CN113501873B - Rbv的蛋白结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种成本低、产能高且可以特异性地预防或治疗RBV感染相关疾病的蛋白分子，弥补或者取代市场上抗狂犬病免疫球蛋白产能不足，供不应求的状态。利用噬菌体展示库技术筛选得到的具有高特异性、高亲和力和高稳定性的针对狂犬病毒的蛋白结合分子。所述蛋白结合分子针对RBV的G蛋白，所述RBV蛋白结合分子为包含一免疫球蛋白单一可变结构域的抗体，与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，具有更好的针对RBV病毒的中和抑制功能。

Description

RBV的蛋白结合分子及其用途
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，更具体地说，它涉及RBV的蛋白结合分子及其用途。
背景技术
狂犬病毒(简称“RBV”)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。是引起狂犬病的病原体，狂犬病毒具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的传染病。
RBV含有5种主要蛋白(L、N、G、M1和M2)和2种微小蛋白(P40和P43)。L蛋白呈现转录作用；N蛋白是组成病毒粒子的主要核蛋白是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，常用于狂犬病病毒的诊断、分类和流行病学研究；G蛋白是构成病毒表面纤突的糖蛋白，具有凝集红细胞的特性是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病病毒致病与免疫中起着关键作用；M1蛋白为特异性抗原，并与M2构成细胞表面抗原。针对G蛋白的抗体可以抑制其介导的感染周期的起始阶段并中和病毒的感染性从而保护人体免受RBV感染。
RBV进入人体，沿周围传入神经而到达中枢神经系统，因此头、颈部、上肢等处咬伤和创口面积大而深者发病机会多。RBV主要存在于患病动物的延脑、大脑皮层、小脑和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病，在特定条件下也可以通过呼吸道气溶胶传染。
目前世界范围内才采用注射狂犬疫苗或抗狂犬病免疫球蛋白可用于预防RBV感染引起的相关疾病，只有印度2016年上市了一个名为Rmab治疗狂犬病的单抗，这类抗体具有中和效果好、安全性高、成本低、可大量生产优点，但在临床上效果并不是特好。由于抗狂犬病免疫球蛋白产能不足，且价格昂贵，国内持续处于供不应求状态，因而发展一种成本低、产能高且可以特异性地预防或治疗RBV感染相关疾病的抗体药物是当务之急。
单域抗体(single domain antibody，sdAb)，又称纳米抗体(nanobody)，仅有一个重链可变区结构域(VHH)。该结构域最初发现于骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出的一种重链抗体(heavy chain antibody，hcAb)，通过基因手段，扩增出其中的VHH片段。VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。单域抗体具有结构简单，亲和力及稳定性高，组织渗透力强和免疫原性低等一系列优点，是抗体药物领域里的最新技术。目前，应用单域抗体技术来解决病毒感染类疾病已成为国内外科学家的共识。
发明内容
发明一种成本低、产能高且可以特异性地预防或治疗RBV感染相关疾病的蛋白分子，弥补或者取代市场上抗狂犬病免疫球蛋白产能不足，供不应求的状态。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
在一个方面，本发明提供了RBV的蛋白结合分子，其包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1选自SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19，CDR2选自SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20，CDR3选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子包括：
1)如SEQ ID NO：1所示的CDR1、如SEQ ID NO：2所示的CDR2、如SEQ ID NO：3所示的CDR3；或者，
2)如SEQ ID NO：4所示的CDR1、如SEQ ID NO：5所示的CDR2、如SEQ ID NO：6所示的CDR3；或者，
3)如SEQ ID NO：7所示的CDR1、如SEQ ID NO：8所示的CDR2、如SEQ ID NO：9所示的CDR3；或者，
4)如SEQ ID NO：10所示的CDR1、如SEQ ID NO：11所示的CDR2、如SEQ ID NO：12所示的CDR3；或者，
5)如SEQ ID NO：13所示的CDR1、如SEQ ID NO：14所示的CDR2、如SEQ ID NO：15所示的CDR3；或者，
6)如SEQ ID NO：16所示的CDR1、如SEQ ID NO：17所示的CDR2、如SEQ ID NO：18所示的CDR3；或者，
7)如SEQ ID NO：19所示的CDR1、如SEQ ID NO：20所示的CDR2、如SEQ ID NO：21所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1选自SEQ ID NO：22、26、30、34、38、42、46，FR2选自SEQ ID NO：23、27、31、35、39、43、47，FR3选自SEQ ID NO：24、28、32、36、40、44、48，FR4选自SEQ ID NO：25、29、33、37、41、45、49。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子包括：
1)如SEQ ID NO：22所示的FR1、如SEQ ID NO：23所示的FR2、如SEQ ID NO：24所示的FR3、如SEQ ID NO：25所示的FR4；或者、
2)如SEQ ID NO：26所示的FR1、如SEQ ID NO：27所示的FR2、如SEQ ID NO：28所示的FR3、如SEQ ID NO：29所示的FR4；或者、
3)如SEQ ID NO：30所示的FR1、如SEQ ID NO：31所示的FR2、如SEQ ID NO：32所示的FR3、如SEQ ID NO：33所示的FR4；或者、
4)如SEQ ID NO：34所示的FR1、如SEQ ID NO：35所示的FR2、如SEQ ID NO：36所示的FR3、如SEQ ID NO：37所示的FR4；或者、
5)如SEQ ID NO：38所示的FR1、如SEQ ID NO：39所示的FR2、如SEQ ID NO：40所示的FR3、如SEQ ID NO：41所示的FR4；或者、
6)如SEQ ID NO：42所示的FR1、如SEQ ID NO：43所示的FR2、如SEQ ID NO：44所示的FR3、如SEQ ID NO：45所示的FR4；或者、
7)如SEQ ID NO：46所示的FR1、如SEQ ID NO：47所示的FR2、如SEQ ID NO：48所示的FR3、如SEQ ID NO：49所示的FR4。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子与选自SEQ ID NO：50～56的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，且能够特异性结合G蛋白。优选的，所述RBV的蛋白结合分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：50～56所示。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1选自SEQ ID NO：64、67、70、73、76、79，CDR2选自SEQ ID NO：65、68、71、74、77、80，CDR3选自SEQ ID NO：66、69、72、75、78、81。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括：
1)如SEQ ID NO：64所示的CDR1、如SEQ ID NO：65所示的CDR2、如SEQ ID NO：66所示的CDR3；或者，
2)如SEQ ID NO：67所示的CDR1、如SEQ ID NO：68所示的CDR2、如SEQ ID NO：69所示的CDR3；或者，
3)如SEQ ID NO：70所示的CDR1、如SEQ ID NO：71所示的CDR2、如SEQ ID NO：72所示的CDR3；或者，
4)如SEQ ID NO：73所示的CDR1、如SEQ ID NO：74所示的CDR2、如SEQ ID NO：75所示的CDR3；或者，
5)如SEQ ID NO：76所示的CDR1、如SEQ ID NO：77所示的CDR2、如SEQ ID NO：78所示的CDR3；或者，
6)如SEQ ID NO：79所示的CDR1、如SEQ ID NO：80所示的CDR2、如SEQ ID NO：81所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1选自SEQ ID NO：82、86、90、94、98、102，FR2选自SEQ ID NO：83、87、91、95、99、103，FR3选自SEQ ID NO：84、88、92、96、100、104，FR4选自SEQ ID NO：85、89、93、97、101、105。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括：
1)如SEQ ID NO：82所示的FR1、如SEQ ID NO：83所示的FR2、如SEQ ID NO：84所示的FR3、如SEQ ID NO：85所示的FR4；或者、
2)如SEQ ID NO：86所示的FR1、如SEQ ID NO：87所示的FR2、如SEQ ID NO：88所示的FR3、如SEQ ID NO：89所示的FR4；或者、
3)如SEQ ID NO：90所示的FR1、如SEQ ID NO：91所示的FR2、如SEQ ID NO：92所示的FR3、如SEQ ID NO：93所示的FR4；或者、
4)如SEQ ID NO：94所示的FR1、如SEQ ID NO：95所示的FR2、如SEQ ID NO：96所示的FR3、如SEQ ID NO：97所示的FR4；或者、
5)如SEQ ID NO：98所示的FR1、如SEQ ID NO：99所示的FR2、如SEQ ID NO：100所示的FR3、如SEQ ID NO：101所示的FR4；或者、
6)如SEQ ID NO：102所示的FR1、如SEQ ID NO：103所示的FR2、如SEQ ID NO：104所示的FR3、如SEQ ID NO：105所示的FR4。
