CN113063940A - 一种同时检测多种抗原抗体的方法及其载体制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测多种抗原抗体的方法及其载体制备，将所述待反应样品分别加入抗原载体和抗体载体所在的反应腔内样品反应；对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行初次清洗；将酶标试剂注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行酶标反应；对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行二次清洗；将发光底物注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔；在避光条件下采用CCD获取发光信号。载体制备包括对抗原、抗体和载体进行前处理，将前处理载体置于前处理溶液稀释后制成的包被缓冲液中，得到包被载体；将包被载体清洗封闭，得到抗原载体和抗体载体。本发明通过将抗原和抗体制备成抗原载体和抗体载体，然后结合检测芯片，可以同时实现多种指标的检测。

Description

一种同时检测多种抗原抗体的方法及其载体制备
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，并且更具体地，涉及到一种同时检测多种抗原抗体的方法及其载体制备。
背景技术
弓形虫病又称弓形体病，是由刚地弓形虫所引起的人畜共患病，猫和猫科动物在传染此病时最为重要。孕妇感染弓形虫后，可通过胎盘垂直传播给胎儿，损害胚胎发育，引起胎儿严重的精神系统发育畸形和智力障碍，降低人口素质，甚至引起死亡。TOX-IgM抗体早于TOX-IgG抗体出现，在急性期过后，TOX-IgM抗体较快下降，而TOX-IgG抗体可能长时间存在。故测定TOX-IgM抗体适用于早期诊断，TOX-IgG抗体阳性说明曾经感染过弓形虫，多为慢性感染。
风疹病毒属于被膜病毒科风疹病毒属，包含一单股、正链RNA，及三种结构蛋白E1、E2和C，其中糖蛋白E1、E2以异二聚体形式位于包膜上，蛋白C与RNA组成核衣壳。风疹患者是风疹的传染源。人是风疹病毒的唯一宿主，风疹病毒主要通过呼吸道飞沫传播。孕妇感染后，可通过胎盘感染胎儿。临床上以发热、耳后枕部和颈后的淋巴结病变和斑丘疹为主要表现，大量患者表现为隐性感染。妊娠早期(前3月)感染的孕妇易引起死胎、流产或造成胎儿畸形等先天性风疹综合征。风疹IgG抗体(RUB-IgG)通常出现在皮疹出现的时间，在出疹后会仍然存在。
巨细胞病毒(Cytomegalo Virus，CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，具有典型的疱疹病毒形态。分布广泛，人对其有广泛的易感性，传播途径多种多样，属于性传播性疾病。其感染主要为无症状的亚临床感染，CMV感染可引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。孕妇感染了巨细胞病毒后，病毒可通过胎盘感染胎儿，造成胎儿先天性感染，流产和死胎。CMV-IgG在病毒感染后4～6周出现，并持续终生。
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的病毒性病原体，可引起如龈口炎、角膜结膜炎、脑炎以及生殖系统感染和新生儿的感染。人类是人HSV的唯一宿主，HSV可存在于病人、恢复者或健康带毒者的水疱疱液、唾液及粪便中，在体内经血液或神经通路播散，感染后HSV以某种形式潜伏于局部感染神经节细胞中。病毒分为两个血清型即I型和II型。其中HSV-I型感染复发率低，发作时间间隔长。患者感染HSV后，针对HSV的抗体在1周左右出现，3-4周达到高峰，并可持续多年，治疗后，抗体水平会相应地下降。HSV II主要通过性生活传播，感染生殖器及腰以下部位，其典型临床表现为外生殖器皮肤黏膜的红斑、丘疹等。孕妇一旦发生感染，可引起胎儿流产、先天性畸形或发育障碍，新生儿致死或永久性的神经系统受损。HSV II-IgG在病毒感染后4～6周出现，且通常持续终生。
