CN103255128A - 多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法。本发明提供利用多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤：1）用n种抗原蛋白混合作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；2）所述免疫后小鼠的离体脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；3）将融合细胞进行第一轮ELISA筛选，选取发生免疫阳性的杂交瘤细胞；4）将所述发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA筛选，选取针对单一抗原免疫阳性反应的杂交瘤细胞；本发明建立了一种通过一次细胞融合获得多种蛋白单克隆抗体的高通量技术方法，为单抗制备节省了时间和人力成本，并为提高单克隆抗体的生产效率做出了贡献。

Description

多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法。

背景技术

随着蛋白质组学研究的发展，数以千计的蛋白需要用亲和试剂如单克隆抗体进行进一步的功能验证，如蛋白的定性、定量分析、蛋白质的分离纯化、功能验证、蛋白质间的相互作用验证及蛋白翻译后修饰的识别等。

单克隆抗体技术是产生具有蛋白质识别功能的高度特异性抗体的基本方法，因此，单克隆抗体在蛋白质的研究中已经成为必不可少的工具。然而传统的单抗制备耗时长、效率低，许多文章报道了在提高单克隆抗体生产速度和通量方面所做的尝试。Ning等人采用组份化的血浆蛋白免疫小鼠，然后用免疫沉淀/质谱法鉴定相应的抗原。一些研究者采用蛋白混合物免疫小鼠然后用蛋白芯片和流式细胞术鉴定相应的抗原，另外也有一些不依赖于细胞融合的方法，如重组抗体及噬菌体展示制备抗体的报道。

不同的抗体适用于不同的检测方法（如免疫印迹法、免疫沉淀法，免疫组织化学法、免疫荧光法及流式细胞术等等），所以需要更多的抗体以适应不同的需求。为满足这种需要，建立高通量快速获得单克隆抗体的方法是十分必要的。

在之前的研究中曾用四种已知蛋白免疫小鼠并用ELISA法及蛋白芯片对单克隆抗体进行筛选，但是免疫和筛选的种类还是不够多。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法。

本发明的方法，包括如下步骤：

1）用n种目标蛋白的混合物作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；

n大于4且小于15；

所述n种目标蛋白的混合物为将n种目标蛋白混合，得到的混合物；

2）收集处死后的步骤1）所得免疫小鼠的离体脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；

3）对所述融合细胞进行第一轮ELISA检测，选取发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞；

所述第一轮ELISA检测中，将所述n种目标蛋白混合物包被作为抗原、一抗为所述融合细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；

4）将所述第一轮ELISA检测中发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA检测，选取针对单一抗原发生免疫阳性的杂交瘤细胞株，即为分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；

所述第二轮ELISA检测中，将n种目标蛋白均单独包被作为抗原、一抗为所述在第一轮ELISA检测中发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；

所述单一抗原为n种目标蛋白中任一种。

所述分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞为如下杂交瘤细胞中的一种或几种：分泌抗蛋白1的单克隆抗体的杂交瘤细胞、分泌抗蛋白2的单克隆抗体的杂交瘤细胞、……、分泌抗蛋白n的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

上述方法中，所述n种目标蛋白混合为等质量混合；

所述n种目标蛋白之间的同源性小于34%，所述n种目标蛋白之间的同源性为9-34%；

所述目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；若作为免疫抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；

若作为免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同。

上述方法中，步骤1）中，所述免疫包括如下步骤：

A、将所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠；

B、将所述免疫抗原加强免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠；

所述加强免疫的时间为首次免疫第10-20天，所述加强免疫的时间具体为首次免疫第11天，将首次免疫开始记作第1天；

步骤1）中，所述首次免疫的免疫抗原的量为每250ul免疫抗原中含有质量均为10μg的8种含有HIS标签的重组抗原蛋白；

所述加强免疫的免疫抗原的量为每250ul免疫抗原中含有质量均为10μg的8种含有HIS标签的重组抗原蛋白；

所述免疫抗原中的n种抗原蛋白等质量混合；

步骤2）中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0细胞骨髓瘤细胞；所述离体脾细胞与所述SP2/0骨髓瘤细胞的个数比为5-10:1，所述离体脾细胞与所述SP2/0骨髓瘤细胞的个数比具体为5:1；

