamycin) 신호 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 TGF-β/SMAD(FKBP12-FK506/rapamycin) 신호 경로에 위치하는 단백질은 FKBP12, SMAD4 단백질 C-말단 MH2 도메인 및 N-SKI으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질은 억제성 면역체크포인트 경로(Inhibitory immune checkpoint pathway)에 위치하는 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 억제성 면역체크포인트 경로에 위치하는 단백질은 SHP-1 단백질의 N-SH2 도메인이나 이의 단편 또는 SHP-2 단백질의 N-SH2 도메인 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 이뮤노필린은 FKBP12 또는 이의 단편, 또는 사이클로필린 A 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질은 트로고사이토시스(Trogocytosis)에 관여하는 단백질 또는 이의 단편인 것이, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 트로고사이토시스에 관여하는 단백질은 TC21 또는 RhoG인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제3항에 있어서,
    상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 TCR/Zap70 경로의 어댑터 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 TCR/Zap70 경로의 어댑터는 NCK1, LAT 및 NEMO으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제3항에 있어서,
    상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 TNFR/TLR 수용체(TRAF/NF-kB) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제3항에 있어서,
    상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 MAP 키나제 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 MAP 키나제 경로에 위치한 단백질은 GADD45α, CDC42 및 HRAS으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제3항에 있어서,
    상기 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질은 사이토카인 신호 경로의 네거티브 피드백(Negative feedback of cytokine signaling pathway) 억제에 관여하는 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 사이토카인 신호 경로의 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질은 SOCS1 단백질의 C말단 도메인인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 하기 구조식 (I)을 가지는 것인, 폴리뉴클레오티드:
    N'-X-L1-Y-C' (I)
    이때, 상기 구조식(I)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 L1은 자가-절단성 펩타이드이며,
    상기 X 및 Y는 각각 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; b) 이뮤노필린 또는 이의 단편; c) 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질 또는 이의 단편; d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; 및 e) 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 하기 구조식 (II)를 가지는 것인, 폴리뉴클레오티드:
    N'-X-L1-Y-L2-Z-C' (II)
    이때, 상기 구조식 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 L1은 자가-절단성 펩타이드이며,
    상기 X, Y 및 Z는 각각 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; b) 이뮤노필린 또는 이의 단편; c) 항원 손실-매개 재발에 관여하는 단백질 또는 이의 단편; d) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질 또는 이의 단편; 및 e) 네거티브 피드백 억제에 관여하는 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편, 사이클로필린 A 및 SHP2 단백질의 N-말단 SH2 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서바이빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 CD19에 특이적으로 결합하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인이 T-세포 수용체, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, AMN 및 PD-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인이 CD8α로부터 유래된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인이 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  29. 제1항에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인이 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서,
    상시 공자극 도메인이 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 분자로부터 유래된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  31. 제24항에 있어서,
    상기 공자극 도메인이 CD137(4-1BB)로부터 유래된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  32. 제29항에 있어서,
    상기 공자극 도메인이 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  33. 제29항에 있어서,
    상기 1차 신호전달 도메인이 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d으로부터 유래된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 1차 신호전달 도메인이 CD3ζ로부터 유래된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  35. 제29항에 있어서,
    상기 1차 신호전달 도메인이 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 자가-절단성 펩타이드가 P2A, E2A, F2A 또는 T2A로부터 유래된 것인, 폴리뉴클레오티드.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 자가-절단성 펩타이드가 P2A인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  38. 제1항 내지 제37항의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 벡터가 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 더 포함하는 것인, 벡터.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열이 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열 앞에 삽입되는 것인, 벡터.
  41. 제1항 내지 제37항의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스.
  42. 제1항 내지 제37항의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 도입된 면역세포.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 면역세포가 T 세포 또는 자연살해세포인 것인, 면역세포.
  44. 하기 (i) 내지 (v)를 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    (i) 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (iv) IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (v) 신호 기전 조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  45. 제44항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터.
  46. 제44항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스.
  47. 제44항의 폴리뉴클레오티드가 도입된 면역세포.
  48. 하기 (i) 내지 (iv)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드:
    (i) 항원 결합 도메인;
    (ii) 막관통 도메인;
    (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인;
    (iv) 신호 기전 조절 인자;를
    포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서,
    (i) 항원 결합 도메인과 (ii) 막관통 도메인 사이에는 스페이서를 더 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  50. 제48항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 TNFR/TLR 수용체 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 TNFR/TLR 수용체 경로에 위치한 단백질은 TLR4 세포내 도메인인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  53. 제50항에 있어서,
    상기 T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질은 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질 또는 이의 단편인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  54. 제51항에 있어서,
    상기 사이토카인 수용체(JAK-STAT) 경로에 위치한 단백질은 γc인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  55. 제48항 내지 제54항의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 벡터가 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 더 포함하는 것인, 벡터.
  57. 제54항에 있어서,
    상기 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열이 항원 결합 도메인을 코딩하는 서열 앞에 삽입되는 것인, 벡터.
  58. 제48항 내지 제54항의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 포함된 바이러스.
  59. 제48항 내지 제54항의 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드가 도입된 면역세포.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 면역세포가 T 세포 또는 자연살해세포인 것인, 면역세포.
  61. 외래에서 도입된 신호 기전 조절 인자를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 면역세포.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 면역세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것인, 형질전환된 면역세포.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 면역세포는 CAR-T 세포 또는 TCR T 세포인 것인, 형질전환된 면역세포.
  64. 제61항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 a) 면역억제 신호 경로에 위치하는 단백질, b) 항원 손실-매개 재발(antigen loss-mediated relapse)에 관여하는 단백질, c) T 세포 자극 경로에 위치하는 단백질, d) 네거티브 피드백(negative feedback) 억제에 관여하는 단백질 및 e) 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인, 형질전환된 면역세포.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 FKBP12 단백질 또는 이의 단편; SMAD4 단백질 C말단 MH2도메인 또는 이의 단편; N-SKI 또는 이의 단편; 사이클로필린 A(CYPA) 또는 이의 단편; SHP-1 단백질 N-말단 SH2도메인 또는 이의 단편; SHP-2 단백질 N-말단 SH2도메인 또는 이의 단편; TC21 또는 이의 단편; RhoG 또는 이의 단편; NCK1 또는 이의 단편; LAT 또는 이의 단편; NEMO 또는 이의 단편; TLR4 세포내 도메인 또는 이의 단편; GADD45α 또는 이의 단편; CDC42 또는 이의 단편; HRAS 또는 이의 단편; 및 SOCS1 C-말단 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 형질전환된 면역세포.
  66. 제63항에 있어서,
    상기 CAR-T 세포는 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 면역세포.
  67. 제61항에 있어서,
    상기 신호 기전 조절 인자는 세포질 내에서 작동하는 것인, 형질전환된 면역세포.
  68. 제42항의 형질전환된 면역세포 또는 제61항의 형질전환된 면역세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종, 신장암, 흑색종, 다발 골수종, 뇌암, 골육종, 교모세포종, IgG-opsonized tumor, 림프종, 신경종, 중피종, 및 식도암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  70. 제42항의 형질전환된 면역세포 또는 제61항의 형질전환된 면역세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방 방법.
  71. 암 치료를 위한 제42항의 형질전환된 면역세포 또는 제61항의 형질전환된 면역세포의 용도.
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