WO2016200189A1 - 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자 - Google Patents

광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자 Download PDF

Info

Publication number
WO2016200189A1
WO2016200189A1 PCT/KR2016/006145 KR2016006145W WO2016200189A1 WO 2016200189 A1 WO2016200189 A1 WO 2016200189A1 KR 2016006145 W KR2016006145 W KR 2016006145W WO 2016200189 A1 WO2016200189 A1 WO 2016200189A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
binding molecule
seq
antibody
rabies virus
epitope
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/006145
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
장신재
이수영
김판겸
안정선
추민주
Original Assignee
(주)셀트리온
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)셀트리온 filed Critical (주)셀트리온
Priority to US15/735,068 priority Critical patent/US10722571B2/en
Priority to CN201680033860.2A priority patent/CN107709360B/zh
Publication of WO2016200189A1 publication Critical patent/WO2016200189A1/ko
Priority to HK18103596.2A priority patent/HK1244018A1/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to an epitope of rabies virus G protein (glycoprotein) and a rabies virus neutralizing binding molecule specifically binding thereto.
  • Rabies is a viral common infectious disease that primarily affects wildlife and pets, as well as mammals, including humans, causing acute brain disease. It is a fatal disease that occurs almost once in death, and is known to have the highest mortality rate with AIDS. The rabies spreads worldwide, with more than 10 million people receiving treatment after infection each year, with 40,000 to 70,000 deaths each year.
  • Rabies is transmitted from saliva and blood, usually from bites of dogs or cats infected with rabies. It can also be infected by most mammals, such as skunks and bats.
  • Rabies virus shows actual onset symptoms after reaching the brain's nerve tissue through the terminal nerve tissue of the body.
  • the human brain has a blood brain barrier that blocks foreign substances, so viruses cannot penetrate, but the rabies virus passes through the blood barrier through the RVG (rabies virus glycoprotein) protein to the central nervous system. (central nervous system) Infects the brain.
  • RVG rabies virus glycoprotein
  • Post-treatment treatment consists of immediate topical wound protection and antibody administration for passive immunity (anti-rabies immunoglobulin: hereinafter referred to as "anti-rabies antibody”) and vaccine administration for active immunity.
  • anti-rabies antibodies include human-derived rabies immunoglobulin (hereinafter referred to as "HRIG”) and equine-derived rabies immunoglobulin (hereinafter referred to as "ERIG").
  • HRIG's supply is not smooth and expensive and it is a polyclonal antibody, so its efficacy per unit weight is not high.
  • the present inventors have found that the epitope of a human antibody (see Korean Patent Application No. 10-2014-0178030) that binds to rabies virus and neutralizes the amino acid 33 of rabies virus G protein (see SEQ ID NO: 2). , 34, 35, 38, 200, 202 and 215 or the amino acid position 331 and 333, and confirmed the neutralizing ability of the antibody cocktail mixed with the two types of antibody binding to the different epitopes was completed.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a rabies virus neutralizing binding molecule that binds to the epitope in the amino acid residues 33 to 333 of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the present invention is to provide an immunoconjugate in which one or more tags are additionally bound to the binding molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the binding molecule.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted.
  • Another object of the present invention is to provide a cell line wherein the expression vector is transformed into a host cell to bind to rabies virus and produce a binding molecule having a neutralizing ability.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for diagnosing, preventing or treating rabies including the binding molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing, preventing or treating rabies including the binding molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing, preventing or treating rabies using the binding molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the binding molecule by culturing the cell line.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting rabies virus using the binding molecule.
  • compositions for preventing or treating rabies comprising a.
  • composition a) administering said composition to a subject in a therapeutically effective amount
  • It provides a method for diagnosing, preventing or treating rabies comprising a.
  • Another object of the present invention is to provide a polypeptide comprising an epitope in amino acid residues 33 to 215 of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the present invention is to provide a polypeptide comprising an epitope within amino acid residues 331 to 333 of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a rabies virus neutralizing binding molecule that specifically binds to the polypeptide.
  • Another object of the present invention is to provide a rabies virus vaccine composition comprising the polypeptide.
  • one embodiment of the present invention provides a rabies virus neutralizing binding molecule that binds to an epitope within the 33 to 333th amino acid residue of the wild type G protein of the rabies virus represented by SEQ ID NO: 2.
  • the epitope may be an epitope within the 33rd to 215th amino acid residue of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2, more specifically 33, 34, 35, 38, 200, 202 And at least one selected from the group consisting of the 215th amino acid residue.
  • the rabies virus neutralizing binding molecule that binds to the epitope may have a binding affinity (KD) of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 8 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 9 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 11 M.
  • the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 12 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M.
  • the rabies virus neutralizing binding molecule that binds to the epitope
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 5; And / or
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 6, a CDR2 region of SEQ ID NO: 7, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 8
  • the binding molecule may be a binding molecule comprising a variable region of SEQ ID NO: 15 and / or a variable region of SEQ ID NO: 16. In another embodiment, the binding molecule may be a binding molecule comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 19 and / or a light chain of SEQ ID NO: 20.
  • the epitope may be an epitope within amino acid residues 331 to 333 of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2, and more specifically from the group consisting of 331 and 333 amino acid residues. It may be an epitope comprising one or more selected.
  • the rabies virus neutralizing binding molecule that binds to the epitope may have a binding affinity (K D ) of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 12 M.
  • the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 13 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 13 M.
  • the binding affinity (K D ) can be measured using surface plasmon resonance, for example using the BIACORE system.
  • the rabies virus neutralizing binding molecule that binds to the epitope
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 9, a CDR2 region of SEQ ID NO: 10, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 11; And / or
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 12, a CDR2 region of SEQ ID NO: 13, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 14
  • the binding molecule may be a binding molecule comprising a variable region of SEQ ID NO: 17 and / or a variable region of SEQ ID NO: 18. In another embodiment, the binding molecule may be a binding molecule comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 21 and / or a light chain of SEQ ID NO: 22.
  • the CDRs of the variable regions were determined by conventional methods according to a system devised by Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5 th ), National Institutes of Health, Bethesda) , MD. (1991). Although the CDRs used in the present invention were determined using the Kabat method, binding molecules including CDRs determined according to other methods such as the IMGT method, the Chothia method, and the AbM method are also included in the present invention.
  • the binding molecule may be an antibody or fragment thereof.
  • the binding molecule may be, but is not limited to, Fab fragments, Fv fragments, diabodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies.
  • One embodiment of the invention provides a fully human antibody that binds to rabies virus.
  • an antibody is used in its broadest sense and is specifically an intact monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a multispecific antibody (eg, a bispecific antibody) formed from two or more intact antibodies, and a target.
  • Antibodies are proteins produced by the immune system that can recognize and bind specific antigens.
  • the antibody typically has a Y-shaped protein consisting of four amino acid chains (two heavy chains and two light chains).
  • Each antibody mainly has two regions, a variable region and a constant region.
  • the variable region located at the distal portion of the arm of Y binds to and interacts with the target antigen.
  • the variable region comprises a complementarity determining region (CDR) that recognizes and binds to a specific binding site on a particular antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • the constant region located in the tail of Y is recognized and interacted with by the immune system.
  • Target antigens generally have multiple binding sites called epitopes, recognized by CDRs on multiple antibodies. Each antibody that specifically binds to a different epitope has a different structure. Therefore, one antigen may have one or more corresponding antibodies.
  • the present invention includes functional variants of the antibodies.
  • Antibodies are considered functional variants of the antibodies of the invention if the variants can compete with the antibodies of the invention to specifically bind rabies virus or its G protein.
  • Functional variants are not necessarily to be the primary structural sequence comprises a substantially similar derivatives, but limited to, for example, ex vivo (in-vitro) or in vivo (in- vivo) modification, chemical and / or biochemical drugs And they are not found in the parental monoclonal antibodies of the invention.
  • Such modifications include, for example, acetylation, acylation, covalent linkages of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent linkages of lipids or lipid derivatives, crosslinking, disulfide bond formation, glycosylation, hydroxylation, methylation, oxidation, PEGylation, proteolysis And phosphorylation and the like.
  • Functional variants may optionally be antibodies comprising an amino acid sequence containing substitutions, insertions, deletions or combinations of one or more amino acids in comparison to the amino acid sequence of the parent antibody.
  • functional variants may include truncated forms of amino acid sequences at one or both of the amino terminus or carboxy terminus.
  • the functional variant of the invention may have the same or different, higher or lower binding affinity compared to the parent antibody of the invention, but can still bind to rabies virus or its G protein.
  • the amino acid sequence of the variable region including but not limited to, the framework, Hypervariable region, particularly the CDR 3 region, may be modified.
  • the light or heavy chain region comprises three hypervariable regions, including three CDR regions, and a more conserved region, the framework region (FR). Hypervariable regions include amino acid residues from CDRs and amino acid residues from hypervariable loops.
  • Functional variants within the scope of the present invention are about 50% -99%, about 60% -99%, about 80% -99%, about 90% -99%, about 95% -99%, Or about 97% -99% amino acid sequence identity. Gap or Bestfit known to those skilled in the art can be used in computer algorithms to optimally arrange the amino acid sequences to be compared and to define similar or identical amino acid residues.
  • the functional variant may be changed by or obtained by known general molecular biological methods including, but not limited to, a parent antibody or a part thereof by PCR, mutagenesis using oligomeric nucleotides, and partial mutagenesis.
  • the rabies virus may be derived from any one selected from the group consisting of dogs, cows, mongoose, bats, skunks, raccoons, coyotes, foxes, and wolves, but is not limited thereto.
  • another embodiment of the present invention provides an immunoconjugate in which at least one tag is additionally bound to the binding molecule.
  • a drug may be further attached to the antibody according to the invention. That is, the antibody according to the present invention can be used in the form of an antibody-drug conjugate to which a drug is bound.
  • Antibody-Drug Conjugates (ADCs), or immunoconjugates, for topical delivery of drugs can be used to deliver targeted drug moieties to infected cells, when administered without conjugating the drug agent. This is because unacceptable levels of toxicity can be caused even for normal cells.
  • ADCs Antibody-Drug Conjugates
  • another embodiment of the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the binding molecule.
  • the present invention includes an isolated nucleic acid molecule encoding a rabies virus neutralizing binding molecule that binds to an epitope of the wild type G protein of the rabies virus.
  • the nucleic acid molecule includes all of the nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of the antibody provided in the present invention is translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences can be prepared by an open reading frame (ORF), all of which are also included in the nucleic acid molecules of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • another embodiment of the present invention provides an expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted.
  • the expression vector is Celltrion-specific expression vector MarEx vector (see Korean Patent Registration No. 10-1076602) and commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322 , ToL, Ti vectors; Cosmid; Phages such as lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; It is preferable to use an expression vector selected from any one selected from the group consisting of plant viruses, but not limited thereto. All expression vectors known to those skilled in the art can be used in the present invention, and when selecting an expression vector, a target host may be selected. It depends on the nature of the cell.
  • Vector introduction into host cells may be performed by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-Dextran regulated transfection, lipofectamin transfection, or electroporation, but is not limited thereto.
  • the person skilled in the art can select and use an introduction method suitable for the expression vector and host cell to be used.
  • the vector contains one or more selection markers (Maker), but is not limited thereto, and may be selected depending on whether the product is produced using a vector that does not include the selection marker.
  • the selection of the selection marker is chosen by the host cell of interest, which uses methods already known to those skilled in the art and the present invention is not so limited.
  • tag sequences can be inserted and fused onto expression vectors.
  • the tag may include, but is not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag. Any tag that facilitates purification known to those skilled in the art may be used in the present invention.
  • another embodiment of the present invention provides a cell line wherein the expression vector is transformed into a host cell, thereby binding to rabies virus to produce a binding molecule having a neutralizing ability.
  • the cell line may include, but is not limited to, cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin.
  • the mammalian cells include any one selected from the group consisting of CHO cells, F2N cells, CSO cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, AT1080 cells, A549 cells, HEK 293 cells and HEK293T cells.
  • One may be used as a host cell, but is not limited thereto, and all cells usable as mammalian host cells known to those skilled in the art are available.
  • another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for diagnosing, preventing or treating rabies including the binding molecule.
  • the pharmaceutical composition for prophylaxis or treatment of the present invention may include a pharmaceutically acceptable excipient in addition to a binding molecule having a rabies virus neutralizing ability.
  • Pharmaceutically acceptable excipients are well known to those skilled in the art.
  • the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition of the present invention may include at least one other rabies therapeutic agent, and may also include various types of monoclonal antibodies, thereby exhibiting a synergistic effect on neutralizing activity.
  • the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition of the present invention may further include at least one other therapeutic or diagnostic agent.
  • therapeutic agents include, but are not limited to, anti-viral agents.
  • agents can be antibodies, small molecules, organic or inorganic compounds, enzymes, polynucleotide sequences, anti-viral peptides, and the like.
  • the prophylactic or therapeutic pharmaceutical compositions of the present invention are sterile and stable under the conditions of manufacture and storage and may be present in powder form for reconstitution in a suitable pharmaceutically acceptable excipient upon or prior to delivery.
  • suitable pharmaceutically acceptable excipient upon or prior to delivery.
  • preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization, which produce further desired components from the powder of the active ingredient and its presterilized-filtered solution.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be in solution and may be added and / or mixed before or at the time of delivery of an appropriate pharmaceutically acceptable excipient to provide a unit dosage injectable form.
  • the pharmaceutically acceptable excipients used in the present invention are suitable for drug concentration, can maintain a suitable flowability, and can be delayed if necessary.
  • Selection of an optimal route of administration of a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of the present invention includes several relationships including the physico-chemical properties of the active molecules in the pharmaceutical composition, the urgency of the clinical situation and the plasma concentration of the active molecule to the desired therapeutic effect. Influenced by factors.
