WO2018194380A2 - Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a binding molecule capable of specifically binding to leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1 (Lrig-1) protein, which is a protein present on the surface of T regulatory cells (Treg cells), and the use thereof. It is about.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • autoimmune disease One of the most important traits of all normal individuals is their ability to recognize and eliminate non-self antigens, while not detrimentally reacting to self-constituting antigenic substances. To have. Such non-response of living body to self antigen is called immunologic unresponsiveness or tolerance. Self-tolerance occurs by removing lymphocytes that may have specific receptors for their antigens, or by inactivating their ability to react after contact with the magnetic antigens. When a problem arises in inducing or maintaining self-tolerance, an immune response occurs to self antigens, and the resulting disease is called an autoimmune disease.
  • the regulatory T cell plays an important role in naturally preventing the occurrence of excessive inflammation and immune response, but when the autoimmune disease and chronic inflammatory disease occurs, the function and number of the regulatory T cell is significantly reduced Has been reported. Therefore, in patients with immune and inflammatory diseases, it is important that regulatory T cells are produced at normal levels, which can be one of the treatments for these diseases.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDRs mainly serve to bind antigen epitopes of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially as CDR1, CDR2 and CDR3, starting from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • One object of the present invention is to provide a binding molecule specific for Lrig-1 protein present on the surface of a Regulatory T cell (Treg).
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the binding molecule according to the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide an expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted.
  • Still another object of the present invention is to provide a host cell line transfected with the expression vector according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody-drug conjugate according to the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating an immune-related disease comprising the binding molecule according to the present invention.
  • the inventors have discovered a Lrig-1 protein that is specifically present on the surface of regulatory T cells, and selects an antigenic epitope of the protein to specifically bind to the Lrig-1 protein.
  • the present invention was completed by fabricating.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1 protein.
  • a “binding molecule” is an intact immunoglobulin comprising a monoclonal antibody, such as a chimeric, humanized or human monoclonal antibody, or an immunoglobulin that binds to an antigen, for example By a variable domain comprising immunoglobulin fragments that compete with intact immunoglobulins for binding of influenza A virus to monomeric HA or trimer HA. Regardless of the structure, the antigen-binding fragment binds to the same antigen recognized by intact immunoglobulins.
  • An antigen-binding fragment comprises two or more continuations of the amino acid sequence of a binding molecule, at least 20 contiguous amino acid residues, at least 25 contiguous amino acid residues, at least 30 contiguous amino acid residues, at least 35 contiguous amino acid residues, at least 40 contiguous amino acid residues.
  • At least 50 contiguous amino acid residues at least 60 contiguous amino acid residues, at least 70 contiguous amino acid residues, at least 80 contiguous amino acid residues, at least 90 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, Peptides or polypeptides comprising an amino acid sequence of at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues.
  • Antigen-binding fragments are in particular Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv, dAb, Fd, complementarity determining region (CDR) fragments, single-chain antibodies (scFv), bivalent Single-chain antibodies, single-chain phage antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, polypeptides containing one or more fragments of immunoglobulin sufficient to bind a particular antigen to a polypeptide, and the like.
  • the fragments may be produced synthetically or by enzymatic or chemical digestion of complete immunoglobulins or may be produced genetically by recombinant DNA techniques. Production methods are well known in the art.
  • the Lrig-1 protein is a transmembrane protein consisting of 1091 amino acids present on the surface of regulatory T cells, leucine-rich repeat (LRR) and three immunities of the extracellular or lumen side. It consists of immunoglobulin-like domains, cell membrane penetration sequences and cytoplasmic tails.
  • the LRIG gene family includes LRIG1, LRIG2 and LRIG3, and the amino acids between them are highly conserved.
  • the LRIG1 gene is highly expressed in normal skin and can be expressed in the basal and hair follicle cells to control the proliferation of epithelial stem cells.
  • the Lrig-1 protein may be a protein present in humans or mice, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein may be a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 derived from human or a polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 derived from mouse, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1 may be encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3 may be encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain CDR1 consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5, 13, 21 and 29
  • a heavy chain CDR2 consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 14, 22 and 30
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 15, 23, and 31;
  • Light chain CDR1 consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 16, 24, and 32
  • Light chain CDR2 represented by the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9, 17, 25, and 33
  • It may be a binding molecule comprising a light chain variable region comprising
  • light chain CDR3 consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 18, 26 and 34.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain variable region selected from the group consisting of: a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 29, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 30, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 31;
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 18;
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 24, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 25, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region selected from the group consisting of; a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 32, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 33, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 34; It may be a binding molecule.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 5, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 7; And a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 8, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 10;
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 21, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 22, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 23;
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 24, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 25, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 29, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 30, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 31;
  • a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 32, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 33, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 34; and a binding molecule selected from the group consisting of: have.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a heavy chain variable region consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 11, 19, 27, and 35;
  • It may be a binding molecule comprising a; light chain variable region consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 20, 28 and 36.
  • the binding molecule In the present invention, the binding molecule,
  • a binding molecule comprising a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 11, and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 12;
  • a binding molecule comprising a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 20;
  • a binding molecule comprising a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 27, and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 28;
  • It may be a binding molecule selected from the group consisting of; a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 35, and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 36.
  • the binding molecule may further include a fragment crystallization region or a constant region.
  • the Fc region may be an Fc region of an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody, may be derived from it, or may be a hybrid Fc region.
  • the Fc region may be an Fc region of a mammalian-derived IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody, and preferably, may be an Fc region of a human-derived IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody, but is not limited thereto. .
  • the Fc region may be a mouse-derived IgG2a Fc region represented by SEQ ID NO: 37, but is not limited thereto.
  • the Fc region may be a mouse-derived immunoglobulin kappa constant region represented by SEQ ID NO: 38.
  • the Fc region may be a human-derived IgG1 Fc region represented by SEQ ID NO: 39.
  • the Fc region may be a human-derived IgG2 Fc region represented by SEQ ID NO: 40, but is not limited thereto.
  • the Fc region may be a human-derived IgG4 Fc region represented by SEQ ID NO: 42, but is not limited thereto.
  • the Fc region may be a human-derived immunoglobulin kappa constant region represented by SEQ ID NO: 43, but is not limited thereto.
  • the Fc region may be a human-derived immunoglobulin lambda constant region, but is not limited thereto.
  • the hybrid Fc region may be represented by SEQ ID NO: 44, but is not limited thereto.
  • a peptide linker consisting of 33 amino acids located in the 282 to 314th part of the human albumin most present in the blood, more preferably consisting of 13 amino acids located in the 292 to 304th part It may be a peptide linker, which is a part that is mostly exposed to the outside of the three-dimensional structure is a part that minimizes the possibility of inducing an immune response in the body. However, it is not limited thereto.
  • the binding molecule of the present invention may further comprise a heavy chain constant region consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 39, 41, 42, 43 and 44.
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37;
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, 41, 42 or 43;
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a heavy chain constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 may further be included.
  • binding molecule of the present invention is a binding molecule of the present invention.
  • a binding molecule comprising a heavy chain represented by SEQ ID NO: 45, and a light chain represented by SEQ ID NO: 46;
  • a binding molecule comprising a heavy chain represented by SEQ ID NO: 47, and a light chain represented by SEQ ID NO: 48;
  • a binding molecule comprising a heavy chain represented by SEQ ID NO: 49, and a light chain represented by SEQ ID NO: 50;
  • It may be a binding molecule selected from the group consisting of; a binding molecule comprising a heavy chain represented by SEQ ID NO: 51, and a light chain represented by SEQ ID NO: 52.
  • the binding molecule of the present invention is characterized by being an antibody, but is not limited thereto.
  • the antibody has the ability to bind to Lrig-1 protein as a monoclonal antibody, a full-length antibody or as part of an antibody and competitively binds to the Lrig-1 antigen determination site with the binding molecule of the invention. It includes all antibody fragments.
  • the "antibody” refers to a protein molecule that serves as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen.
  • the antigen may be Lrig-1 protein present on the surface of regulatory T cells. Preferably, it may be to specifically recognize the Leucine Rich Region or the immunoglobulin-like domain of the Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • the "immunoglobulin” has a heavy chain and a light chain, and each heavy and light chain includes a constant region and a variable region.
  • the variable regions of the light and heavy chains comprise three multivariable regions and four framework regions called complementarity determining regions (hereinafter referred to as "CDRs").
  • the CDR mainly serves to bind to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially as CDR1, CDR2 and CDR3, starting from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the "monoclonal antibody” refers to an antibody molecule having a single molecule composition obtained from substantially the same antibody population, and exhibits a single binding specificity and affinity for a specific antigenic epitope.
