CN104829686A - 一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法 - Google Patents

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王贵荣
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Abstract

一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法，是将小分子物质与多肽分子耦连，然后免疫动物制备完全抗体。小分子物质作为半抗原结合到大分子载体上以后，可以形成新的表位，半抗原在表位中是关键性的基团。最后利用免疫反应将细胞内该小分子物质及与之相互结合的蛋白模型作为一个复合体沉淀下来，并从中筛选目标蛋白。本发明的方法具有目的明确，周期短，针对性强等优点。

Description

一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术，特别涉及一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法。
技术背景
通过免疫共沉淀分离蛋白是一种常规的分子生物学实验手段，是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质相互作用的经典方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用模型被整体保留了下来。这种方法得到的目的蛋白符合体内实际情况，结果可信度高。所以常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
传统的免疫共沉淀操作主要用于研究蛋白与蛋白的相互作用。然而，对于催化酶与底物、转运蛋白与被转运化学物质等小分子分化合物与相关蛋白的对应关系及相互作用，目前主要通过体外催化、基因遗传转化等途径进行验证。传统的实验方法具有盲目性大，周期长，针对性差等缺点。
发明内容
本发明的目的，就是为了克服上述现有技术存在的缺点，提供一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一，将小分子物质与多肽片段相耦连，制备半抗原载体系统；
步骤二，将步骤一得到的半抗原载体系统免疫动物，提取、分离单克隆抗体；
步骤三，将步骤二得到的抗体固定到磁珠上；
步骤四，在非变性条件下裂解生物细胞，并加入防止蛋白降解的缓冲液，得到含有目标蛋白与小分子物质的溶液；
步骤五，将步骤三得到的磁珠加入到步骤四得到的溶液中进行反应；
步骤六，离心收集磁珠、以及磁珠上的“小分子物质-蛋白”复合体，并进行质谱分析鉴定。
步骤一所述多肽片段长度为10-20个氨基酸。
步骤四所述防止蛋白降解的缓冲液包含EDTA 0.5-1.0mol/L，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐1.5-2.0mol/L，抑肽酶1.0-2.0mol/L，E-64蛋白酶抑制剂0.5-1.0mol/L，pH值为7.0-8.5。
本发明将小分子物质与多肽分子耦连，然后免疫动物制备完全抗体。小分子物质作为半抗原结合到大分子载体上以后，可以改变载体原有的表位，也可以形成新的表位，半抗原在表位中是关键性的基团。最后利用免疫反应将细胞内该小分子物质及与之相互结合的蛋白模型作为一个复合体沉淀下来，并从中筛选目标蛋白。具有目的明确，周期短，针对性强等优点。
具体实施方法
下面通过一个具体实施例对本发明作进一步说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例 从青蒿中分离与青蒿素相关的转运蛋白。
步骤如下：
1、将青蒿素与包含10个氨基酸的多肽片段通过生物素相连，制备半抗原载体系统；
2、将得到的半抗原载体系统免疫小白鼠，提取、分离单克隆抗体；
3、将抗体固定到磁珠上；
4、用液氮速冻生物体细胞后研磨成粉，并加入到缓冲液中，得到含有目标蛋白与小分子物质的溶液；
5、把步骤3得到的磁珠加入到步骤4得到的溶液中进行反应；
6、离心收集磁珠，以及磁珠上的“小分子物质-蛋白”复合体，并进行质谱分析鉴定。
上述缓冲液包含EDTA 0.5-1.0mol/L，AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐)1.5-2.0mol/L，Aprotinin(抑肽酶)1.0-2.0mol/L，E-64(蛋白酶抑制剂)0.5-1.0mol/L，pH值为7.0-8.5。
质谱分析鉴定结果表明，本实施例成功找到了一个与青蒿素相关的转运蛋白，这个转运蛋白对应的基因长度为40010bp，属于PDR家族，其具体特征正在研究中。

Claims (3)

1.一种通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将小分子物质与多肽片段相耦连，制备半抗原载体系统；
步骤二，将步骤一得到的半抗原载体系统免疫动物，提取、分离单克隆抗体；
步骤三，将步骤二得到的抗体固定到磁珠上；
步骤四，在非变性条件下裂解生物细胞，并加入防止蛋白降解的缓冲液，得到含有目标蛋白与小分子物质的溶液；
步骤五，将步骤三得到的磁珠加入到步骤四得到的溶液中进行反应；
步骤六，离心收集磁珠、以及磁珠上的“小分子物质-蛋白”复合体，并进行质谱分析鉴定。
2.根据权利要求1所述的通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法，其特征在于：步骤一所述多肽片段长度为10-20个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的通过小分子化合物免疫共沉淀分离目标蛋白的方法，其特征在于：步骤四所述防止蛋白降解的缓冲液包含EDTA0.5-1.0mol/L，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐1.5-2.0mol/L，抑肽酶1.0-2.0mol/L，E-64蛋白酶抑制剂0.5-1.0mol/L，pH值为7.0-8.5。
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