所述收集所述免疫小鼠的离体脾细胞为加强免疫第3天，将加强免疫开始记作第1天；

所述步骤3）或步骤4）中，所述抗小鼠IgG的抗体均为HRP标记的羊抗鼠IgG。

上述方法中，在步骤1）和步骤2）之间，还包括如下步骤：用ELISA检测所述免疫小鼠的离体血清的抗体效价，选取针对n种目标蛋白均有特异性抗体的免疫小鼠；

所述ELISA检测中，将n种目标蛋白均单独包被作为抗原、一抗为所述免疫小鼠的离体血清、二抗为抗小鼠IgG的抗体。

上述方法中，所述免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同；

所述n为8；所述免疫抗原中的8种目标蛋白分别为含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9、含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2和含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN；

所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的8种目标蛋白分别为含有GST标签重组蛋白GST-TP53、含有GST标签重组蛋白GST-c-myc、含有GST标签重组蛋白GST-S100A8、含有GST标签重组蛋白GST-S100A9、含有GST标签重组蛋白GST-pCAF、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2和含有GST标签重组蛋白GST-PTEN。

上述方法中，所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53为由序列1所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc为由序列2所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8为由序列3所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9为由序列4所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF为由序列5所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1为由序列6所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2为由序列7所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN为由序列8所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-TP53为由序列9所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-c-myc为由序列10所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A8为由序列11所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A9为由序列12所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-pCAF为由序列13所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1为由序列14所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2为由序列15所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-PTEN为由序列16所示的核苷酸编码的蛋白。

上述方法中，所述n为8；8种不含标签的目标蛋白为蛋白TP53、蛋白c-myc、蛋白S100A8、蛋白S100A9、蛋白pCAF、蛋白PCT-1、蛋白PCT-2、蛋白PTEN；

所述蛋白TP53为由序列表中序列1自5’末端第502-1329位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白c-myc为由序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白S100A8为由序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白S100A9为由序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白pCAF为由序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白PCT-1为由序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白PCT-2为由序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白PTEN基因为由序列表中序列8自5’末端第496-1122位核苷酸编码的蛋白。

由上述方法制备的杂交瘤细胞也是本发明保护的范围。

由上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种用于免疫的蛋白组合物。本发明提供的用于免疫的蛋白组合物，为如下1)或2):

1）所示的蛋白组合物由8种不带标签的目标蛋白组成，所述8种不带标签的目标蛋白为所述蛋白TP53、所述蛋白c-myc、所述蛋白S100A8、所述蛋白S100A9、所述蛋白pCAF、所述蛋白PCT-1、所述蛋白PCT-2和所述蛋白PTEN；

2）所示的蛋白组合物由8种含标签A的目标蛋白组成，所述8种含标签A的目标蛋白为所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9、所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2和所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN。

本发明的实验证明，本发明选取在人类生理或病理过程中起重要作用，且相互之间具有较低相似性的8种蛋白质，将它们混合后免疫同一只小鼠，免疫10天并加强免疫3天后，通过细胞融合获得杂交瘤细胞，通过筛选，最终获得了分别针对8种蛋白在ELISA水平阳性的分泌单抗的杂交瘤细胞株，并且分别针对多种抗原的单抗在ELISA和免疫印迹检测中均呈现阳性。因此，本发明建立了一种通过一次细胞融合获得多种蛋白的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的高通量方法，为单抗制备节省了时间和人力成本，并为提高单克隆抗体的生产效率做出了贡献。

附图说明

图1为8种His标签重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果

图2为8种GST标签重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果

图3为两轮ELISA筛选后，针对不同抗原的阳性杂交瘤细胞株数

图4为在第二轮ELISA筛选中部分单特异性细胞株的ELISA结果

图5为两轮ELISA筛选后，部分单特异性细胞株在免疫印迹中进一步验证其特异性

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中免疫用蛋白和检测用蛋白的氨基酸及对应的基因的核苷酸序列如下：

序列1为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53的基因的核苷酸序列，其中，序列1自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列1自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列1自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列1自5’末端第502-1329位核苷酸为TP53基因；序列1所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53。

序列2为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc的基因的核苷酸序列，其中，序列2自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列2自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列2自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列2自5’末端第502-1392位核苷酸为c-myc基因；序列2所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc。

序列3为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8的基因的核苷酸序列，其中，序列3自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列3自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列3自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列3自5’末端第496-777位核苷酸为S100A8基因；序列3所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8。

序列4为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9的基因的核苷酸序列，其中，序列4自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列4自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列4自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列4自5’末端第496-843位核苷酸为S100A9基因；序列4所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9。