  • monoclonal antibodies of the invention can be prepared with carriers that prevent their rapid release, such as controlled release formulations, including implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid can be used in the present invention.
  • Monoclonal antibodies can also be coated with or administered with a substance or compound that prevented the inactivation of the antibody.
  • monoclonal antibodies can be administered with a suitable carrier—liposomes or diluents.
  • the method of administering the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition of the present invention may be divided into oral and parenteral, for example, the route of administration may be intravenous, but is not limited thereto.
  • the oral forms include tablets, troches, medicinal drops, aqueous or oily suspensions, powders or dispersible granules, emulsions, rigid capsules, soft gelatin capsules, syrups or elixirs, pills, dragees, solutions, gels or It may be formulated as a slurry.
  • These formulations include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable excipients containing inert diluents, granulating or disintegrating agents, binders, brightening agents, preservatives, colorants, flavoring or sweetening agents, vegetable or mineral oils, wetting agents and thickeners. It is not.
  • the parenteral form may be in the form of an aqueous or non-aqueous isotonic sterile non-toxic injection or infusion solution or suspension.
  • the solution or suspension may be a drug such as 1,3-butanediol, Ringus's solution, Hanks' solution, isotonic sodium chloride solution, oils, fatty acids, local anesthetics, preservatives, buffers, viscosity or solubility that are nontoxic to the receptor at the dosage and concentration applied Agents, water soluble antioxidants, oil soluble antioxidants and metal chelating agents.
  • the dosage of the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition of the present invention depends on the subject being treated, the severity of the disease or condition, the rate of administration and the judgment of the prescribing physician.
  • the binding molecule may be administered parenterally or once a day in divided amounts in an amount of 0.001 to 10 mg / kg body weight, or 0.005 to 1 mg / kg body weight per day for mammals. .
  • smaller dosages may be more suitable than the above-mentioned ranges, and larger amounts may be used without causing harmful side effects, and higher dosages may be dispensed in smaller portions over a day. have.
  • the binding molecule of this invention used for the diagnostic pharmaceutical composition is detectably labeled.
  • Various methods available for labeling biomolecules are well known to those skilled in the art and are contemplated within the scope of the present invention.
  • marker types include enzymes, radioisotopes, colloidal metals, fluorescent compounds, chemiluminescent compounds and bioluminescent compounds.
  • markers include phosphors (eg, fluresin, rhodamine, Texas red, etc.), enzymes (eg, horseradish peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase), radioisotopes (eg, 32P or 125I), biotin, digoxigenin, colloidal metals, chemiluminescent or bioluminescent compounds (eg dioxetane, luminol or acridinium). Labeling methods such as covalent binding of enzymes or biotinyl groups, iodide methods, phosphorylation methods, biotinylation methods and the like are well known in the art.
  • Detection methods include, but are not limited to, autoradiography, fluorescence microscopy, direct and indirect enzyme reactions, and the like. Commonly used detection assays include radioisotopes or non-radioisotope methods. These include Western blotting, overlay-assay, Radioimmuno Assay (RIA) and Immunity Radioimmunometric Assay (IRMA), Enzyme Immuno Assay (EIA), Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Fluorescent Immuno Assay (CIA) and Chemiluminoluminescent Immune Assay).
  • radioisotopes or non-radioisotope methods include Western blotting, overlay-assay, Radioimmuno Assay (RIA) and Immunity Radioimmunometric Assay (IRMA), Enzyme Immuno Assay (EIA), Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Fluorescent Immuno Assay (CIA) and Chemiluminoluminescent Immun
  • It provides a kit for diagnosing, preventing or treating rabies comprising.
  • the container of b) may include a solid carrier.
  • the binding molecules of the invention can be attached to a solid carrier, which solid carrier is porous or nonporous. It can be flat or non-planar.
  • step b) determining whether rabies infection is analyzed by analyzing the result of step a)
  • It provides a rabies diagnostic method comprising a.
  • the sample may be any one selected from the group consisting of sputum, saliva, blood, sweat, lung cells, lung tissue mucus, respiratory tissue and saliva of the subject, but is not limited thereto. Sample preparation is possible by known conventional methods.
  • another embodiment of the present invention provides a method for preventing or treating rabies, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the binding molecule.
  • It provides a method for detecting a rabies virus comprising a.
  • the subject sample includes, but is not limited to, blood, serum, saliva, sputum, saliva, sweat, tissue or other biological material from a (potentially) infected subject.
  • Sample preparation is possible by the following method.
  • the (potential) subject of infection may be a human subject, but may also be animals suspected of being a carrier of rabies virus.
  • the subject sample may first be manipulated to make it more suitable for the detection method.
  • the binding molecule or immunoconjugate of the invention is contacted with the subject sample under conditions that allow the formation of an immunological complex between the binding molecule and the rabies virus or its antigenic component present in the subject sample.
  • immunological complexes indicative of the presence of rabies virus in the subject sample is detected and measured by appropriate means.
  • immunoassays such as radioimmunoassay (RIA), ELISA, immunofluorescence, immunohistochemistry, FACS, BIACORE, Western blot analysis.
  • cocktail composition for diagnosing, preventing or treating rabies.
  • the cocktail composition may include a) the first binding molecule and b) the second binding molecule in a concentration ratio of 1: 9 to 9: 1. In another embodiment, the cocktail composition may include 1: 3 to 9: 1.
  • the epitope to which the first binding molecule binds is the group consisting of the 33rd, 34th, 35th, 38th, 200th, 202th and 215th amino acid residues of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2. It may include one or more selected from.
  • the epitope to which the second binding molecule binds may comprise one or more selected from the group consisting of 331 and 333th amino acid residues of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2. .
  • the first binding molecule may have a binding affinity (KD) of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 8 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 9 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 5 ⁇ 10 ⁇ 12 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M.
  • the second binding molecule may have a binding affinity (K D ) of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 11 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 12 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 3 ⁇ 10 ⁇ 13 M. In another embodiment, the binding molecule may have a binding affinity of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 13 M.
  • the first binding molecule is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 5; And / or
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 6, a CDR2 region of SEQ ID NO: 7, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 8
  • the first binding molecule may be a binding molecule comprising a.
  • the first binding molecule may be a binding molecule comprising a variable region of SEQ ID NO: 15 and / or a variable region of SEQ ID NO: 16.
  • the first binding molecule may be a binding molecule comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 19 and / or a light chain of SEQ ID NO: 20.
  • the second binding molecule in one embodiment of the invention, the second binding molecule
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 9, a CDR2 region of SEQ ID NO: 10, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 11; And / or
  • variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 12, a CDR2 region of SEQ ID NO: 13, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 14
  • the second binding molecule may be a binding molecule comprising a.
  • the second binding molecule may be a binding molecule comprising a variable region of SEQ ID NO: 17 and / or a variable region of SEQ ID NO: 18.
  • the second binding molecule may be a binding molecule comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 21 and / or a light chain of SEQ ID NO: 22.
  • the binding molecule may be an antibody or an antigen binding fragment, and an antiviral drug may be further attached to the antibody.
  • the cocktail composition may be a sterile injectable solution, lyophilized formulation, prefilled injection solution, oral formulation, external preparation or suppository.
  • It provides a method for diagnosing, preventing or treating rabies comprising.
  • therapeutic agents known to those skilled in the art may be administered together.
  • the administration method may be divided into oral and parenteral, for example, the route of administration may be intravenous, but is not limited thereto.
  • the method may further include administering an anti-viral drug.
  • the anti-viral drug may be, but is not limited to, anti-rabies virus monoclonal antibody, anti-rabies virus polyclonal antibody, DNA polymerase inhibitor, siRNA agent, or therapeutic vaccine.
  • It provides a method for diagnosing, preventing or treating rabies comprising.
  • a pharmaceutical composition for diagnosing, preventing or treating rabies is provided.
  • a pharmaceutical composition for diagnosing, preventing or treating rabies comprising a therapeutically effective amount of the first binding molecule and the second binding molecule;
  • a package insert instructing the subject to administer a second therapeutically effective amount of the second binding molecule and subsequently to the subject a sequential administration of the first binding molecule.
  • It provides a kit for diagnosing, preventing or treating rabies comprising a.
  • another embodiment of the present invention provides a polypeptide comprising an epitope within amino acid residues 33 to 215 of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2.
  • the epitope may comprise one or more selected from the group consisting of the 33, 34, 35, 38, 200, 202 and 215th amino acid residues of the wild type G protein of the rabies virus.
  • another embodiment of the present invention provides a polypeptide comprising an epitope within amino acid residues 331 to 333 of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2.
  • the epitope may comprise one or more selected from the group consisting of 331 and 333 th amino acid residues of the wild type G protein of the rabies virus.
  • the epitope is available in a form combined with a carrier in order to maintain its three-dimensional structure or to improve efficiency when used as a composition such as a vaccine.
  • the carrier according to the present invention can be used as long as it is suitable for a living body and can achieve the desired effect in the present invention, but may be selected from peptides, serum albumin, immunoglobulins, hemocyanin and polysaccharides, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the epitope.
  • Polynucleotides encoding epitopes comprising the amino acid positions provided herein are themselves available in the form of gene vaccines.
  • the polynucleotide may be available on its own without a carrier, and may be carried in a body supported on a viral or nonviral carrier.
  • Viral or non-viral carriers may be used as long as they are known to be commonly available in the art.
  • viral carriers may include adenoviruses, adeno-associated viruses, lentiviruses, retroviruses, and the like.
  • Warm polymers, liposomes, lipids, phospholipids, hydrophilic polymers, hydrophobic polymers and one or more complexes selected from these may be used, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides an expression vector comprising the polynucleotide encoding the epitope.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism or virus transformed with the expression vector.
  • the recombinant microorganism or virus may be recombinant E. coli, recombinant yeast, or recombinant bacteriophage.
  • the invention is an epitope within the 33-215 amino acid residues of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2 or the 331-333th of the wild type G protein of rabies virus represented by SEQ ID NO: 2
  • a recombinant vector comprising a sequence encoding an inducing promoter or a signal protein and various microorganisms or viruses including the recombinant vector may be used.
  • Particularly suitable microorganisms or viruses may be recombinant E. coli, recombinant yeast and recombinant bacterio.
  • phrases, etc. are not limited thereto.
  • display techniques well known in the art to which the present invention pertains may be used, and in particular, on the microbial cell or virus surface.
  • a polynucleotide sequence encoding an epitope comprising the amino acid position is expressed in a sequence encoding a promoter or signal protein which is induced to be induced, or a part of a gene region encoding a protein expressed on its original surface is deleted and thus Methods of inserting a polynucleotide sequence encoding an epitope comprising a position, and the like are available, but are not limited to such.
  • the epitope comprising the amino acid position expressed on the surface of the microorganism or virus can be isolated and purified on its own and used for a specific use according to the present invention, and the epitope comprising the amino acid position in the state expressed on the surface thereof can be used. It can also be used for the purpose of selecting and obtaining an antibody which specifically binds.
  • the present invention provides a method for producing an epitope comprising culturing the recombinant microorganism or virus.
  • the present invention also provides a composition for detecting rabies virus comprising the epitope or a polynucleotide encoding the epitope.
  • another embodiment of the present invention provides a method for screening a rabies virus neutralizing binding molecule that specifically binds to the polypeptide comprising contacting the binding molecule to the polypeptide.
  • the binding molecule may be an antibody or an antigen binding fragment.
  • the screening method according to the invention can be carried out by any immunoassay, for example by ELISA, staining of tissues or cells (including transfected cells), by neutralization assay or with the desired specificity. Or by other methods well known in the art to verify functionality, but is not limited thereto.
  • another embodiment of the present invention provides a rabies virus vaccine composition comprising the polypeptide.
  • the vaccine composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • a pharmaceutically acceptable adjuvant any one can be used as long as it can achieve the object in the present invention by promoting the formation of the antibody when injected into the body, aluminum salt (Al (OH) 3, ALPO 4), squalene (squalene), sorbent A sorbitane, polysorbate 80, CpG, liposomes, cholesterol, monophosphoryl lipid A (MPL), glucopyranosyl lipid A (GLA) may be used, but are not limited thereto.
  • binding molecule refers to an intact immunoglobulin, or an immunoglobulin that binds to an antigen, including monoclonal antibodies, such as chimeric, humanized or human monoclonal antibodies, eg For example, it refers to a variable domain comprising an immunoglobulin fragment that competes with an intact immunoglobulin for binding to a rabies virus or a G protein (Glycoprotein) or a fragment thereof outside the virus. Regardless of the structure, the antigen-binding fragment binds to the same antigen recognized by intact immunoglobulins.
  • An antigen-binding fragment may comprise at least two contiguous amino acid residues, at least 5 contiguous amino acid residues, at least 10 contiguous amino acid residues, at least 15 contiguous amino acid residues, at least 20 contiguous amino acid residues, 25 of the amino acid sequence of the binding molecule.
  • At least 30 contiguous amino acid residues at least 30 contiguous amino acid residues, at least 30 contiguous amino acid residues, at least 35 contiguous amino acid residues, at least 40 contiguous amino acid residues, at least 50 contiguous amino acid residues, at least 60 contiguous amino acid residues, at least 70 contiguous amino acid residues, 80 At least contiguous amino acid residues, at least 90 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or 250 Containing amino acid sequences of consecutive amino acid residues It may comprise a peptide or polypeptide.
  • Antigen-binding fragments are especially Fab, F (ab '), F (ab') 2 , Fv, dAb, Fd, complementarity determining region (CDR) fragments, single-chain antibodies (scFv), bivalent single- Chain antibodies, single-chain phage antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, polypeptides containing one or more fragments of immunoglobulin sufficient to bind a particular antigen to the polypeptide, and the like It includes.
