CN104479007A - 桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，采用水溶性1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，之后与蛋白载体进行偶联，最后经透析纯化得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。本发明方法反应条件温和，能够生产出灵敏度高、特异性强、稳定性好的抗桔青霉毒素单克隆抗体；制备过程简便可行，耗时短，容易规模化生产和推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种桔青霉毒素-—蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法。
背景技术
红曲，泛指红曲菌在米饭或淀粉基质上生长发酵的产品。红曲作为传统的特色发酵食品，在我国具有悠久的历史，主要产地在福建、台湾等地，被广泛应用于食品发酵剂、食用色素、食品防腐剂以及食品增香剂的生产。1995年，法国教授Blanc证实红曲中存在桔青霉毒素，一石惊起千层浪，红曲的安全性问题也引起了全世界的关注。
众所周知，真菌毒素作为产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是一类能够导致人畜毒害的天然有毒化合物。而桔青霉毒素作为其中的一员，是由青霉属和曲霉属等某些真菌菌株产生的，尽管它具有良好的抑菌性，能抑制芽孢杆菌、结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌，还能抗某些真菌和原生动物，对革兰氏阴性菌抑制较弱。但它具有很强的肾脏毒性，以及致畸致癌致突变等作用，鉴于这些特性，近年来桔青霉毒素污染引发的各类毒害问题，越来越多的吸引了人们的注意。欧洲各国出于食品安全的考虑，将桔青霉毒素列为必检毒素之一。因此，对可能污染桔青霉毒素的产品进行检测显得非常必要。
目前，桔青霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和免疫化学方法。其中，TLC方法具有操作简单，不需要复杂精密的仪器设备的优点，但灵敏度较低，准确度不高；而HPLC对桔青霉毒素的检测也有报道，但其前处理繁琐、仪器设备昂贵、需要严格的操作环境以及专业的操作人员等限制了该方法在临床检测中的推广和应用；免疫化学方法主要是酶联免疫检测法，由于它具有较高的灵敏度和特异性、对样品的纯度要求不高、特别适合于大批量样本的检测，便于推广使用。因此，这一方法近年来被广泛应用于各种真菌毒素的检测。
抗原和抗体是酶联免疫检测方法的核心部分，若要提高检测方法的灵敏度和特异性，关键是获得具有高度特异性和亲和力的抗体。桔青霉毒素分子量是250.3Da，属于小分子化合物（分子量≤1000Da），不具有免疫原性，只具有反应原性。只有将桔青霉毒素与蛋白载体相互偶联，制成人工完全抗原才能刺激机体引起免疫反应产生相应的抗体。
桔青霉毒素分子结构简单，含有三个活性基团，分别是C1的活泼氢、C7的羧基以及C8的羟基。目前报道的桔青霉毒素人工偶联抗原的制备方法主要有活性酯法、甲醛加成法、羰基二咪唑法和双交联化学合成法，但其过程均较为繁琐，耗时长，个别制备方法免疫获得的抗体灵敏度低、特异性差，甚至无法获得相应抗体。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种桔青霉毒素-—蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法。它能够生产出灵敏度高、特异性强的抗桔青霉毒素单克隆抗体；制备过程简便可行，耗时短，容易规模化生产和推广应用。
本发明采用水溶性1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联试剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，之后与蛋白载体进行偶联，最后经透析纯化得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。
具体的制备方法包括以下步骤：
1. 桔青霉毒素的活化预处理以及与偶联试剂相互反应：将1 mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液（0.1 mol/L MES，0.5 mol/L NaCl，pH6.0）中进行活化预处理，加入偶联试剂（0.4 mg EDC和0.6 mg NHS），摇匀后，室温避光进行偶联反应15min；
2. 过量EDC的处理：向活化缓冲液中加入1.4 μL β—巯基乙醇，中和剩余的过量EDC；
3. 蛋白载体的预处理：按照桔青霉毒素与蛋白载体初始摩尔比为10:1—50:1称取适量蛋白载体，溶解于1 mL偶联缓冲液（磷酸盐缓冲液，100 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，pH7.2）中；
4. 桔青霉毒素与蛋白载体偶联反应：调整活化缓冲液的pH至7.0以上，之后与偶联缓冲液混合，摇匀后，室温避光反应2 h即可；
5. 透析纯化：待反应结束后将反应液取出，以0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液为透析液，4 ℃透析48 h，每间隔12 h更换1次透析液，之后收集透析袋内溶液，进行紫外全波长扫描，计算偶联比，并将偶联产物冷冻干燥后-20 ℃保存，得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。
偶联缓冲液即为磷酸盐缓冲液。所用蛋白载体可选用牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、多聚赖氨酸等生物蛋白质。
本发明中，以BSA为蛋白载体为例，桔青霉毒素和载体蛋白质偶联制备得到桔青霉毒素人工偶联抗原的合成路线如下。