在一些实施方案中，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体，其与选自SEQ ID NO：106～111的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。优选的，所述RBV的蛋白结合分子为人源化抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：106～111所示。
在一些实施方案中，所述的RBV的蛋白结合分子为包含一免疫球蛋白单一可变结构域的抗体。
在一些实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域为一重链可变区结构域。
在一些实施方案中，所述的RBV的蛋白结合分子，其包括免疫球蛋白Fc区。
在一些实施方案中，所述的RBV的蛋白结合分子，其结合RBV蛋白小于1×10-7M。
在一些实施方案中，其中所述RBV蛋白分子形成多价链接。
本发明还提供了编码上述RBV的蛋白结合分子的核酸分子。
在一些实施方案中，编码所述RBV的蛋白结合分子的核酸分子与选自SEQ ID NO：57～63和112～117的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。优选的，编码所述RBV的蛋白结合分子的核酸分子如SEQ IDNO：57～63和112～117所示。
在另一个方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其表达上述所述的RBV的蛋白结合分子。
在另一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述所述的RBV的蛋白结合分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本发明的RBV的蛋白结合分子、检测试剂盒、药物组合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断与RBV感染相关疾病的药物中的用途。
本发明利用噬菌体展示库技术筛选得到的具有高特异性、高亲和力和高稳定性的针对狂犬病毒的蛋白结合分子。所述蛋白结合分子针对RBV的G蛋白，所述RBV蛋白结合分子为包含一免疫球蛋白单一可变结构域的抗体，与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，具有更好的针对RBV病毒的中和抑制功能。
附图说明
图1为单域抗体VHH片段扩增图；
图2为噬菌体展示库多样性分析；
图3、4、5为挑选噬菌体单克隆，进行Phage ELISA鉴定；
图6、7、8为噬菌体展示库cell panning第四轮淘选产物phage ELISA；
图9、10、11为构建的G蛋白单域抗体表达后流式检测：
图12显示pDonor-CMV-G protein-puro质粒结构；
图13为表达载体Lenti-hIgG1-Fc2示意图；
图14为流式细胞仪检测人源化后抗体与CHO细胞的结合情况；
图15为人源化G蛋白单域抗体表达后亲和力流式检测；
图16G蛋白重组细胞株流式检测；
图17流式细胞仪检测人源化后抗体与CHO-GM004细胞的结合情况；
图18流式细胞仪检测人源化后抗体与CHO细胞的结合情况；
图19人源化抗体HM1和HM4和原始抗体D10亲和力检测。
其中，图9的横坐标数值沿正方向依次为100、101、102、103、104、105、106；图10、图11、图14、图15、图16、图17、图18的横坐标数值与图9相同。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“MolecularCloning:ALaboratory Manual”(第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Lewin,“Genes IV”，Oxford University Press,New York,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
除非另有说明，否则可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
如本文所用，术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
如本文所用的术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层组成。
如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变结构域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变结构域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变结构域的一个实例为“结构域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。免疫球蛋白单一可变结构域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,SongaEB,BendahmanN,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid of lightchains”；Nature363,446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(其在本文中称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(其在本文中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规4链抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
在本发明的上下文中，术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及“Nanobody○R”及“Nanobody○R结构域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。
例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)中所示，对于骆驼科的VHH结构域所应用的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH结构域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US PublicHealthServices,NIH Bethesda,MD,公开案第91号)。根据该编号法，
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
然而应注意，如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
本领域中已知对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，所述替代方法还可以类似地应用于VHH结构域。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述的根据Kabat且适于VHH结构域的编号。
VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。
VHH结构域及含有其的多肽的其他结构特性及功能性质可总结如下：
VHH结构域(其已经天然“设计”以在不存在轻链可变结构域且不与轻链可变结构域相互作用的情况下与抗原功能性结合)可用作单一且相对较小的功能性抗原结合结构单元、结构域或多肽。此区分VHH结构域与常规4链抗体的VH及VL结构域，这些VH及VL结构域自身通常不适于作为单一抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变结构域进行实际应用，但需要以某种形式或另一形式组合以提供功能性抗原结合单元(如以诸如Fab片段等常规抗体片段的形式；或以由与VL结构域共价连接的VH结构域组成的scFv的形式)。
由于这些独特性质，使用VHH结构域—单独或作为较大多肽的一部分—提供许多优于使用常规VH及VL结构域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的显著优势：
-仅需要单一结构域以高亲和力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独结构域，也不需要确保该两个结构域以适当空间构象及构型存在(例如scFv一般需要使用经特别设计的接头)；
-VHH结构域可自单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH结构域可容易地改造成多价及多特异性格式(格式化)；
-VHH结构域高度可溶且无聚集趋势；
-VHH结构域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；
-VHH结构域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此；
-VHH结构域与常规4链抗体及其抗原结合片段相比相对较小(大约15kDa或大小为常规IgG的1/10)，因此相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，显示较高的组织渗透性且可以较高剂量给药；
-VHH结构域可显示所谓腔结合性质(尤其由于与常规VH结构域相比其延长的CDR3环)，从而可到达常规4链抗体及其抗原结合片段不可到达的靶及表位。
获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.vanderLinden et al.,Journal of Immunological Methods,240(2000)185–195；Lietal.,JBiol Chem.,287(2012)13713–13721；Deffar et al.,African Journal ofBiotechnologyVol.8(12),pp.2645-2652,17June,2009和WO94/04678。
源自骆驼科的VHH结构域可通过以人常规4链抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”(本文中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一具体实施方案中，可含IGHV3的人框架区序列。
如本文所用，术语“结构域抗体”(亦称为“Dab”及“dAb”)特别用于指代非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL结构域。为了以单一抗原结合结构域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL结构域序列的文库对所述抗原结合性质进行具体选择。
