CN104804083B - 一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组抗NC08单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该抗体的DNA分子，表达该抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明提供的抗NC08单克隆抗体能在NC08用药过程中快速检测受试者血清中NC08浓度，同时也能作为抗NC08的阳性对照抗体应用于NC08的免疫原性检测。

Description

一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗体技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的重组抗人抗狂犬病毒单克隆抗体的单克隆抗体，及其制备方法和用途。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，流行性广，病死率几近百分之百，对人民生命健康造成严重威胁。人狂犬病主要通过患病动物咬伤、抓伤或由粘膜感染引起，在特定的条件下还可通过呼吸道气溶胶传染。传染动物主要是犬(超过90%)，其次是猫。根据中国疫情报告系统资料，1998年后狂犬病疫情年增长幅度越来越高，死亡人数不断攀升。

对于狂犬病毒暴露后预防，WHO推荐的处理方法是全程注射狂犬疫苗，同时合并注射抗狂犬病马血清(ERIG)或抗狂犬病毒人免疫球蛋白(HRIG)。但HRIG由于来源限制价格昂贵，而马血清制品则较易发生严重的过敏反应，所以现今国际上已经公认有必要用重组单克隆抗体取代狂犬病毒暴露后预防中使用的抗狂犬病毒血源抗体。

此外，抗狂犬病毒重组单克隆抗体具有中和效果好、安全性好、成本低、可大量生产等优点，具有取代ERIG和HRIG的潜在能力，可用于狂犬病的暴露后预防。陈哲等人运用噬菌体表面呈现技术，采集多个具有高滴度狂犬病毒抗体的狂犬病毒疫苗注射者外周血淋巴细胞, 构建了抗狂犬病毒Fab 基因工程抗体文库，并对抗体库进行富集筛选，获得特异性抗狂犬病毒基因工程抗体Fab段，并将其命名为RVFab8。由于小分子抗体在亲和力和中和活性方面均低于全抗体，于是他们将上述Fab抗体RVFab8的轻链和重链基因分别克隆进入全抗体表达载体Pac-L-Fc并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达得到全抗体RVIgG8。并进一步对其进行功能鉴定，结果表明RVIgG8具有较好的中和活性，能达到876.61IU/mg，完全具备了中和国际标准攻击毒株CVS-11株的能力(病毒学报.2010.7;26(4):271-275) (中国专利：人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab8)，公开号CN101812131A)。

华北制药集团新药研究开发有限责任公司将RVFab8的全抗体基因序列在CHO细胞表达系统中表达，构建出成功高效表达该抗体的工程细胞，并把得到的单克隆抗体命名为NC08。该方法操作工艺简便、产品表达水平高、生产的抗体质量均一性及稳定性好，具备产业化价值(中国专利：重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法，公开号CN101100663A)。此外，NC08与本公司之前开发的NM57组成组合制剂，可进一步扩大对狂犬病毒毒株的覆盖。

在NC08及其组合制剂进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来成为药物后患者应用的过程中，为了研究药物代谢及保证用药安全，需要检测受试者（动物或人）或患者血清的NC08浓度或者需要检测人抗NC08的抗体。在某些情况下，可能需要从现有产品中检测有无NC08的添加。因此，迫切需要一种能有效、快速检测NC08和人抗NC08抗体的产品。

发明内容

本发明需要解决的第一个技术问题是提供一种抗NC08单克隆抗体，用于检测NC08浓度和人抗NC08抗体。

本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述抗NC08单克隆抗体的DNA分子。

本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种表达载体。

本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种真核宿主细胞。

本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种该重组抗NC08单克隆抗体的制备方法。

本发明需要解决的第六个技术问题是提供上述单克隆抗体的两种用途。

为实现上述发明目的，本发明一方面提供了一种重组抗NC08单克隆抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQID NO:l所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。

在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO:3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA分子。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有上述表达载体。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。

本发明第五方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a）构建含有权利要求2所述DNA分子的表达载体；

b）用步骤a）所述的表达载体转化宿主细胞；

c）培养步骤b）所得的宿主细胞；

d）分离纯化获得所述单克隆抗体。

本发明提供的抗体可以在体外检测NC08的浓度和人抗NC08抗体，本发明第六方面提供了一种利用本发明所述抗体检测NC08浓度的方法。在一个较佳的实例中，检测方法为桥联ELISA法。该抗体可用于制备检测试剂或者检测试剂盒。