  • the fragments may be produced synthetically or by enzymatic or chemical digestion of complete immunoglobulins or may be produced genetically by recombinant DNA techniques. Production methods are well known in the art.
  • epitopes refers to a portion of an antigen recognized by an antibody as an antigenic determinant, containing a single or multiple peptides as used herein and in the claims.
  • peptide material is meant, including peptides having amino acid sequence data and variants thereof described herein and set forth in SEQ ID NO: 2, and having an activity profile described herein and in the claims. Therefore, proteins with almost equal or altered activity should also be interpreted in this sense.
  • modifications may be intentional, ie modifications obtained through site directed mutagenesis, or may be accidental, ie, obtained through mutations in a host that is the producer of a complex or a designated subunit thereof.
  • Methods of forming and testing modifications of peptides including epitopes, including variants, that is, site directed mutagenesis or random mutagenesis and the like are well known to those skilled in the art.
  • the term "pharmaceutically acceptable excipient” refers to an inert material that is combined into an active molecule, such as a drug, agent, or binding molecule, to produce an acceptable or convenient dosage form.
  • Pharmaceutically acceptable excipients are nontoxic or are excipients that are acceptable to the recipient for their intended use, at least in the doses and concentrations in which the toxicity is used, and with other components of the formulation including drugs, preparations or binding powders. It is compatible.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the binding molecule of the invention effective for prophylaxis or treatment before or after exposure of the rabies virus.
  • the inventors of the present invention using shotgun mutagenesis, when the positions 33, 34, 35, 38, 200, 202 and 215 of the rabies virus G protein excluding the signal peptide are replaced with other amino acid residues, By confirming that the binding ability was significantly reduced, it was confirmed that this site was an epitope of rabies virus G protein.
  • the amino acid residues 331 and 333 of the rabies virus G protein were replaced with other amino acid residues using shotgun mutagenesis, the binding ability with another antibody according to the present invention was remarkably decreased. It was identified that it is an epitope of G protein.
  • the antibody cocktail in which the two antibodies were mixed has a neutralizing ability against rabies virus by binding to different epitopes without interference.
  • the epitope of the present invention and the binding antibody binding thereto, and the antibody cocktail thereof can be usefully used to treat patients infected with rabies virus derived from a wide range of individuals.
  • the present invention identified different epitope sites of rabies virus G protein, and confirmed that binding molecules and cocktails mixed therewith have neutralizing ability against various rabies viruses.
  • the epitope of the rabies virus G protein and the rabies virus neutralizing binding molecule specifically binding thereto are useful for diagnosing, preventing or treating rabies.
  • antibody 1 the rabies virus G protein ( A single mutation in (see SEQ ID NO: 1) was induced and the binding capacity of antibody 1 and antibody 2 to each of the mutants was examined.
  • Preparation of each mutant and analysis of the binding capacity of antibody 1 and antibody 2 see shotgun mutagenesis, J Am Cehm Xoc. 2009; 131 (20): 6952-6954, et al., Integral Molecular, USA. ) was used.
  • Shotgun mutagenesis allows expression and analysis of libraries of mutated target proteins in eukaryotic cells. That is, all residues in the target protein can be mutated to different amino acids and expressed in mammalian cell lines to analyze changes in monoclonal antibody (MAb) binding or function.
  • MAb monoclonal antibody
  • Shotgun mutagenesis was performed in two steps. First, G protein expression plasmids of wild-type rabies virus CVS-11 strain were prepared and expressed in mammalian cell lines, and then antibody concentrations were optimized for analysis of the binding ability of antibody 1 and antibody 2.
  • a mutation library (hereinafter referred to as a "single mutation library") in which each of the amino acid residues in the G protein of the rabies virus CVS-11 strain was substituted with another amino acid was produced and analyzed for binding to the antibody. Epitopes of 1 and antibody 2 were identified.
  • the plasmid used a gene expressing the G protein of the rabies virus CVS-11 strain (Genbank Ref # AAC34683.1) and tagged V5 / HIS6 at the C-terminus to confirm expression.
  • the plasmid was then expressed in HEK293 cells. Temporally transfecting HEK293 cells with plasmids, the plasmid containing only the structure (WT RABV) expressing the positive control rabies virus G protein body (vector) and the negative control vector (vector) were incubated in a 384 well plate.
  • Shotgun mutagenesis was used to prepare a single mutation library in which each of the amino acid residues at positions 1 to 505 of the rabies virus G protein (see SEQ ID NO: 2), except for the signal peptide, was substituted with a different amino acid.
  • the plasmid the plasmid prepared in Example 1-1 was used as the parent plasmid.
  • Alanine Scanning Mutagenesis was performed as a mutation expression strategy to produce 505 mutant clones (hereinafter referred to as "alanine scanning mutations").
  • the alanine scanning mutation method is a method of substituting alanine for an amino acid of a protein to evaluate the contribution of amino acids at specific sites to the function, stability, or external reaction of the entire protein.
  • the immunofluorescence FACS analysis was performed to confirm the binding between the alanine scanning mutation library prepared in Example 1-2 and antibody 1 and antibody 2, and the mutations were selected in two iterations.
  • an optimal Fab concentration of antibody 1 was 0.33 ug / ml, and an optimal Fab concentration of antibody 2 was 0.33 ug / ml.
  • Abcam 1C5 (Abcam Inc.) and QED 20501 (QED Bioscience Inc.) antibodies were used as a control antibody, and the optimal concentration of the control antibody Abcam 1C5 was 0.25 ug / ml, and the optimal concentration of the control antibody QED 20501 was 0.5 ug / ml. The analysis was performed.
  • antibody 2 In addition, in the case of antibody 2, one tailored mutation was selected, and the selected mutation confirmed that the epitope region of antibody 2 was located at amino acid position 331 of the rabies virus G protein.
  • the epitopes of antibody 1 were amino acids 33, 34, 35, 38, 200 of rabies virus G protein (SEQ ID NO: 2). , Positions 202 and 215, and the epitopes of antibody 2 were identified as amino acids 331 and 333 of the rabies virus G protein.
  • the rabies virus binding site is indicated as the antigenic site of the surface glycoprotein of rabies virus, and for each site the antigenic structure of the rabies glycoprotein is described in Lafon et al. (J. Gen. Virol. 64: 843-8451 1983). Was defined first. Currently identified rabies virus binding sites are classified as antigenic sites I, II, III, IV and a, respectively, to Marissen et al. (J Virol. 2005 Apr; 79 (8): 4672-8.). Was defined by.
  • Antibody ID Amino acid residues Rabies virus binding site No. Amino acid mutations Amino acid position * Antibodies 1 One Glu (E)-> Ala (A) 33 None known 2 Gly (G)-> Ala (A) 34 Antigenic site II 3 Cys (C)-> Ala (A) 35 Antigenic site II 4 Leu (L)-> Ala (A) 38 Antigenic site II 5 Ala (A)-> Ser (S) 200 Antigenic site II 6 Lys (K)-> Ala (A) 202 None known 7 Leu (L)-> Ala (A) 215 None known Antibody 2 One Ser (S)-> Leu (L) 331 Antigenic site III 2 Arg (R)-> Ala (A) 333 Antigenic site III
  • Example 2 Determination of antigen-antibody binding affinity using surface plasmon resonance technology
  • the binding affinity of purified rabies virus G protein with antibody 1 and antibody 2 was determined by assay buffer HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.005% surfactant P20 at 25 ° C).
  • assay buffer HBS-EP 10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.005% surfactant P20 at 25 ° C).
  • PH 5.0 Biacore T200
  • Biacore T200 control software and Biacore T200 evolution software were used for reaction analysis.
  • Antibody 1 and antibody 2 were diluted in HBS-EP buffer.
  • Binding and separation rate constants Ka (M ⁇ 1 s ⁇ 1 ) and Kd (s ⁇ 1 ) were determined at a flow rate of 30 ⁇ l / min. Rate constants were obtained by performing reaction binding measurements at antibody concentrations ranging from 2.46 to 200 nM as 3-fold serial dilution and using buffer as a control.
  • Example 3-1 Escape Virus Generation Against CR4098 Antibodies
  • CR4098 antibody (Crucell) was obtained from a patent (see US7579446) and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database and synthesized from Enzynomics Co. Ltd., Yuseong-gu, Daejeon, pCT146 expression vector. (See Korean Patent Application No. 10-2014-0178030) and was then cloned to Celltrion Inc. The sequence of the synthesized part was confirmed by restriction digestion analysis and DNA sequencing. CR4098 antibodies were produced by transient transduction method in F2N78 cell line.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • FreeStyleTM Max (Invitrogen, 16447-100), a cationic polymer, was used for transient transduction in cells, and transduction was performed according to the manufacturer's instructions. The day before the transduction, centrifugation of F2N78 cells (see Korean Patent No.
  • EX-CELL 293 serum-free medium (Sigma, 14571C: hereinafter referred to as "EX-CELL 293 medium") After separation, the medium was replaced with FreeStyle293 serum-free medium (Gibco, 12338) and inoculated in 50 ml (100 ml total) using two 250 ml shaker flasks at a concentration of 0.8 ⁇ 10 6 cells per ml. On the day of transduction, 125 ⁇ g of pCT178 DNA and 125 ⁇ l of FreeStyleTM Max reagent containing the antibody gene were diluted into 2 ml volumes using OptiPRO SFM II (Invitrogen, 12309) medium, and then mixed lightly.
  • OptiPRO SFM II Invitrogen, 12309
  • 10 6 infectious rabies virus CVS-11 strains were serially diluted 1.5-fold in 96 well cell culture plates and allowed to react with 10-40 IU / ml CR4098 antibody at 37 ° C. for 1 hour. After 1 hour of reaction, 2x10 5 cells / ml of BHK cells were added and cultured for 3 days. After 3 days the virus was obtained, fixed cells and confirmed by staining the expression of Rabies Nucleocapsid protein to see if the CVS-11 strain was infected (Jenobiotech, 9061). In the second passage, the same experiment was repeated, increasing the amount of CR4098 antibody to the virus obtained in the first passage.
  • virus 4-5 identified as having developed or increased incidence, even though the virus obtained from the rabies virus CVS-11 strain was found to be uninfected or in small amounts. Clones were amplified (amplification) and RNA was isolated using a QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN, 52904).
  • Example 3-2 CR4098 Confirmation of antibody neutralization ability against escape virus produced by antibody
  • Fluorescent Antibody Virus-Neutralizing Test is a test for determining the levels of rabies virus antibodies in human or animal serum through cell culture methods.
  • the test method of FAVNT was put into a 96 well plate with a dilution test antibody (or HRIG) and a certain amount of rabies virus [100 TCID50 /0.1 ml] for 60 minutes, and then the baby hamster kidney cells contained 10% bovine serum. Incubated with culture medium (Eagle's minimum essential medium) and incubated for 36 to 48 hours. After culture, the cells were fixed and stained with rabies virus using anti-Rabies antibody, ABC kit (VECTASTAIN) and DAB kit (VECTASTAIN). Finally, the number of stained wells was counted to calculate the neutralizing ability of the test antibody relative to HRIG, which knew the exact neutralizing ability.
  • HRIG dilution test antibody
  • rabies virus 100 TCID50 /0.1 ml
  • both antibody 1 and antibody 2 showed a neutralizing ability against CR4098 antibody escape virus (N336K), and it was confirmed that only CR4098 antibody had no neutralizing ability.
  • RFFIT Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test
  • RFFIT like FAVNT
  • RFFIT is a method for determining the levels of rabies virus antibodies in human or animal serum through cell culture methods. Immunofluorescence staining is used as a measure of virus proliferation and takes about 20 hours.
  • RFFIT Fluorescing Foci Doses (50 FFD50) /0.1 ml].
  • the slide of the mixed form was incubated for 90 minutes in a 37 °C carbon dioxide incubator in a state containing neuroblastoma, culture medium (Eagle's minimum essential medium) and 10% bovine serum.
  • the whole was incubated for 20 hours in a 37 ° C. carbon dioxide incubator in the form of serum-virus-cells. Thereafter, the cells were cultured, washed, fixed and stained with a rabies conjugate and labeled with a fluorescence microscope.
  • RFFIT was performed on the wild-type virus of Table 8 below, which emerged in India using antibody 1, antibody 2, and a cocktail (antibody 1 + antibody 2). Experimental progress was carried out at the National Institute Mental Health and Science (NIMHANS). Each antibody is at a concentration of about 1 ug, 100 FFD 50 of each virus in Table 8 below The experiment was performed on Neuro 2 a cells. RFFIT results showed neutralizing capacity for each virus in all three antibodies.
  • FIG. 1 is a graph showing the survival rate of the mouse against the SV2 virus of the total six viruses (SV1 ⁇ SV6) in animal experiments.
  • Example 6-1 Wild-type Rabies Virus and Rabies Virus CVS Confirmation of Interference Effects of Antibody 1 and Antibody 2 Cocktails Using Neutralization Tests for -11 Weeks
  • RFFIT was performed as in Example 4 above on 12 wild type rabies virus and rabies virus CVS-11 strains using antibody 1, antibody 2 and cocktail (antibody 1 + antibody 2).

Abstract

본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질의 서로 다른 에피토프 부위를 규명하였고, 이에 결합하는 결합 분자 및 이들을 혼합한 칵테일이 다양한 광견병 바이러스를 대상으로 중화 능력을 보유하고 있음을 확인하였다.

Description

광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자
본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질(glycoprotein)의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자에 관한 것이다.