与VHH一样，结构域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。正如在VHH结构域的情况下，结构域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。
“结构域抗体”已公开于例如以下文献中：Ward,E.S.,等人:“Bindingactivitiesof a repertoire of single immunoglobulin variable domains secretedfromEscherichia coli”；Nature 341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domainantibodies:proteins for therapy”；TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003)。
此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。
如本文所用，术语“表位”或可互换使用的术语“抗原决定簇”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in MethodsinMolecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别给定抗原的表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。举例而言，线性表位可通过例如以下方法来确定：在固体支持物上同时合成大量肽，其中这些肽对应于蛋白质分子的各部分，且使这些肽在仍然与支持物连接的情况下与抗体反应。这些技术在本领域中为已知的且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中。类似地，构象表位可通过诸如通过例如x射线结晶学及2维核磁共振确定氨基酸的空间构形加以鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols(同上)。
可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的抗体分子竞争结合RBV蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变结构域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合分子的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为缔合常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解，取决于具体感兴趣的抗原，可以以已知方式测定亲和力。亲合力为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
如本文所用，术语“RBV蛋白结合分子”意指任何能够特异性结合RBV蛋白的分子。RBV蛋白结合分子可以包括针对RBV蛋白的如本文定义的抗体或其缀合物。RBV蛋白结合分子还涵盖所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)，或者免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。
“RBV蛋白结合分子”或者可以指结合RBV的F蛋白的单价分子(即与RBV的F蛋白的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子)。本发明的“RBV蛋白结合分子”可以包含至少一个结合RBV蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域如VHH。在一些实施方案中，本发明的“RBV蛋白结合分子”可以包含两个结合RBV蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域如VHH。含有一个以上的免疫球蛋白单一可变结构域的RBV蛋白结合分子亦称为“格式化的”RBV蛋白结合分子。格式化的RBV蛋白结合分子除结合RBV蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本发明的“RBV蛋白结合分子”还涵盖双特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白单一可变结构域。
通常，本发明的RBV蛋白结合分子将以如于Biacore或KinExA测定中测量的优选10-7至10-11摩尔/升(M)、更优选10-8至10-11摩尔/升、甚至更优选10-9至10-11、甚至更优选10-10至10-11或更低的解离常数(KD)，和/或以至少10 7M-1、优选至少108M-1、更优选至少109M-1，更优选至少1010M-1、例如至少1011M-1的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原(即RBV蛋白)。任何大于10-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定。
氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof SequenceData,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991。
相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分(例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时，多肽或核酸分子视为“基本上分离的”。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上分离的”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“基本上分离的”多肽或核酸分子优选基本上为均质的。
“亲和力成熟”的抗RBV蛋白抗体，特别是VHH或结构域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对RBV蛋白的亲和力相比于其各自的亲本抗RBV蛋白抗体有所增加。亲和力成熟的抗RBV蛋白抗体可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人,1992,Biotechnology10:779-783或Barbas等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene 169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896；KS Johnson及RE Hawkins,“Affinitymaturation of antibodies using phage display”,Oxford UniversityPress 1996。
如本文所用的术语“对象”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。
对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。
或者，抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
本发明的RBV蛋白结合分子的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于RBV相关疾病的治疗，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将病毒生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，更优选至少约99％。抑制病毒生长的能力可以在预测对抑制RBV的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制RBV生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明RBV蛋白结合分子的优选给药途径包括雾化吸入、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或雾化吸入。
疾病预防和治疗：本发明提供了本发明所述RBV蛋白结合分子、核酸分子、宿主细胞、免疫缀合物及药物组合物在预防和/或治疗RBV感染的相关的疾病中用途和方法。本发明的一方面提供一种预防和/或治疗对象中的RBV感染性疾病的方法，包括给该对象施用本发明的RBV蛋白结合分子，使得所述对象的RBV感染性疾病得到预防和/或治疗。
具体实施例：
实施例1：针对RBV蛋白的单域抗体的筛选
1.1免疫和免疫后血清效价测定
免疫用的RBV蛋白由CHO细胞表达(表达载体Lenti-CMV-puro，按照常规方法制备，经镍柱亲和层析纯化得到RBV蛋白。选取一只美洲无峰驼(alpaca)进行免疫。6次免疫结束后，采取美洲无峰驼提取100mL外周血，用于噬菌体展示库的构建。采集5ml外周血，将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜；2.将血清转移至一个新的无菌离心管中，5000rpm离心20min；采用ELISA检测免疫效价，结果见下表所示。
序列 血清稀释比列 OD值
1 1:1k 2.748
2 1:2k 2.57
3 1:4k 2.583
4 1:8k 2.421
5 1:16k 2.287
6 1:32k 2.00
7 1:64k 1.655
8 PBS 0.11
注：稀释比例越高，OD值越高，代表效价越高，可以用于后续的筛选实验。
1.2 RBV G蛋白-FC抗原制备
通过基因合成G蛋白的胞外段(20AA-458AA)序列，在C端添加human IgG1Fc标签，且G蛋白和Fc之间添加肠激酶酶切位点，用于去除FC标签；亚克隆至真核表达载体中，构建抗原表达载体。将构建好的G蛋白-Fc蛋白表达载体进行质粒大抽，瞬时转染CHO细胞后，连续培养10天，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。
1.3 G蛋白重组细胞株筛选
通过基因合成G蛋白的全长，亚克隆至慢病毒表达载体Lenti-CMV-puro，构建抗原过表达载体。将构建好的Lenti-CMV-G蛋白(Full)-puro载体包装慢病毒，感染CHO-S细胞，48小时后使用嘌呤霉素进行筛选，构建CHO-GM004重组细胞株。构建好的CHO-G蛋白重组细胞株和CHO细胞分别孵育Rafivirumab阳性抗体(1μg/106cell)，孵育1h后，PBS清洗3次；加入PE-anti-Human IgG(1:200)，避光孵育45min，PBS清洗3次后，使用500ul PBS重悬细胞，进行流式检测，结果见图16所示，可以看出G蛋白重组细胞株可以用于筛选阳性抗体。
