CN104311650A - 一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原、抗体及其制备方法和应用，将磺胺间二甲氧嘧啶小分子与EDC-HCl混合，加入无水N,N-二甲基甲酰胺DMF使其全部溶解，为A液，取载体蛋白溶于PBS中，为B液；将A液缓慢滴加到B液中，在室温下搅拌反应；反应产物在PBS缓冲溶液中透析，得到纯化的磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原。本发明将磺胺间二甲氧嘧啶与非动物源的载体大豆11S球蛋白酸性亚基成功连接形成新型抗原，并顺利生产出单克隆抗体。大豆11S球蛋白酸性亚基有稳定的结构，可在有机溶剂条件下同磺胺间二甲氧嘧啶等小分子半抗原连接，并与免疫动物保持较远的亲缘关系，因此可作为新型的免疫载体，以尝试取代牛血清白蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶联免疫分析方法检测使用的抗原抗体，尤其涉及的是一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
目前，农兽药残留已给我国食品的安全供应带来严重的危害，药物残留涉及的药物种类越来越多，磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)也是其中之一。磺胺间二甲氧嘧啶是一种人造抗生素，作为饲料添加剂广泛添加到动物饲料中。目前农兽药残留物的检测多通过酶联免疫分析的方法，通过特异的抗体抗原反应，来检测外来抗原的存在。磺胺间二甲氧嘧啶是小分子化合物，必须同载体蛋白结合形成全抗原，从而诱导抗体的产生。目前，在ELISA中，比较常用的载体是动物源的载体，但是存在一定的免疫缺陷。制备出的抗体的亲和力较差，可迅速被肾脏系统消除；与免疫动物的亲缘关系较近，会一定程度上增加阳性克隆筛选的难度和工作量；此载体蛋白质存在着很大的安全隐患，可能携带病毒。因而，探索并使用新型的非动物源性的免疫载体将逐渐成为未来的发展趋势。这种载体应该同免疫动物的亲缘关系较远，且具有比较稳定的结构和较强的水溶性，在有机溶剂存在的状态下能和半抗原进行交联，制备抗体的亲和力良好，检测灵敏度较高。
11S球蛋白分子量为302000-375000,它是由6个酸性亚基(A1、A2、A3、A4、A5、A6)和6个碱性亚基(B1 B2 B3 B4 B5 B6)构成的两个环状六角形结构,酸性和碱性亚基交互对应，通过二硫键连接，形成比较稳定的结构形式。酸性亚基A1、A2、A3的等电点为pH5.15、pH5.40、pH4.75，碱性亚基B1、B2、B3的等电点为pH8.0、pH8.25、pH8.5。酸性亚基是大豆蛋白中主要起抗原作用的亚基，因此可以尝试在免疫反应中用作载体。大豆11S球蛋白酸性亚基溶解度较高，同免疫动物的亲缘关系较远，制备抗体的亲和力良好，检测灵敏度较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原，分子结构式为：
所述载体蛋白protein为大豆11S球蛋白酸性亚基，所述载体蛋白为大豆11S球蛋白酸性亚基。
一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.05mmol的磺胺间二甲氧嘧啶小分子与26.26mg的EDC-HCl混合，加入无水N,N-二甲基甲酰胺DMF使其全部溶解，为A液，取5mg的载体蛋白溶于0.02M，pH＝7.4的PBS中，为B液；
(2)将A液缓慢滴加到B液中，在室温下搅拌反应4～6h，然后4℃冰箱过夜；
(3)反应产物在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中透析3天，得到纯化的磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原，测定其浓度，分装，-20℃保存。
所述载体蛋白大豆11S球蛋白酸性亚基的制备方法如下：
(1)以1:10的比例将大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl缓冲液，加β巯基乙醇之后调节混合溶液的整体浓度至0.015mol.L-1，调pH为8.0，在90℃条件下水浴30min；
(2)收集除去碱性亚基的上清液，调pH至5.0，4℃、6500r·min-1条件下离心20min分离沉淀，调pH至中性，冷冻干燥后即得大豆11S球蛋白酸性亚基。
一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原用于制备磺胺间二甲氧嘧啶抗体。
一种磺胺间二甲氧嘧啶抗体，使用所述磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原作为免疫抗原免疫巴比氏小鼠得到单克隆细胞株，分离纯化后得到磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体。