  • the "full length antibody” is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected by a heavy chain and disulfide bond, and includes IgA, IgD, IgE, IgM, and IgG.
  • the IgG subtypes thereof include IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the "fragment of an antibody” means a fragment having an antigen binding function, and includes Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv.
  • the Fab has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and a first constant region of the heavy chain (CH1 domain).
  • Fab ' also differs from Fab in that it has a hinge region comprising one or more cysteine residues at the C terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Variable fragment refers to the smallest fragment of an antibody having only the heavy and light chain variable regions.
  • Double-chain Fv (dsFv) is a disulfide bond in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked, and a short-chain Fv (scFv) is generally covalently linked in a heavy chain variable region and a light chain variable region through a peptide linker.
  • the antibody fragment can be obtained by using a proteolytic enzyme, for example, papain or pepsin, fragments of Fab or F (ab ') 2 and can be produced through genetic recombination techniques.
  • the antibody is a chimeric antibody, humanized antibody, bivalent, bispecific molecule, minibody, domain antibody, bispecific antibody, antibody mimetic, dia It may be a body, a triabody, a tetrabody, or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the "humanized antibody” refers to an antibody in which the protein sequence of an antibody derived from a non-human species is modified to be similar to antibody variants naturally produced in humans.
  • the humanized antibody may be prepared by recombining a mouse-derived CDR with a human antibody-derived FR to produce a humanized variable region, and may be recombined with a constant region of a preferred human antibody to prepare a humanized antibody. May also be provided as a bispecific antibody or bispecific antigen binding fragment capable of binding to Lrig-1 protein and binding to other proteins.
  • Bispecific antibodies and bispecific antigen binding fragments provided herein provide antigen binding domains, which are binding molecules capable of binding to Lrig-1 proteins, and antigen binding domains capable of binding other target proteins. Include.
  • the antigen binding domain capable of binding other target proteins is a protein other than Lrig-1 protein, but may be, for example, an antigen binding domain capable of binding PD-1 or cell surface receptors. However, it is not limited thereto.
  • Bispecific antibodies and bispecific antigen binding fragments according to the present invention may be in any suitable format, for example, Kontermann MAbs 2012, 4 (2): 182-197, which is incorporated herein by reference in its entirety. It may be provided in the format described in.
  • a bispecific antibody or bispecific antigen binding fragment may be a bispecific antibody conjugate (eg IgG2, F (ab ') 2 or CovX-body), bispecific IgG or IgG-type molecule (eg IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, or 2 in 1-IgG, mAb2, or Tandemab common LC), asymmetric bispecific IgG Or IgG-type molecules (eg kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb
  • bispecific antibodies in the present invention are described, for example, in DM and Bast, BJ 2001. Production of Bispecific Antibodies.Current Protocols in Immunology. 14: IV: 2.13: 2.13 As described in .1-2.13.16), wherein the antibody-producing hybridomas are fused with, for example, polyethylene glycol to produce quadroma cells capable of secreting bispecific antibodies.
  • Bispecific antibodies and bispecific antigen binding fragments according to the invention are also described, for example, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), both of which are hereby incorporated by reference in their entirety. ), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), or French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40: 333-339)
  • it can be produced recombinantly by expression from a nucleic acid construct encoding a polypeptide for an antigen binding molecule.
  • two antigen binding domains ie, light and heavy chain variable domains for antigen binding domains that can bind PD-1, and light and heavy chain variable domains for antigen binding domains that can bind other target proteins.
  • DNA constructs comprising sequences encoding light and heavy chain variable domains, and encoding suitable linkers or dimerization domains between antigen binding domains can be prepared by molecular cloning techniques.
  • Recombinant bispecific antibodies can then be produced by expression of the construct (eg in vitro) in a suitable host cell (eg a mammalian host cell), and then the expressed recombinant bispecific antibody can be optionally purified.
  • Antibodies can be produced by an affinity maturation process in which a modified antibody is produced with improved affinity of the antibody for antigen as compared to an unmodified parent antibody.
  • Affinity matured antibodies are described in the art, for example, in Marks et al., Rio / Technology 10: 779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809- 3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-159 (1995) and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
  • the binding molecule provided in the present invention may include a variant of the amino acid sequence as long as it can specifically bind to Lrig-1 protein.
  • changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be referred to as biologically functional equivalents.
  • each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • binding molecules of the present invention are also construed to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing.
  • the term "substantial identity” means at least 61% of the parallelism between the sequence of the present invention and any other sequence as closely as possible and when the paralleled sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. By a sequence that shows homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI), etc.
  • BLSAT is accessible at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparison methods using this program can be found online (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html).
  • the binding molecule preferably the antibody
  • the binding molecule may be produced by conventional methods of producing the antibody, but may be produced by affinity maturation.
  • affinity maturation refers to a process in which activated B cells produce an antibody having an increased affinity for an antigen during an immune response.
  • said affinity maturation can produce antibodies or antibody fragments produced due to affinity maturation based on the principles of mutation and selection, in the same manner as in nature.
  • Binding molecules provided herein preferably antibodies, specifically activate immune function, increase the number of cells and regulate immune tolerance of immune cells, thereby effectively preventing immune-related diseases. Can be improved or treated.
  • the "immune related disease” is a disease induced by excessive activation and expression of various immune cells and inflammatory cells, for example, autoimmune diseases; Graft-versus-host disease; Organ transplant rejection; asthma; atopy; Or an acute or chronic inflammatory disease, but is not limited thereto.
  • the "autoimmune disease” is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Bechesi disease, Sjogren's syndrome, Gillia-Barre syndrome, chronic It may be one or more selected from the group consisting of thyroiditis, multiple sclerosis, multiple myositis, ankylosing spondylitis, fibromyalitis and nodular polyarteritis, but is not limited thereto.
  • nucleic acid molecule encoding the binding molecule provided in the present invention is provided.
  • Nucleic acid molecules of the invention include both nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of the binding molecule provided herein is translated into a polynucleotide sequence, as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences can be prepared by an open reading frame (ORF), all of which are also included in the nucleic acid molecules of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • an expression vector into which the isolated nucleic acid molecule provided in the present invention is inserted is provided.
  • the "vector” is the nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector which refers to circular double stranded DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • a phage vector Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Some vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors are episomal mammalian vectors of bacterial replication origin).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • Other vectors can enter the host cell and integrate into the genome of the host cell, thereby replicating with the host genome.
  • some vectors can direct the expression of the genes to which they are linked in a working dimension.
  • Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” or simply "expression vectors.”
  • expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids.
  • plasmid and vector may be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used form of the vector.
  • the expression vector in the present invention include commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vectors; Cosmid; Phages such as lambda, lambbdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; It can be selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto. All expression vectors known to those skilled in the art as expression vectors can be used in the present invention, and the selection of the expression vector depends on the nature of the host cell of interest.
  • the introduction of the vector into the host cell may be performed by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-dextran controlled transfection, lipofectamine transfection or electroporation, but is not limited thereto.
  • An introduction method suitable for the expression vector and the host cell can be selected and used.
  • the vector contains one or more selection markers, but is not limited thereto, and may be selected depending on whether the product is produced using a vector that does not include the selection marker.
  • the selection of the selection marker is selected by the host cell of interest, which uses methods already known to those skilled in the art and the present invention is not so limited.
  • tag sequences can be inserted and fused to an expression vector.
  • the tag may include, but is not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag. Any tag that facilitates purification known to those skilled in the art may be used in the present invention.
  • a host cell line transfected with the expression vector provided in the present invention.
  • host cell in the present invention includes individual cells or cell cultures that may or may have been recipients of the vector (s) for incorporation of the polypeptide insert.
  • Host cells include the progeny of a single host cell, which may not necessarily be exactly the same (in morphological or genomic DNA complement) as the original parent cell because of natural, accidental or intentional mutations.
  • Host cells include cells transfected in vivo with the polypeptide (s) herein.
  • the host cell may include cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin, for example, bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Fungal cells such as yeast cells and peach pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Chinese hamster ovary cells (CHO), SP2 / 0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, bow melanoma cells, HT-1080, BHK (Baby hamster kidney cells, Baby Hamster Kidney cells), animal cells of HEK (Human Embryonic Kidney cells) or PERC.6 (human retinal cells); Or it may be a plant cell, but is not limited thereto, any cell that can be used as a host cell line known to those skilled in the art is available.
  • bacterial cells such as E. coli, Streptomy
  • an antibody-drug conjugate comprising the antibody and drug provided in the present invention.
  • the "antibody-drug conjugate (ADC)" refers to a form in which the drug and the antibody are chemically linked without degrading the biological activity of the antibody and the drug.
  • the antibody-drug conjugate is a form in which a drug is bound to an amino acid residue at the N-terminus of the heavy and / or light chain of the antibody, specifically, the N-terminal, ⁇ -amine group of the heavy and / or light chain of the antibody. This refers to the combined form.