本发明的有益效果在于：(1) 本交联反应条件温和，即使在冷却条件下，也能于中性pH中进行；(2) 本发明的整个制备过程简便可行，无需特别的仪器设备，大大缩短了制备人工抗原的时间，几个小时即可完成偶联反应，易推广应用；(3) 本发明制备合成的桔青霉毒素人工偶联抗原具有较好的稳定性。
附图说明
图1是桔青霉毒素紫外—可见光谱连续扫描图谱曲线图谱。
图2是桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原的紫外—可见光谱连续扫描图谱。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1：桔青霉毒素-BSA人工偶联抗原的制备与鉴定
1. 将1 mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液（0.1 mol/L MES，0.5 mol/L NaCl，pH6.0）中，加入偶联试剂0.4 mg EDC和0.6 mg NHS，摇匀后，室温避光反应15 min；向活化缓冲液中加入1.4 μL β-巯基乙醇，中和剩余的过量EDC；称取6-26 mg蛋白载体BSA，溶解于1 mL偶联缓冲液（磷酸盐缓冲液，100 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，pH7.2）中；调整活化缓冲液的pH至7.0以上，之后与偶联缓冲液混合，摇匀室温避光反应2 h；待反应结束后将反应液取出，以0.01 M pH7.4的磷酸盐缓冲液为透析液，4 ℃透析48 h，每间隔12 h更换1次透析
液，之后收集透析袋内溶液，冷冻干燥后-20 ℃保存，得到桔青霉毒素-BSA人工偶联抗原。
2. 通过紫外-可见光谱扫描图谱鉴定桔青霉毒素见图1；通过紫外-可见光谱扫描图谱鉴定桔青霉毒素-BSA人工偶联抗原见图2，从图2中可以看出人工偶联抗原的紫外图谱同时出现了两个特征吸收峰，一个在280 nm附近，一个在350 nm附近，其中280 nm附近的吸收峰与BSA的特征吸收峰相一致，350 nm附近的吸收峰与桔青霉毒素的吸收峰相比，存在一定的位移，由其吸光度值及消光系数可以算出桔青霉毒素-蛋白载体BSA其偶联比为6：1。实验结果表明，桔青霉毒素与载体蛋白BSA偶联成功。
实施例2：桔青霉毒素-OVA人工偶联抗原的制备与鉴定
1. 将1 mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液（0.1 mol/L MES，0.5 mol/L NaCl，pH6.0）中，加入偶联试剂0.4 mg EDC和0.6 mg NHS，摇匀后，室温避光反应15 min；向活化缓冲液中加入1.4 μL β-巯基乙醇，中和剩余的过量EDC；称取4-18 mg蛋白载体OVA，溶解于1 mL偶联缓冲液（磷酸盐缓冲液，100 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，pH7.2）中；调整活化缓冲液的pH至7.0以上，之后与偶联缓冲液混合，摇匀室温避光反应2 h；待反应结束后将反应液取出，以0.01 M pH7.4的磷酸盐缓冲液为透析液，4 ℃透析48 h，每间隔12 h更换1次透析液，之后收集透析袋内溶液，冷冻干燥后-20 ℃保存，得到桔青霉毒素-OVA人工偶联抗原，进行紫外全波长扫描，计算其偶联比。
实施例3：抗桔青霉毒素-BSA人工偶联抗原多克隆抗体的制备与鉴定
1. 动物试验：用0.01M PBS将制备的桔青霉毒素-BSA人工完全抗原配成1.267mg/mL的溶液，第一次免疫用0.45 mL的桔青霉毒素-BSA人工完全抗原与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，每只6-8周龄的雌性Balb/C小鼠皮下注射0.18 mL，相当于100 微克蛋白。每隔3周加强免疫1次，加强免疫时用0.32 mL的桔青霉毒素-BSA人工完全抗原与等体积的不完全弗氏佐剂混合，充分乳化后每只Balb/C小鼠皮下注射0.12 mL，相当于80微克蛋白。每次加强免疫后第10-12 天从小鼠尾部取血，制备抗血清。
2. 间接ELISA 检测抗体效价试验：为避免ELISA检测出现假阳性结果，利用本发明方法制备的桔青霉毒素-OVA人工完全抗原作为检测抗原进行抗血清效价检测；以pH 9.6 的碳酸盐缓冲液将检测抗原桔青霉毒素-OVA稀释成5 μg/mL，酶标板每孔加入100 μL，4℃过夜，倾去包被液，用PBST洗涤液每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入100 μL 5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h，倾去封闭液，每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；从100倍开始倍比稀释抗血清，每孔加入100 μL，并平行设置对照孔，以阴性血清为阴性对照，以PBST作空白对照，37℃孵育1 h，洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入100 μL 1：10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃孵育1 h，每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加100 μL OPD显色液，37℃避光反应10-15 min，每孔加入50 μL 2M硫酸溶液终止反应，测492 nm吸光值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价；测定结果如表1。
表1 抗血清效价测定结果不仅证明了利用本发明方法可以制备抗桔青霉毒素-BSA人工完全抗原的多克隆抗体，而且经间接ELISA检测可以得到效价在1：50000倍以上的多克隆抗体，为筛选抗桔青霉毒素单克隆抗体提供了支持。
实施例4：抗桔青霉毒素-BSA人工偶联抗原多克隆抗体的特异性试验