1.4 PBMC分离及VHH抗体片段的获得
采集50ml外周血，使用淋巴细胞分离液分选PBMC。提取RNA，使用PrimeScriptTM II1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA。再进行VHH片段的扩增，扩增PCR后采用琼脂糖电泳回收750bp产物，在进行第二轮扩增，其产物采用琼脂糖电泳检测并回收产物，大小为400bp，结果见图1所示。
1.5噬菌体展示库的构建
1)菌体展示载体的构建
SfiI分别酶切pCom F载体和上述获得的VHH PCR胶回收产物，50℃酶切过夜。使用1％的琼脂糖凝胶分离pCom F载体片段，切取5000bp的载体片段进行胶回收；同时使用DNA片段回收试剂盒纯化PCR酶切产物，并用NanoDrop测定浓度。酶切好的pCom F载体和VHH片段使用T4 ligase连接，16℃连接过夜。
2)噬菌体连接产物电转化大肠杆菌
准备电转杯、连接产物和电转感受态置于冰上预冷；取预冷的建库连接产物加入到电转感受态中，置于冰上1min，向每个电转杯中加入70μL DNA/感受态混合物，将电转杯放于冰上；按照2500V，5ms进行电转；电击结束后，立刻加入平衡至室温的SOC培养基重悬菌体，37℃摇床培养1小时。取菌液15mL直接进行噬菌体拯救，其余5mL电转产物加入等体积的50％甘油，均匀混合后保存在-80℃。另外取菌液20μL，加入980μL2YT培养基进行稀释后，取100μL稀释后产物，加入900μL 2YT培养基进行第二步稀释，取50μL均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。第二天，取出平板，计算每个连接能够产生的克隆数，计算库容。同时挑取平板上的单克隆20个到含氨苄青霉素的2YT培养基中，37℃震荡培养约6-8小时，送菌液测序(测序通用引物M13R)，看库的多样性，见图2所示，序列差异代表多样性，可以看出多样性好。
3)噬菌体展示库的复苏和拯救，噬菌体沉淀
将电转后的转化产物用2YT稀释调整至OD600为0.2左右，加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素置于恒温摇床中，37℃，225rpm培养，至OD600为0.5时停止；投入M13KO7，摇匀后37℃静置30min后，37℃，225rpm培养1h。M13KO7体积＝10x体积x OD600 x 5x 108/M13KO7滴。将菌液6000rpm离心10min后用2YT-AK培养基重悬，25℃，200rpm过夜培养；将菌液10000rpm离心15min；弃去沉淀，将上清转至新的离心管，管内加入1/5菌液体积的PEG/NaCl，混匀后放置4℃，静置2h。将沉淀的噬菌体上清，10000rpm，4℃，离心30min；弃去上清，每个50ml离心管的沉淀(噬菌体)用1ml无菌PBS重悬；将重悬的噬菌体转移至1.5mLEP管中，置于离心机中，12000g，4℃，离心5min；将上清转移至新的1.5mlEP管，每管加入250μl的PEG/NaCl，混匀后4℃静置10min。12000g离心10min，弃上清，加入1ml PBS重悬。12000g离心5min，弃沉淀，将上清转移至新的1.5mlEP管。2000g离心5mi，将上清转移至新的1.5mlEP管，得到噬菌体原始库。取10μl沉淀投入90μl 2YT培养基，记做10-1，依次往后10倍稀释至10-9，取10-7、10-8、10-9三个梯度20μl稀释好的样品投入200μl事先准备好的OD600为0.5的ER2738，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，每108μl涂1块LB-AMP固体平板，37℃过夜，第二天数斑以确定Titer。Titer计算：选取斑数在30-300之间的平板，两块平板取平均值，斑数量乘以稀释倍数再乘以100得到titer，见图3所示，说明库容量大。
4)噬菌体展示库的固相panning
使用ELISA板，包被目的蛋白，经历数次洗脱步骤后，使用TEA将结合在固定抗原上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行测序。
用PBS稀释抗原至50μg/ml，150μl/well，共包被3well，置于4℃包被过夜；吸去target蛋白，用3％MPBS室温封闭1h；将lib phage或上轮扩增的沉淀用450μl 3％MPBS稀释，将6x1011Pfu的phage(每孔2x1011Pfu)投入到对照蛋白包被孔中，每孔投入150μl的稀释好的phage，室温孵育1h；吸去target蛋白的MPBS，并将对照孔中的phage转至包被target蛋白的孔中，室温孵育1-1.5h；将phage吸去，用0.05％PBST洗涤8-10次，每次2-3min，再用PBS洗涤4-5次，每次2-3min，同时用PBS洗涤事先封闭的1.5ml EP管；用1xTEA洗脱6～8min，每孔200μl，收集洗脱下来的产物至预先封闭过的EP管中，每孔再加入100μl Tris-HCl中和；取10μl output产物投入90μl 2YT培养基，记做100，依次往后10倍稀释至10-2，取101、100、10-1、10-2四个梯度20μl稀释好的样品投入200μl事先准备好的OD600为0.5的ER2738(101是直接将未稀释的产物20μl加入ER2738)，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，每108μl涂1块LB-AMP固体平板，37℃过夜，第二天数斑以确定Titer。Titer计算：选取斑数在30-300之间的平板，两块平板取平均值，用斑数量乘以稀释倍数再乘以洗脱体积，见图4所示，说明在扩增。
5)噬菌体展示库的cell-based panning
使用过表达靶蛋白的重组细胞株，将噬菌体库依次与空细胞和过表达靶蛋白的细胞进行孵育后，经数次洗涤洗去非特异性结合的噬菌体后，使用甘氨酸或TEA将结合在细胞表面上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行ELISA检测。
提前一天用1％PBSA封闭1.5ml EP管，4℃过夜；Target cell和control cell各取1x107，用PBS洗涤三次，用10mL1％PBSA重悬，放置于脱色摇床室温低速封闭1h；向controlcell中投入1x1011的噬菌体，孵育1h，target cell继续封闭；将孵育结束的细胞置于离心机中，1000g离心5min，弃去target cell上清(1％PBSA)，并将control cell的上清小心吸出，加入到target cell管中，重悬后，置于摇床，低速孵育1h；将target cell置于离心机中，1000g离心5min；(同时用PBS洗涤三次昨天封闭的1.5ml EP管)，弃去target cell上清，加入4ml PBS重悬，分装至封闭的1.5ml EP管，用PBS离心洗涤5次，再将细胞转移至另外四个EP管，继续洗涤5次，然后将细胞转移至同一个EP管中；用200μl PBS重悬细胞，然后加入200μl 2xTEA迅速吹吸，直至溶液不再粘稠，再加入200μl Tris-HCl中和，即得到产物；测定Output库的titer，同固相panning方案，见图5所示，可以看出库容量在富集。
6)Phage ELISA
分装2YT-Amp培养基至96孔深孔板，每孔500μl，挑取output平板上的单克隆，37℃，225rpm培养至OD600直至0.5；最后两孔H11和H12不挑克隆，只放培养基，作为空白对照；同时用CBS包被抗原至ELISA板，浓度1μg/ml，100μl/well，37℃，包被2h；另取一块96孔深孔板，分装2YT-A培养基，每孔500μl，用排枪依次吸取OD600为0.5的菌液10μl至新分装的96孔板中，置于37℃，225rpm培养过夜，此为送样测序菌液；向OD600为0.5的菌液中，加入M13KO7，混匀后放于37℃，静置15min；
M13KO7体积＝10x体积x OD600 x 5x 108/M13KO7滴度；将侵染结束的菌液置于摇床上，37℃，225rpm培养45min；将菌液置于离心机中，4000rpm离心10min，弃去上清，用2YT-AK培养基重悬，每孔800μl，重置于摇床中，30℃，210rpm过夜培养；同时ELISA板甩掉抗原，用PBST洗液洗三遍后，用3％MPBS封闭250μl/well，4℃过夜；并额外封闭一块空白板，作为BLANK；第二天，将96孔深孔板置于离心机中，4000rpm离心10min；将ELISA板中的牛奶弃去，用200μL PBST洗涤4次；在每孔先加入50μl PBST，再一一对应加入50μL离心后的噬菌体上清，置4℃孵育1h；弃去上清，并用PBST洗涤5次；用PBST稀释HRP-Anti M13二抗，每孔100μl，4℃孵育45min后，洗去二抗，PBST洗5次，TMB常温显色10min，盐酸终止，读数，选取S/N比大的值的克隆，用保种的菌液送测；见图6～8所示，S/N值越大越好。
实施例2：针对RBV的单域抗体的初步评价鉴定
2.1单域抗体的表达载体的构建和表达
根据噬菌体单克隆Elisa检测结果，挑选阳性克隆进行测序，获得15个VHH抗体序列。将分析获得的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体Lenti-hIgG1-Fc2中(载体示意图13)。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。
从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体Lenti-hIgG1-Fc2，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取500μLPBS至24孔板的一个孔，加入4μg Lenti-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。此处的混合物称为DNA/LVTransm复合物。将上述532μL DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL CHO细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的FreeStyleTM 293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，进行后续的流式和ELISA检测。
2.2流式检测重组抗体与靶蛋白的结合
从液氮中复苏CHO和CHO-GM004细胞株，调整细胞状态至对数生长期；将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*105个细胞；将表达的抗体分别孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时；800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；加入1μL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