  • the "drug” may mean any substance having a specific biological activity in a cell, which is a concept including DNA, RNA or peptides.
  • the drug may be in a form including a reactor capable of reacting and crosslinking with an ⁇ -amine group, and also including a form in which a linker including a reactor capable of reacting with and reacting with an ⁇ -amine group is connected.
  • Examples of the reactor that can be crosslinked by reacting with the ⁇ -amine group in the present invention are not particularly limited as long as the reactor can be crosslinked by reacting with an ⁇ -amine group at the N-terminal end of a heavy or light chain of an antibody. It includes all the kinds which react with known amine groups. Examples include isothiocyanate, isocyanates, acyl azides, NHS esters, sulfonyl chlorides, aldehydes, glyoxals, Epoxide, Oxirane, Carbonate, Aryl halide, Imidoester, Carbodiimide, Anhydride and Fluorophenyl ester ester), but is not limited thereto.
  • the drug is included regardless of the type of drug that can treat the disease targeted by the Lrig-1 antibody, but preferably immune-related disease, for example, autoimmune disease, graft versus host disease , Organ transplant rejection, asthma, atopy, or acute or chronic inflammatory diseases.
  • immune-related disease for example, autoimmune disease, graft versus host disease , Organ transplant rejection, asthma, atopy, or acute or chronic inflammatory diseases.
  • a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of an immune-related disease comprising a binding molecule or an antibody-drug conjugate (ADC) provided in the present invention as an active ingredient.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Binding molecules provided herein preferably antibodies, specifically activate immune function, increase the number of cells and regulate immune tolerance of immune cells, thereby effectively preventing immune-related diseases. Can be improved or treated.
  • the "immune related disease” is a disease induced by excessive activation and expression of various immune cells and inflammatory cells, for example, autoimmune diseases; Graft-versus-host disease; Organ transplant rejection; asthma; atopy; Or an acute or chronic inflammatory disease, but is not limited thereto.
  • the "autoimmune disease” is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Bechesi disease, Sjogren's syndrome, Gillia-Barre syndrome, chronic It may be one or more selected from the group consisting of thyroiditis, multiple sclerosis, multiple myositis, ankylosing spondylitis, fibromyalitis and nodular polyarteritis, but is not limited thereto.
  • prophylaxis may be used without limitation any action to block the symptoms of the disease, or to suppress or delay the symptoms using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment may include without limitation any action that improves or benefits the symptoms of the disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that the capsule, tablets, granules, injections, ointments, powder or beverage form, the pharmaceutical composition may be characterized in that it is intended for humans.
  • the pharmaceutical composition is not limited thereto, but may be used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, such as powders, granules, capsules, tablets, and aqueous suspensions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc.
  • buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have. And other solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like.
  • Suitable carriers, excipients, and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may further be included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition in the present invention is not limited to these, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route of administration, and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg / kg per day. Or 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • a binding molecule preferably an antibody, specific for the Lrig-1 protein according to the present invention activates the function of regulatory T cells and increases their cell numbers, and regulates immune tolerance to control various immune and inflammatory cells. It is a disease induced by excessive activation and expression of the disease, for example, autoimmune diseases, graft versus host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, or acute or chronic inflammatory diseases such as inflammatory diseases effectively Prevention, amelioration or treatment.
  • the binding molecule specific to the Lrig-1 protein according to the present invention preferably an antibody
  • the binding molecule specific to the Lrig-1 protein according to the present invention can be more effectively targeted to the Lrig-1 protein as compared to the antibody against Lrig-1, which is commercially available, It also has a very good advantage.
  • Figure 1 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of predicting the epitope of the antigen of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of predicting the epitope of the antigen of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the expression level of Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the result of comparing the expression level of Lrig-1 protein in regulatory T cells and non-regulated T cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 shows the expression of Lrig-1 protein on the surface of regulatory T cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of analyzing the binding capacity of Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) to Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of analyzing the mechanism of Lrig-1 protein-induced Stat3 phosphorylation in regulatory T cells of Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) according to an embodiment of the present invention will be.
  • Figure 13 shows an experimental design for the therapeutic effect of autoimmune diseases of Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 14 shows the results of analyzing the therapeutic effect of autoimmune diseases of Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) according to an embodiment of the present invention.
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 5, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 6, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 7;
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 8, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 10;
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 21, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 22, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 23;
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 24, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 25, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 29, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 30, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 31;
  • a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 32, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 33, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 34; a binding molecule selected from the group consisting of to provide.
  • T cells In order to confirm that Lrig-1 protein is expressed only in regulatory T cells (Treg), subsets of T cells, Th0, Th1, Th2, Th17 and iTreg, were prepared.
  • the iTreg refers to cells which artificially induced differentiation in a medium containing the following composition, unlike nTreg, which is naturally isolated.
  • Subtypes of T cells were first isolated from na ⁇ ve T cells obtained from the spleen of the rat, and then RPMI1640 containing 10% fetal bovine serum (FBS; hyclone, logan, UT) (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY). To further include each of the components of Table 1 in the nutrient medium, differentiation was induced to each cell through 72 hours incubation in 37 °C, 5% CO 2 incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • the three-dimensional conformation of the extracellular domain of Lrig-1 protein was predicted to produce antibodies specific for Lrig-1 protein, the surface protein of regulatory T cells.
  • LRR1 to LRR15 existed in the Lrig-LRR domain (amino acid sequence Nos. 41 to 494) of the extracellular domain of Lrig-1 protein.
  • LRR domains consisted of 23 to 27 amino acids, with 3 to 5 leucine present.
  • the prediction of the nucleotide sequence was performed using Ellipro server (http://tools.iedb.org/ellipro/), which is an epitope prediction software based on the structure of the Lrig-1 protein.
  • the Ellipro search engine corresponds to a search engine known to have the highest reliability among algorithms for predicting existing antigenic determinants.
  • Example 2 After entering the extracellular domain analyzed in Example 1 into the epitope predictor software, the predicted contiguous or discontinuous amino acid sequences of the predicted epitope are shown in FIGS. 3 and 4.
  • Antibodies specific for the Lrig-1 protein according to the present invention were constructed. This antibody did not produce a specific antigenic determinant but produced an antibody capable of binding any site to Lrig-1 protein.
  • Lrig-1 protein cells expressing Lrig-1 protein were prepared. More specifically, the DNA fragment and pcDNA (hygro) corresponding to SEQ ID NO: 2 are cleaved with a cleavage enzyme, cultured at 37 ° C, and ligated to insert the DNA sequence of the Lrig-1 protein. Prepared pcDNA. The prepared pcDNA inserted SEQ ID NO: 2 was introduced through transfection into L cells so that Lrig-1 protein could be expressed on the surface of L cells.
  • a sequence of light and heavy chain amino acids capable of binding to Lrig-1 expressed on the cell surface was selected from the Human scFv library to select a total of eight heavy and light chains.
  • the selected heavy and light chain amino acid sequences were fused with the mlgG2a Fc region to prepare a monoclonal antibody.
  • the sequence of the monoclonal antibody is shown in Table 2 below.
  • Lrig-1 protein could act as a biomarker specific for regulatory T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen of the mice using magnet-activated cell sorting (MACS) through CD4 beads. Subsequently, regulatory T (CD4 + CD25 + T) and non-regulated T (CD4 + CD25 ⁇ T) cells were separated using a fluorescent activated cell sorter (FACS) using a CD25 antibody. Each cell and the cells differentiated in Preparation Example 1 extracted mRNA using Trizol, and genomic RNA removed gDNA by a protocol provided by a company using gDNA extraction kit (Qiagen). . gDNA removed mRNA was synthesized into cDNA through the BDsprint cDNA Synthesis Kit (Clonetech).
  • Lrig-1 in regulatory T ((CD4 + CD25 + T) cells is 18.1 times higher than non-regulated T (CD4 + CD25 - T) cells.
  • the expression level was about 10 times higher.
  • regulatory T cells, especially induction, were compared to other types of immune cells.
  • the expression of Lrig-1 mRNA was significantly higher in naturally isolated regulatory T cells (nTreg) than in regulatory T cells (iTreg).
  • Lrig-1 expression was the highest among the Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 corresponding to the Lrig family.
  • Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells, particularly naturally occurring regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein expressed from Lrig-1 mRNA was specifically expressed only in regulatory T cells.
  • a magnet-activated cell sorter (magnet-activated) from a mouse's spleen to CD4 beads using FOXP3-RFP-Knock-in mice incorporating a red fluorescence protein (RFP) to the FOXP3 promoter, a regulatory T cell-specific transcription factor.
