CN106589121A - 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法 - Google Patents

一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106589121A
CN106589121A CN201611109849.8A CN201611109849A CN106589121A CN 106589121 A CN106589121 A CN 106589121A CN 201611109849 A CN201611109849 A CN 201611109849A CN 106589121 A CN106589121 A CN 106589121A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic bead
haptens
antigen
antibody
interspecific
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611109849.8A
Other languages
English (en)
Inventor
王芳
张东明
李丹丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei Italy And China Medical Inspection Institute Co Ltd
Original Assignee
Hebei Italy And China Medical Inspection Institute Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei Italy And China Medical Inspection Institute Co Ltd filed Critical Hebei Italy And China Medical Inspection Institute Co Ltd
Priority to CN201611109849.8A priority Critical patent/CN106589121A/zh
Publication of CN106589121A publication Critical patent/CN106589121A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，将活化的磁珠和小分子半抗原或种属间高度保守抗原按一定比例在反应体系下充分混合，进行偶联反应，通过免疫小鼠，获得单克隆抗体。本发明降低了种属间高度保守抗原抗体制备的成本，简化了小分子半抗原抗体制备的工艺，提供了一种广泛适用的抗原制备方法，使种属间高度保守的抗原及小分子量半抗原在小鼠体内产生较好的免疫反应，从而筛选出高亲和力、高特异性的抗体。