本发明涉及一种重组抗NC08单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，轻链可变区具有SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本文所用的术语“单克隆抗体（单抗）”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点，而且，与常规多克隆抗体制剂（通常是具有针对不同决定簇的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过基因工程手段合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000 道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L) 和两个相同的重链(H) 组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR) 或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR 区，它们大致上呈β- 折叠构型，由形成连接环的三个CDR 相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR 通过FR 区紧密地靠在一起并与另一链的CDR 一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法制得，或用重组DNA方法制得，也可从噬菌体抗体库中分离获得。

本发明还提供了编码本发明重组抗NC08单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO:3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQID NO:4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

在获得编码本发明重组抗NC08单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列的表达载体。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。

本发明中所用的表达载体是本领域技术人员己知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体，以及可购得的表达载体pMH3（杭州安瑞普生物制品研究有限公司）。

随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。

用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene（1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物）介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。

然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗NC08单克隆抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Scatchard分析方法来测定。

本发明的优点在于本发明的单克隆抗体用于检测NC08具有特异性强、灵敏度高的优点，能在NC08进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来成为药物后患者应用的过程中，快速、准确检测受试者（动物或人）或患者的血清NC 08浓度；还可用于检测人抗NC08抗体；在某些情况下，还可用于从现有产品中检测有无NC08的添加。

附图说明

图1：还原SDS-PAGE电泳检测NC08 F(ab')₂纯度，泳道1为制备所得NC08 F(ab')₂，泳道2为NC08。

图2：载体pMH3-L，并且标明了其中的元件及酶切位点，其中，10C7-L为轻链基因；polyA为多聚腺苷化信号；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。

图3：载体pMH3-H，并且标明了其中的元件及酶切位点，其中，10C7-H为重链基因，polyA为多聚腺苷化信号；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。

图4：NC08浓度-OD值拟合曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

实施例中未标明来源的实验试剂均为市售。

实施例1表达抗NC08鼠单抗的杂交瘤细胞系的制备和筛选

1) 抗原NC08F(ab')₂的制备

将NC08（制备方法参见中国专利：重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法，公开号CN101100663A）用0.5 mol/L盐酸调pH值至3.5，37℃水浴30分钟。将胃蛋白酶（购自Sigma-Aldrich Co.公司）与抗体样品按1:50（w/w）的比例混合，37℃水浴2小时，加入0.5mol/L Na₂HPO₄溶液调pH值至7.0终止反应后，离心去除沉淀。

用层析介质rProteinA对酶切所得NC08F(ab')₂进行纯化后，用30kD超滤膜对所得纯化溶液超滤换液，保存溶液组成为10mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH6.0。根据体积加入1/200体积的10mg/ml Tween80，混匀，用0.22μm滤膜过滤，分装。用还原SDS-PAGE电泳法检测制备所得抗原NC08F(ab')₂的纯度＞90%（电泳图见图1）。

2)免疫小鼠

用步骤1）制得的NC08F(ab')₂皮下注射免疫6周龄 Balb/c小鼠，首次免疫使用福氏完全佐剂，每隔两周使用福氏不完全佐剂加强免疫一次，共免疫三次，每次每只50μg。取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液。

3）融合和克隆化

按照“The Protein Protocols Handbook”第二版 （John M. Walker 2002Humana Press Inc.）“PART VIII MONOCLONAL ANTIBODIES ”159节“HybridomaProduction”中所述方法，将步骤2）制得的淋巴单细胞与BALB/c小鼠来源的 sp2/0骨髓瘤细胞进行融合及克隆培养。采用《The Protein Protocols Handbook》第二版 （John M.Walker 2002 Humana Press Inc.）PART VIII MONOCLONAL ANTIBODIES 第161节Screening Hybridoma Culture Supernatants Using ELISA所述方法，使用NC08对克隆进行筛选，最后筛选得到一株表达抗NC08鼠源单抗的杂交瘤细胞株10C7。

实施例2 抗体可变区编码序列的克隆和测序

1）取实施例1筛选得到的杂交瘤细胞株进行悬浮培养，取细胞10⁷个，于4℃以离心力200g离心5分钟，尽弃上清，所得细胞使用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒（MagAttract RNACell Mini M48 Kit）提取总RNA。

2）以提取的RNA为模版，使用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒（RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0）进行RT-PCR反应，反转录引物分别为：