2.3单域抗体的表达纯化
从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg Lenti-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL CHO细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的FreeStyleTM 293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。采用流式检测如图9～11所示，获得了7个候选抗体。
Figure BDA0003151511890000121
2.4候选抗体的细胞中和抑制实验
RBV抗体中和抑制试验快速荧光灶抑制试验法。
实验步骤：
(一)中和用病毒的制备
1)病毒悬液的制备：取CVS-11毒种(一般为冻干毒种)做适当稀释，以0.1MOI感染量接种生长良好的BSR细胞，于37℃、5％二氧化碳条件下培养1天后转入34℃继续培养，2天后收集培养上清液，于4℃以每分钟4000转离心10分钟去除细胞碎片，取上清液加入10％新生牛血清，混匀后分装小管，-70℃以下冻存备用。
2)病毒液的预滴定：取冻存的病毒悬液1支，经流水速融后，在24孔培养板上从1:5开始做5倍系列稀释，取100μL病毒液加入400μL含10％灭能新生牛血淸的DMEM培养液中，充分混匀后，每个稀释度取50μL转移至96孔培养板，每个稀释度平行做2份，每孔再加入5x106/ml的BSR细胞悬液50μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。培养结束后弃上清液，PBS洗1遍，再加入80％冷丙酮，每孔50μL，4℃固定30分钟，或-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后每孔加入50μL工作浓度的FITC标记的狂犬病病毒核蛋白抗体染色，于37℃孵育30分钟，用PBS洗3遍，甩干，每孔加80％甘油50μL,于荧光显微镜下观察；计数每孔中的荧光灶数，取每孔荧光灶数在30以下的孔，记录相邻4孔荧光灶数，取其平均值，计算如下：
病毒滴度(FFU/ml)＝20X(最高稀释倍数孔荧光灶平均值x5+相邻孔稀释倍数较低的荧光灶平均值)/2x稀释倍数较低孔病毒稀释倍数
3)中和用病毒液的制备：取病毒悬液1支，按病毒液的预滴定同法操作。在荧光显微镜下计数每孔中的荧光灶比例，以
Figure BDA0003151511890000131
的细胞被病毒感染的病毒稀释度为中和试验用病毒稀释度。
取冻存的病毒悬液1支，经流水融化后，用含5％灭能新生牛血清的DMEM培养液将病毒稀释至中和试验用病毒稀释度，置冰浴备用。
4)狂犬病免疫球蛋白标准品/阳性对照抗体工作液的制备：用含10％灭能新生牛血清的DMEM培养液将狂犬病免疫球蛋白标准品/阳性对照抗体做3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μL培养液，取50μL标准品/阳性对照抗体加入其中，成为1:3稀释度，充分混合后，吸取50μL加入下一孔100μL培养液中，成为1:9稀释度，如此系列稀释若干孔至适宜稀释度。
(二)待测样本工作液的制备
待测样本(抗体样品应预先经56℃、30分钟灭能)用含10％灭能新生牛血清的DMEM培养液做3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加人100μL培养液，取50μL待测样本加入其中，即为1:3稀释度，充分混合后，吸取50μL加人下一孔100μL培养液中，成为1:9稀释度，如此系列稀释若干孔至适宜稀释度，最后一孔中50μL弃去。
(三)测定方法
将稀释后的标准品/阳性对照抗体及待测样本各孔中加入中和用病毒液，50μL/孔，同时设正常细胞对照孔(只加100μL DMEM于孔中)，以及中和用病毒对照孔(含5％灭能新生牛血清的DMEM 100μL,加入中和用病毒50μL,)，混匀后置37℃中和1小时，每孔加入Ix106个/ml的BSR细胞悬液50μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。待培养结束吸干培养液，每孔中加入PBS 100μL清洗并吸干后，每孔加人预冷至4℃的80％丙酮50μL，4℃固定30分钟，或-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加人工作浓度的荧光标记狂犬病病毒核蛋白抗体，50μL/孔，37℃孵育30分钟，弃去液体，用PBS洗板
Figure BDA0003151511890000132
次，甩干，每孔加人80％甘油50μL,荧光显微镜下观察。
最终获得的结果如下表：
序号 名称 规格 结果
1 SDAB19051501-4-H8纯化抗体 1.36mg/ml,400μl 543.4
2 SDAB19051501-D10纯化抗体 1.55mg/ml,400μl 183250.3
3 SDAB1905150-2-43纯化抗体 1.68mg/ml,300μl 395.2
4 SDAB1905150-2-52纯化抗体 1.49mg.ml,400μl 365.9
5 SDAB1905150-2-59纯化抗体 0.98mg/ml,500μl 329.8
6 SDAB1905150-2-60纯化抗体 0.66mg/ml,400μl 951.5
7 SDAB1905150-2-79纯化抗体 0.96mg/ml,500μl 318.7
对照抗体1 Rafivirumab抗体 2.1mg/mL,200μl 1613
对照抗体2 Foravirumab抗体 2.5mg/mL,200μl 17759.6
注：结果数值越大，代表中和抑制能力越好，从结果可以看出，SDAB19051501-D10抗体是阳性对照抗体Rafivirumab的113.6倍，是阳性对照抗体Foravirumab的10.3倍。
实施例3：人源化抗体
3.1人源化抗体基因合成及表达载体构建
根据细胞中和抑制实验结果筛选单域抗体D10序列做人源化，首先通过建模获得该抗体的同源模型，结合abysis软件分析距离CDRs
Figure BDA0003151511890000142
范围的框架氨基酸以及稀有氨基酸，这些氨基酸位点通常影响CDR的构象或抗原结合活性。然后通过IMGT分析获得人源germline，通过将选定的人源germline框架与抗体的CDRs进行拼接后，比对设计获得的人源化抗体与原始抗体的框架区序列，找出两者框架区序列中存在差异的氨基酸位点，通过分析亲本抗体的同源建模结果，确定这些存在差异的氨基酸位点是否会影响CDR的构象或抗原结合活性。在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸进行替换，设计抗体人源化(HM-D10-1到HM-D10-6)。
Figure BDA0003151511890000141
将上述设计的人源化抗体分别进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc2中(图13)。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。
3.2人源化抗体瞬时转染表达
1)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取500μl PBS至24孔板的一个孔，加入4μgpcDNA3.4-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
2)将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的OPM-293CD05培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3)连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，纯化抗体，进行流式检测。
3.3流式检测人源化抗体与靶蛋白的结合
1)从液氮中复苏CHO和CHO-GM004细胞株，使用CHOGrow CD1培养基调整细胞状态至对数生长期；
2)将细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*105个细胞。
3)将表达的抗体分别孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。
4)800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。
5)加入1uL PE或者Alexa488标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟。
6)800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次。
7)使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
3.4人源化抗体的表达纯化
1)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μgpcDNA3.4-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
2)将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的OPM-293CD05培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3)连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。
3.5结果
3.5.1抗体表达载体构建测序结果
所有构建的抗体表达载体均经Sanger测序，抗体表达载体均完全正确。
3.5.2人源化抗体流式细胞检测结果
将人源化的抗体表达载体瞬时转染293F细胞进行小试表达，收集培养基上清，采用流式细胞仪检测人源化后抗体与重组细胞CHO和CHO-GM004细胞膜表面的抗原结合情况，见图18所示。
根据流式检测结果，人源化抗体HM1，HM4均特异性与重组CHO-native G protein细胞结合，且结合力与D10抗体相当。
3.6人源化抗体亲和力检测
将GM004重组蛋白使用10mMAcetate缓冲液固定在CM5芯片上，分别以HM1和HM4阳性人源化抗体及原始抗体D10作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白GM004的结合能力，见图19所示，亲和力检测结果：
Figure BDA0003151511890000151
结果分析：根据亲和力检测结果，人源化抗体与原始抗体的亲和力一致。
从结果我们可以看出人源化抗体HM1和HM4与原始抗体D10亲和力相当。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 高光
<120> RBV的蛋白结合分子及其用途
<160> 117