광견병(rabies)은 바이러스성 인수공통 감염병이며, 주로 야생 및 애완 동물에 영향을 미칠 뿐 아니라 인간을 포함한 포유류에게 영향을 미쳐 급성 뇌 질환의 원인이 된다. 한 번 발생하면 거의 사망에 이르는 치명적인 질병으로, 에이즈와 더불어 치사율이 가장 높은 질병으로 알려져 있다. 이러한 광견병은 전세계적으로 퍼져 있으며, 매년 천만 명 이상이 감염 후 치료를 받으며 매년 40,000명에서 70,000명이 사망한다.
광견병은 타액과 피로 전염되는데, 주로 광견병에 감염된 개 또는 고양이 등에 물리게 되면 발병한다. 또한, 스컹크, 박쥐 등 대부분의 포유류에 의해 감염될 수 있다.
광견병 바이러스(rabies virus)는 신체의 말단 신경 조직을 통해 뇌 신경 조직으로 도달한 뒤 실제 발병 증상을 나타낸다. 원래 인간의 뇌에는 혈액 내 장벽(blood brain barrier)이 존재하여 외부 물질을 차단하기 때문에 바이러스 등이 침투할 수 없으나, 광견병 바이러스는 RVG(rabies virus glycoprotein) 단백질을 통해 혈액 내 장벽을 통과하여 중추신경계(central nervous system) 뇌를 감염시킨다.
초기에는 감기와 비슷한 증상 이외에, 물린 부위에 가려움증이나 열을 느낀다. 광견병이 진행되면서 불안감, 공수증(물 등의 액체를 삼키게 되면 근육이 경련을 일으키고 심한 통증을 느껴 물을 두려워하는 증상), 바람에 대한 두려움(바람이 감각 기관을 과민하게 함), 흥분, 마비, 정신 이상 등의 신경 이상 증상이 나타난다. 또한 햇빛에 과민 반응을 일으키기도 한다. 이러한 증상이 관찰된 지 2-7일 뒤에 전신의 신경이나 근육이 마비를 일으켜 혼수 상태에 빠지고, 결국 호흡장애로 사망하게 된다.
광견병에 노출된 후의 처치로는 교상 후 치료법(노출 후 예방요법)이 있다. 교상 후 치료법은 즉각적인 국소 상처 보호와 수동면역을 위한 항체 투여(항-광견병 이뮤노글로블린: 이하 "anti-rabies antibody"라 칭함), 능동 면역을 위한 백신 투여로 이루어져 있다. 현재 개발된 anti-rabies antibody는 인간 유래 광견병 항체(human derived rabies immunoglobulin: 이하 "HRIG"라 칭함)와 말 유래 광견병 항체(equine derived rabies immunoglobulin: 이하 "ERIG"라 칭함)가 있다. HRIG의 경우 공급이 원활하지 않으며 고가인데다 다클론 항체(polyclonal antibody)여서 단위 무게 당 효능이 높지 않다. 또한, 인간의 혈액에서 유래한 것이기 때문에 HIV 등 인간 유래 질병의 잠재적 감염 위험성이 높다. ERIG의 경우 HRIG보다 저가이기는 하나, HRIG보다도 치료 효율이 낮아 훨씬 높은 용량으로 환자에게 투여된다. 이러한 이유로 인간과는 다른 동물인 말에서 유래한 항체이므로 과민증(anaphylaxis)을 일으킬 수 있다. 이와 같이 원활하지 못한 공급과 다클론 항체가 갖는 단점을 극복하고자 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있은 단일 항체(monoclonal antibody)의 사용이 제안되었다. 1980년 대에 광견병-바이러스 중화 뮤린 단일 항체가 개발되었으나(Schumacher CL et al., J. Clin. Invest. Vol. 84, p. 971-975, 1989), 인체 내에서의 짧은 반감기와, 항체에 의한 체내 면역반응의 부재, 인간 항-뮤린 항체(HAMA ; human anti-mouse antibody)의 유도 등의 단점으로 인간 환자에 대한 직접적인 투여에는 제한되어 있다.
또한, WHO에서는 기존의 HRIG이나 ERIG을 교체하기 위해 몇 가지 권고사항을 제시하였다(WHO Consultation on a Rabies Monoclonal Antibody Cocktail for Rabies Post Exposure Treatment. WHO, Geneva, 23-24 May 2002). 그 중 단일 항체가 광견병 치료제가 되기 위해서는 2-3개의 항체가 칵테일화되어 광견병 바이러스 표면 당단백질에 서로 다른 부위에 결합해야 함을 제안하였다.
따라서 효과적인 광견병 치료를 위하여, 혈액에서 유래하지 않아 잠재적 감염에 대한 안전성이 높으며, 배양을 통한 생산으로 대규모 생산 공급이 가능하고, 효능을 갖는 항체만으로 구성되어 균일한 품질 확보와 단위량 당 효능이 높은 인간 단일클론 항체 및 다양한 광견병 바이러스를 대비한 혼합 칵테일의 개발이 시급한 실정이다.
이에 상기의 문제점들을 해결하고자, 본 발명자들은 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 인간 항체(대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030 참조)의 에피토프가 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 2 참조)의 아미노산 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치 또는, 아미노산 331 및 333번 위치임을 확인하였고, 상기 서로 다른 에피토프에 결합하는 두 종류의 항체를 혼합한 항체 칵테일의 중화 능력을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 세포주를 배양하여 상기 결합 분자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 결합 분자를 이용한 광견병 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는
a) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 1 결합 분자; 및
b) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 2 결합 분자
를 포함하는 광견병 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 조성물을 투여하는 단계;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 순차적으로 투여하는 단계
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 광견병 바이러스 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일 구체예는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프일 수 있고, 보다 구체적으로 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는 1X10-8 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5x10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는
a) 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역, 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 6의 CDR1 영역, 서열번호 7의 CDR2 영역, 및 서열번호 8의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 15의 가변영역 및/또는 서열번호 16의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 19의 중쇄 및/또는 서열번호 20의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프일 수 있고, 보다 구체적으로 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
상기 결합친화도(KD)는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면 BIACORE 시스템을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는
a) 서열번호 9의 CDR1 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역, 및 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 12의 CDR1 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역, 및 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다.
다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 17의 가변영역 및/또는 서열번호 18의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 서열번호 21의 중쇄 및/또는 서열번호 22의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 결정은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합 분자도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 이것의 단편일 수 있다. 또한, 상기 결합 분자는 Fab 절편, Fv 절편, 디아바디(diabody), 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있으나, 이것에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서는 광견병 바이러스에 결합하는 완전한 인간 항체(fully human antibody)를 제공한다. 본 명세서에서 항체는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상(intact) 단일클론 항체, 다클론 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 항체의 기능적 변이체를 포함한다. 항체들은 변이체들이 광견병 바이러스 또는 이것의 G 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있다면 본 발명의 항체의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in-vitro) 또는 생체내(in- vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 광견병 바이러스 또는 이것의 G 단백질에 결합할 수 있다. 일 예로, 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 CDR 3 영역을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 가변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 항체와 약 50%~99%, 약 60%~99%, 약 80%~99%, 약 90%~99%, 약 95%~99%, 또는 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit 등을 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 광견병 바이러스는 개, 소, 몽구스, 박쥐, 스컹크, 너구리, 코요테, 여우 및 늑대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개체에서 유래될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자에 추가적으로 하나 이상의 태그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)를 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체에 약물이 추가로 부착될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 항체는 약제가 결합된 항체-약물 접합체(conjugate)의 형태로 사용될 수 있다. 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체(Antibody Drug Conjugate, ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 상기 약물 모이어티를 감염된 세포에 표적화 전달할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 투여하게 되면, 정상 세포에 대해서도 허용될 수 없는 수준의 독성이 야기될 수 있기 때문이다. 약물-연결성 및 약물-방출성뿐만 아니라 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단일클론 항체(monoclonal antibody, mAb)의 선택성을 높임으로써 ADC의 최대 효능과 최소 독성을 개선할 수 있다.
약물 모이어티(Moiety)를 항체에 부착시키는, 즉 공유 결합을 통하여 연결시키는 통상적인 수단으로는, 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 수많은 부위에 부착되는 불균질한 분자 혼합물이 유발된다. 예를 들어, 세포독성 약물을 전형적으로, 종종 항체의 수 많은 리신 잔기를 통하여 항체와 접합시켜 불균질한 항체-약물 접합체 혼합물을 생성시킬 수 있다. 반응 조건에 따라서, 이러한 불균질한 혼합물은 전형적으로, 약물 모이어티에 부착된 항체 분포도가 0 내지 약 8 이상이다. 또한, 특별한 정수비의 약물 모이어티 대 항체를 수반한 접합체의 각 아군은, 약물 모이어티가 항체 상의 각종 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이다. 항체는 크고, 복잡하며 구조적으로 다양한 생체 분자이고, 종종 많은 반응성 관능기를 갖고 있다. 링커(Linker) 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 조용매와 같은 요인들에 의해 좌우된다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일 예로 본 발명은 상기 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
상기 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide) 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터(Expression vector)를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터(한국특허등록 제10-1076602호 참조) 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입시 인산칼슘 트랜스펙션(Transfection), 바이러스 감염, DEAE-Dextran 조절 트랜스펙션, 리포펙타민(Lipofectamin) 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커(Maker)를 함유하나 이에 제한되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터도 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선택되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 결합 분자의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그(Tag) 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 발현 벡터가 숙주 세포에 형질전환되어, 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 세포주를 배양하는 단계; 및
b) 발현된 결합 분자를 회수하는 단계
를 포함하는 광견병 바이러스에 결합하여 중화 능력을 가지는 결합 분자를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포주는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 상기 포유동물 세포로는 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 숙주 세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 광견병 바이러스 중화 능력을 가지는 결합 분자 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업자에게 이미 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 적어도 하나의 다른 광견병 치료제를 포함할 수 있으며, 또한 여러 종류의 단일클론 항체를 포함할 수 있으며, 이를 통해 중화 활성에 상승 작용을 나타낼 수 있다.
아울러, 본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 상기 치료제로는 항-바이러스 약제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 약제로는 항체, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항-바이러스성 펩티드 등일 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균하고 안정하며, 전달 시 또는 전달 전에 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 중에 재구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 살균성 주사용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 구성성분의 분말과 이의 미리 살균-여과된 용액으로부터 추가의 원하는 구성성분을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 의약 조성물은 용액 상태일 수 있고, 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 단위 투여량 주사형을 제공하기 위해 전달되기 전 또는 전달 시에 첨가 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 약물농도에 알맞고, 알맞은 흐름성을 유지할 수 있고, 필요에 따라 흡수가 지연될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물 투여의 최적 경로 선택은 의약 조성물 내의 활성 분자들의 물리-화학적 특성, 임상적 상황의 긴급성 및 원하는 치료용 효과에 대한 활성 분자의 플라즈마 농도의 관계를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다. 예를 들어 본 발명의 단일클론 항체는 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은 그들의 신속한 방출을 막은 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한 단일클론 항체는 항체의 불활성화를 막은 물질 또는 화합물로 코팅되거나 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 적합한 담체-리포좀 또는 희석제-와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 일 예로 투여 경로는 정맥 내일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 경구 형태로는 정제, 트로키제, 약용 드롭스제, 수성 또는 유성 현탁제, 산제 또는 분산과립제, 에멀젼제, 강성 캡슐제, 연성 젤라틴 캡슐제, 시럽제 또는 엘릭서제, 필제, 당의정, 액제, 겔제 또는 슬러리제로서 제제화될 수 있다. 이들 제형은 불활성 희석제, 과립화 또는 붕해제, 결합제, 광택제, 보존제, 착색제, 풍미제 또는 감미제, 식물성유 또는 미네랄유, 습윤제 및 점증제를 함유하는 약제학적적으로 허용 가능한 부형제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 비경구 형태로는 수성 또는 비수성 등장성 살균 비독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 용액 또는 현탁액은 적용된 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성인 1,3-부탄디올, 링거스 용액, 행크스 용액, 등장성 염화나트륨 용액과 같은 약제, 오일, 지방산, 국소마취제, 보존제, 완충액, 점도 또는 용해도 증가제, 수용성 항산화제, 유용성 항산화제 및 금속 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 투여량은 처리되는 대상, 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 일 예로 유효성분으로서 결합 분자는 포유 동물에 대해 하루 0.001 내지 10 mg/kg(체중), 또는 0.005 내지 1 mg/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 경우에 따라, 상기 언급된 범위보다 적은 투여량이 보다 적합할 수 있고, 해로운 부작용을 일으키지 않으면서도 보다 많은 양이 사용될 수 있으며, 보다 많은 투여량의 경우는 하루에 걸쳐 수회의 적은 분량으로 분배될 수 있다.