序列5为免疫用含有HIS标签的重组蛋白HIS–pCAF的基因的核苷酸序列，其中，序列5自5’末端第13-30位核苷酸为HIS标签，序列5自5’末端第109-699位核苷酸为pCAF基因；序列5所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF。

序列6为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1的基因的核苷酸序列，其中，序列6自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列6自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列6自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列6自5’末端第502-852位核苷酸为PCT-1基因；序列6所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1。

序列7为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2基因的核苷酸序列，其中，序列7自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列7自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列7自5’末端400-444位核苷酸为S标签，序列7自5’末端第502-774位核苷酸为PCT-2基因；序列7所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2。

注：PCT-1为PCT全长序列，PCT-2为PCT从5’端第52位核苷酸到3’末端。

序列8为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN的基因的核苷酸序列，其中，序列8自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列8自5’末端第1-327位核苷酸为Trx（硫氧环蛋白）标签，序列8自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列8自5’末端第496-1122位核苷酸为PTEN基因；序列8所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN。

序列9为检测用含有GST标签重组蛋白GST-TP53的基因的核苷酸序列，其中，序列9自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列9自5’末端第688-1515位核苷酸为TP53基因；序列表中序列9所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-TP53。

序列10为检测用含有GST标签重组蛋白GST-c-myc的基因的核苷酸序列，其中，序列10自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列10自5’末端第688-1578位核苷酸为c-myc基因；序列表中序列10所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-c-myc。

序列11为检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A8的基因的核苷酸序列，其中，序列11自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列11自5’末端第679-960位核苷酸为S100A8基因；序列表中序列11所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A8。

序列12为检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A9的基因的核苷酸序列，其中，序列12自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列12自5’末端第679-1026位核苷酸为S100A9基因；序列表中序列12所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A9。

序列13为检测用含有GST标签重组蛋白GST-pCAF的基因的核苷酸序列，其中，序列13自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列13自5’末端第688-1278位核苷酸为pCAF基因；序列表中序列13所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-pCAF。

序列14为检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1的基因的核苷酸序列，其中，序列14自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列14自5’末端第688-1038位核苷酸为PCT-1基因；序列表中序列14所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1。

序列15为检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2的基因的核苷酸序列，其中，序列15自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列15自5’末端第688-960位核苷酸为PCT-2基因；序列表中序列15所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2。

序列16为检测用含有GST标签重组蛋白GST-PTEN的基因的核苷酸序列，其中，序列16自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列16自5’末端第679-1305位核苷酸为PTEN基因；序列表中序列16所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-PTEN。

实施例1、多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞

一、多种免疫抗原和检测蛋白的获得

1、多种目标蛋白的选取

选取如下8种蛋白作为目标蛋白：肿瘤蛋白p53(TP53,NP_000537.3)、c-myc(NP_002458.2)、S100钙结合蛋白A8(S100A8,NP_002955.2)、S100钙结合蛋白A9(S100A9,NP_002956.1)、组蛋白乙酰化酶pCAF(NP_003875.3)、降钙素PCT-1(NP_001732.1)、降钙素截短体PCT-2（NP_001732.1上部分片段，PCT-2蛋白)、蛋白酪氨酸磷酸酶PTEN(PTEN,NP_000305.3)。

上述各种蛋白的编码基因的核苷酸序列如上文所示。

任何两个目标蛋白的氨基酸序列相似性列在表1，PCT-1和PCT2由于具有一段相同的氨基酸序列，而具有较高的同源性（64%），其它蛋白两两之间的氨基酸序列相似性均≤34%。

表1为8种目标蛋白中任何两个蛋白的氨基酸序列相似性

2、免疫抗原和检测蛋白的制备

1）免疫抗原的制备

8种免疫抗原分别为重组蛋白Trx-HIS–S-TP53（其编码基因的核苷酸序列为序列1）、重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc（其编码基因的核苷酸序列为序列2）、重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8（其编码基因的核苷酸序列为序列3）、重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9（其编码基因的核苷酸序列为序列4）、重组蛋白HIS-pCAF（其编码基因的核苷酸序列为序列5）、重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1（其编码基因的核苷酸序列为序列6）、重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2（其编码基因的核苷酸序列为序列7）、重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN（其编码基因的核苷酸序列为序列8）。