1. 间接竞争ELISA阻断试验：以pH 9.6 的碳酸盐缓冲液将包被抗原桔青霉毒素-OVA稀释成5 μg/mL，酶标板每孔加入100 μL，4℃过夜，倾去包被液，用PBST洗涤液每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入100 μL 5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h，倾去封闭液，每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔各加入50 μL的1：3200倍稀释的抗血清与50 μL的不同稀释倍数的桔青霉毒素标准品，并平行设置对照孔，以阴性血清为阴性对照，以PBST作空白对照，37℃孵育1 h，洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入100 μL 1：10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃孵育1 h，每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加100 μL OPD显色液，37℃避光反应10-15 min，每孔加入50 μL 2M硫酸溶液终止反应，测492 nm吸光值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照；若随着桔青霉毒素标准品浓度的增加而吸光值下降，则证明抗血清中抗体能够与桔青霉毒素标准品发生结合反应；间接竞争ELISA 试验结果如表2。
表2竞争ELISA阻断实验结果表明，随着CIT浓度的增加，吸光值也随着下降，说明小鼠经免疫后产生了针对桔青霉毒素的特异性抗体。
2. 抗体交叉反应鉴定试验：以pH 9.6 的碳酸盐缓冲液将包被抗原桔青霉毒素-OVA稀释成5 μg/mL，酶标板每孔加入100 μL，4℃过夜，倾去包被液，用PBST洗涤液每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入100 μL 5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h，倾去封闭液，每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入抗血清与不同小分子物质的混合溶液，具体配制方法为：按1：3200倍稀释的抗血清50 μL，再分别加入桔青霉毒素CIT、黄曲霉素AFB1、玉米赤霉烯酮毒素ZEN、展青霉毒素PAT、赭曲霉毒素OTA和伏马毒素FB1溶液，每孔50 μL，浓度均为10 μg/mL，混合溶液总体积即为100 μL，将混合溶液分别加入至各孔中，37℃孵育1 h；并平行设置对照孔，以阴性血清为阴性对照，以PBST作空白对照，37℃孵育1 h，洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加入100μL 1：10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗，37℃孵育1 h，每孔洗涤5次，每次3 min，拍干；每孔加100 μL OPD显色液，37℃避光反应10-15 min，每孔加入50 μL 2M硫酸溶液终止反应，测492 nm吸光值。抗体交叉反应鉴定试验结果如下表3。
表3抗体交叉反应鉴定试验结果表明，本发明获得的抗桔青霉毒素-BSA人工完全抗原多克隆抗体对黄曲霉毒素等小分子抗原几乎不存在交叉反应，说明本发明方法获得了针对桔青霉毒素的特异性抗体。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）桔青霉毒素的活化预处理：将1 mg桔青霉毒素溶解于1 mL的活化缓冲液中，加入偶联试剂，摇匀后，室温避光进行偶联反应15min；
（2）过量1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺的处理：向活化缓冲液中加入1.4 μL β—巯基乙醇，中和剩余的过量1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺；
（3）蛋白载体的预处理：按照桔青霉毒素与蛋白载体初始摩尔比为10:1—50:1称取蛋白载体，溶解于1 mL偶联缓冲液中；
（4）桔青霉毒素与蛋白载体偶联反应：调整活化缓冲液的pH至7.0以上，之后与偶联缓冲液混合，摇匀后，室温避光反应2h；
（5）透析纯化：待反应结束后将反应液取出，以0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液为透析液，4 ℃透析48 h，每间隔12 h更换1次透析液，之后收集透析袋内溶液，进行紫外全波长扫描，计算偶联比，并将偶联产物冷冻干燥后-20 ℃保存，得到桔青霉毒素—蛋白载体人工偶联抗原。
2.根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，其特征在于，所述的活化缓冲液为0.1 mol/L 2-（N-吗啉）乙磺酸-水合物，0.5 mol/L NaCl，pH6.0。
3.根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，其特征在于，偶联试剂为0.4 mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺和0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺。
4.根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，其特征在于，步骤（3）所用蛋白载体选用牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、多聚赖氨酸。
5.根据权利要求1所述的一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，其特征在于，偶联缓冲液即为磷酸盐缓冲液，为100 mM 磷酸钠和150 mM NaCl，pH7.2。
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