  • CD4 + T cells were isolated using cell sorting (MACS). Then, by using RFP protein, regulatory T (CD4 + RFP + T) cells and unregulated T (CD4 + RFP - T) were obtained by fluorescence activated cell sorter (FACS). Each of the cells was purchased Lrig-1 antibody and negative control wasotype (isotype) staining to measure the expression level of Lrig-1 with a fluorescent active cell sorter, the results are shown in Figure 9.
  • the non-regulated T cells indicated by dotted lines showed almost the same expression level of Lrig-1 as the negative control, but there were a large number of cells with high expression levels of Lrig-1 in the case of regulatory T cells. .
  • Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein Since Lrig-1 protein must be expressed on the surface of regulatory T cells in order to be a target of cell therapy, more effective target therapy can be achieved. Therefore, it was confirmed whether Lrig-1 protein is expressed on the surface.
  • Each differentiated T cell subtype of Preparation Example 1 was stained with anti-CD4-APC and anti-Lrig-1-PE antibodies and surfaced to each cell using a Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS). The expression level of Lrig-1 at was measured, and the results are shown in FIG.
  • Lrig-1 is expressed in an amount of 0.77 to 15.3 in activated T cells, Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, and Naive T cells, whereas differentiation. was highly expressed as 83.9 in T-induced T cells (iTreg).
  • Lrig-1 protein according to the present invention is not only specifically expressed in regulatory T cells (Treg) cells, but also more highly expressed on the surface of Treg cells.
  • each of the antibodies of Preparation Examples 1 to 8 was applied to L cells stably expressing Lrig-1. After binding, a secondary antibody conjugated with eFlour 670 conjugated with eFlour 670 was added, and then analyzed for binding to Lrig-1 protein of the monoclonal antibody using FACS. Is shown in FIG. 11.
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) according to the present invention was able to confirm that the effective recognition of the Lrig-1 protein present on the surface of L cells bound to .
  • the antibodies of Preparation Examples 1 to 8 were used in Treg cells After stimulating Lrig-1 present on the surface of the Treg cells, the degree of tyrosine phosphorylation of Stat3 protein present in the Treg cells stimulated by phosphotyrosine immunoblot The results are shown in FIG. 12.
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) according to the present invention was confirmed to increase the phosphorylation of Stat3 to the same level as Th17 cells.
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibody is induced by the excessive activation and expression of various immune cells and inflammatory cells, autoimmune disease, graft versus host disease, organ transplant rejection, asthma, It can be seen that atopic or immune-related diseases such as acute or chronic inflammatory diseases can be effectively prevented, improved or treated.
  • the present invention provides a binding molecule capable of specifically binding to leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1 (Lrig-1) protein, which is a protein present on the surface of T regulatory cells (Treg cells), and uses thereof.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • Reg cells T regulatory cells

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 결합 분자는, 조절 T 세포의 기능을 활성화하여 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등의 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자, 바람직하게 항체는, 기존에 상업적으로 판매되고 있던 Lrig-1에 대한 항체와 비교할 때 Lrig-1 단백질에 더욱 효과적으로 표적화 할 수 있고, 결합력 또한 매우 우수한 장점이 있다.

Description

LRIG-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
본 발명은 조절 T 세포(T regulatory cell; Treg cell)의 표면에 존재하는 단백질인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자 및 그의 용도에 관한 것이다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중 하나는, 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비-자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 제거할 수 있는 능력을 갖는 것이다. 이처럼 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 자기 관용은 자기 항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기 항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기 항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.
상기 자가면역질환의 치료를 위하여, 970년 대 초 Gershon에 의해 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과 기능(effector function)을 제어 및 억제할 수 있는 T 세포의 존재 가능성이 있는 억제 T 세포라는 개념을 도입하여, 처음으로 제시된 이래(R. K. Gershon and K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37), 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다.
이에, 상기 조절 T 세포(Treg cell)는 과다한 염증과 면역 반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증질환이 발생하는 경우 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것이 보고되었다. 따라서, 면역 질환과 염증 질환이 있는 환자의 경우, 조절 T 세포가 정상적인 수준으로 생성되는 것이 중요하며, 이는 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
현재까지 조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되어, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR 및 CD45RB 등의 물질이 표지 물질에 해당할 수 있음이 제시되어 왔지만, 아직 조절 T 세포만을 단독으로 표적화 할 수 있는 유전자 및 단백질은 존재하지 않는다.
한편, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포(Regulatory T cell; Treg)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체-약물 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 결합 분자를 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 존재하는 Lrig-1 단백질을 발견하고, 상기 단백질의 항원 결정 부위(epitope)를 선별하여 상기 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 "결합 분자"는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로믈린, 예를 들면 인플루엔자 A 바이러스의 단량체 HA 또는 삼량체 HA와의 결합을 위해 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. "항원-결합 단편"은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 1091개의 아미노산으로 이루어진 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역 체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 이들간의 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재 시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 인간 또는 쥐에 존재하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Lrig-1 단백질은 인간 유래인 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드이거나, 마우스 유래인 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 Lrig-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질은 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
서열번호 5, 13, 21 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6, 14, 22 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7, 15, 23 및 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 8, 16, 24 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9, 17, 25 및 33으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10, 18, 26 및 34로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
(a) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;
(b) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;
(c) 서열번호 21로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역; 및
(e) 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열번호 24로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;
(h) 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
(1) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
(2) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
(3) 서열번호 21로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 24로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
(4) 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서, 상기 결합 분자는,
서열번호 11, 19, 27 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 12, 20, 28 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는,
서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
서열번호 19로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
서열번호 27로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
서열번호 35로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자일 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Fc 영역(Fragment crystallization region) 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역이거나, 그로부터 유래된 것일 수 있고, 혹은 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역일 수 있다.
본 발명에서 상기 Fc 영역은 포유동물 유래 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역일 수 있고, 바람직하게는 인간 유래 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 37로 표시되는 마우스 유래 IgG2a Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 38로 표시되는 마우스 유래 면역글로불린 카파(kappa) 불변 영역일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 39로 표시되는 인간 유래 IgG1 Fc 영역일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 40으로 표시되는 인간 유래 IgG2 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 41로 표시되는 인간 유래 IgG3 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 42로 표시되는 인간 유래 IgG4 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 서열번호 43으로 표시되는 인간 유래 면역글로불린 카파(kappa) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Fc 영역은 인간 유래 면역글로불린 람다(lambda) 불변 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "하이브리드 Fc"는 인간 IgG 서브클래스의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유도될 수 있다. 상기 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자, 폴리펩티드 등에 결합하는 경우, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 높이는 효과가 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 하이브리드 Fc 영역은 서열번호 44로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 결합 분자에서 상기 Fc 또는 불변 영역은 상기 가변 영역에 링커(linker)로 연결될 수 있다. 이때 상기 Fc의 C-말단에 링커가 연결되며, 상기 링커에 본 발명의 결합 분자의 N-말단이 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "링커(linker)"는 목적하는 질환의 조직 또는 세포 내에서 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같이 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 경우에는 Fc 부분으로 인하여 폴리펩티드의 활성이 저하되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다. 본 발명에서는 링커의 바람직한 예로, 혈액 내에 가장 많이 존재하는 인간 알부민의 282번 내지 314번째 부분에 위치한 33개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 292번 내지 304번째 부분에 위치한 13개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커일 수 있으며, 이러한 부분은 3차원적인 구조상 대부분 외부에 노출된 부분으로서 체내에서 면역반응을 유도할 가능성이 최소화된 부분이다. 단, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 결합 분자는, 서열번호 37, 39, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는, 서열번호 38 또는 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 39, 41, 42 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는,
서열번호 45로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 46으로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;
서열번호 47로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 48로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;
서열번호 49로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 50으로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자; 및
서열번호 51로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 52로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 항체인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 전장 항체 (full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로써 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합하는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항체의 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. 또한, Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(Variable fragment)는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 다이설파이드 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 상기 항체 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.본 발명에서 상기 결합 분자는 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있고, 그 외의 다른 단백질에도 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편으로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 일 예시로, 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 결합 분자인 항원 결합 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함한다. 여기서, 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 Lrig-1 단백질 이외의 다른 단백질로, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, PD-1 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 임의의 적합한 포맷, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197)에 기재된 포맷으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(예: IgG2, F(ab')2 또는 CovX-바디), 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 또는 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 Tandemab common LC), 비대칭성 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍 또는 SEED-바디), 소형 이중특이적 항체 분자(예: 디아바디(Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv (taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디, 트리플 헤드, Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예: taFv-Fc, 디-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예: scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 특히, 문헌(참조: Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19)의 도 2를 참조한다. 당업자는 본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편을 설계하고 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하는 방법은, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16)에 기재된 바와 같이 환원성 디설파이드 또는 비환원성 티오에테르 결합과 항체 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 디설파이드 연결된 이중특이적 F(ab)2 헤테로다이머를 생성하기 위해, 예를 들면, 힌지 영역 SH- 그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하기 위한 다른 방법은, 예를 들면, 문헌(참조: D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16)에 기재된 바와 같이, 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마 세포를 생성하기 위해 항체-생산 하이브리도마를, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시킴을 포함한다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 또한, 예를 들면, 둘 다 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), 또는 French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339)에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 항원 결합 분자를 위한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로부터 발현에 의해 재조합으로 생산될 수 있다.