具体制备方法如下：

（1）重组载体的获得

8种重组载体分别为将上述8种目标蛋白的基因分别插入pET-32a(+)(Novagen，69015-3，载体本身含有Trx、His和S标签)和pET-28a(+)(Novagen，69864-3，载体本身仅含有His标签)载体的多克隆位点中，得到8种重组载体，具体插入位点如下：

PCT-1基因（序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸）、PCT-2基因（序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸）、TP53基因（序列表中序列1自5’末端第502-1329位核苷酸）、c-myc基因（序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸）均分别插入pET-32a(+)的EcoR I和Xho I位点间；

pCAF基因（序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸）插入pET-28a(+)(Novagen，69864-3，载体本身含有His标签)的EcoR I和Xho I位点间；

S100A8基因（序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸）、S100A9基因（序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸）、PTEN基因（序列表中序列8自5’末端第496-1122位核苷酸）均分别插入pET-32a(+)的BamH I和Xho I位点间。

且上述重组载体测序结果正确，说明各含有重组蛋白的编码基因。

（2）诱导表达及纯化免疫抗原

将上述8种重组载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞株中，得到8种重组菌，将上述8种重组菌分别在终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，分别得到8种重组菌培养物。离心重组菌培养物，收集菌体（沉淀），400w冰上超声破碎，工作5秒，间隔5秒共计20min，分别得到8种重组蛋白粗提物。

分别将上述8种重组蛋白粗提物通过镍柱NiSepharose^TM6Fast Flow(GE Healthcare，17-5318-06)进行亲和纯化，纯化步骤大致如下：用5倍柱床体积的蒸馏水冲洗填料，用至少5个柱床体积结合缓冲液（20mM磷酸钠，500mM NaCl,20-40mM咪唑，1%Triton X-100，pH7.4）平衡填料，加入样品，反复上样三次，再用5-10个柱体积的结合缓冲液冲洗填料，用洗脱缓冲液（20mM磷酸钠，500mM NaCl,分别用50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑阶梯洗脱，1%Triton X-100，pH7.4）洗脱结合的蛋白，各个咪唑浓度收集1ml流出液。

分别用SDS-PAGE检测洗脱液，结果如图1所示，显示8种带HIS标签的重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果，重组蛋白Trx-HIS–S-TP53为50.3KDa、重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc为52.1KDa、重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8为30.1KDa、重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9为32.6KDa、重组蛋白HIS-pCAF为27.1KDa、重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1为34.5KDa、重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2为29.1KDa、重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN为43.9KDa，说明8种带HIS标签的重组HIS标签的重组蛋均以正确的分子量表达（图中的大小为重组蛋白的大小），软件分析(Bio-rad)抗原纯度均大于90%。

因此收集纯化的8种带HIS标签的重组蛋白作为后期实验的免疫抗原。

2）检测蛋白的获得

由于免疫抗原带有His等多个标签，为了避免筛选到针对标签的抗体，将8种目标蛋白基因分别构建到另一载体pGEX-4T-1（带GST标签），使表达的蛋白带有GST标签，用于筛选针对目的蛋白的单克隆抗体。

8种检测蛋白分别为重组蛋白GST-TP53（其编码基因为序列表中序列9）、重组蛋白GST-c-myc（其编码基因为序列表中序列10）、重组蛋白GST-S100A8（其编码基因为序列表中序列11）、重组蛋白GST-S100A9（其编码基因为序列表中序列12）、重组蛋白GST-pCAF（其编码基因为序列表中序列13）、重组蛋白GST-PCT-1（其编码基因为序列表中序列14）、重组蛋白GST-PCT-2（其编码基因为序列表中序列15）、重组蛋白GST-PTEN（其编码基因为序列表中序列16）。

检测蛋白具体制备方法如下：

（1）重组载体的获得

8种重组载体为将上述8种目的蛋白基因分别插入pGEX-4T-1(GE,27-4580-01，含有GST标签)载体的多克隆位点中，得到8种重组载体，各基因插入的位点如下：

PCT-1基因（序列表中序列14自5’末端第688-1038位核苷酸）、PCT-2基因（序列表中序列15自5’末端第688-960位核苷酸）、TP53基因（序列表中序列9自5’末端第688-1515位核苷酸）、c-myc基因（序列表中序列10自5’末端第688-1578位核苷酸）、pCAF基因（序列表中序列13自5’末端第688-1278位核苷酸）均分别插入pGEX-4T-1的EcoR I和Xho I位点间；