진단용 의약 조성물에 사용되는 본 발명의 결합 분자는 검출 가능하게 표식되는 것이 바람직하다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다. 검출 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그 중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 상기 결합 분자; 및
b) 용기
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단, 예방 또는 치료용 키트에 있어서, 상기 b)의 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체로는 다공성 또는 비다공성. 평면 또는 비평면일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 단계 a)의 결과를 분석하여 광견병 감염 여부를 판별하는 단계
를 포함하는 광견병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 대상에게 상기 결합 분자를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 광견병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
예를 들어, 광견병 위험지역을 여행할 때 본 발명의 인간 단일 항체를 투여함으로써 1일, 2일, 3일 또는 수일 내에 광견병 바이러스에 대한 면역성을 부여할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상 시료와 상기 결합 분자를 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 결합 분자가 대상 시료에 특이적으로 결합하는지 측정하는 단계
를 포함하는 광견병 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 광견병 바이러스 검출 방법에 있어서, 상기 대상 시료는 (잠재적) 감염 대상으로부터의 혈액, 혈청, 타액, 가래, 침, 땀, 조직 또는 다른 생물학적 물질을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다. (잠재적) 감염 대상은 인간 대상일 수 있지만, 또한 광견병 바이러스의 담체로써 의심되는 동물들일 수 있다. 대상 시료는 먼저 그것을 검출 방법에 더 적절하게 만들기 위해 조작될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 분자 또는 이뮤노컨쥬게이트는 결합 분자와 광견병 바이러스 또는 대상 시료에 존재하는 그것의 항원성 성분 사이의 면역학적 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 대상 시료와 접촉된다. 대상 시료 내의 광견병 바이러스의 존재를 나타내는 면역학적 복합체의 형성은 적절한 수단에 의해 검출되고 측정된다. 이러한 방법으로 방사면역측정법(RIA), ELISA, 면역형광법, 면역 조직 화학, FACS, BIACORE, 웨스턴 블롯 분석과 같은 면역분석이 있지만, 이것에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 1 결합 분자; 및
b) 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 제 2 결합 분자
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물(이하 "칵테일 조성물")을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 칵테일 조성물은 상기 a) 제 1 결합 분자와 b) 제 2 결합 분자를 농도 비율 1:9 내지 9:1로 포함할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 칵테일 조성물은 1:3 내지 9:1로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자가 결합하는 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자가 결합하는 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 1X10-8 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5x10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 5X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도(KD)를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-10 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-11 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-12 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 3X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 1X10-13 M 미만의 결합친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
a) 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역, 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 6의 CDR1 영역, 서열번호 7의 CDR2 영역, 및 서열번호 8의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 15의 가변영역 및/또는 서열번호 16의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 19의 중쇄 및/또는 서열번호 20의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
a) 서열번호 9의 CDR1 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역, 및 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 및/또는
b) 서열번호 12의 CDR1 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역, 및 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 17의 가변영역 및/또는 서열번호 18의 가변 영역을 포함하는 결합 분자일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 21의 중쇄 및/또는 서열번호 22의 경쇄를 포함하는 결합 분자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있고, 상기 항체에 항-바이러스 약물이 추가로 부착될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 칵테일 조성물은 멸균 주사용액, 동결건조 제형, 사전 충전식 주사 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 칵테일 조성물을 투여하는 단계;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 순차적으로 투여하는 단계
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 당업자에게 알려진 치료제를 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 일 예로 투여 경로는 정맥 내일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 항-바이러스 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항-바이러스 약물은 항-광견병 바이러스 단일클론 항체, 항-광견병 바이러스 다클론 항체, DNA 폴리머라제 저해제, siRNA 제제 또는 치료 백신일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여하는 단계; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여하는 단계
를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 순차 투여; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 순차 투여
하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는
(1) 치료적 유효량의 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물; 및
(2) a) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여함;
b) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 순차 투여함; 또는
c) 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 상기 제 1 결합 분자를 순차 투여함을 지시하는 패키지 삽입물(package insert)
을 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 에피토프는 상기 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 에피토프는 상기 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드에 있어서, 상기 에피토프는 그 3차원 구조를 유지하거나, 백신 등의 조성물로 이용시 효율을 제고하기 위하여 담체(carrier)와 결합된 형태로 이용 가능하다. 본 발명에 따른 담체는 생체에 적합하며 본 발명에서 목적하는 효과를 거둘 수 있는 것이라면 모두 사용 가능한데, 펩타이드, 혈청 알부민, 면역 글로불린, 헤모시아닌 및 다당체 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체로 유전자 백신 형태로 이용가능하다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 전달체 없이 그 자체로 이용가능할 수도 있으며, 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체에 담지되어 체내로 전달될 수 있다. 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용가능하다고 알려진 것이면 어떤 것이라도 이용가능하다. 구체적으로 바이러스성 전달체는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(letrovirus) 등이 가능하며, 비바이러스성 벡터로는 양이온성 폴리머, 비이온성 폴리머, 리포좀, 지질, 인지질, 친수성 폴리머, 소수성 폴리머 및 이들 중에서 선택된 하나 이상의 복합체 등이 이용가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질 전환된 재조합 미생물 또는 바이러스를 제공한다. 일 구체예로, 상기 재조합 미생물 또는 바이러스는 재조합 대장균, 재조합 효모, 또는 재조합 박테리오 파지일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프 또는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 미생물 또는 바이러스 표면에 발현하는 방법을 제공한다. 이때 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 코딩하는 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 다양한 미생물 또는 바이러스가 사용될 수 있으며, 특히 적합한 미생물 또는 바이러스는 재조합 대장균, 재조합 효모 및 재조합 박테리오 파지 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 미생물 또는 바이러스 표면에 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 미생물 또는 바이러스 표면에 발현시키기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 디스플레이(display) 기술이 이용될 수 있으며, 특히 미생물 세포 또는 바이러스 표면에 발현되도록 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 인코딩하는 서열에 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시켜 발현하거나, 원래 표면에 발현되는 단백질을 인코딩하는 유전자 부위의 일부를 결손시키고 이에 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 방법 등이 이용가능하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법으로 미생물 또는 바이러스 표면에 발현된 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프는 그 자체로 분리, 정제되어 본 발명에 따른 특정한 용도로 사용할 수 있으며, 표면에 발현된 상태로 상기 아미노산 위치를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하여 수득하는 용도로도 이용가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물 또는 바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 에피토프를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 에피토프, 또는 이 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 광견병 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 폴리펩타이드에 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝하는 방법은 임의의 면역분석법에 의해, 예를 들어, ELISA, 조직 또는 세포(형질주입된 세포를 포함)의 염색에 의해, 중화 분석(neutralization assay)에 의해 또는 목적으로 하는 특이성 또는 기능을 확인하기 위해 업계에서 잘 알려진 다른 방법들 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 광견병 바이러스 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 면역보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 면역보조제로는 체내에 주입시 항체 형성을 증진시키는 역할을 하여 본 발명에서의 목적 달성이 가능한 것이라면 어떤 것이라도 사용 가능하며, 알루미늄염(Al(OH)3, ALPO4), 스쿠알렌(squalene), 소르비탄 (sorbitane), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), CpG, 리포좀, 콜레스테롤, MPL(monophosphoryl lipid A), GLA(glucopyranosyl lipid A)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명에서 사용되는 단어를 아래와 같이 정의한다.
본 발명에서 사용되는 "결합 분자"라는 용어는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로믈린, 예를 들면 광견병 바이러스 또는 바이러스 외부의 G 단백질(Glycoprotein) 또는 그의 단편과의 결합을 위해 온전한 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 잔기, 5개 이상의 연속 아미노산 잔기, 10개 이상의 연속 아미노산 잔기, 15개 이상의 연속 아미노산 잔기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
항원-결합 단편은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 "에피토프"라는 용어는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로서, 본 명세서와 청구의 범위에 사용된 바와 같이 단일 또는 복수 펩타이드를 함유하는 펩타이드 물질을 의미하고, 본 명세서에 설명되고 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열 데이터 및 이의 변형체를 갖고, 본 명세서와 청구의 범위에 설명된 활성 프로필을 갖는 펩타이드까지 포함한다. 따라서, 활성이 거의 동등하거나 변경된 활성을 나타내는 단백질도 이와 같은 의미로 해석되어야 한다. 이러한 변형은 고의적인 것, 즉 부위 지시된 돌연변이유발을 통해 수득한 변형이거나, 또는 우연한 것, 즉 복합체 또는 이의 지정된 서브유닛의 생산자인 숙주에서 돌연변이를 통해 수득된 것일 수 있다. 변형체를 비롯한 에피토프를 포함하는 펩타이드의 변형을 형성시키고 검사하는 방법으로서, 즉 부위 지시된 돌연변이유발 또는 랜덤 돌연변이유발 등은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"라는 용어는 용인 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "치료적 유효량"이라는 용어는 광견병 바이러스의 노출 전 또는 노출 후에 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 결합 분자의 양을 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 샷건 돌연변이법을 이용하여 신호 펩티드를 제외한 광견병 바이러스 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치를 다른 아미노산 잔기로 치환하였을 때 본 발명에 따른 항체와의 결합능이 현저히 떨어지는 것을 확인함으로써, 이 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프임을 규명하였다. 또한, 샷건 돌연변이법을 이용하여 상기 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 331 및 333번 위치를 다른 아미노산 잔기로 치환하였을 때 본 발명에 따른 또 다른 항체와의 결합능이 현저히 떨어지는 것을 확인함으로써, 이 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프임을 규명하였다. 아울러, 상기 두 항체를 혼합한 항체 칵테일의 경우 서로 다른 에피토프에 결합하여 간섭 없이 광견병 바이러스에 대한 중화 능력을 가짐을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 에피토프 및 이에 결합하는 결합 항체, 이들의 항체 칵테일이 광범위한 개체에서 유래된 광견병 바이러스에 감염된 환자를 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 광견병 바이러스 G 단백질의 서로 다른 에피토프 부위를 규명하였고, 이에 결합하는 결합 분자 및 이들을 혼합한 칵테일이 다양한 광견병 바이러스를 대상으로 중화 능력을 보유하고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 광견병 바이러스 G 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자는 광견병 진단, 예방 또는 치료에 유용하다.
도 1은 동물실험에서 SV2 바이러스에 대한 마우스의 생존율을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예 1: 항체의 에피토프 규명
대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030의 실시예 4에서 최종 선별된 4개의 항체 중 2개의 항체(이하 "항체 1" 또는 "항체 2" 라 칭함)의 에피토프를 규명하기 위하여, 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 1 참조) 내의 단일 돌연변이를 유발시키고, 각 돌연변이체들에 대한 항체 1 및 항체 2의 결합능력을 조사하였다. 각 돌연변이체의 제조 및 항체 1 및 항체 2의 결합능력 분석은 미국의 인테그랄 몰레큘라(integral Molecular) 사의 샷건 돌연변이법(shoutgun mutagenesis, J Am Cehm Xoc. 2009; 131(20): 6952-6954 등 참조)을 이용하였다.
샷건 돌연변이법은 진핵 세포 내의 돌연변이된 표적 단백질의 라이브러리의 발현 및 분석이 가능하다. 즉, 표적 단백질 중의 모든 잔기를 각각 다른 아미노산으로 돌연변이 시키고, 포유류 세포주에 발현하여 단일클론항체(MAb) 결합 또는 기능에서의 변화를 분석할 수 있다.
샷건 돌연변이법은 두 단계로 진행하였는데, 먼저 야생형 광견병 바이러스 CVS-11 주의 G 단백질 발현 플라스미드를 제조하여 포유류 세포주에 발현시킨 후 항체 1 및 항체 2의 결합능력 분석을 위한 항체 농도를 최적화하였다.
그런 다음 샷건 돌연변이법을 이용하여 광견병 바이러스 CVS-11 주의 G 단백질 내 아미노산 잔기 각각을 다른 아미노산으로 치환시킨 돌연변이 라이브러리(이하 "단일 돌연변이 라이브러리" 라 칭함)를 제작하고 항체에 대한 결합능력을 분석하여 항체 1 및 항체 2의 에피토프를 확인하였다.
실시예 1-1: 광견병 바이러스 G 단백질을 발현하는 플라스미드 제작
플라스미드는 광견병 바이러스 CVS-11 주의 G 단백질을 발현하는 유전자(Genbank Ref # AAC34683.1)를 사용했으며 발현 유무를 확인하기 위해 C-말단에 V5/HIS6를 태그하였다. 그 다음, HEK293 세포에서 상기 플라스미드를 발현하였다. HEK293 세포에 해당 플라스미드를 일시적으로 트랜스펙션 시켜서 하루 동안 양성 대조군인 광견병 바이러스 G 단백질체를 발현하는 구조물(WT RABV)과 음성 대조군인 벡터(vector) 만 포함된 플라스미드를 384 웰 플레이트에서 배양하였다.
실시예 1-2: 광견병 바이러스 G 단백질의 단일 돌연변이 라이브러리 제작
샷건 돌연변이법을 이용하여 신호 펩티드(signal peptide)를 제외한 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 2 참조)의 1 내지 505번 위치의 아미노산 잔기 각각이 다른 아미노산으로 치환된 단일 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 플라스미드로 상기 실시예 1-1에서 제작한 플라스미드를 부모 플라스미드로 사용하였다. 돌연변이 발현 전략으로 알라닌 스캐닝 돌연변이법(Alanine Scaning Mutagenesis)를 진행하여 505 돌연변이 클론(이하 "알라닌 스캐닝 돌연변이" 라 칭함)을 제작하였다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 방법이란 단백질의 아미노산을 알라닌으로 치환하여 특정 부위의 아미노산이 전체 단백질의 기능, 안정성 혹은 외부 반응에 미치는 기여도를 평가하는 방법이다. 또한, 탈출 돌연변이 바이러스(escape mutant virus) 실험 방법(대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030 참조)으로 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 34, 210, 331, 336 및 413번 위치 각각을 알라닌이 아닌 다른 아미노산 잔기로 치환한 단일 돌연변이 클론(이하 "맞춤형 돌연변이" 라 칭함)을 제작하였다. 따라서, 하기 [표 1]과 같이 총 라이브러리 크기는 512 돌연변이 클론들로 구성이 되었다.
에피토프 규명을 위해 사용된 라이브러리 특성
클론 명칭 클론 설명 클론 수
알라닌 스캐닝 돌연변이 광견병 G 단백질의 아미노산 1-505 각각 → Ala(A) 치환 광견병 G 단백질의 마이노산 1-505 내 Ala(A) → Ser(S) 치환 505
맞춤형 돌연변이 광견병 G 단백질의 아미노산 34 Gly(G) → Val(V) 치환 7
광견병 G 단백질의 아미노산 34 Gly(G) → Glu(E) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 34 Gly(G) → Arg(R) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 210 Val(V) → Glu(E) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 331 Ser(S) → Leu(L) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 336 Asn(N) → Lys(K) 치환
광견병 G 단백질의 아미노산 413 Glu(E) → Asp(D) 치환
총 수 512
*상기 아미노산 위치는 광견병 바이러스 G 단백질의 신호 펩티드를 제외하고 넘버링한 위치임
실시예 1-3: 항체의 에피토프 확인
실시예 1-3-1: 알라닌 스캐닝 돌연변이를 이용한 항체의 에피토프 확인
항체 1 및 항체 2의 에피토프를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제작한 알라닌 스캐닝 돌연변이 라이브러리를 이용하여 항체 1 및 항체 2와의 결합능력을 분석하였다.