예를 들면, 2개의 항원 결합 도메인(즉, PD-1에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 이중특이적 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포) 중에서 작제물의 발현(예: 시험관내)에 의해 생산될 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 임의로 정제될 수 있다.
항체는, 비변형된 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙 공정에 의해 생성될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야, 예를 들면, 문헌(참조: Marks et al., Rio/Technology 10:779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-159 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992))에 공지된 절차로 생산될 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 결합 분자는, Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 수행할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York (1979)). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Gln/Glu 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 결합 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서 용어 "실질적인 동일성"이란, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 병렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 병렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio.48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 온라인(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html)을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자, 바람직하게 상기 항체는, 항체를 생산하는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있지만, 친화도 성숙(Affinity maturation)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "친화도 성숙(Affinity maturation)"은, 활성화된 B 세포가 면역 반응 과정에서 항원에 대한 친화도가 증가된 항체를 생산하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 친화도 성숙은 자연에서 일어나는 과정과 동일하게, 돌연변이와 선택의 원리에 기초하여 친화도 성숙으로 인해 생성된 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 결합 분자, 바람직하게 항체는 면역 세포 중 특히 조절 T 면역 세포(Treg cell)의 기능을 활성화시키고 그 세포 수를 증가시키며 면역 관용성(immunological tolerance)을 조절하여 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역 관련 질환"은 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 결합 분자의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하 시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명에서 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명에서 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 약물은 Lrig-1 항체가 표적으로 하는 질환을 치료할 수 있는 약물이라면 그 종류에 관계없이 포함되나, 바람직하게는 면역 관련 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등의 치료제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 결합 분자 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 결합 분자, 바람직하게 항체는 면역 세포 중 특히 조절 T 면역 세포(Treg cell)의 기능을 활성화시키고 그 세포 수를 증가시키며 면역 관용성(immunological tolerance)을 조절하여 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역 관련 질환"은 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자, 바람직하게는 항체는, 조절 T 세포의 기능을 활성화시키고 그 세포 수를 증가시키며, 면역 관용성(immunological tolerance)을 조절하여 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등의 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자, 바람직하게 항체는, 기존에 상업적으로 판매되고 있던 Lrig-1에 대한 항체와 비교할 때 Lrig-1 단백질에 더욱 효과적으로 표적화 할 수 있고, 결합력 또한 매우 우수한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)의 조절 T 세포 내에서 Lrig-1 단백질 유도 Stat3 인산화 조절 기작을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)의 자가면역질환의 치료 효과를 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)의 자가면역질환의 치료 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, (1) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
(2) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
(3) 서열번호 21로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 24로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
(4) 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는, 결합 분자를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도 하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNββ
Th17 IL-6, TGFββ, anti-IFNββ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFββ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(http://www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 항원 결정기(epitope) 아미노산 서열 예측
상기 염기서열의 예측은 Lrig-1 단백질의 구조를 기반으로 하는 항원 결정기 예측 소프트웨어(epitope prediction software)인 Ellipro 서버(http://tools.iedb.org/ellipro/)를 이용하였다. 상기 Ellipro 검색 엔진은 현존하는 항원 결정기를 예측하는 알고리즘 중에서 가장 신뢰도가 높다고 알려진 검색엔진에 해당하여 이를 이용하였다.
항원 결정기 예측 소프트웨어에 상기 실시예 1에서 분석된 세포외 도메인을 입력한 뒤, 예측된 항원 결정기의 예측된 연속 또는 불연속 아미노산 서열을 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3 및 4에서 보는 바와 같이, 연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 총 22개가 예측되었고, 불연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 총 8개가 예측되었다.
[제조예 1 내지 4] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Lright chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하여, 총 8개의 중쇄 및 경쇄를 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 mlgG2a Fc 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일 클론 항체의 서열은 하기 표 2와 같다.
구분 클론 위치 아미노산 서열 서열정보
제조예 1 A7 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKGLEWVSLIYPDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGLSWAGAFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 45
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 서열번호 46
제조예 2 C8 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISPGDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLYSNPNEPFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 47
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLNGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 서열번호 48
제조예 3 E7 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISPDGSNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVGLRCRYEACSYAYGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 49
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDSSLNGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 서열번호 50
제조예 4 G3 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISPSSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLDAFWRPSFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 51
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNNVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 서열번호 52
제조예 5 A8 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQVPGKGLEWVSWISHGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGLCKTGLCYYYDAMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK -
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNSVTWYQQLPGTAPKLLIYADNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC -
제조예 6 B8 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHWTTFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK -
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNNVTWYQQLPGTAPKLLIYANSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC -
제조예 7 D9 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDILPCPWGRCYYDYAMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK -
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSDSSSNIGSNTVSWYQQLPGTAPKLLIYADNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC -
제조예 8 H6 clone 중쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISHGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVISNCHLGVCYYSNGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK -
경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTWQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC -
[실시예 3] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T)세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T)세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 ΔΔCT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다.
프라이머 서열
쥐 Lrig-1 Forward 5' - GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT - 3'
Reverse 5' - CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG - 3'
쥐 Lrig-2 forward 5' - TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA- 3'
reverse 5' - GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA- 3'
쥐 Lrig-3 forward 5' - CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC - 3'
reverse 5' - CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG - 3'
쥐 FOXP3 forward 5' - CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC - 3'
reverse 5' - ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC - 3'
ACTG1 forward 5' - GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG - 3'
reverse 5' - ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA - 3'
도 5에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T)세포에 비하여 조절 T((CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.또한, 도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 8에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T)세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T)를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비-조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 5] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현 되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 Treg 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합능 평가
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1을 잘 인식하는 지를 확인하기 위하여, Lrig-1을 안정하게 발현하는 L 세포에 상기 제조예 1 내지 8의 항체 각각을 결합시킨 뒤 마우스 항체를 인식할 수 있으면서 eFlour 670이 컨쥬게이션(conjugation)된 2차 항체(secondary antibody)를 넣은 후 FACS를 이용하여 상기 단일클론항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3) 모두 L 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질을 효과적으로 인식하여 결합한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 본 발명에 따른 항체의 Treg 세포 내 신호전달경로의 조절
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1 단백질을 통하여 Treg 세포 내의 신호전달경로에 어떠한 영향을 미치는 지를 분석하기 위하여, 상기 제조예 1 내지 8의 항체를 Treg 세포에 처리하여 상기 Treg 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1를 자극한 뒤, 포스포티로신 면역 블롯(phosphotyrosine immunoblot)을 통하여 자극받은 Treg 세포 내에 존재하는 Stat3 단백질의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation) 정도를 분석하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 Th17 세포와 같은 수준으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] 본 발명에 따른 항체의 자가면역질환의 치료 효과
상기 제조예 1 내지 4에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)의 자가면역질환에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여, RAG-1-/- 마우스에 CD45RB(high) 세포들을 입양 이식(adoptive transfer)하여 자가면역질환인 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)을 유도한 뒤 상기 제조예 1 내지 4의 항체를 200㎍/mouse의 양으로 복강 내 주사한 뒤 자가면역질환의 치료 효과를 분석하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)는 염증성 장 질환 유도 마우스에서 몸무게 감소 효과를 현저하게 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체는 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등의 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명은 조절 T 세포(T regulatory cell; Treg cell)의 표면에 존재하는 단백질인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자 및 그의 용도로, 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등의 면역 관련 질환의 예방 또는 치료에 관한 것이다.
<110> Good T Cells, Inc.