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Asp Ser Val Thr Thr Asn Tyr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Gly Asp Met Gly Pro Phe Tyr Cys Ser Gly Tyr Val Cys Gly Ala
1 5 10 15
Gln Arg Ala Asp Phe Gly Phe
20
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Arg
1 5
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Val Asp Thr Lys Thr Tyr Gly Tyr Cys Ser Ile Tyr Val Ala Glu
1 5 10 15
Tyr His Tyr
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Asn Ser Asp Asn Ala Gly Thr
1 5
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Lys Glu Gln Ala Ser Ile Val Tyr Phe Pro Ser Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Asp Ser Ile Thr Thr Asn Tyr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Asp Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 12
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Gly Ala Thr Gly Pro Phe Tyr Cys Gly Gly Ser Val Cys Tyr Val
1 5 10 15
Thr His Asp Asp Tyr Asp Tyr
20
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Gly Ser Ile Thr Thr Asn Tyr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 14
Ile Asp Tyr Ser Gly Asp Thr
1 5
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Arg Gly Asp Ser Pro Tyr Tyr Cys Glu Gly Pro Val Cys Tyr Val
1 5 10 15
Ile Gln Ser Asp Tyr Asp Ser
20
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Gly Ser Ile Ala Thr Tyr Asn Ser Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 17
Ile Asp Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Arg Glu Met Gly Pro Phe Tyr Cys Gly Gly His Val Cys His Val
1 5 10 15
Gln Arg Val Asp Phe Glu Ser
20
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Ser Cys Ile Ala Ser Thr Gly Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Ile Thr Asp Leu Ser Leu Cys His Asp Pro Tyr Tyr Gly Gln Glu
1 5 10 15
Tyr
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 23
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr Ile
<210> 24
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 24
Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ala Ser Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Thr Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 25
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 27
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 28
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 28
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Thr Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
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Met Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
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Tyr
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Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Thr Ser Ile Ser Arg Asp Thr
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Tyr
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65 70 75 80
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atggggccat tctactgttc aggctatgtg tgtggtgccc agcgggccga ctttggtttc 360
tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tcg 393
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ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtgt atttctgtac aaaagagcag 300
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caggcgcagc tcgtggagtc gggcccaggc ctggtgaagc cctcgcagac actctccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcgca acctacaatt catactggca ctgggtccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt ggatacatag attatagcgg cagcacttac 180
tacagcccgt ccctcgagag ccgcacgtcc atctccaggg acacgtccaa gaatcaattc 240
accctgcagc tgagctctgt gacccctgaa gacacagccg tgtattactg cgccagagag 300
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<212> DNA
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<400> 63
cagaggcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagcctc 60
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gccgtctcct ca 372
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Ala Val Asp Thr Lys Thr Tyr Gly Tyr Cys Ser Ile Tyr Val Ala Glu
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Tyr His Tyr
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Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr Ala
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Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Arg
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Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr Ala
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Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Arg
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Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Arg
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Ala Val Asp Thr Lys Thr Tyr Gly Tyr Cys Ser Ile Tyr Val Ala Glu
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Cys
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Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Gly Val Ser