Description

一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法
技术领域
本发明涉及一种制备抗体的方法，具体涉及一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，属于生物工程技术领域。
技术背景
免疫分析是建立在抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应基础上的高效分析技术。继Yelow等人于1959年首次创立放射性免疫分析方法在痕量分析中取得重大突破，酶免疫分析法、荧光免疫分析法和化学发光免疫分析法等免疫学分析方法相继发展起来，并凭借其检测迅速、样品通量大、灵敏性高、特异性强、成本低廉等特点，在药物残留分析、分子标志物检测、疾病筛查、环境污染物检测等领域得到了广泛的应用。作为各种免疫分析的核心试剂，抗体在免疫分析的特异性、灵敏度等指标中起着决定性的作用。因此，制备高亲和力抗体是建立免疫分析方法的关键环节。许多分子标记物、药物、毒素的分子量小于1000Da，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，难以通过常规的动物免疫制备抗体。目前，制备小分子半抗原抗体的一般方法是：通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备特异性抗体。其中，涉及半抗原的设计，连接臂的引入及活性基团的选择等多个技术环节，工艺复杂。此外，有许多疾病筛查的关键分子在种属间的同源性较高，而对于同源性大于75%的蛋白，由于小鼠对自身蛋白的免疫耐受，一般需免疫相应的基因敲除鼠才能得到相应的抗体，而针对某一蛋白构建相应的基因敲除鼠工程复杂、成本高昂。因此，迫切需要一种广泛适用的抗原制备方法，使种属间高度保守的抗原及小分子量半抗原在小鼠中产生较好的免疫反应，从而筛选出高亲和力、高特异性的抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，其工艺简单、操作方便。
本发明的目的是这样实现的，一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法。
具体的，本发明的一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，包括以下步骤：
（1）抗原溶液制备
取适量抗原，即小分子半抗原或种属间高度保守抗原，用中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为0.1～3.0 mg/ml的抗原溶液，置于4℃保存；
（2）抗原与磁珠偶联
取适量抗原溶液与等体积磁珠在EP管中混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1～2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋15s，采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；
（3）封闭磁珠
加入浓度为0.15mol/L NaCl溶液于前述EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时，采用磁性分离架富集磁珠，弃上清；
（4）在前述EP管中加入适量流穿液重新悬浮磁珠，再加入等体积免疫佐剂，充分混合，得到磁珠偶联抗原与佐剂混合物；
（5）将前述得到的磁珠偶联抗原与佐剂混合物免疫动物；
（6）经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗体的杂交瘤细胞株；
（7）在小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的单克隆抗体。
本发明中所述的小分子半抗原是指分子量小于1000 Da且具有伯胺基团的化合物。
本发明中所述的种属间高度保守抗原是指与免疫动物自身蛋白具有75%以上氨基酸序列相同的异源蛋白。
本发明所述的磁珠是表面含有NHS基团的磁珠，与传统的氨基、羧基磁珠相比，表面含有NHS基团的磁珠无需事先采用EDC/NHS或戊二醛进行活化。
本发明将含有伯氨基的生物配体溶解在中性盐缓冲液中，室温下将化合物与NHS磁珠混合1～2小时，完成配体和磁珠的共价偶联，偶联过程条件温和，操作简单。
本发明使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离，不再依赖柱层析、离子层析，简化了传统偶联方法中分离纯化步骤。
本发明取得的有益效果如下：本发明降低了种属间高度保守抗原抗体制备的成本，简化了小分子半抗原抗体制备的工艺，提供了一种广泛适用的抗原制备方法，使种属间高度保守的抗原及小分子量半抗原通过免疫动物的方法，筛选并获得高亲和力、高特异性的抗体。
附图说明
图1是点杂交检测图，其中A是普通细胞培养上清与m6A结合的点；B是杂交瘤细胞培养上清与m6A结合的点。
图2是Western Blot检测图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，以下对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1 m6A抗体制备
m6A的分子量只有281Da，是典型的半抗原，在抗体制备过程中，直接给小鼠注射m6A分子溶液，不能引起小鼠机体的免疫反应，本实施例中通过与磁珠偶联提高m6A的免疫原性。
（1） m6A与磁珠偶联物的制备
取2.5 mg抗原m6A用0.5 ml中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为5.0 mg/ml的抗原溶液，与等体积磁珠混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1~2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋5s。采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。加入1 mL的0.15M NaCl溶液于EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时。采用磁性分离架富集磁珠，弃上清。在EP管中加入0.5 ml流穿液重新悬浮磁珠，并与等体积的免疫佐剂充分混合，置于4℃保存。
（2）免疫动物
本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，免疫佐剂为KX0210041，购自北京博奥龙免疫技术有限公司。
1）腿部肌肉注射免疫BABL/C小鼠（200ul/只）。
2）每隔一个月进行重复免疫，免疫三次。
（3）单克隆抗体的制备和纯化
将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。
具体方法如下：
1）将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。
2）ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此为单克隆。即通常认为的建株成功的细胞株。
3）将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2×106 /管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。
4）细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。
5）腹水完成后采用Protein G柱纯化腹水。
（4）单克隆抗体的点杂交检测
分别将m6A核苷溶液溶液点样于硝酸纤维素膜上，待溶液吸干，加封闭液于室温封闭至少1 h；PBST洗液洗膜5次，用所制备的单克隆抗体作为一抗，用普通小鼠血清作为阴性对照，4℃孵育过夜。孵育结束后用PBST洗液洗膜5次，抗体稀释液稀释HRP标记的抗小鼠二抗，孵育1 h，PBST洗液洗膜5次。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色，结果如图1所示。
结果表明该单克隆抗体能较为特异性地识别m6A。
实施例2 抗人UBE2C的单克隆抗体的制备
人UBE2C蛋白与小鼠UBE2C蛋白仅有8个氨基酸有差异，同源性大于95%，通过普通的小鼠免疫无法获得抗体，因此，采用磁珠偶联提高人UBE2C蛋白的免疫原性。
（1）人UBE2C蛋白与磁珠偶联物的制备
取0.5 mg人UBE2C蛋白用0.5 ml中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为1 mg/ml的抗原溶液，与等体积磁珠混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1~2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋15s。采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。加入1 mL的0.15M NaCl溶液于EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时。采用磁性分离架富集磁珠，弃上清。在EP管中加入0.5 ml流穿液重新悬浮磁珠，并与等体积的免疫佐剂充分混合，置于4℃保存。
（2）免疫动物
本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，免疫佐剂为KX0210041，购自北京博奥龙免疫技术有限公司。
1）腿部肌肉注射免疫BABL/C小鼠（200ul/只）。
2）每隔一个月进行重复免疫，免疫三次。
（3）单克隆抗体的制备和纯化
将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。
具体方法如下：
1）将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。
2）ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此为单克隆。即通常认为的建株成功的细胞株。
3）将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2×106 /管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。
4）细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。
5）腹水完成后采用Protein G柱纯化腹水。
（4）单克隆抗体的Western Blot检测
变性的人UBE2C蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；电泳结束后，进行湿法转膜。封闭液室温封闭2h；用单克隆抗体作为一抗，40C孵育过夜；PBST洗液洗膜3次，PBS洗液洗膜1次；加二抗1:5000稀释后室温孵育45min，孵育过程中轻微振荡；用PBST洗液洗膜3次，PBS洗液洗膜1次，用Odyssey红外成像系统扫描。结果见图2。结果表明该单克隆抗体能特异性的识别人UBE2C蛋白。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施案例的限制，上述实施案例和说明书中的相关注释说明了本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (3)