<120> BINDING MOLECULE SPECIFIC TO LRIG-1 PROTEIN AND USE THEREOF
<130> DPB172433.k01
<150> KR 10-2017-0049854
<151> 2017-04-18
<160> 52
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 759
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Pro Arg Ala Pro Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Gly Asp Ser
1 5 10 15
Leu Asp Cys Gly Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Pro Gly Asp Leu Pro
20 25 30
Ser Trp Thr Arg Ser Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Lys Leu Ser Glu Ile
35 40 45
Asp Pro Ala Gly Phe Glu Asp Leu Pro Asn Leu Gln Glu Val Tyr Leu
50 55 60
Asn Asn Asn Glu Leu Thr Ala Val Pro Ser Leu Gly Ala Ala Ser Ser
65 70 75 80
His Val Val Ser Leu Phe Leu Gln His Asn Lys Ile Arg Ser Val Glu
85 90 95
Gly Ser Gln Leu Lys Ala Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Asp Leu Ser
100 105 110
Leu Asn Asn Ile Thr Glu Val Arg Asn Thr Cys Phe Pro His Gly Pro
115 120 125
Pro Ile Lys Glu Leu Asn Leu Ala Gly Asn Arg Ile Gly Thr Leu Glu
130 135 140
Leu Gly Ala Phe Asp Gly Leu Ser Arg Ser Leu Leu Thr Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Lys Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Val Arg Ala Phe Lys Leu Pro
165 170 175
Arg Leu Thr Gln Leu Asp Leu Asn Arg Asn Arg Ile Arg Leu Ile Glu
180 185 190
Gly Leu Thr Phe Gln Gly Leu Asn Ser Leu Glu Val Leu Lys Leu Gln
195 200 205
Arg Asn Asn Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ala Phe Trp Gly Leu Ser
210 215 220
Lys Met His Val Leu His Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Val Glu Val Asn
225 230 235 240
Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Leu His Leu Ser
245 250 255
Asn Asn Ser Ile Ala Arg Ile His Arg Lys Gly Trp Ser Phe Cys Gln
260 265 270
Lys Leu His Glu Leu Val Leu Ser Phe Asn Asn Leu Thr Arg Leu Asp
275 280 285
Glu Glu Ser Leu Ala Glu Leu Ser Ser Leu Ser Val Leu Arg Leu Ser
290 295 300
His Asn Ser Ile Ser His Ile Ala Glu Gly Ala Phe Lys Gly Leu Arg
305 310 315 320
Ser Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp His Asn Glu Ile Ser Gly Thr Ile
325 330 335
Glu Asp Thr Ser Gly Ala Phe Ser Gly Leu Asp Ser Leu Ser Lys Leu
340 345 350
Thr Leu Phe Gly Asn Lys Ile Lys Ser Val Ala Lys Arg Ala Phe Ser
355 360 365
Gly Leu Glu Gly Leu Glu His Leu Asn Leu Gly Gly Asn Ala Ile Arg
370 375 380
Ser Val Gln Phe Asp Ala Phe Val Lys Met Lys Asn Leu Lys Glu Leu
385 390 395 400
His Ile Ser Ser Asp Ser Phe Leu Cys Asp Cys Gln Leu Lys Trp Leu
405 410 415
Pro Pro Trp Leu Ile Gly Arg Met Leu Gln Ala Phe Val Thr Ala Thr
420 425 430
Cys Ala His Pro Glu Ser Leu Lys Gly Gln Ser Ile Phe Ser Val Pro
435 440 445
Pro Glu Ser Phe Val Cys Asp Asp Phe Leu Lys Pro Gln Ile Ile Thr
450 455 460
Gln Pro Glu Thr Thr Met Ala Met Val Gly Lys Asp Ile Arg Phe Thr
465 470 475 480
Cys Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Met Thr Phe Ala Trp Lys
485 490 495
Lys Asp Asn Glu Val Leu Thr Asn Ala Asp Met Glu Asn Phe Val His
500 505 510
Val His Ala Gln Asp Gly Glu Val Met Glu Tyr Thr Thr Ile Leu His
515 520 525
Leu Arg Gln Val Thr Phe Gly His Glu Gly Arg Tyr Gln Cys Val Ile
530 535 540
Thr Asn His Phe Gly Ser Thr Tyr Ser His Lys Ala Arg Leu Thr Val
545 550 555 560
Asn Val Leu Pro Ser Phe Thr Lys Thr Pro His Asp Ile Thr Ile Arg
565 570 575
Thr Thr Thr Val Ala Arg Leu Glu Cys Ala Ala Thr Gly His Pro Asn
580 585 590
Pro Gln Ile Ala Trp Gln Lys Asp Gly Gly Thr Asp Phe Pro Ala Ala
595 600 605
Arg Glu Arg Arg Met His Val Met Pro Asp Asp Asp Val Phe Phe Ile
610 615 620
Thr Asp Val Lys Ile Asp Asp Ala Gly Val Tyr Ser Cys Thr Ala Gln
625 630 635 640
Asn Ser Ala Gly Ser Ile Ser Ala Asn Ala Thr Leu Thr Val Leu Glu
645 650 655
Thr Pro Ser Leu Val Val Pro Leu Glu Asp Arg Val Val Ser Val Gly
660 665 670
Glu Thr Val Ala Leu Gln Cys Lys Ala Thr Gly Asn Pro Pro Pro Arg
675 680 685
Ile Thr Trp Phe Lys Gly Asp Arg Pro Leu Ser Leu Thr Glu Arg His
690 695 700
His Leu Thr Pro Asp Asn Gln Leu Leu Val Val Gln Asn Val Val Ala
705 710 715 720
Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Thr Cys Glu Met Ser Asn Thr Leu Gly Thr
725 730 735
Glu Arg Ala His Ser Gln Leu Ser Val Leu Pro Ala Ala Gly Cys Arg
740 745 750
Lys Asp Gly Thr Thr Val Gly
755
<210> 2
<211> 2397
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggcccgcggg cgccctgcgc ggccgcctgc acttgcgctg gggactcgct ggactgcggt 60
gggcgcgggc tggctgcgtt gcccggggac ctgccctcct ggacgcggag cctaaacctg 120
agttacaaca aactctctga gattgaccct gctggttttg aggacttgcc gaacctacag 180
gaagtgtacc tcaataataa tgagttgaca gcggtaccat ccctgggcgc tgcttcatca 240
catgtcgtct ctctctttct gcagcacaac aagattcgca gcgtggaggg gagccagctg 300
aaggcctacc tttccttaga agtgttagat ctgagtttga acaacatcac ggaagtgcgg 360
aacacctgct ttccacacgg accgcctata aaggagctca acctggcagg caatcggatt 420
ggcaccctgg agttgggagc atttgatggt ctgtcacggt cgctgctaac tcttcgcctg 480
agcaaaaaca ggatcaccca gcttcctgta agagcattca agctacccag gctgacacaa 540
ctggacctca atcggaacag gattcggctg atagagggcc tcaccttcca ggggctcaac 600
agcttggagg tgctgaagct tcagcgaaac aacatcagca aactgacaga tggggccttc 660
tggggactgt ccaagatgca tgtgctgcac ctggagtaca acagcctggt agaagtgaac 720
agcggctcgc tctacggcct cacggccctg catcagctcc acctcagcaa caattccatc 780
gctcgcattc accgcaaggg ctggagcttc tgccagaagc tgcatgagtt ggtcctgtcc 840
ttcaacaacc tgacacggct ggacgaggag agcctggccg agctgagcag cctgagtgtc 900
ctgcgtctca gccacaattc catcagccac attgcggagg gtgccttcaa gggactcagg 960
agcctgcgag tcttggatct ggaccataac gagatttcgg gcacaataga ggacacgagc 1020
ggcgccttct cagggctcga cagcctcagc aagctgactc tgtttggaaa caagatcaag 1080
tctgtggcta agagagcatt ctcggggctg gaaggcctgg agcacctgaa ccttggaggg 1140
aatgcgatca gatctgtcca gtttgatgcc tttgtgaaga tgaagaatct taaagagctc 1200
catatcagca gcgacagctt cctgtgtgac tgccagctga agtggctgcc cccgtggcta 1260
attggcagga tgctgcaggc ctttgtgaca gccacctgtg cccacccaga atcactgaag 1320
ggtcagagca ttttctctgt gccaccagag agtttcgtgt gcgatgactt cctgaagcca 1380
cagatcatca cccagccaga aaccaccatg gctatggtgg gcaaggacat ccggtttaca 1440
tgctcagcag ccagcagcag cagctccccc atgacctttg cctggaagaa agacaatgaa 1500
gtcctgacca atgcagacat ggagaacttt gtccacgtcc acgcgcagga cggggaagtg 1560
atggagtaca ccaccatcct gcacctccgt caggtcactt tcgggcacga gggccgctac 1620
caatgtgtca tcaccaacca ctttggctcc acctattcac ataaggccag gctcaccgtg 1680
aatgtgttgc catcattcac caaaacgccc cacgacataa ccatccggac caccaccgtg 1740
gcccgcctcg aatgtgctgc cacaggtcac ccaaaccctc agattgcctg gcagaaggat 1800
ggaggcacgg atttccccgc tgcccgtgag cgacgcatgc atgtcatgcc ggatgacgac 1860
gtgtttttca tcactgatgt gaaaatagat gacgcagggg tttacagctg tactgctcag 1920
aactcagccg gttctatttc agctaatgcc accctgactg tcctagagac cccatccttg 1980
gtggtcccct tggaagaccg tgtggtatct gtgggagaaa cagtggccct ccaatgcaaa 2040
gccacgggga accctccgcc ccgcatcacc tggttcaagg gggaccgccc gctgagcctc 2100
actgagcggc accacctgac ccctgacaac cagctcctgg tggttcagaa cgtggtggca 2160
gaggatgcgg gccgatatac ctgtgagatg tccaacaccc tgggcacgga gcgagctcac 2220
agccagctga gcgtcctgcc cgcagcaggc tgcaggaagg atgggaccac ggtaggcatc 2280
ttcaccattg ctgtcgtgag cagcatcgtc ctgacgtcac tggtctgggt gtgcatcatc 2340
taccagacca ggaagaagag tgaagagtac agtgtcacca acacagatga aaccgtc 2397
<210> 3
<211> 761
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Gln Ala Gly Pro Arg Ala Pro Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Gly
1 5 10 15
Asp Ser Leu Asp Cys Ser Gly Arg Gly Leu Ala Thr Leu Pro Arg Asp
20 25 30
Leu Pro Ser Trp Thr Arg Ser Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Ser
35 40 45
Glu Ile Asp Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Thr Asn Leu Gln Glu Val
50 55 60
Tyr Leu Asn Ser Asn Glu Leu Thr Ala Ile Pro Ser Leu Gly Ala Ala
65 70 75 80
Ser Ile Gly Val Val Ser Leu Phe Leu Gln His Asn Lys Ile Leu Ser
85 90 95
Val Asp Gly Ser Gln Leu Lys Ser Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Asp
100 105 110
Leu Ser Ser Asn Asn Ile Thr Glu Ile Arg Ser Ser Cys Phe Pro Asn
115 120 125
Gly Leu Arg Ile Arg Glu Leu Asn Leu Ala Ser Asn Arg Ile Ser Ile
130 135 140
Leu Glu Ser Gly Ala Phe Asp Gly Leu Ser Arg Ser Leu Leu Thr Leu
145 150 155 160
Arg Leu Ser Lys Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Val Lys Ala Phe Lys
165 170 175
Leu Pro Arg Leu Thr Gln Leu Asp Leu Asn Arg Asn Arg Ile Arg Leu
180 185 190
Ile Glu Gly Leu Thr Phe Gln Gly Leu Asp Ser Leu Glu Val Leu Arg
195 200 205
Leu Gln Arg Asn Asn Ile Ser Arg Leu Thr Asp Gly Ala Phe Trp Gly
210 215 220
Leu Ser Lys Met His Val Leu His Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Val Glu
225 230 235 240
Val Asn Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Leu His
245 250 255
Leu Ser Asn Asn Ser Ile Ser Arg Ile Gln Arg Asp Gly Trp Ser Phe
260 265 270
Cys Gln Lys Leu His Glu Leu Ile Leu Ser Phe Asn Asn Leu Thr Arg
275 280 285
Leu Asp Glu Glu Ser Leu Ala Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ile Leu Arg
290 295 300
Leu Ser His Asn Ala Ile Ser His Ile Ala Glu Gly Ala Phe Lys Gly
305 310 315 320
Leu Lys Ser Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp His Asn Glu Ile Ser Gly
325 330 335
Thr Ile Glu Asp Thr Ser Gly Ala Phe Thr Gly Leu Asp Asn Leu Ser
340 345 350
Lys Leu Thr Leu Phe Gly Asn Lys Ile Lys Ser Val Ala Lys Arg Ala
355 360 365
Phe Ser Gly Leu Glu Ser Leu Glu His Leu Asn Leu Gly Glu Asn Ala
370 375 380
Ile Arg Ser Val Gln Phe Asp Ala Phe Ala Lys Met Lys Asn Leu Lys
385 390 395 400
Glu Leu Tyr Ile Ser Ser Glu Ser Phe Leu Cys Asp Cys Gln Leu Lys
405 410 415
Trp Leu Pro Pro Trp Leu Met Gly Arg Met Leu Gln Ala Phe Val Thr
420 425 430
Ala Thr Cys Ala His Pro Glu Ser Leu Lys Gly Gln Ser Ile Phe Ser
435 440 445
Val Leu Pro Asp Ser Phe Val Cys Asp Asp Phe Pro Lys Pro Gln Ile
450 455 460
Ile Thr Gln Pro Glu Thr Thr Met Ala Val Val Gly Lys Asp Ile Arg
465 470 475 480
Phe Thr Cys Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Met Thr Phe Ala
485 490 495
Trp Lys Lys Asp Asn Glu Val Leu Ala Asn Ala Asp Met Glu Asn Phe
500 505 510
Ala His Val Arg Ala Gln Asp Gly Glu Val Met Glu Tyr Thr Thr Ile
515 520 525
Leu His Leu Arg His Val Thr Phe Gly His Glu Gly Arg Tyr Gln Cys
530 535 540
Ile Ile Thr Asn His Phe Gly Ser Thr Tyr Ser His Lys Ala Arg Leu
545 550 555 560
Thr Val Asn Val Leu Pro Ser Phe Thr Lys Ile Pro His Asp Ile Ala
565 570 575
Ile Arg Thr Gly Thr Thr Ala Arg Leu Glu Cys Ala Ala Thr Gly His
580 585 590
Pro Asn Pro Gln Ile Ala Trp Gln Lys Asp Gly Gly Thr Asp Phe Pro
595 600 605
Ala Ala Arg Glu Arg Arg Met His Val Met Pro Asp Asp Asp Val Phe
610 615 620
Phe Ile Thr Asp Val Lys Ile Asp Asp Met Gly Val Tyr Ser Cys Thr
625 630 635 640
Ala Gln Asn Ser Ala Gly Ser Val Ser Ala Asn Ala Thr Leu Thr Val