상기 실시예 1-2에서 제작한 알라닌 스캐닝 돌연변이 라이브러리와 항체 1 및 항체 2의 결합 확인을 위해 면역 형광 FACS 분석을 수행하였고, 2번 반복으로 돌연변이를 선별하였다.
에피토프 분석을 위한 실험에 항체 1 및 항체 2의 전체 항체 몸체를 그대로 사용했을 시 해당 분석에 변별력이 떨어져 이를 극복하고자, 항체 1 및 항체 2에 파파인(papin)을 처리하여 항체의 Fc 부분을 제거하고 Fab 부분만 남은 항체 1의 Fab 및 항체 2의 Fab를 사용하기로 결정하였다. Fc 부분이 제거된 Fab를 이용하여 실험하였기 때문에 분석 검출하기 위한 2차 항체는 Fab-특이적 AlexaFluor488 접합 2차 항체(Jackson Immunoresearch Alexafluor488 Goat anti-human F(ab')2 fragment)를 사용하였다.
또한, 에피토프 분석을 위한 실험에 항체 1의 Fab 최적 농도는 0.33 ug/ml, 항체 2의 Fab 최적 농도는 0.33 ug/ml으로 하여 분석을 수행하였다. 대조군 항체로는 Abcam 1C5(Abcam Inc.)와 QED 20501(QED Bioscience Inc.) 항체를 사용하였고, 대조군 항체 Abcam 1C5의 최적 농도는 0.25 ug/ml, 대조군 항체 QED 20501의 최적 농도는 0.5 ug/ml로 하여 분석을 수행하였다.
라이브러리 선별에서 상기 실시예 1-1의 양성 대조군에 대한 결합 반응성에 대비하여, 대조군 항체 Abcam 1C5 또는 QED 20501의 80% 초과 발현이면서 동시에 항체 1의 Fab 또는 항체 2의 Fab의 15% 미만 발현된 알라닌 스캐닝 돌연변이를 선별하였다.
돌연변이 결합 반응성(% WT)
항체 1 Fab 항체 2 Fab Abcam 1C5 Mab QED 20501 MAb
E33A 1.3 59.3 81.2 93.4
G34A -0.3 95.9 98.2 91.7
C35A 3.9 83.7 101.6 94.9
L38A 5.4 130.2 127.6 113.8
A200S 10.5 102.9 109.1 87.6
K202A 4.2 132 113 105.5
L215A 6.6 100.1 101.7 100.0
R333A 68.6 5.4 103.1 109.1
그 결과, [표 2]에 나타낸 바와 같이, 항체 1의 경우 총 7 알라닌 스캐닝 돌연변이를 선별하였고, 상기 선별된 돌연변이를 통해 항체 1의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치임을 확인하였다.
또한 항체 2의 경우 총 1 알라닌 스캐닝 돌연변이를 선별하였고, 기 선별된 돌연변이를 통해 항체 2의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 333번 위치임을 확인하였다.
실시예 1-3-2: 맞춤형 돌연변이를 이용한 항체의 에피토프 확인
항체 1 및 항체 2의 에피토프를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 제작한 맞춤형 돌연변이 라이브러리를 이용하여 항체 1 및 항체 2와의 결합능력을 분석하였다.
상기 실시예 1-2에서 제작한 맞춤형 돌연변이 라이브러리와 항체 1 및 항체 2의 결합 확인을 위해 상기 실시예 1-3-1과 같이 면역 형광 FACS 분석을 수행하여 돌연변이를 선별하였고, 선별 결과를 하기 [표 3]에 나타내었다. Anti-V5 의 경우 발현 백터가 올바르게 광견병 바이러스 G 단백질의 발현 여부를 확인하는 분석 대조군으로 사용되었다.
돌연변이 결합 반응성(% WT)
항체 1 Fab 항체 2 Fab Abcam 1C5 MAb QED 20501 MAb Anti-V5
G34V 2.1 108 101 74.6 91.9
G34E 1.4 138 167 124 75.2
G34R 1.4 76.6 120 56.7 72.3
V210E 23.9 8.3 1.6 -1 85.9
S331L 60.5 -0.1 82.3 50.4 111
N336K 85.3 101 84.4 59 96.1
E413D 78.6 77.7 115 40.7 80.4
그 결과, [표 3]에 나타낸 바와 같이, 항체 1의 경우 3 맞춤형 돌연변이를 선별하였고, 상기 선별된 돌연변이를 통해 항체 1의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 34번 위치임을 확인하였다.
또한, 항체 2의 경우 1 맞춤형 돌연변이를 선별하였고, 상기 선별된 돌연변이를 통해 항체 2의 에피토프 부위가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 331번 위치임을 확인하였다.
실시예 1-3-3: 항체의 에피토프 확인 결과
상기 실시예 1-3-1 및 1-3-2의 결과를 통해 하기 [표 4]와 같이 항체 1의 에피토프가 광견병 바이러스 G 단백질(서열번호 2)의 아미노산 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번 위치임을 확인하였고, 항체 2의 에피토프가 광견병 바이러스 G 단백질의 아미노산 331 및 333번 위치임을 확인하였다.
광견병 바이러스 결합 부위는 광견병 바이러스의 표면 당단백질의 항원성 부위로 표시되며, 각 부위에 대해서는 광견병 당단백질의 항원성 구조는 Lafon et al.(J. Gen.Virol. 64:843-8451 1983)에 의해 최초로 정의되었다. 현재 확인된 광견병 바이러스 결합 부위는 각각 항원성 부위(antigenic site) I, II, III, IV, a로 분류되어 Marissen et al.(J Virol. 2005 Apr;79(8):4672-8.)에 의해 정의되었다.
항체 ID 아미노산 잔기 광견병 바이러스 결합 부위
No. 아미노산 변이 아미노산 위치*
항체 1 1 Glu(E)-->Ala(A) 33 알려진바 없음
2 Gly(G)-->Ala(A) 34 항원성 부위 II
3 Cys(C)-->Ala(A) 35 항원성 부위 II
4 Leu(L)-->Ala(A) 38 항원성 부위 II
5 Ala(A)-->Ser(S) 200 항원성 부위 II
6 Lys(K)-->Ala(A) 202 알려진 바 없음
7 Leu(L)-->Ala(A) 215 알려진 바 없음
항체 2 1 Ser(S)-->Leu(L) 331 항원성 부위 III
2 Arg(R)-->Ala(A) 333 항원성 부위 III
*상기 아미노산 위치는 광견병 바이러스 G 단백질의 신호 펩티드를 제외하고 넘버링한 위치임
실시예 2: 표면 플라스몬 공명 기술을 이용한 항원-항체 결합친화도 결정
표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 검정(Biocore Inc.)은 정반응 속도 상수 및 역반응 속도 상수의 역학적 측정에 의해 항체의 결합친화도를 결정하였다. 따라서, 표면 플라스몬 공명 기술을 이용하여 항체 1 및 항체 2의 항원-항체 결합친화도를 결정하였다.
구체적으로, 정제된 광견병 바이러스 G 단백질과 항체 1 및 항체 2의 결합친화도는 25℃에서 분석 완충액 HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)을 사용하는 Biacore T200 (GE Healthcare) 장비로 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정되었다. 10 mM 아세트산나트륨 (Sodium Acetate, pH 5.0) 중에 희석된 광견병 바이러스 G 단백질 50 ㎍/ml를 제조사의 지침 및 절차에 따라 아민 커플링 키트(Amine coupling kit)를 사용하여 CM5 연구용 바이오센서 칩에 약 500 RU만큼 직접적으로 고정시켰다. 바이오센서 표면에서 반응하지 않은 부분을 에탄올아민(ethanolamine)으로 차단하였다. 반응 분석을 위해 Biacore T200 콘트롤 소프트웨어, Biacore T200 이벨루에이션 소프트웨어를 사용하였다. 항체 1 및 항체 2는 HBS-EP 완충액에 희석하였다. 검정 동안에, 모든 측정은 고정된 광견병 바이러스 G 단백질이 없는 바이오센서 표면을 대조군으로 사용하였다. 결합 및 분리 속도 상수 Ka(M-1s-1) 및 Kd(s-1)은 30 ㎕/분의 유속에서 결정하였다. 속도 상수는 3배의 연속희석으로서 2.46 - 200 nM 범위의 항체 농도에서 반응 결합 측정을 실시하고 완충액을 대조군으로 사용함으로써 획득하였다. 이어서, 항체와 표적 항원 사이의 반응에 대한 평형 해리 상수 KD (M)를 반응 속도 상수로부터 다음의 등식에 의해 계산하였다: KD = Kd/Ka. 결합은 시간과 반응 속도 상수의 함수를 계산하여 기록하였다.
그 결과, [표 5]에 나타낸 바와 같이, 정제된 광견병 바이러스 G 단백질에 대하여 항체 1 및 항체 2의 결합친화도를 결정하였다. 항체 1 및 항체 2 모두 광견병 바이러스 G 단백질에 대하여 높은 친화도를 나타냄을 확인하였다.
광견병 바이러스 G 단백질을 이용한 결합친화도 측정
샘플 ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) KD AVR KD
항체 1 2.52E+05 9.39E-04 3.73E-09 4.54E-09
2.14E+05 1.15E-03 5.36E-09
항체 2 2.11E+06 0.0005743 2.72E-10 2.24E-10
1.54E+06 2.70E-04 1.75E-10
실시예 3: CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
실시예 3-1: CR4098 항체에 대한 탈출바이러스 생성
CR4098 항체(Crucell)에 대한 DNA 서열은 특허(US7579446 참조)와 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이타베이스(database)로부터 확보하였고 엔지노믹스(Enzynomics Co.Ltd, 대전시 유성구 소재)에서 합성하여 pCT146 발현 벡터(대한민국 특허 출원번호 10-2014-0178030 참조)에 클로닝 후 셀트리온(Celltrion Inc.)으로 전달되었다. 합성된 부분의 서열은 제한효소 절단 분석과 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하였다. CR4098 항체는 F2N78 세포주에서 일시적 형질도입 방법으로 생산하였다.
세포 내 일시적 형질도입을 위하여 양이온성 폴리머(cationic polymer)인 FreeStyleTM Max(Invitrogen, 16447-100)를 사용하였으며, 제조사의 사용설명서에 따라 형질도입을 수행하였다. 형질도입 전날, EX-CELL 293 무혈청 배지(Sigma, 14571C: 이하 "EX-CELL 293 배지"라 기재함)에서 자라는 F2N78 세포(한국등록특허 제10-1005967호 참조, 특허권자: ㈜셀트리온)를 원심 분리하여, FreeStyle293 무혈청 배지(Gibco, 12338)로 배지를 교체하였으며, ㎖ 당 0.8×106 개의 세포 농도로 250 ㎖ shaker flask 두 개를 이용하여 50 ㎖씩(총 100 ㎖) 접종하였다. 형질도입 당일 날, 항체 유전자를 포함하는 pCT178 DNA 125 ㎍과 FreeStyleTM Max 시약 125 ㎕를 각각 OptiPRO SFM II(Invitrogen, 12309) 배지를 이용하여 2 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 섞어 주었다. 즉시 희석된 FreeStyleTM Max 시약 용액을 DNA가 희석되어 있는 용액에 섞은 다음, 상온에서 17분 반응하였다. 상온에서 17분 반응하는 동안, 형질도입에 사용할 접종된 F2N 세포의 수를 측정하고, 그 FreeStyle293 배지를 이용하여, 세포 농도를 1.0×106 개가 되도록 희석하였다. 17분 후, DNA와 FreeStyleTM Max 시약 혼합 용액을 F2N 세포에 처리함으로써 형질도입을 진행하였다. 형질도입 다음날, 동량의 EX-CELL 293 배지를 형질도입된 세포에 첨가하여 7일 동안 배양함으로써 CR4098 항체를 생산하였다.
이후 CR4098을 이용하여 해당 항체에 대한 탈출 돌연변이 바이러스(escape mutant virus)를 생성하는 실험을 진행하였다.
ml당 106의 감염성을 가지는 광견병 바이러스 CVS-11 주를 96 웰 세포 배양 플레이트에 연속적으로 1.5배씩 희석한 후 10~40 IU/ml의 CR4098 항체와 37℃에서 1시간 동안 반응시켜준다. 1시간 반응 후에 2x105 cells/ml의 BHK 세포를 넣어주고 3일을 배양하였다. 3일 후에 바이러스는 얻고, 세포를 고정시키고 상기 CVS-11 주가 감염되었는지 광견병 뉴클레오캡시드 단백질(Rabies Nucleocapsid protein)의 발현을 염색하여 확인하였다(Jenobiotech, 9061). 두 번째 계대(passage)에서는 첫 번째 계대에서 얻은 바이러스에 CR4098 항체의 양을 늘려 상기와 동일한 실험을 반복하였다. 첫 번째 혹은 두 번째 계대에서는 광견병 바이러스 CVS-11 주가 감염되지 않거나 소량으로 감염된 것으로 확인된 곳에서 얻은 바이러스가 CR4098 항체를 점차적으로 늘렸음에도 감염이 일어나거나 감염 정도가 증가된 것으로 확인된 바이러스 4~5 클론은 증폭(amplification)한 후 QIAamp Viral RNA Mini kit(QIAGEN, 52904)을 이용하여서 RNA를 분리하였다.