S100A8基因（序列表中序列11自5’末端第679-960位核苷酸）、S100A9基因（序列表中序列12自5’末端第679-1026位核苷酸）、PTEN基因（序列表中序列16自5’末端第679-1305位核苷酸）均分别插入pGEX-4T-1(+)的BamH I和Xho I位点间。

且上述重组载体测序结果正确，说明各含有重组蛋白的编码基因。

（2）诱导表达和纯化

将上述8种重组载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞株中，得到8种重组菌，将上述8种重组菌分别在终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，分别得到8种重组菌培养物。离心重组菌培养物，收集菌体（沉淀），裂解液（50mM Tris-HCl pH8，0.2mM EDTA,100mM NaCl,1%Triton x-100，1mM DTT，100μg/ml PMSF，10mg/ml溶菌酶）重悬，400w超声破碎，工作5秒，间隔5秒共计20min，分别得到8种重组蛋白粗提物。

分别将上述8种重组蛋白粗提物通过4℃，12000rpm/min离心10分钟所得沉淀即为包涵体，将包涵体沉淀逐步重悬于含有适量脲（1M，2M，4M）的裂解液中洗涤，超声波处理5秒打碎沉淀，4°C高速搅拌悬液10min,4℃，12000rpm/min离心10分钟为洗涤纯化后的包涵体，最后用含8M脲的裂解液将包涵体溶解。

分别用SDS-PAGE检测洗脱液，结果如图2所示，8种带GST标签的重组蛋白均以正确的分子量表达：GST-TP53的分子量为57kDa、GST-c-myc的分子量为58.8kDa、GST-S100A8的分子量为36.8kDa、GST-S100A9的分子量为39.3kDa、GST-pCAF的分子量为48.2kDa、GST-PCT-1的分子量为41.5kDa、GST-PCT-2的分子量为36.1kDa、GST-PTEN的分子量为50.6kDa。

免疫抗原和检测蛋白也可以如下：采用不带任何标签的8种目标蛋白TP53、c-myc、S100A8、S100A9、pCAF、PCT-1、PCT-2、PTEN作为免疫抗原，而对应的检测蛋白可以为为不带任何标签的8种目标蛋白，也可以为带标签的目标蛋白。

二、免疫

1、免疫

首次免疫：将上述一的2的1）获得的8种免疫抗原（带HIS标签的重组蛋白）分别取10μg充分混匀，再用生理盐水稀释至250ul，得到免疫抗原；将250ul免疫抗原（其中抗原总量为80μg）与250ul弗氏完全佐剂（Sigma，F5881）乳化后背部皮下多点首次免疫Balb/c小鼠，将首次免疫日期记作第1天。

加强免疫：在初次免疫第11天进行加强免疫：将上述一的2的1）获得的8种免疫抗原（带HIS标签的重组蛋白）分别取10μg充分混匀，再用生理盐水稀释至250ul，得到混合抗原；将250ul混合抗原（其中抗原总量为80μg）与250ul弗氏不完全佐剂（Sigma，F5506）乳化后背部皮下多点免疫，将加强免疫开始记作第1天。

免疫的小鼠为3只。

2、小鼠血清抗体的效价检测

在上述1的加强免疫的第3天取小鼠尾血，用ELISA检测血清效价，具体如下：

将上述一的2的2）得到的8种检测抗原（重组蛋白GST-目标蛋白）用包被液（0.1M、pH值为9.6碳酸盐缓冲液（Na₂CO₃，1.59g；NaHCO₃，2.93g；NaN₃，0.2g溶于1L蒸馏水中）分别配置成浓度为1μg/ml，均作为抗原分别进行包板，以每孔100μl加入96孔ELISA板中，放置4°C过夜（12h），用含0.05%tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST配方：NaCl，50g；KCl，1.25g；KH₂PO₄，1.25g；Na₂HPO₄·12H₂O，200μL Tween-20溶于1L蒸馏水中）洗3次，并以5%的脱脂奶粉置37°C封闭1小时，再用PBST洗3次；将上述加强免疫后的小鼠血清稀释100倍后做3倍倍比稀释作为一抗，以每孔100μl加入抗原包被的96孔板中，37°C孵育1小时，再用PBST洗涤3次；再将HRP标记的羊抗鼠IgG(Jackson，115-035-164)按照使用说明稀释后加入到96孔板中，37°C孵育30分钟，最后用TMB（Sigma）显色液显色并用0.5M H₂SO₄终止反应。置酶标仪中，在450nm波长下读数。