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Cys
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<211> 38
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Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<400> 89
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Cys
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<211> 38
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<400> 92
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Asn Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
1 5 10
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<400> 94
Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 17
<212> PRT
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Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 96
<211> 38
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<400> 96
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
1 5 10
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<211> 25
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Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser
20 25
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Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
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<400> 100
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20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
1 5 10
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<211> 25
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<400> 102
Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
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20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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1 5 10
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<400> 106
Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Arg Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120 125
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<211> 126
<212> PRT
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr
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100 105 110
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115 120 125
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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100 105 110
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<210> 112
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 112
caggctcagc tggttgaatc tggcggcgga cttgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg cctctggctt caccctggat gattatgcca tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggcaagg gaagagaagg cgtgtcctgt atcagcagca gcggccggac aagaaactac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaacaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggacacc 300
aagacctacg gctactgcag catctacgtg gccgagtacc actattgggg ccagggcaca 360
accgtgaccg tttctcca 378
<210> 113
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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caggctcagc tggttgaatc tggcggcgga cttgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg cctctggctt caccctggat gattatgcca tcggctgggt ccgacaggcc 120
cctggaaaag gacttggcgg agtgtcctgt atcagcagca gcggcagaac cagaaactac 180
gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaacaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggacacc 300
aagacctacg gctactgcag catctacgtg gccgagtacc actattgggg ccagggcaca 360
accgtgaccg tttctcca 378
<210> 114
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 114
caggctcagc tggttgaatc tggcggcgga cttgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg cctctggctt caccctggat gattatgcca tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggcaaag agagagaggg cgtcagctgt atcagcagca gcggcagaac cagaaactac 180
gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaacaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggacacc 300
aagacctacg gctactgcag catctacgtg gccgagtacc actattgggg ccagggcaca 360
accgtgaccg tttctcca 378
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
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caggctcagc tggttgaatc tggcggcgga cttgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg cctctggctt caccctggat gattatgcca tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggcaagg gaagagaagg cgtgtcctgt atcagcagca gcggccggac aagaaactac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggacacc 300
aagacctacg gctactgcag catctacgtg gccgagtacc actattgggg ccagggcaca 360
accgtgaccg tttct 375
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<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 116
caggctcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtagcg ccagcggctt caccctggat gattatgcca tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggcaagg gaagagaagg cgtgtcctgt atcagcagca gcggccggac aagaaactac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggacacc 300
aagacctacg gctactgcag catctacgtg gccgagtacc actattgggg ccagggcaca 360
accgtgaccg tttct 375