RNA를 주형(template)으로 하여 SuperScriptIII First-strand Synthesis system for RT-PCR(Invitrogen, 18080-051)를 이용하여 cDNA를 합성한 후에, Takara ExTaq(Takara, RR001A)으로 증폭한 후에 시퀀싱을 진행하였다. 시퀀싱 결과 CR4098 항체에 대한 탈출 돌연변이 바이러스의 변화된 시퀀스는 N336K에서 보였다.
실시예 3-2: CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
상기 실시예 3-1에서 CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스(N336K)에 대하여, 항체 1 및 항체 2가 중화 능력이 있는지 확인하였다.
중화 능력 실험은 FAVNT 방법으로 진행하였다. Fluorescent Antibody Virus-Neutralizing Test (FAVNT)는 세포 배양 방법을 통해 인간이나 동물의 혈청에서 광견병 바이러스 항체의 수준을 결정짓기 위한 시험법이다.
FAVNT의 실험방법은 희석 시험 항체(또는 HRIG) 와 일정한 양의 광견병 바이러스 [100 TCID50 /0.1 ml] 와 함께 96 웰 플레이트에 넣어 60분간 반응시킨 후, 새끼 햄스터 신장 세포를 10% 우혈청이 포함된 배양배지 (Eagle's minimum essential medium)와 함께 넣고 36~48 시간 배양하였다. 배양 후에는 고정시킨 후, anti-Rabies 항체, ABC kit (VECTASTAIN)과 DAB kit (VECTASTAIN)를 사용하여 광견병 바이러스에 감염된 세포를 염색하였. 마지막으로, 염색된 웰의 숫자를 세어 정확한 중화 능력을 알고 있는 HRIG 대비 시험 항체의 중화 능력을 계산하였다.
그 결과, [표 6]에 나타낸 바와 같이, 항체 1 및 항체 2 모두는 CR4098 항체 탈출바이러스(N336K)에 중화 능력을 보였으며, 오직 CR4098 항체만 중화 능력이 없음을 확인하였다.
CR4098 항체로 생성된 탈출바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인 결과
바이러스 항체 IU/mg
CR4098 항체탈출바이러스(N336K) CR4098 모두 감염
항체 1 1352
항체 2 3081
실시예 4: 다양한 종류의 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
전세계에 만연한 약 50여개의 광견병 바이러스를 대상으로 항체 1 및 항체 2의 in vitro 중화 능력 실험을 수행하였으며, 이는 RFFIT를 통해 수행되었다. 그 결과는 하기 [표 7]에 나타내었다.
중화 능력 실험으로 Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT)는 광견병 바이러스 항원에 의해 노출된 항체를 측정한다. 이 중화 항체는 바이러스 겉 표면의 글라이코 단백질에 의해 유도된다. 질병관리본부는 RFFIT 방법이 신속하고 경제적이며 민감하고 재현성이 있어서 이 방법을 채택해 오고 있다.
RFFIT는 FAVNT와 마찬가지로 세포 배양 방법을 통해 인간이나 동물의 혈청에서 광견병 바이러스 항체의 수준을 결정짓기 위한 시험법이다. 면역형광염색은 바이러스 증식의 척도로 사용되며 약 20시간이 소요가 된다.
RFFIT는 혼합된 희석 시험 혈청과 일정한 양의 광견병 바이러스 [50-50% Fluorescing Foci Doses(50 FFD50)/0.1 ml] 와 함께 다중 웰이 고안된 슬라이드에서 수행되었다. 상기 혼합된 형태의 슬라이드에는 신경아세포종과 배양배지 (Eagle's minimum essential medium)와 10% 우혈청이 포함된 상태로 37℃ 이산화탄소 배양기에서 90분간 배양되었다. 전체적으로 혈청-바이러스-세포의 형태로 37℃ 이산화탄소 배양기에서 20시간 배양되었다. 이후에는 배양과 세척, 고정 그리고 광견병 바이러스 접합체(rabies conjugate)와 표식으로 염색한 뒤 형광 현미경 (fluorescence microscope)을 이용하여 관찰하였다.
다양한 종류의 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인 결과
No. 바이러스 ID 항체 1 항체 2
Working conc.(ug/ml) 0.20
1 Mongoose RSAMongoose, South Africa Titer 270 320
IU/mL 7.7 9.1
IU/mg 7714 9143
2 Dog TunDog, Tunisia Titer 230 270
IU/mL 2.3 2.7
IU/mg 2300 2700
3 Dog thaiDog, Thailand Titer 320 1300
IU/mL 2.3 9.3
IU/mg 2286 9286
4 Dog sonDog, Mexico Titer 340 1100
IU/mL 2.7 8.8
IU/mg 2720 8800
5 Phi 002 (231)Human/dog, Philippines Titer 250 250
IU/mL 2.5 2.5
IU/mg 2500 2500
6 DR MXBat, Mexico Titer 250 180
IU/mL 2.4 1.7
IU/mg 2381 1714
7 DR BrazilBat, Brazil Titer 56 45
IU/mL 2.2 1.8
IU/mg 2240 1800
8 WA BatBat, Washington, USA Titer 270 250
IU/mL 2.2 2.0
IU/mg 2160 2000
9 rv61Human (ex, dog),UK(ex, India) Titer 200 280
IU/mL 1.7 2.4
IU/mg 1739 2435
10 AL BatBat, California, USA Titer 1100 1100
IU/mL 7.6 7.6
IU/mg 7586 7586
11 AZ BatBat , Arizona Titer 125 1300
IU/mL 1.1 11.3
IU/mg 1087 11304
12 phi dogHuman/dog, Philippines Titer 75 280
IU/mL 0.28 1.04
IU/mg 1389 5185
13 Rv342 ChinaCow/dog, China Titer 280 1300
IU/mL 0.5 2.4
IU/mg 2545 11818
14 TX SK 4384Skunk, Texas, USA Titer 75 250
IU/mL 0.21 0.71
IU/mg 1071 3571
15 AK FXArctic Fox, Alaska, USA Failed Titer 60 270
IU/mL 0.44 2.00
IU/mg 2222 10000
16 Gray FX-AZ (AZ fox)Gray Fox, Arizona, USA Titer 16 170
IU/mL 0.53 5.67
IU/mg 2667 28333
17 323RDog / Coyote, Texas, USA Titer 60 625
IU/mL 0.33 3.47
IU/mg 1667 17361
18 RVHNHuman (ex, wolf), Russia, Arctic Titer 54 42
IU/mL 0.40 0.31
IU/mg 2000 1556
19 TN-269Bat, Tennessee, USA Titer 145 390
IU/mL 1.16 3.12
IU/mg 5800 15600
20 China dog 2005Dog, China Titer 12 13
IU/mL 0.43 0.46
IU/mg 2143 2321
21 TN410Bat, Tennessee, USA Titer 19 200
IU/mL 0.51 5.33
IU/mg 2533 26667
22 Dog ArgDog, Argentina Titer 145 170
IU/mL 0.36 0.43
IU/mg 1813 2125
23 TX SK 4380Skunk, Texas, USA Titer 50 70
IU/mL 0.40 0.56
IU/mg 2000 2800
24 RACRaccoon, Georgia, USA Titer 95 145
IU/mL 0.70 1.07
IU/mg 3519 5370
25 TX CoyoteCoyote, Texas, USA Titer 56 170
IU/mL 0.33 1.00
IU/mg 1647 5000
26 Mongoose PRMongoose, Puerto-Rico Titer 54 56
IU/mL 0.39 0.40
IU/mg 1929 2000
27 I-151Dog, India Titer 125 320
IU/mL 0.74 1.88
IU/mg 3676 9412
28 Sri LankaCow, Sri Lanka Titer 54 50
IU/mL 0.43 0.40
IU/mg 2160 2000
29 Wu ABLVAustralian bat lyssa, Genotype 7 Titer 250 440
IU/mL 0.38 0.68
IU/mg 1923 3385
30 ABV (SM 4476) Australian bat lyssa, Genotype 7 Titer 54 210
IU/mL 0.40 1.56
IU/mg 2000 7778
31 3860 CA BatBat, California, USA Titer 56 210
IU/mL 0.40 1.50
IU/mg 2000 7500
32 Gabon dogDog, Gabon Titer 65 170
IU/mL 0.41 1.06
IU/mg 2031 5313
33 CVS-11 Titer 70 250
IU/mL 0.41 1.47
IU/mg 2059 7353
34 EBLV 1 A09-3484Genotype 5 Titer 56 540
IU/mL 0.56 5.40
IU/mg 2800 27000
35 EBLV 2 A03-4659Genotype 6 Titer 54 280
IU/mL 0.60 3.11
IU/mg 3000 15556
36 DuvenhageGenotype 4 Titer 13 180
IU/mL 0.44 7.20
IU/mg 2200 36000
37 EBLV 1 A09-3485Genotype 5 Titer 50 180
IU/mL 1.85 6.67
IU/mg 9259 33333
38 EBLV 2 A09-3483Genotype 6 Titer 50 125
IU/mL 2.22 5.56
IU/mg 11111 27778
39 CASKSkunk, California, USA Titer 50 54
IU/mL 0.40 0.43
IU/mg 2000 2160
40 Bat EfBat, Pennsylvania, USA Titer 50 50
IU/mL 1.05 1.05
IU/mg 5263 5263
41 C1434Bat, Alabama, USA Titer 19 36
IU/mL 0.51 0.96
IU/mg 2533 4800
42 VA 399Bat, Virginia, USA Titer 10 50
IU/mL 0.56 2.78
IU/mg 2778 13889
43 TN 132Bat, Tennessee, USA Titer 56 280
IU/mL 2.00 10.00
IU/mg 10000 50000
44 TXFXGray fox, TX Titer 56 250
IU/mL 0.41 1.85
IU/mg 2074 9259
45 I-148Dog, India Titer 13 10
IU/mL 0.52 0.40
IU/mg 2600 2000
46 LC NYBat, New York, USA Titer 11 45
IU/mL 0.52 2.14
IU/mg 2619 10714
47 857rRaccoon dog, Russia, Far East Titer 56 54
IU/mL 2.80 2.70
IU/mg 2800 2700
48 NC SKSkunk, Wisconsin, USA Titer 280 270
IU/mL 2.24 2.16
IU/mg 2240 2160
49 MI1625Bat, Tennessee, USA Titer 11 70
IU/mL 0.39 2.50
IU/mg 1964 12500
50 MyotisBat, Washington, USA Titer 230 280
IU/mL 1.64 2.00
IU/mg 8214 10000
51 ERA Titer 50 250
IU/mL 0.36 1.79
IU/mg 1786 8929
실시예 5: 인도에서 분리한 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인
실시예 5-1: in-vitro 실험
항체 1, 항체 2 및 칵테일(항체 1 + 항체 2)을 이용하여 인도에서 창궐한 하기 [표 8]의 야생형 바이러스에 대하여 상기 실시예 4와 같이 RFFIT를 수행하였다. 실험 진행은 인도신경과학센터 (National Institute Mental Health and Science: NIMHANS) 에서 수행하였다. 각 항체는 약 1 ug의 농도로, 하기 [표 8]의 각 바이러스의 100 FFD50 로 Neuro 2 a 세포에서 실험을 진행하였다. RFFIT 결과는 세 가지 항체 모두에서 각 바이러스에 대해 중화 능력을 보였다.
인도에서 분리한 광견병 바이러스
바이러스 약칭 바이러스가 분리된 동물 바이러스가 분리된 지역
SV1 Dog Kerala, India
SV2 Dog Kerala, India
SV3 Human Karnataka, India
SV4 Human Karnataka, India
SV5 Dog Chennai, Tamilnadu ,India
SV6 Dog Chennai, Tamilnadu, India
실시예 5-2: in-vivo 실험
상기 실시예 5-1의 in-vitro 실험에 이어서 마우스에서 in-vivo 실험을 진행하였고, 하기 [표 9]에 나타낸 바와 같이 각 동물실험군에서 모든 항체는 높은 중화 능력을 나타내었다. 각 동물실험군에는 마우스 10마리씩 사용이 되었으며, 사용된 바이러스는 100 LD50(in 0.1 mL)이 사용되었다. 바이러스 접종 후 (근육 주사) 3시간 뒤에 각 항체(약 1 ug)를 동일한 곳(근육 주사)에 접종을 하였으며, 이 후 생존율은 30일까지 관찰하였다. 도 1은 동물실험에서 총 여섯 가지 바이러스(SV1~SV6) 중 SV2 바이러스에 대한 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
본 동물실험에서 SV1~SV6 바이러스의 각각에 해당되는 생존율은 [표 9]와 같다.
동물실험을 통한 인도 분리 광견병 바이러스에 대한 항체의 중화 능력 확인 결과
SV1 SV2 SV3 SV4 SV5 SV6
항체 1 100 100 100 100 100 100
항체 2 80 90 90 80 90 90
항체 1 +항체 2 100 100 100 100 100 100
대조군 0 0 0 0 0 0
실시예 6: 항체 1 및 항체 2 칵테일 간섭 효과 확인
실시예 6-1: 야생형 광견병 바이러스와 광견병 바이러스 CVS -11 주에 대한 중화 능력 확인 실험을 이용한 항체 1 및 항체 2 칵테일의 간섭 효과 확인
항체 1, 항체 2 및 칵테일(항체 1 + 항체 2)를 이용하여 12개의 야생형 광견병 바이러스와 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대하여 상기 실시예 4와 같이 RFFIT를 수행하였다.