单克隆抗体在检测磺胺类化合物中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明利用碳二亚胺法将磺胺间二甲氧嘧啶与非动物源的载体大豆11S球蛋白酸性亚基成功连接形成新型抗原，并顺利生产出单克隆抗体。大豆11S球蛋白酸性亚基有稳定的结构，可在有机溶剂条件下同磺胺间二甲氧嘧啶等小分子半抗原连接，并与免疫动物保持较远的亲缘关系，因此可作为新型的免疫载体，以尝试取代牛血清白蛋白。
附图说明
图1是磺胺间二甲氧嘧啶新型抗原紫外扫描图；
图2是蛋白载体的荧光激发峰和发射峰；
图3是磺胺间二甲氧嘧啶新型抗原的荧光光谱；
图4是磺胺间二甲氧嘧啶新型抗原的共振散射光谱。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本实施例包括以下步骤：
1、人工抗原的制备
(1)将0.05mmol的磺胺间二甲氧嘧啶小分子与26.26mg的EDC-HCl混合，加入无水N,N-二甲基甲酰胺DMF使其全部溶解，为A液，取5mg的载体蛋白溶于0.02M，pH＝7.4的PBS中，为B液；
(2)将A液缓慢滴加到B液中，在室温下搅拌反应4～6h，然后4℃冰箱过夜；
(3)反应产物在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中透析3天，得到纯化的磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原，测定其浓度，分装，-20℃保存。
2、大豆11S球蛋白酸性亚基的制备
(1)以1:10的比例将大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl缓冲液，加β巯基乙醇之后调节混合溶液的整体浓度至0.015mol.L-1，调pH为8.0，在90℃条件下水浴30min；
(2)收集除去碱性亚基的上清液，调pH至5.0，4℃、6500r·min-1条件下离心20min分离沉淀，调pH至中性，冷冻干燥后即得大豆11S球蛋白酸性亚基。
3、计算磺胺间二甲氧嘧啶同载体的偶联比例：
其中：x、y分别为偶联物和载体蛋白在280nm处的吸光值；z为蛋白浓度mol/Lε280nm为SDM的摩尔消光系数为898.6789L·mol-1·cm-1。
4、人工抗原的鉴定
(1)紫外扫描鉴定
将磺胺间二甲氧嘧啶、相应的人工抗原及蛋白载体用pH7.4的0.02mol/LPBS配成2g/L溶液，在波长190～400nm范围内，分别对磺胺间二甲氧嘧啶、人工抗原及载体进行紫外波长扫描。记录各波段波长扫描吸光度(A)，绘制曲线观测结果，如图1所示。
由图1可以看出，磺胺间二甲氧嘧啶偶联物抗原的紫外吸收光谱明显不同于磺胺间二甲氧嘧啶和蛋白载体，其紫外吸收峰的强度高于蛋白载体，低于磺胺间二甲氧嘧啶，而且峰的位置也在SDM的基础上发生了偏移，介于SDM和载体之间。根据紫外光谱的加合性，这表明SDM与载体已成功交联。此交联的关键在于，采用碳二亚胺偶联方法将SDM与蛋白载体相互交联，而不是通过其他方法。
(2)荧光光谱和共振散射光谱法表征
在波长190～400nm范围内,对蛋白载体进行荧光光谱扫描，绘制曲线观测结果，如图2所示。由图2可以看出，酸性亚基的荧光激发峰在320nm附近，以320nm激发时，其特征荧光峰出现在465nm左右。
以320nm为激发波长，在波长190～400nm范围内,对磺胺间二甲氧嘧啶抗原进行荧光光谱扫描，绘制曲线观测结果，如图3所示。随着偶联比的增加,在实验范围内酸性亚基的荧光逐步被猝灭，且有红移的趋势。这说明磺胺间二甲氧嘧啶与酸性亚基发生了相互作用，且这种作用可能引起酸性亚基中荧光发色团的微环境及蛋白质分子构象行为的变化。因为酸性亚基含有能发射内源荧光的苯丙氨酸，随着SDM的增加，分子的高级结构逐渐被破坏，苯丙氨酸残基不断被暴露，所以最大发射波长会发生渐进式红移变化。
在波长190～400nm范围内,对磺胺间二甲氧嘧啶抗原进行共振散射光谱扫描，绘制曲线观测结果，如图4所示。随着偶联比的增加,酸性亚基的共振光散射强度依次降低。这可能是新形成的磺胺间二甲氧嘧啶-酸性亚基复合物破坏了白蛋白表面的保护水层,使原来较为分散的蛋白质更加分散，即所谓的解聚作用,引起蛋白质粒径减小，从而导致其共振光散射强度逐步下降。
5、磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备
(1)免疫原蛋白含量为5mg/ml，免疫剂量为60微克/只小鼠，首次免疫为完全佐剂，之后为不完全佐剂，抗原与佐剂体积为1:1，每次免疫间隔为2周，共免疫5～6次；
(2)免疫3～4次后，尾部或眼眶取血，制备血清，采用间接ELISA点阵法测试效价和抗体亲和力，选择效价高，抑制好的小鼠进行细胞融合。
(3)根据免疫测定的情况进行细胞融合和阳性杂交瘤的筛选，最后进行保种及腹水制备。
6、磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体的鉴定和表征
(1)标准抑制曲线的拟合方程和半数抑制浓度(IC50)的测定
对磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体分离纯化后，如表1所示。
表1 标准抑制曲线的拟合方程和半数抑制浓度(IC50)
| 抑制对象 | 半数抑制浓度 | 标准抑制曲线方程 | R2 |
| SDM-BSA | 7.9432 | y＝-0.1137x+0.8399 | 0.9716 |
| SDM-酸性亚基 | 6.0241 | y＝-0.1233x+0.8194 | 0.9725 |
由表可见，SDM对SDM-大豆11S球蛋白酸性亚基抗体的IC50值小于SDM对SDM-BSA抗体的IC50值。SDM-大豆11S球蛋白酸性亚基抗体的特异性较好，灵敏度较高。(2)交叉反应率测定
分别将磺胺二甲基嘧啶，氨苯磺胺，磺胺嘧啶，吡嗪磺，磺胺甲氧吡嗪，磺胺喹噁啉配成浓度为1mg/mL的储备液，然后取少量稀释至不同浓度：1ng/ml～4ug/ml，每个浓度下取三个标准样，体积为50μL，分别加入50μL的1:200稀释的多抗血清，混合加入到包被封闭好的酶标板孔内，ELISA法测定450nm下的吸光值。通过计算得出交叉反应率，公式如下：
式中，B0为无SDM抑制时的吸光值，B为有SDM抑制时的吸光值。
根据实验结果计算可得，SDM与蛋白载体的偶联比分别为14∶1。大豆11S球蛋白酸性亚基在空间上了形成相对紧密、稳定的活性功能，可以同SDM偶联的羧基数较多，所以同SDM的偶联性较好，偶联比较高。
SDM-大豆11S球蛋白酸性亚基单克隆抗体、SDM-BSA单克隆抗体与其他磺胺类药物(氨苯磺胺、磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪钠、磺胺甲氧嗪、磺胺喹噁啉)的交叉反应率如表2所示。
表2 SDM多抗对其他磺胺类物质的交叉反应
由表2可见，SDM-大豆11S球蛋白酸性亚基单克隆抗体与其他磺胺类药物的交叉反应率低于0.01％，说明与其他磺胺类药物的的交叉反应性较好。因此，SDM-大豆11S球蛋白酸性亚基具有较好的免疫原性可刺激机体产生效价较高的抗体，而且SDM-大豆11S球蛋白酸性亚基抗体的特异性及交叉反应率较好，可以用于磺胺间二甲氧嘧啶的残留检测。
Claims (6)
1.一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原，其特征在于，分子结构式为：
所述载体蛋白protein为大豆11S球蛋白酸性亚基。
2.如权利要求1所述的一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将0.05mmol的磺胺间二甲氧嘧啶小分子与26.26mg的EDC-HCl混合，加入无水N,N-二甲基甲酰胺DMF使其全部溶解，为A液，取5mg的载体蛋白溶于0.02M，pH＝7.4的PBS中，为B液；
(2)将A液缓慢滴加到B液中，在室温下搅拌反应4～6h，然后4℃冰箱过夜；
(3)反应产物在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中透析3天，得到纯化的磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原，测定其浓度，分装，-20℃保存。
3.根据权利要求2所述的一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白大豆11S球蛋白酸性亚基的制备方法如下：
(1)以1:10的比例将大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl缓冲液，加β巯基乙醇之后调节混合溶液的整体浓度至0.015mol.L-1，调pH为8.0，在90℃条件下水浴30min；
(2)收集除去碱性亚基的上清液，调pH至5.0，4℃、6500r·min-1条件下离心20min分离沉淀，调pH至中性，冷冻干燥后即得大豆11S球蛋白酸性亚基。
4.如权利要求1所述的一种磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原用于制备磺胺间二甲氧嘧啶抗体。
5.根据权利要求4所述的一种磺胺间二甲氧嘧啶抗体，其特征在于，使用所述磺胺间二甲氧嘧啶人工抗原作为免疫抗原免疫巴比氏小鼠得到单克隆细胞株，分离纯化后得到磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体在检测磺胺类化合物中的应用。
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| CN108752464A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-06 | 新疆农业大学 | 一种磺胺二甲氧嘧啶人工抗原合成的方法 |
| CN113720812A (zh) * | 2020-05-26 | 2021-11-30 | 重庆福莱鲨生物技术有限公司 | 一种测定蛋白溶解度的方法 |
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