结果如表2所示，

表2为加强免疫后收集小鼠血清抗体效价

抗原	抗体效价
		TP53	1:24300
c-myc	1:100
		S100A8	1:72900
S100A9	1:218700
		pCAF	1:2700
PCT-1	1:300
		PTEN	1:100
PCT-2	1:300

结果显示免疫后3只小鼠血清中均产生了针对8种免疫抗原的特异性抗体。其中一只结果如表2所示，收集此小鼠的脾细胞进行如下实验。

三、细胞融合

在上述二经过血清效价检测血清中均产生了针对8种免疫抗原的特异性抗体对应的小鼠在加强免疫第3天处死取脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞（:CRL-1581^TM）进行细胞融合，得到融合细胞。

具体如下：取1×10⁸个免疫鼠的脾细胞和2×10⁷个sp20细胞混合，1500rpm室温（25℃）离心5分钟，将离心上清液倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1分钟内加入1ml融合剂PEG-1450(Sigma,P7306)，并搅拌细胞，37℃水浴放置45秒,在1分钟内加入1ml1640培养基并搅拌细胞,2分钟内加入5ml1640培养基并搅拌细胞,2分钟内加入10ml1640培养基并搅拌细胞。500rpm离心7分钟，弃上清。轻轻将沉淀下来的细胞弹匀，缓缓加入HAT（Sigma，H0262）培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中,37℃,5%CO₂培养箱中培养，得到融合细胞。

四、分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的获得

将上述三得到的融合细胞利用ELISA进行两轮ELISA检测：

1、第一轮ELISA筛选：

将上述一的2的2）得到的8种检测蛋白（重组蛋白GST-目标蛋白）分别用包被液（0.1M、pH值为9.6碳酸盐缓冲液）稀释，分别配置成浓度均为1μg/ml，再等体积混合，得到混合蛋白作为抗原进行包板，以每孔100μl加入96孔ELISA板中，放置4°C过夜，用含0.05%tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗3次，并以5%的脱脂奶粉置37°C封闭1小时，再用PBST洗3次；将上述三得到的融合细胞上清液作为一抗，以每孔100μl加入抗原包被的96孔板中，37°C孵育1小时，再用PBST洗涤3次；再将HRP标记的羊抗鼠IgG(Jackson)按照使用说明稀释后加入到96孔板中，37°C孵育30分钟，最后用TMB（Sigma）显色液显色并用0.5M H₂SO₄终止反应。置酶标仪中，在450nm波长下读数。

结果如表3所示：融合细胞在第一次ELISA筛选中检测了2256个孔的细胞培养上清，其中129孔检测到阳性克隆（发生免疫阳性反应）。

表3为用8种GST标签蛋白混合包被进行第一轮抗体筛选结果

2、第二轮ELISA筛选：

将上述第一轮筛选的阳性克隆的细胞上清液进行第二轮ELISA筛选，筛选方法和上述第一轮的基本相同，不同的是:

(1)抗原为将上述一的2的2）得到的8种检测抗原（重组蛋白GST-目标蛋白）分别用包被液（0.1M、pH值为9.6碳酸盐缓冲液）稀释，分别配置成浓度为1μg/ml作为抗原，分别包板。

（2）一抗为第一轮筛选的阳性克隆上清液。

结果如图3和表4所示。

表4为第二轮筛选获得的阳性杂交瘤细胞株数及反应模式

上述结果看出，

对第一轮筛选中获得的128个阳性孔的细胞上清液进行了第二轮筛选，其中87孔出现不同反应模式的阳性反应(图3），原始结果见表4；

其中，31个孔的细胞上清液呈现单一抗原特异性免疫阳性(相应的抗原为：TP53,c-Myc,S100A8,S100A9,pCAF,PCT-1,PTEN和PCT-2)，这31个孔对应的细胞为分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，分泌针对抗原TP53的单克隆抗体的杂交瘤细胞为3株，分泌针对抗原c-Myc的单克隆抗体的杂交瘤细胞为1株，分泌针对抗原S100A8的单克隆抗体的杂交瘤细胞为4株，分泌针对抗原S100A9的单克隆抗体的杂交瘤细胞为7株，分泌针对抗原pCAF的单克隆抗体的杂交瘤细胞为10株，分泌针对抗原PCT-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞为4株，分泌针对抗原PTEN的单克隆抗体的杂交瘤细胞为1株，分泌针对抗原PCT-2的单克隆抗体的杂交瘤细胞为1株。