645 650 655
Leu Glu Thr Pro Ser Leu Ala Val Pro Leu Glu Asp Arg Val Val Thr
660 665 670
Val Gly Glu Thr Val Ala Phe Gln Cys Lys Ala Thr Gly Ser Pro Thr
675 680 685
Pro Arg Ile Thr Trp Leu Lys Gly Gly Arg Pro Leu Ser Leu Thr Glu
690 695 700
Arg His His Phe Thr Pro Gly Asn Gln Leu Leu Val Val Gln Asn Val
705 710 715 720
Met Ile Asp Asp Ala Gly Arg Tyr Thr Cys Glu Met Ser Asn Pro Leu
725 730 735
Gly Thr Glu Arg Ala His Ser Gln Leu Ser Ile Leu Pro Thr Pro Gly
740 745 750
Cys Arg Lys Asp Gly Thr Thr Val Gly
755 760
<210> 4
<211> 2283
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 4
caggctggcc cgcgggcccc ctgcgcggcc gcctgcactt gcgccgggga ctcgctggac 60
tgcagtgggc gcgggctggc gacgctgccc cgggacctgc cctcctggac gcgcagccta 120
aacctgagtt ataacagact ctccgagatc gactctgctg cttttgagga cttgacgaat 180
ctgcaggaag tgtacctcaa cagcaatgag ctgacagcca taccatcact gggcgctgct 240
tccataggag ttgtctctct ctttttgcag cacaacaaga tccttagtgt ggatgggagc 300
cagctgaagt cgtacctgtc cttggaagtg ctggatctga gttccaacaa catcacggaa 360
attcggagct cctgtttccc gaacggcctg cgtataaggg aactcaactt ggcgagcaac 420
cgcatcagca tcctggagtc tggagcattt gatggtctgt cgcggtcact gctgactctc 480
cgtctgagca aaaacaggat cacccagctt cctgtgaaag cgttcaagct acccaggctg 540
acacaactag acctgaatcg gaatcggatt cggctgattg aaggcctcac gttccagggg 600
ctcgacagct tagaggtgct gaggcttcag aggaacaaca tcagcaggct gacggacggg 660
gccttctggg ggctgtctaa gatgcacgtg ctgcacctgg agtacaacag tctggtggaa 720
gtgaacagtg gctccctcta tggcctcaca gccctgcacc agctgcacct cagcaacaac 780
tccatctctc gaattcagcg tgatggctgg agcttctgcc aaaagctgca tgagttgatt 840
ctgtccttca acaacctcac gcggctggat gaggagagtc tagcggagtt gagcagcctc 900
agtatcctgc gcctcagtca caacgccatc agtcacattg ctgaaggcgc cttcaaggga 960
ctcaagagtc tgcgggtctt ggacctggac cataacgaga tctcgggtac aatcgaggat 1020
accagtggtg cctttacggg gcttgacaac ctcagcaagc tgactctgtt tggaaacaag 1080
atcaaatctg tggctaagag agccttctcg ggcctggaaa gcctggaaca cctgaacctt 1140
ggagagaatg caatcaggtc tgtccagttt gatgcctttg caaagatgaa gaaccttaaa 1200
gagctctaca tcagcagtga gagcttcctg tgtgactgcc agctcaagtg gctgccccca 1260
tggctaatgg gtaggatgct gcaggccttt gtgacagcca cctgtgccca tccagagtcg 1320
ctgaagggcc agagcatttt ctcagtgctg ccagacagct ttgtgtgtga tgactttcca 1380
aagccacaga tcatcaccca gcctgagacg accatggctg tggtgggcaa ggacatccgt 1440
ttcacatgct ccgcagccag cagcagcagc tcaccaatga ccttcgcctg gaagaaggac 1500
aatgaggtcc tggccaatgc agacatggag aactttgccc acgtccgtgc acaggacggc 1560
gaagtgatgg agtataccac tatcctgcac ctccgtcacg tcacctttgg gcacgagggc 1620
cgctaccagt gtatcatcac aaaccacttt ggctccacat actcccacaa agccaggctc 1680
actgtgaatg tgttgccatc attcactaaa ataccccatg acattgccat ccggactggc 1740
accacagccc gcctcgagtg tgctgccacg ggccacccta accctcagat tgcctggcag 1800
aaggatggag gcaccgattt cccggcagct cgtgagcgac gcatgcatgt tatgccagac 1860
gatgatgtgt tcttcatcac tgatgtgaaa atagacgaca tgggggtcta cagctgcact 1920
gcccagaact cggcaggctc ggtttcagcc aacgctaccc tcacagtctt agaaactcca 1980
tccttggcag tgcctctgga agaccgtgtg gtaactgtgg gagaaacagt ggccttccag 2040
tgcaaagcaa ccgggagccc cacaccacgc atcacctggc ttaagggagg tcgcccattg 2100
agcctcacag agcgccacca tttcactcca ggcaaccagc tgctggttgt tcagaatgtg 2160
atgatagacg atgcagggcg gtatacctgt gagatgtcta atcccctggg cactgagcga 2220
gcacatagcc agctgagcat tttacctacc cctggctgcc ggaaggatgg gaccaccgta 2280
ggc 2283
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 heavy chain CDR 1
<400> 5
Gly Tyr Asp Met Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 heavy chain CDR 2
<400> 6
Leu Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Asn Lys
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 heavy chain CDR 3
<400> 7
Arg Asp Ala Gly Leu Ser Trp Ala Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 light chain CDR 1
<400> 8
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 light chain CDR 2
<400> 9
Ser Asp Ser His
1
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 light chain CDR 3
<400> 10
Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala
1 5
<210> 11
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 heavy chain_variable region
<400> 11
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Gly Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Leu Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Leu Ser Trp Ala Gly Ala Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 12
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 light chain_variable region
<400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp
100 105 110
Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu
130
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 heavy chain CDR 1
<400> 13
Asn Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 heavy chain CDR 2
<400> 14
Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Ser Thr
1 5
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 heavy chain CDR 3
<400> 15
Lys Gly Leu Tyr Ser Asn Pro Asn Glu Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 light chain CDR 1
<400> 16
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 light chain CDR 2
<400> 17
Asp Asp Ser Gln
1
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 light chain CDR 3
<400> 18
Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Asn Gly
1 5
<210> 19
<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 heavy chain_variable region
<400> 19
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Tyr Ser Asn Pro Asn Glu Pro Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
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<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 light chain_variable region
<400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp
100 105 110
Asp Tyr Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu
130
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<220>
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<220>
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1 5
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<220>
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<220>
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Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Tyr Ala Tyr Gly Met Asp Val
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<220>
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Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp
100 105 110
Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu
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<220>
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1 5
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Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile
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<220>
<223> G3 heavy chain CDR 3
<400> 31
Lys Asp Leu Asp Ala Phe Trp Arg Pro Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 light chain CDR 1
<400> 32
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn
1 5 10
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 light chain CDR 2
<400> 33
Ser Asp Ser His
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 light chain CDR 3
<400> 34
Gly Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala
1 5
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<211> 141
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 heavy chain_variable region
<400> 35
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Asn Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Asp Ala Phe Trp Arg Pro Ser Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 36
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 light chain_variable region
<400> 36
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Asn Asn Asn Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
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85 90 95
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp
100 105 110
Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu
130
<210> 37
<211> 328
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 37
Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro
20 25 30
Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val
35 40 45
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser
50 55 60
Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu
85 90 95
Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
100 105 110
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
115 120 125
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
130 135 140
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
145 150 155 160
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
165 170 175
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
180 185 190
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
195 200 205
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
210 215 220
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
225 230 235 240
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
245 250 255
Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr
260 265 270
Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
290 295 300
Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
305 310 315 320
Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 38
Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 39
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 41
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 42
<211> 377
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 43
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 44
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid Fc_Heavy region
<400> 44
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys
1 5 10 15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His
20 25 30
Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
35 40 45
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
50 55 60
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
65 70 75 80
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
85 90 95
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
100 105 110
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
115 120 125
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
130 135 140
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
145 150 155 160
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
165 170 175
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
180 185 190
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
195 200 205
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
210 215 220
