CN101100663B - 重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的生产方法,利用基因重组哺乳动物细胞成功生产出高纯度的人抗狂犬病毒单克隆抗体NM57,该株抗体稳定性好、特异性强,能够中和目前中国境内的代表性狂犬病毒街毒株,特别适用于狂犬病暴露后预防,取代目前所使用的抗狂犬病马血清(ERIG)或人免疫球蛋白(HRIG)。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体地说涉及人抗狂犬病毒单克隆抗体基因、含有该基因的重组载体以及利用该载体转化的宿主制备人抗狂犬病毒单克隆抗体及其应用。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病,流行性广,病死率几近百分之百,对人民生命健康造成严重威胁。人狂犬病主要通过患病动物咬伤、抓伤或由粘膜感染引起,在特定的条件下还可通过呼吸道气溶胶传染。传染动物主要是犬(超过90%),其次是猫。
根据中国疫情报告系统资料,1998年后狂犬病疫情年增长幅度越来越高。2001年中国狂犬病发病891例,死亡854例;2002年发病数1122例,死亡1003例;2003年发病数达到2009例,死亡1827例。病死数占各种法定传染病死亡总数的37.29%,成为当年死亡人数最多的传染病,2004年和2005年死亡人数更是分别达到了2660例和2537例。
对于狂犬病毒暴露后预防,WHO推荐的处理方法是全程注射狂犬疫苗,同时合并注射抗狂犬病马血清(ERIG)或人免疫球蛋白(HRIG)。抗血清和免疫球蛋白的代表性产品是法国巴斯德-梅里厄-康纳(Pasteur Merieux Connaught)公司生产的ERIG PMC和RABIES-HT;另外,Bayer公司生产的BayRabTM(人免疫球蛋白)在市场上也占相当分额。但HRIG由于来源限制价格昂贵,而马血清制品则较易发生严重的过敏反应,虽然PMC公司在降低马血清制品的过敏原性方面做了一些工作,包括在ERIG制备过程中加入层析纯化及加热灭活病毒的步骤,但异源成分在人体引起的过敏反应依然时有发生。
现今国际上已经公认有必要用重组单克隆抗体取代狂犬病暴露后预防中使用的抗狂犬病毒血源抗体。国外研究者已经进行了广泛的相关研究,并取得了显著的成果。B.Dietzschold利用细胞融合技术制备了多株人抗狂犬病毒单克隆抗体,发现能特异结合狂犬病毒G蛋白的一株抗体MAb57能够高效和广泛地中和狂犬病毒并且对狂犬病毒攻击的实验室啮齿动物可以起保护作用(J Virol.1990June;64(6):3087-3090)。B.Dietzschold等将MAb57基因转入SPBN重组病毒表达系统,在BSR细胞中制备了SO57抗体(J Immunol Methods.2001Jun1;252(1-2):199-206,),SO57抗体重链和轻链的氨基酸序列分别见GENEBANKgi:27728677和gi:27728683。但该方法的稳定性差,操作繁琐,难以实现产业化。开发出抗狂犬病毒单克隆抗体的产业化制备工艺是本领域急待解决的问题。
发明内容
发明人把SO57的基因序列在CHO细胞表达系统中表达,构建成功高效表达SO57的工程细胞,把得到的单抗重命名为NM57,该方法操作工艺简便、产品表达水平高(超过100毫克/升)、生产的抗体质量均一而且稳定性好,具备了产业化价值。
本发明得到的抗体及其药物组合物特别适用于狂犬病暴露后预防,可以取代目前所使用的抗狂犬病马血清(ERIG)或人免疫球蛋白(HRIG)。
发明人采用完全化学合成的方式分别合成了编码NM57重链可变区和轻链可变区的DNA序列,将其与载体pCAdhfr连接,得到可以用于表达完整NM57抗体的重组载体,利用该载体转染哺乳动物细胞,如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、鼠骨髓瘤细胞(NS0)、幼鼠肾细胞(BHK)或人胚胎肾细胞(HEK-293),优选CHO细胞,筛选得到可以稳定高效表达NM57抗体的重组哺乳动物细胞株。
发明人对表达NM57抗体的重组哺乳动物细胞进行了中试规模的放大工艺研究,确定了细胞悬浮培养、固液分离、层析纯化、超滤浓缩换液等工艺,制备得到高纯度NM57抗体,并对NM57样品按照重组生物制品质量控制的常规要求进行了理化性质检定及功能分析,结果显示我们开发的NM57对狂犬病毒有明确的中和作用,同时在街毒株的攻击性实验中,显示了优于市售血源抗狂犬病免疫球蛋白HRIG的保护率。我们对制备的NM57样品进行了安全性检测,结果表明,我们开发的NM57符合临床用药安全标准。
发明人将NM57抗体添加适当的赋型剂制备成为NM57抗体药物,经过产品质量、安全性、药效、稳定性等方面经过系统研究,结果表明我们开发的NM57抗体符合临床用药标准。
具体实施方式
NM57抗体基因:根据已知的SO57抗体重链和轻链可变区基因序列利用全化学合成的方法由上海生工公司进行合成,在SO57抗体重链和轻链可变区基因的5’端和3’分别加入限制性内切酶EcoRI和NotI位点,在EcoRI下游引入Kozac序列GAACAA连接起始密码ATG,在转录终止位点引入双终止子TAATGA连接NotI位点。经DNA序列测定确认正确后用于重组载体的构建。
pCAdhfr载体:来自美国Amprotein公司。