其余各孔结果如下：50个孔对两种蛋白呈现阳性反应，2个孔对三种蛋白呈现阳性反应，1孔对四种蛋白呈现阳性反应，1孔对五种蛋白呈现阳性反应，1孔对六种蛋白呈现阳性反应，1孔对七种蛋白呈现阳性反应，1孔对所有八种蛋白呈现阳性反应。

从上述结果可以看出，用8种抗原免疫后，可筛选出分别针对不同抗原的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

图4显示了部分呈单特异性反应的杂交瘤细胞上清液在第二轮ELISA检测中的结果，其中，克隆1-8分别为第二轮筛选中部分单特异性杂交瘤。由结果可以得出：克隆1对应的抗原为c-myc，克隆2对应的抗原为TP53，克隆3对应的抗原为S100A9，克隆4对应的抗原为pCAF，克隆5对应的抗原为S100A8，克隆6对PCT-1和PCT-2均呈现阳性反应，克隆7对应的抗原为PCT-1，克隆8对应的抗原为PTEN。

克隆6对PCT-1和PCT-2均呈现阳性反应，说明其针对的表位是二者共有的部分，而克隆7则仅对PCT-1呈特异性阳性反应。其它克隆均呈现单特异性反应（原始结果见表5）。

表5为部分呈单特异性反应的抗体在第二轮ELISA检测中的结果

从上述结果可以看出，本发明的方法在一次细胞融合可筛选出分别针对8种抗原的特异单克隆抗体。

重复免疫10只小鼠，每只小鼠均可制备出分别针对8种抗原的特异单克隆抗体。

五、特异性单克隆抗体的免疫印迹验证

将上述四筛选出的31个杂交瘤细胞株的上清液分别进行SDS-PAGE电泳并转印到PVDF膜上，加入两个无关蛋白Clu（Clusterin，genbank号NP_000305.3，泳道7）和MLH1（DNAmismatch repair protein Mlh1，genbank号NP_000240.1，泳道1）做对照；具体方法为：将膜在37°C进行孵育2小时，用PBST将膜洗三次，HRP标记的羊抗鼠IgG(Jackson)作为二抗与膜在37°C孵育1小时，然后用ECL(Pierce)免疫印迹试剂盒进行显色。其中一抗分别为第二轮筛选中呈现单特异性结果的杂交瘤细胞株培养上清液。

部分结果如图5所示，所有胶的上样顺序均为：泳道1:MLH1、泳道2:TP53、泳道3:c-Myc、泳道4:S100A8、泳道5:S100A9、泳道6:pCAF、泳道7:Clu、泳道8:PCT-1、泳道9:PTEN、泳道10:PCT-2；a为在第二轮ELISA筛选中针对抗原S100A9（泳道5）呈阳性的两株杂交瘤细胞的培养上清，b为在第二轮ELISA筛选中针对抗原S100A8（泳道4）呈阳性的三株杂交瘤细胞的培养上清，c为在第二轮ELISA筛选中针对抗原PCT-1（泳道8）和抗原PCT-2（泳道10）呈阳性的杂交瘤细胞培养上清，d为在第二轮ELISA筛选中针对抗原TP53（泳道2）呈阳性的两株杂交瘤细胞培养上清，e为在第二轮ELISA筛选中针对抗原pCAF（泳道6）呈阳性的四株杂交瘤细胞培养上清；从结果可以看出，从上述一至四的方法筛选出的分泌针对特异抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞只针对单一抗原产生反应，不和其它7种抗原有交叉反应；其中，图4c中的抗体表现出对PCT-1和-2均呈阳性反应，说明该抗体针对的表位是PCT-1和-2相同序列部位，如图4中的克隆6。TP53（图5d）和pCAF（图5e）在Western-blotting中呈现多条条带，在对蛋白的分析中发现这两种蛋白部分降解。

采用上述的方法检测筛选的31个孔中的其他孔的杂交瘤细胞上清（指31个孔中未在图5中列出结果的孔），结果也证明筛选出的杂交瘤细胞的上清液可以和其对应的特异抗原发生阳性反应，不和其它7种抗原有交叉反应。