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Gly Lys
245
<210> 45
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 heavy chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
<400> 45
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Gly Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Leu Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Leu Ser Trp Ala Gly Ala Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala
130 135 140
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr
195 200 205
Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala
210 215 220
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly
225 230 235 240
Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
260 265 270
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
290 295 300
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
325 330 335
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln
370 375 380
Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr
385 390 395 400
Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr
405 410 415
Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser
435 440 445
Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser
450 455 460
Arg Thr Pro Gly Lys
465
<210> 46
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A7 light chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
<400> 46
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp
100 105 110
Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser
165 170 175
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
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210 215 220
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 heavy chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
<400> 47
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
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115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala
130 135 140
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr
195 200 205
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210 215 220
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly
225 230 235 240
Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
260 265 270
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
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Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
325 330 335
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340 345 350
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr
405 410 415
Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser
435 440 445
Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser
450 455 460
Arg Thr Pro Gly Lys
465
<210> 48
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C8 light chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
<400> 48
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Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
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Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp
100 105 110
Asp Tyr Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
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Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
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Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> E7 heavy chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
<400> 49
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr
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Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Gly Leu Arg Cys Arg Tyr Glu Ala Cys
115 120 125
Ser Tyr Ala Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys
145 150 155 160
Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly
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Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr
195 200 205
Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser
210 215 220
Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser
290 295 300
Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His
305 310 315 320
Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile
325 330 335
Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn
340 345 350
Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys
355 360 365
Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe
385 390 395 400
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
405 410 415
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
420 425 430
Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg
435 440 445
Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His
450 455 460
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
465 470 475
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<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E7 light chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
<400> 50
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Trp Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp
100 105 110
Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
145 150 155 160
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Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
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<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 heavy chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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65 70 75 80
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245 250 255
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Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
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305 310 315 320
Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
325 330 335
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala
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Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln
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Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G3 light chain_mouse IgG2 Fc_full sequence
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100 105 110
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210 215 220
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235

Claims (25)

  1. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 2 또는 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 5, 13, 21 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6, 14, 22 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7, 15, 23 및 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8, 16, 24 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9, 17, 25 및 33으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10, 18, 26 및 34로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    (a) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (b) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (c) 서열번호 21로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역; 및
    (e) 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (f) 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (g) 서열번호 24로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (h) 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역;으로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것인, 결합 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    (1) 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 7로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
    (2) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
    (3) 서열번호 21로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 24로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
    (4) 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 31로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는, 결합 분자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 11, 19, 27 및 35로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 12, 20, 28 및 36으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 결합 분자.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
    서열번호 19로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;
    서열번호 27로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자; 및
    서열번호 35로 표시되는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 36으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 결합 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 Fc 영역 또는 불변 영역(constant region)을 더 포함하는, 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체의 Fc 영역, 또는 하이브리드 Fc(hybrid Fc) 영역인, 결합 분자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 37, 39, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 38 또는 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
    서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 39, 41, 42 또는 43으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역; 및
    서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는, 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 결합 분자.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는,
    서열번호 45로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 46으로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;
    서열번호 47로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 48로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;
    서열번호 49로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 50으로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자; 및
    서열번호 51로 표시되는 중쇄, 및 서열번호 52로 표시되는 경쇄를 포함하는 결합 분자;로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 결합 분자.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그 단편인, 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 결합 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자.
  20. 제19항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  21. 제20항의 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주.
  22. 서열번호 5, 13, 21 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 6, 14, 22 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 서열번호 7, 15, 23 및 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 8, 16, 24 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 9, 17, 25 및 33으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2; 서열번호 10, 18, 26 및 34로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3;를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 결합 분자를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환인, 약학 조성물.
  25. 면역 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위하여, 치료를 필요로 하는 대상에 청구항 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
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