下面具体实施例仅用于进一步阐明本发明,不应解释为对本发明的限制。下面实施例中未注明具体实验条件的方法为常规条件,如萨姆布鲁克等著的“分子克隆操作指南(第三版)”(J.萨姆布鲁克,D W拉塞尔..北京:科学出版社,2002)中所述的相应实验条件,或者制造厂商所建议的条件。
实施例NM57抗体的制备
实施例1表达NM57抗体的重组载体pCAdhfr-NM57的构建
将得到的NM57抗体重链和轻链可变区基因按照常规方法分别克隆到载体pCAdhfr的相应限制性内切酶EcoRI和NotI位点,将连接产物按照常规方法转化大肠杆菌,经筛选得到分别含有完整NM57抗体重链和轻链编码基因的重组载体,分别命名为pCAdhfr-NM57H和pCAdhfr-NM57L。
实施例2表达NM57抗体的重组CHO细胞株的构建
分别取20ug重组载体pCAdhfr-NM57H和pCAdhfr-NM57L DNA,混合后利用电转染法转染CHO-K1细胞株(购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC编号GDC018),电转染条件按照BIO-RAD公司推荐的条件进行,具体参数参阅GenePulser Electroprotocol Survey number 086程序,经贴壁培养后检测瞬时表达情况。确认表达目的产物后进行克隆化培养及高表达细胞株筛选,加入0.1-10uM MTX进行加压筛选,得到的细胞株在贴壁培养条件下的表达水平为50ug/106细胞/天,将其命名为CHO-K1-NM57。
实施例3工程细胞培养
由生产种子库复苏的细胞,扩大培养,经鉴定合格后,以1∶3~1∶5的分种率接种在DMEM培养基中进行悬浮培养驯化,连续传代扩增细胞,收获,将上述细胞悬液接种至NBS 5L生物反应器中,连续灌流培养,收集细胞培养液。
实施例4NM57的纯化与检定
细胞培养收液经0.22um中空纤维过滤除去细胞碎片。然后经rProteinA SFF亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、超滤浓缩换液步骤,制备得到NM57原液。
对NM57原液进行还原SDS-PAGE及分子筛HPLC纯度检定,结果表明NM57纯度>98%。
经过以上生产工艺制备出的NM57,均一性好,连续三批生产的样品经检测,均符合我们制定的质量标准。
将制备的NM57原液进行分子量、等电点、肽图、亲和常数、免疫印迹、生物学活性、N端氨基酸序列测定并与SO57测定数据进行比较,检定结果均显示二者在性质和功能方面具有一致性。
实验例NM57抗体的功能研究
实验例1中和试验
我们对制备得到的NM57纯品进行了充分的功能鉴定,利用小鼠中和试验法(在武汉生生物制品所进行)和RFFIT法(在美国KSU VENTERINARYMEDICAL CENTER进行)对NM57的同一批样品进行了多次中和效价的测定,用快速荧光灶抑制试验(RAPID FLUORESCENT FOCUS INHIBITIONTEST,RFFIT)测定NM57对CVS的中和效价,结果为1324IU/mg,用小鼠中和试验测定NM57对CVS的中和效价,结果为2211IU/mg。
我们用狂犬病毒标准攻击毒株(CVS)以及中国有代表性的街毒株进行了中和试验,结果显示我们开发的NM57对狂犬病毒有明确的中和作用。从我们进行的一系列体内外试验的结果来看,NM57这一株抗体可以中和目前中国境内具有地域的代表性狂犬病毒街毒株,如:简株、CQ92株、SBD株(徐葛林,LiKu2,吴杰,等。病毒学报,2002,18(1):48-51);以及其它动物来源的街毒株,如:鹿源、牛源,结果均显示了明确的中和作用。
实验例2狂犬病暴露后预防试验
我们选用中国流行株SBD进行暴露后预防试验。16-18g Balb/c雌性小鼠,每组10只,小鼠于0天大腿肌肉注射80%致死量狂犬病病毒街毒株SBD 0.1ml(染色确定部位),0.5-1小时后同部位肌肉注射单抗NM57200IU/kg或HRIG200IU/kg,分别按照下表给予不同的处理:
说明:●处理 -未处理
处理方式如下:
病毒攻击:0天大腿肌肉注射街毒株SBD 0.1ml
NM57:200IU/kg 0.5-1小时后同部位肌肉注射;
HRIG:200IU/kg 0.5-1小时后同部位肌肉注射;
免疫:维尔博狂犬疫苗125倍稀释,0,7天腹腔免疫,0.5ml/只。
小鼠存活情况如下表:
在街毒攻击试验中,NM57对街毒株SBD攻击的动物能提供100%的保护,保护率明显优于HRIG组(仅为40%)。
利用鼠骨髓瘤细胞(NS0)、幼鼠肾细胞(BHK)或人胚胎肾细胞(HEK-293),发明人同样成功制备了NM57抗体,并进行了同样的功能研究,取得了相似的结果。
Claims (4)
1.一种抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法,其特征在于采用导入了含有完整人抗狂犬病毒单克隆抗体NM57重链编码基因的重组载体pCAdhfr-NM57H和含有完整人抗狂犬病毒单克隆抗体NM57轻链编码基因的重组载体pCAdhfr-NM57L的重组CHO细胞表达系统表达。
2.如权利要求1所述的制备方法,包括将所述重组CHO细胞,经贴壁培养制得所述抗体。
3.如权利要求1所述的制备方法,包括将所述重组CHO细胞,经悬浮培养制得所述抗体。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法,其特征在于所述的抗体为抗狂犬病毒单克隆抗体NM57。
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