1.一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）抗原溶液制备
取适量种属间高度保守抗原或小分子半抗原，用中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为0.1～3.0 mg/ml的抗原溶液，置于4℃保存；
（2）抗原与磁珠偶联
取适量前述抗原溶液与等体积磁珠在EP管中混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1～2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋15s，采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；
（3）封闭磁珠
加入浓度为0.15mol/L NaCl溶液于前述EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时，采用磁性分离架富集磁珠，弃上清；
（4）在前述EP管中加入适量流穿液重新悬浮磁珠，再加入等体积免疫佐剂，充分混合，获得磁珠偶联抗原与佐剂的混合物；
（5）将前述获得的磁珠偶联抗原与佐剂混合物免疫动物；
（6）经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗体的杂交瘤细胞株；
（7）在小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁珠是表面含有NHS基团的磁珠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小分子半抗原是指分子量小于1000Da且具有伯胺基团的化合物，种属间高度保守抗原是指与被免疫动物自身蛋白具有75%以上氨基酸序列相同异源蛋白。
CN201611109849.8A 2016-12-06 2016-12-06 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法 Pending CN106589121A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611109849.8A CN106589121A (zh) 2016-12-06 2016-12-06 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611109849.8A CN106589121A (zh) 2016-12-06 2016-12-06 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106589121A true CN106589121A (zh) 2017-04-26

Family

ID=58596378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611109849.8A Pending CN106589121A (zh) 2016-12-06 2016-12-06 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106589121A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236045A (zh) * 2017-05-08 2017-10-10 中国人民解放军第二军医大学 一种抗m6A单克隆抗体的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829686A (zh) * 2015-05-04 2015-08-12 上海交通大学 一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法
CN105301253A (zh) * 2015-09-07 2016-02-03 北京勤邦生物技术有限公司 富集t-2毒素的免疫磁珠及其制备方法与应用
CN105319356A (zh) * 2015-12-16 2016-02-10 北京勤邦生物技术有限公司 一种用于黄曲霉毒素b1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
CN105837684A (zh) * 2016-05-06 2016-08-10 中国人民解放军第二军医大学 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829686A (zh) * 2015-05-04 2015-08-12 上海交通大学 一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法
CN105301253A (zh) * 2015-09-07 2016-02-03 北京勤邦生物技术有限公司 富集t-2毒素的免疫磁珠及其制备方法与应用
CN105319356A (zh) * 2015-12-16 2016-02-10 北京勤邦生物技术有限公司 一种用于黄曲霉毒素b1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用
CN105837684A (zh) * 2016-05-06 2016-08-10 中国人民解放军第二军医大学 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236045A (zh) * 2017-05-08 2017-10-10 中国人民解放军第二军医大学 一种抗m6A单克隆抗体的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106591240B (zh) 杂交瘤细胞株4f4及其抗体
JPS5859994A (ja) 組換えモノクローナル抗体
CN106701688A (zh) 杂交瘤细胞株7g11及其抗体
CN104357401B (zh) 可分泌抗ii型登革病毒ns1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用
CN113637081B (zh) 一株分泌抗二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN104312978B (zh) 一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用
CN112877296A (zh) 一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株ad及其制备方法与应用
CN105838681A (zh) 一株抗地塞米松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株c3及其应用
CN114058594A (zh) 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN112094352B (zh) 一种抗IgM单克隆抗体
CN103255128A (zh) 多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法
CN106589121A (zh) 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法
CN101620231A (zh) 一种检测去甲氯胺酮的elisa测试盒及制备方法
CN111763658A (zh) 一株分泌抗二硝托胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN104004718B (zh) 一株抗吡利霉素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN110408599A (zh) 一株分泌抗重金属铅离子单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN105907725B (zh) 一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh7及其应用
CN104789535B (zh) 抗美沙酮代谢物eddp杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
CN110669736A (zh) 一株安乃近单克隆抗体杂交瘤细胞株cbd及其应用
CN106929477B (zh) 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2及其应用
CN110616194A (zh) 一株乌头碱单克隆抗体细胞株sj及其应用
CN104711230B (zh) 杂交瘤细胞dbp-4e10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体
CN110408598A (zh) 一株分泌抗重金属铅离子单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN110407932A (zh) 一种铅离子人工抗原及其应用
CN109422791A (zh) 一种氢化可的松半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170426