<210> 117
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(Artificial Sequence)
<400> 117
caggctcagc tggttgaatc tggcggcgga cttgtgaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg cctctggctt caccctggat gattatgcca tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggcaaag agagagaggg cgtcagctgt atcagcagca gcggcagaac cagaaactac 180
gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cgtggacacc 300
aagacctacg gctactgcag catctacgtg gccgagtacc actattgggg ccagggcaca 360
accgtgaccg tttctcca 378

Claims (21)

1.狂犬病毒的蛋白结合分子，其包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1选自SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19，CDR2选自SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20，CDR3选自SEQID NO：3、6、9、12、15、18、21；
其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子包括：
1)如SEQ ID NO：1所示的CDR1、如SEQ ID NO：2所示的CDR2、如SEQ ID NO：3所示的CDR3；或者，
2)如SEQ ID NO：4所示的CDR1、如SEQ ID NO：5所示的CDR2、如SEQ ID NO：6所示的CDR3；或者，
3)如SEQ ID NO：7所示的CDR1、如SEQ ID NO：8所示的CDR2、如SEQ ID NO：9所示的CDR3；或者，
4)如SEQ ID NO：10所示的CDR1、如SEQ ID NO：11所示的CDR2、如SEQ ID NO：12所示的CDR3；或者，
5)如SEQ ID NO：13所示的CDR1、如SEQ ID NO：14所示的CDR2、如SEQ ID NO：15所示的CDR3；或者，
6)如SEQ ID NO：16所示的CDR1、如SEQ ID NO：17所示的CDR2、如SEQ ID NO：18所示的CDR3；或者，
7)如SEQ ID NO：19所示的CDR1、如SEQ ID NO：20所示的CDR2、如SEQ ID NO：21所示的CDR3。
2.权利要求1所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1选自SEQ ID NO：22、26、30、34、38、42、46，FR2选自SEQ ID NO：23、27、31、35、39、43、47，FR3选自SEQ ID NO：24、28、32、36、40、44、48，FR4选自SEQ ID NO：25、29、33、37、41、45、49。
3.权利要求2所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子包括：
1)如SEQ ID NO：22所示的FR1、如SEQ ID NO：23所示的FR2、如SEQ ID NO：24所示的FR3、如SEQ ID NO：25所示的FR4；或者、
2)如SEQ ID NO：26所示的FR1、如SEQ ID NO：27所示的FR2、如SEQ ID NO：28所示的FR3、如SEQ ID NO：29所示的FR4；或者、
3)如SEQ ID NO：30所示的FR1、如SEQ ID NO：31所示的FR2、如SEQ ID NO：32所示的FR3、如SEQ ID NO：33所示的FR4；或者、
4)如SEQ ID NO：34所示的FR1、如SEQ ID NO：35所示的FR2、如SEQ ID NO：36所示的FR3、如SEQ ID NO：37所示的FR4；或者、
5)如SEQ ID NO：38所示的FR1、如SEQ ID NO：39所示的FR2、如SEQ ID NO：40所示的FR3、如SEQ ID NO：41所示的FR4；或者、
6)如SEQ ID NO：42所示的FR1、如SEQ ID NO：43所示的FR2、如SEQ ID NO：44所示的FR3、如SEQ ID NO：45所示的FR4；或者、
7)如SEQ ID NO：46所示的FR1、如SEQ ID NO：47所示的FR2、如SEQ ID NO：48所示的FR3、如SEQ ID NO：49所示的FR4。
4.权利要求1～3中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO：50～56。
5.权利要求1～3中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子为人源化抗体。
6.权利要求5所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1选自SEQ ID NO：64、67、70、73、76、79，CDR2选自SEQ ID NO：65、68、71、74、77、80，CDR3选自SEQ ID NO：66、69、72、75、78、81；
其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括：
1)如SEQ ID NO：64所示的CDR1、如SEQ ID NO：65所示的CDR2、如SEQ ID NO：66所示的CDR3；或者，
2)如SEQ ID NO：67所示的CDR1、如SEQ ID NO：68所示的CDR2、如SEQ ID NO：69所示的CDR3；或者，
3)如SEQ ID NO：70所示的CDR1、如SEQ ID NO：71所示的CDR2、如SEQ ID NO：72所示的CDR3；或者，
4)如SEQ ID NO：73所示的CDR1、如SEQ ID NO：74所示的CDR2、如SEQ ID NO：75所示的CDR3；或者，
5)如SEQ ID NO：76所示的CDR1、如SEQ ID NO：77所示的CDR2、如SEQ ID NO：78所示的CDR3；或者，
6)如SEQ ID NO：79所示的CDR1、如SEQ ID NO：80所示的CDR2、如SEQ ID NO：81所示的CDR3。
7.权利要求6所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中FR1选自SEQ ID NO：82、86、90、94、98、102，
FR2选自SEQ ID NO：83、87、91、95、99、103，FR3选自SEQ ID NO：84、88、92、96、100、104，
FR4选自SEQ ID NO：85、89、93、97、101、104。
8.权利要求7所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子为人源化抗体，其包括：
1)如SEQ ID NO：82所示的FR1、如SEQ ID NO：83所示的FR2、如SEQ ID NO：84所示的FR3、如SEQ ID NO：85所示的FR4；或者、
如SEQ ID NO：86所示的FR1、如SEQ ID NO：87所示的FR2、如SEQ ID NO：88所示的FR3、如SEQ
ID NO：89所示的FR4；或者、
如SEQ ID NO：90所示的FR1、如SEQ ID NO：91所示的FR2、如SEQ ID NO：92所示的FR3、如SEQ
ID NO：93所示的FR4；或者、
如SEQ ID NO：94所示的FR1、如SEQ ID NO：95所示的FR2、如SEQ ID NO：96所示的FR3、如SEQ
ID NO：97所示的FR4；或者、
如SEQ ID NO：98所示的FR1、如SEQ ID NO：99所示的FR2、如SEQ ID NO：100所示的FR3、如SEQ
ID NO：101所示的FR4；或者、
如SEQ ID NO：102所示的FR1、如SEQ ID NO：103所示的FR2、如SEQ ID NO：104所示的FR3、如SEQ ID NO：105所示的FR4。
9.权利要求5所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒的蛋白结合分子为人源化抗体，其的氨基酸序列选自SEQ ID NO：106～111。
10.权利要求1～9所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其为包含一免疫球蛋白单一可变结构域的抗体。
11.权利要求10所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，免疫球蛋白单一可变结构域为一重链可变区结构域。
12.权利要求11所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，免疫球蛋白单一可变结构域为人源化的重链可变区结构域。
13.权利要求1～12中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其包括免疫球蛋白Fc区。
14.权利要求1～13中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其结合狂犬病毒蛋白小于1×10-7M。
15.权利要求1～13中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子，其中所述狂犬病毒蛋白分子形成多价链接。
16.一种编码权利要求1～12中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子的核酸分子。
17.权利要求16所述的核酸分子，其的核苷酸序列选自SEQ ID NO：57～63和112～117。
18.一种检测试剂盒，其包括权利要求1～15中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子。
19.一种宿主细胞，其表达权利要求1～15中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子。
20.一种药物组合物，其包括权利要求1～15中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子和一种或多种药
学上可接受的赋形剂。
21.权利要求1～15中任一项所述的狂犬病毒的蛋白结合分子、权利要求18所述的检测试剂盒、权利要求20所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防和/或诊断与狂犬病毒感染相关疾病的药物中的用途。
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