A轻链扩增引物：

正向引物：

LL1：5’ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3’

LL2：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG 3’

LL3：5’ATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA 3’

LL4：5’ATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT 3’

LL5：5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG 3’

反向引物：

Cκ：5’GTTGGTGCAGCATCAGC 3’

B重链引物：

正向引物：

VH1：5’ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT 3’

VH2：5’ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 3’

VH3：5’ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3’

VH4：5’ATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG 3’

反向引物：

Cγ：5’GGGGCCAGTGGATAGAC 3’

反应结束后取反应物在1.5％琼脂糖凝胶电泳上进行分离，采用Qiagen公司的胶回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）提纯扩增的DNA片段，进行序列测定（交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测定）。结果如下：SEQ ID NO:3 显示了其轻链可变区基因序列(5’到3’，324bp)， 其氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1 中；SEQ ID NO:4 显示了其重链可变区基因序列((5’到3’，360bp)，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO:2 中。

实施例3抗体的表达载体构建、表达与纯化

1）用EcoR I 和Not I 限制性酶酶切表达载体pMH3，然后将上述抗体可变区与鼠源恒定区通过搭桥PCR拼接起来，并在两端设计EcoR I 和Not I酶切位点序列，之后与酶切的表达载体连接，从而构建得到分别含有重组抗NC08抗体轻链全长和重链全长基因的表达载体pMH3-L和pMH3-H，如图2、3所示。

2）CHO细胞转染与克隆筛选

上述构建的表达载体分别转化大肠杆菌DH10B菌种，接种于100毫升LB培养基中进行扩增，收集细胞，用Qiagen公司质粒DNA纯化试剂盒（QIAGEN Plasmid Mini Kit）抽提质粒DNA4μg，采用电转化法将上述质粒转染CHO细胞，电转条件：240 V、25 Ω、50μF。

转染后的CHO细胞在MTX选择培养基上进行克隆筛选，最后在96孔板上进行有限稀释培养，连续进行3次。挑取单克隆细胞系在RPMI1640培养基中进行培养，用ELISA法检测上清中的抗体表达水平，选择表达水平最高的克隆作为工作株保存。

3）抗体纯化与检测

将选定的工作株培养后，收集细胞上清或培养液，10000rpm、4ºC离心20分钟，经0.45μm滤膜过滤、抽滤除气后备用。0.1mol/L的PB缓冲液（pH7.0）作为平衡缓冲液平衡Protein A Sepharose 4 Fast Flow层析柱，流速1ml/分钟平衡10-20个柱体积至记录仪基线稳定。将处理后的上清以同样流速上样，收集流穿液。上样结束后用平衡缓冲液洗至基线平稳。用0.1mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液（pH3.0）洗脱融合蛋白，流速1ml/分钟，收集洗脱峰，用1mol/L的Tris-HCL缓冲液调pH至中性，经超滤浓缩置换于PBS（pH7.4）缓冲液中，冻存，用于以下的进一步分析与研究。

实施例4单克隆抗体亲和力测定

1）标记NC08

依照偶联试剂盒（Amine Coupling Kit，购自GE公司）说明，将EDC和NHS按一定的比例加水分别溶解；CM5传感片（GE公司）插入检测仪Biacore 2000（GE公司）后，控制流速为5μl／分钟，用HBS缓冲液（10 mmol/l HEPES、150 mmol/l NaC1、3.4 mmol/l EDTA、0.005％Tween20，pH7.4）平衡体系，待基线稳定，开始标记NC08：(1)EDC和NHS各100μL混合均匀，注射50μl混合液使其流过待标记通道，活化传感片表面的羧基；(2)注射3.0mg/L NC08溶液(溶于10 mmol/l醋酸钠缓冲液，pH4.5)，将NC08通过氨基偶联标记于芯片表面，标记目标8000RU；(3)注射35μL乙醇胺的盐酸溶液封闭残余的活化羧基；(4)注射10μl甘氨酸缓冲液洗去非键合的吸附蛋白和乙醇胺。

2）单抗结合过程检测

用HBS缓冲液梯度稀释实施例3制备所得单抗（35.5μg/ml、17.75μg/ml、8.9μg/ml、4.45μg/ml、2.2μg/ml），12 000rpm离心10分钟，上机检测。上样30秒（流速30μl/ 分钟），HBS缓冲液平衡4分钟（流速30μl/分钟），10mmol/l甘氨酸缓冲液（pH2.0）再生30秒（流速30μl/分钟），HBS缓冲液平衡3分钟。