하기 [표 10]에 나타낸 바와 같이, 12개 야생형 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 항체 1, 항체 2 및 각각을 동일 비율로 혼합한 칵테일 모두 우수한 중화 능력을 나타내었고, 이를 통해 상기 칵테일 내 항체 1 및 항체 2가 생물학적인 중화 능력 평가에서 간섭효과가 없음을 확인하였다.
다양한 종류의 광견병 바이러스에 대한 칵테일의 중화 능력 확인 결과
No. 바이러스 항체 1(IU/mg) 항체 2(IU/mg) 칵테일(1:1)(IU/mg)
1 LC NY Bat, New York, USA 2619 10714 8571
2 Bat Ef Bat, Pennsyl-vania, USA 5263 5263 4421
3 TX Coyote Coyote, Texas, USA 1647 5000 2500
4 I-151 Dog, India 3676 9412 5000
5 Gabon dog Dog, Gabon 2031 5313 4531
6 Sri Lanka Cow, Sri Lanka 2160 2000 2000
7 NC SK Skunk, Wisconsin, USA 2240 2160 2240
8 China dog 2005 Dog, China 2143 2321 1964
9 Dog thai Dog, Thailand 2286 9286 7857
10 phi dog Human/dog, Philippines 1389 5185 4630
11 Mongoose RSA Mongoose, South Africa 7714 9143 9143
12 Myotis Bat, Washington, USA 8214 10000 8929
13 CVS-11 2059 7353 6765
실시예 6-2: 몰 과량(Molar excess) 실험을 이용한 항체 1 및 항체 2 칵테일의 간섭 효과 확인
추가적으로 항체 1 및 항체 2가 간섭 효과가 있는지 몰 과량(Molar excess) 실험을 이용하여 확인하였다. 이를 위해 상기 실시예 6-1에서 실험한 광견병 바이러스 CVS-11 주를 대상으로 두 항체의 농도 비율을 1/9의 적은 양부터 9배 과량으로 혼합하고, 실시예 4와 같이 REFIT를 수행하여 값을 3회 측정하였다. 그 결과를 하기 [표 11] 및 [표 12]에 나타내었다.
또한 상기 항체 1 및 항체 2의 농도 비율을 달리한 시험을 통하여, 항체 1 및 항체 2의 비율을 1:9 내지 9:1로 조절하였을 경우에도 항체 1 및 항체 2 각각과 이 둘을 혼합한 칵테일 항체 모두 광견병 바이러스 중화 능력을 나타냄을 상기 [표 11] 및 [표 12]를 통해 확인하였다.
광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 칵테일의 중화 능력 확인
실험 결과 (IU/mg)(항체 1을 기준으로 측정)
구분 항체 1(%) 항체 2(%) 1 2 3 평균 표준편차
A 0 100 N/A N/A N/A N/A N/A
B 10 90 45000 34185 102556 60581 36752
C 25 75 41023 18000 23688 27570 11992
D 50 50 6837 3948 11844 7543 3995
E 75 25 2000 1519 3464 2328 1013
F 90 10 962 731 1667 1120 487
G 100 0 380 380 658 473 161
광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 칵테일의 중화 능력 확인
실험 결과 (IU/mg)(항체 2를 기준으로 측정)
구분 항체 1(%) 항체 2(%) 1 2 3 평균 표준편차
A 0 100 7793 4500 10256 7516 2888
B 10 90 5000 3798 11395 6731 4084
C 25 75 13674 6000 7896 9190 3997
D 50 50 6837 3948 11844 7543 3995
E 75 25 6000 4558 10391 6983 3038
F 90 10 8659 6580 15000 10080 4386
G 100 0 N/A N/A N/A N/A N/A
간섭 효과 확인을 위한 통계분석 방법으로 시험군과 대조군 간의 중화 능력 차이의 유의성을 평가하기 위해 다중비교 시험 방법 중의 하나인 던넷분석(Dunnett's test)을 사용하였다. 구체적으로 던넷분석에서 보정된 p-값(Adj. p-value)이 유의적 수준(significant level)인 0.05보다 크면 유의하지 않아(not significant), 비교하는 그룹간의 차이가 없음을 나타낸다. 반대로 보정된 p-값이 0.05이 보다 작으면 유의(significant)하여 비교하는 그룹간의 차이가 있음을 나타낸다. 상기 [표 11]와 [표 12]를 바탕으로 던넷분석을 수행한 결과를 각각 [표 13]과 [표 14]로 나타내었다.
하기 [표 13] 및 [표 14]에서 나타낸 바와 같이, 표 [13]에서 항체 1의 비율을 90% 이상 가져갔을 때에만 보정된 p-값이 0.05이 이하를 나타내어 항체 1의 비율 90%를 제외하고 간섭 효과가 없음을 확인하였다. 다만, 항체 1의 비율을 90% 이상인 경우 통계적으로 간섭 효과가 존재할 수 있으나, 이는 항체 1이 매우 강한 중화 능력을 가지고 있는 것에 기인한 것이지 간섭 효과에 의한 영향이라 볼 수 없다. [표 14]에서 항체 2의 비율을 높여도 모두 보정된 p-값이 0.05이 이상을 나타내어 간섭 효과가 없음을 확인하였다. 따라서, 모든 농도에서 두 항체 서로 간에 간섭 효과가 없는 것으로 판단할 수 있다.
항체 1 농도 기준 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 다중비교시험 결과
최소제곱평균 차이
다중비교 시험 추정치 표준 오차 자유도 t 값 확률 > |t| 보정된p-값 결과
B vs G 60108 12961 12 4.64 0.0006 0.0024 유의함
C vs G 27098 12961 12 2.09 0.0585 0.1958 유의하지 않음
D vs G 7070.4 12961 12 0.55 0.5954 0.9718 유의하지 않음
E vs G 1855.1 12961 12 0.14 0.8886 0.9999 유의하지 않음
F vs G 647.41 12961 12 0.05 0.961 1 유의하지 않음
항체 2 농도 기준 광견병 바이러스 CVS-11 주에 대한 다중비교시험 결과
최소제곱평균 차이
다중비교 시험 추정치 표준 오차 자유도 t 값 확률 > |t| 보정된 p-값 결과
B vs A -785.08 3080.8 12 -0.25 0.8032 0.9991 유의하지 않음
C vs A 1673.77 3080.8 12 0.54 0.5969 0.9723 유의하지 않음
D vs A 26.7002 3080.8 12 0.01 0.9932 1 유의하지 않음
E vs A -533.29 3080.8 12 -0.17 0.8655 0.9999 유의하지 않음
F vs A 2563.39 3080.8 12 0.83 0.4216 0.8691 유의하지 않음
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구범위의 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 결합 분자는 1X10-8 M 미만의 결합친화도(KD)를 가짐을 특징으로 하는 결합 분자.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 결합 분자는
    a) 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역, 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 또는
    b) 서열번호 6의 CDR1 영역, 서열번호 7의 CDR2 영역, 및 서열번호 8의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 결합 분자.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 결합 분자는 1X10-9 M 미만의 결합친화도(KD)를 가짐을 특징으로 하는 결합 분자.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 결합 분자는
    a) 서열번호 9의 CDR1 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역, 및 서열번호 11의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역; 또는
    b) 서열번호 12의 CDR1 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역, 및 서열번호 14의 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역
    을 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자는 항체 또는 그의 단편인 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  12. a) 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 제 1 결합 분자; 및
    b) 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 제 2 결합 분자
    를 포함하고, 상기 제 1 결합 분자 와 제 2 결합 분자는 서로 다른 것인, 2 이상의 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 a) 제 1 결합 분자 : b) 제 2 결합 분자의 농도 비율이 1:9 내지 9:1임을 특징으로 하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  14. a) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시에 투여하는 단계;
    b) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 투여하는 단계; 또는
    c) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 투여하는 단계
    를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료 방법.
  15. (1) 치료적 유효량의 제 12항의 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료하는 의약 조성물; 및
    (2) a) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자 및 제 2 결합 분자를 동시 투여함;
    b) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 순차 투여함; 또는
    c) 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 2 결합 분자를 투여한 다음 후속적으로 대상에 치료적 유효량으로 제 12항의 제 1 결합 분자를 순차 투여함을 지시하는 패키지 삽입물(package insert)
    을 포함하는 광견병 진단, 예방 또는 치료용 키트.
  16. 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33 내지 215번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 33, 34, 35, 38, 200, 202 및 215번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  18. 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 내지 333번째 아미노산 잔기 내의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2로 표시되는 광견병 바이러스의 야생형 G 단백질의 331 및 333번째 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 에피토프임을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  20. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드에 결합 분자를 접촉시키는 단계를 포함하는 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자를 스크리닝하는 방법.
  21. 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 광견병 바이러스 백신 조성물.
PCT/KR2016/006145 2015-06-10 2016-06-09 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자 WO2016200189A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/735,068 US10722571B2 (en) 2015-06-10 2016-06-09 Rabies virus G protein epitope, and rabies virus neutralising binding molecule that binds specifically thereto
CN201680033860.2A CN107709360B (zh) 2015-06-10 2016-06-09 狂犬病毒g蛋白表位及与其特异性结合的中和狂犬病毒的结合分子
HK18103596.2A HK1244018A1 (zh) 2015-06-10 2018-03-15 狂犬病毒g蛋白表位及與其特異性結合的中和狂犬病毒的結合分子

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2015-0082284 2015-06-10
KR20150082284 2015-06-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016200189A1 true WO2016200189A1 (ko) 2016-12-15

Family

ID=57503787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/006145 WO2016200189A1 (ko) 2015-06-10 2016-06-09 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10722571B2 (ko)
KR (1) KR101969626B1 (ko)
CN (1) CN107709360B (ko)
HK (1) HK1244018A1 (ko)
WO (1) WO2016200189A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11773155B2 (en) 2018-08-09 2023-10-03 Beijing Wisdomab Biotechnology Co., Ltd Bispecific antibody against rabies virus, and application thereof
CN113501873B (zh) * 2021-07-07 2023-05-23 高光 Rbv的蛋白结合分子及其用途
CN114748618A (zh) * 2022-04-02 2022-07-15 重庆智翔金泰生物制药股份有限公司 包含针对狂犬病病毒g蛋白的双特异性抗体的药物制剂及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005023849A2 (en) * 2003-09-04 2005-03-17 Crucell Holland B.V. Antigenic peptides of rabies virus and uses thereof
KR20130010130A (ko) * 2004-05-27 2013-01-25 크루셀 홀란드 비.브이. 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 및 그 용도
US20130039926A1 (en) * 2005-02-02 2013-02-14 Center For Disease Control And Prevention Human antibodies against rabies and uses thereof
KR20130036150A (ko) * 2011-09-30 2013-04-11 (주)셀트리온 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE471381T1 (de) 2005-03-04 2010-07-15 Celltrion Inc Expressionsvektor für tierische zelle mit wenigstens einer kopie von mar-dna-sequenzen am 3'-ende des transkriptionsterminationsbereichs eines gens sowie verfahren zur expression eines fremdgens unter verwendung des vektors
CN103374069B (zh) * 2012-04-24 2015-06-03 中国科学院上海生命科学研究院 一种抗狂犬病毒的结合分子2e1
WO2015088256A1 (ko) * 2013-12-12 2015-06-18 (주)셀트리온 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005023849A2 (en) * 2003-09-04 2005-03-17 Crucell Holland B.V. Antigenic peptides of rabies virus and uses thereof
KR20130010130A (ko) * 2004-05-27 2013-01-25 크루셀 홀란드 비.브이. 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 및 그 용도
US20130039926A1 (en) * 2005-02-02 2013-02-14 Center For Disease Control And Prevention Human antibodies against rabies and uses thereof
KR20130036150A (ko) * 2011-09-30 2013-04-11 (주)셀트리온 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARISSEN, WILFRED E. ET AL.: "Novel Rabies Virus-Neutralizing Epitope Recognized by Human Monoclonal Antibody: Fine Mapping and Escape Mutant Analysis", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 79, no. 8, 2005, pages 4672 - 4678, XP009052681 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190022211A1 (en) 2019-01-24
CN107709360B (zh) 2021-10-19
US10722571B2 (en) 2020-07-28
KR101969626B1 (ko) 2019-04-16
HK1244018A1 (zh) 2018-07-27
KR20160145508A (ko) 2016-12-20
CN107709360A (zh) 2018-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021194188A1 (ko) 사스-코로나바이러스-2에 중화 활성을 갖는 결합 분자
WO2014158001A1 (ko) 2 이상의 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물
WO2018194381A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2014204280A1 (en) Fcrn-specific human antibody and composition for treatment of autoimmune diseases
WO2014193122A1 (ko) Ｂ형 간염 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자
WO2014090053A1 (zh) 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2019050362A2 (ko) 인간 dlk1에 대한 항체 및 이의 용도
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2016200189A1 (ko) 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자
WO2018174544A2 (ko) Muc1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2021020846A1 (en) Anti-her2/anti-4-1bb bispecific antibody and use thereof
WO2022019671A1 (ko) 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자
WO2020101365A1 (ko) 안정성이 향상된 항 c-met 항체 또는 그의 항원 결합 단편
WO2020080854A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2021060837A1 (en) Anti-mers-cov antibody and use thereof
WO2019190206A1 (ko) 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도
WO2016199964A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
WO2016085284A1 (ko) B형 간염 바이러스 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 b형 간염 바이러스 중화 결합 분자
WO2021020845A1 (en) Anti-egfr/anti-4-1bb bispecific antibody and use thereof
WO2022211558A1 (ko) 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자
WO2015088256A1 (ko) 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자
WO2022085905A1 (ko) SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2022124864A1 (ko) 항-tigit 항체 및 이의 용도
WO2022149837A1 (ko) 항-fgfr3 항체 및 이의 용도
WO2022103245A1 (ko) Sars-cov-2에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16807829

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16807829

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1