上述结果证明，本发明的方法正确，可以在一次细胞融合实验中筛选出分别8种分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。

Claims (10)

1.一种利用多种抗原高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤：

1）用n种目标蛋白的混合物作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；

n大于4且小于15；

所述n种目标蛋白的混合物为将n种目标蛋白混合，得到的混合物；

2）收集处死后的步骤1）所得免疫小鼠的脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；

3）对所述融合细胞进行第一轮ELISA检测，选取发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞；

所述第一轮ELISA检测中，将所述n种目标蛋白混合物包被作为抗原、一抗为所述融合细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；

4）将所述发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA检测，选取针对单一抗原发生免疫阳性的杂交瘤细胞株，即为分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；

所述第二轮ELISA检测中，将n种目标蛋白单独包被作为抗原、一抗为所述发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；

所述单一抗原为n种目标蛋白中任一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述n种目标蛋白混合为等质量混合；

所述n种目标蛋白之间的同源性小于34%，所述n种目标蛋白之间的同源性为9-34%；

所述目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；

若作为免疫抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；

若作为免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述免疫包括如下步骤：

A、将所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠；

B、将所述免疫抗原加强免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠；

所述加强免疫的时间为首次免疫第10-20天，所述加强免疫的时间具体为首次免疫第11天，将首次免疫开始记作第1天；

步骤2）中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞；所述离体脾细胞与所述SP2/0骨髓瘤细胞的个数比为5-10:1，所述离体脾细胞与所述SP20骨髓瘤细胞的个数比具体为5:1；

所述收集所述免疫小鼠的离体脾细胞为加强免疫第3天，将加强免疫开始记作第1天；

所述步骤3）或步骤4）中，所述抗小鼠IgG的抗体均为HRP标记的羊抗鼠IgG。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

在步骤1）和步骤2）之间，还包括如下步骤：用ELISA检测所述免疫小鼠的离体血清的抗体效价，选取针对n种目标蛋白均有特异性抗体的免疫小鼠；

所述ELISA检测中，将n种目标蛋白单独包被作为抗原、一抗为所述免疫小鼠的离体血清、二抗为抗小鼠IgG的抗体。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同；

所述n为8；所述免疫抗原中的8种目标蛋白分别为含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9、含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2和含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN；

所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的8种目标蛋白分别为含有GST标签重组蛋白GST-TP53、含有GST标签重组蛋白GST-c-myc、含有GST标签重组蛋白GST-S100A8、含有GST标签重组蛋白GST-S100A9、含有GST标签重组蛋白GST-pCAF、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2和含有GST标签重组蛋白GST-PTEN。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53为由序列1所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc为由序列2所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8为由序列3所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9为由序列4所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF为由序列5所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1为由序列6所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2为由序列7所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN为由序列8所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-TP53为由序列9所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-c-myc为由序列10所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A8为由序列11所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A9为由序列12所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-pCAF为由序列13所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1为由序列14所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2为由序列15所示的核苷酸编码的蛋白；

所述含有GST标签重组蛋白GST-PTEN为由序列16所示的核苷酸编码的蛋白。

7.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述n为8；8种不含标签的目标蛋白为蛋白TP53、蛋白c-myc、蛋白S100A8、蛋白S100A9、蛋白pCAF、蛋白PCT-1、蛋白PCT-2、蛋白PTEN；

所述蛋白TP53为由序列表中序列1自5’末端第502-1329位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白c-myc为由序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白S100A8为由序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白S100A9为由序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白pCAF为由序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白PCT-1为由序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白PCT-2为由序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸编码的蛋白；

所述蛋白PTEN基因为由序列表中序列8自5’末端第496-1122位核苷酸编码的蛋白。

8.由权利要求1-7所述方法制备的杂交瘤细胞。

9.由权利要求8所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

10.一种用于免疫的蛋白组合物，为如下1)或2):

1）所示的蛋白组合物由8种不带标签的目标蛋白组成，所述8种不带标签的目标蛋白为所述蛋白TP53、所述蛋白c-myc、所述蛋白S100A8、所述蛋白S100A9、所述蛋白pCAF、所述蛋白PCT-1、所述蛋白PCT-2和所述蛋白PTEN；

2）所示的蛋白组合物由8种含标签A的目标蛋白组成，所述8种含标签A的目标蛋白为所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-TP53、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-c-myc、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A8、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-S100A9、所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-1、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PCT-2和所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS–S-PTEN。

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