3）亲和常数计算

通过BIAeval 3.0软件，计算单抗与NC08的结合常数为4.7nmol/l。

实施例5 应用单抗检测NC08的桥联ELISA法

用包被液缓冲液（0.1 mol/L 碳酸盐，pH 9.6）稀释实施例3制备所得单抗至10μg/ml，4℃过夜包被酶标板，用封闭液（1%BSA-PBS）封闭，将含有不同浓度NC08的标准品（S1-S5）和含有NC08的血清样本（将特定量NC08样品加入人血清中制备所得样本X1-X3）及阴性对照品（Blank）加入孔板，37℃孵育90分钟。用PBS洗板3遍，用封闭液稀释实施例3制备所得单抗至10μg/ml。加入板孔中，37℃孵育1小时。洗板3遍，加入用封闭液稀释的人血清吸附处理的羊抗鼠IgG-HRP加入板孔中， 37℃孵育1小时。

用PBS-T洗板5遍，向板孔中加入TMB底物显色液，37℃显色30分钟。加终止液（2mol/l H₂SO₄） 50µl/孔，终止反应。终止后30分钟内读数，波长450/630nm。根据标准曲线(标准曲线见图4 )计算样品的NC08含量。含量测定结果实例见表1。

表1NC08桥联ELISA法测定数据实例

从上表数据可以看出使用该抗体能耐受人血清中存在的IgG的干扰，从人血清中特异地检测出低至2ng/ml的NC08，且准确度高。单抗对NC08表现出了良好的特异性和亲和力。

实施例7 应用单抗做为阳性对照的NC08免疫原性

用桥联ELISA法检测临床实验中注射NC08的人血清样品（样品1-4）中是否含有抗NC08的抗体。该法采用加入了不同浓度单抗（阳性对照品1-3）的人血清做为系列阳性对照品，采用健康人血清作为阴性对照品。

试验步骤

用包被液（0.1 mol/L 碳酸盐，pH 9.6）将NC08稀释至2μg/ml，100μl/孔，加入酶标板，4℃过夜包被。PBS-T洗板3次，用封闭液（3%脱脂奶粉-PBS）封闭，100μl/孔，加入酶标板，37℃孵育1小时。PBST洗板3次，拍向每孔中加入90μl PBS，分别加对应待测样品、阳性对照品和阴性对照品各10μl/孔， 37℃ 孵育2.5小时。

洗板3次，用封闭液稀释NC08-HRP 1：5000，混匀， 100μl/孔，加入酶标板，37℃ 孵育2小时。

洗板5次，加入TMB底物显色液显色，100μl/孔，加入酶标板，37℃显色 5分钟。2mol/l硫酸溶液终止反应，50μl/孔。酶标仪双波长450/630读数。用Cutoff值判断阴阳性。测定实例见表2。

表2 抗体做为阳性对照的NC08免疫原性检测数据

单抗在该方法中作为阳性对照，不仅有明显的响应信号，而且有良好的浓度-信号（平均OD值）的相关性，表现了良好的特异性。

从以上结果可以看出，本发明抗体具有特异性强、亲和力高的优点，作为检测抗体，可快速灵敏的检测出血清样品中的NC08浓度，也可用于检测人抗NC 08抗体。因此，本发明抗体可以用于制备检测NC08的试剂，同时可做为阳性对照检测人抗NC08抗体。

此外，市售的检测试剂盒通常是利用ELISA 双抗体夹心法原理，预先将抗体包被于试剂盒中，用于检测相应的抗原物质，这种方法更加简便、快速。因此，本发明抗体也可以成为检测试剂盒中的包被抗体，用于制备检测NC08浓度的试剂盒。

Claims (10)

1.一种重组抗NC08单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO:3所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO:4所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA分子。

5.一种真核宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于，它是CHO细胞。

7.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a) 构建含有权利要求2所述DNA分子的表达载体；

b) 用步骤a）所述的表达载体转化真核宿主细胞；

c) 培养步骤b）所得的真核宿主细胞；

d) 分离纯化获得所述单克隆抗体。

8.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测NC08浓度的试剂中的应用。

9.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测NC08浓度的试剂盒中的应用。

10.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测NC08免疫原性的试剂中的应用。