目前上述疾病检主要检测方法有：酶联免疫法、胶体金法、化学发光法。其中化学发光法具有更高的灵敏度和特异性，检测的准确率高于酶联免疫法、胶体金法，是采用得最多的一种检测方法。现有的试剂盒多为单项检测试剂盒，每个芯片中只内置一种带抗原的微球，而孕前检测时5项疾病均需要检测，检测时间会很长，无法及时给出检测结果，现有的检测装置无法满足同时检测的需求。
基于此，现有技术仍然有待改进。
发明内容
本发明针对上述问题，目的在于提供一种同时检测多种抗原抗体的方法及其载体制备，以解决现有技术无法同时实现多种抗原抗体检测的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明的实例公开了一种抗原抗体载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一 对抗原、抗体进行前处理，得到前处理溶液，对载体进行前处理，得到前处理载体；
步骤二 将前处理溶液稀释后作为包被缓冲液，将前处理载体置于包被缓冲液中进行包被，得到包被载体；
步骤三 将包被载体清洗后进行封闭处理并烘干，得到抗原载体和抗体载体。
进一步地，所述载体为玻片、微球或硝酸纤维素膜。
进一步地，对抗原、抗体进行前处理包括：
将抗原或抗体放入透析袋并置于前处理缓冲液中在2-8℃下保持10-48小时；
其中，所述前处理缓冲液为0.02mmol/L PH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液、0.05mmol/LPH7.0-10.0碳酸盐缓冲液或0.05-0.1mmol/L PH7.0-9.0Tris盐缓冲液。
进一步地，将前处理溶液稀释后作为包被缓冲液包括：将抗原或抗体的前处理处理溶液采用1x磷酸盐缓冲液和/或1x碳酸盐缓冲液稀释至溶液中抗原或抗体含量为0.1-10ug/ml。
进一步地，所述包被包括：
在温度为35-40℃条件下处理1-4小时，然后再温度为2-8℃下处理8-30小时。
进一步地，采用1-3mm的微球作为载体时，每个微球所使用的包被液约为0.1-2.5mL。
进一步地，所述将包被载体清洗为使用pH6.5-7.5之间的磷酸盐缓冲液清洗3-5次。
进一步地，所述封闭处理包括使用含蛋白的保护液进行封闭，封闭条件为30-40℃温度处理1-4小时。
进一步地，所述含蛋白的保护液为含0.1-1％BSA的PBS缓冲液。
进一步地，所述抗原包括：弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原；
所述抗体为抗人IgMμ链抗体。
另一方面，本发明实施例还公开了一种抗原载体或抗体载体，其采用上述的制备方法制得。
第三方面，本发明实施例还公开了一种同时检测多种抗原抗体的方法，其包括，
将上述的抗原载体和抗体载体分别置于对应的反应腔内；
将待测样品处理后加入至样稀储存腔内并混匀，得到待反应样品；
将所述待反应样品分别加入抗原载体和抗体载体所在的反应腔内样品反应；
样品反应完成后，对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行初次清洗；
初次清洗完成后，将酶标试剂注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行酶标反应；
酶标反应完成后，对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行二次清洗；
二次清洗完成后，将发光底物注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔；
发光底物注入完成后，在避光条件下采用CCD获取发光信号，从而得到检测结果；
其中，所述酶标试剂为标记了HRP的抗原和抗体。
上述方法可用于同时检测优生优育五项IgM和IgG两种抗体10项指标。
本发明的有益效果是：
本发明通过将抗原和抗体制备成抗原载体和抗体载体，然后结合检测芯片，可以同时实现多种指标的检测，通过分区控制和特有的抗原抗体包被设计实现多项指标检测，通过采用同步反应过程，达到简化已有10项指标检测耗时的目的，极短时间(30分钟)内实现10项指标可同时出结果。
附图说明
图1为本发明一实施例的检测芯片的结构示意图；
图2为本发明一实施例的检测芯片的爆炸图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明实施例进一步详细说明。
需要说明的是，本发明实施例中所有使用“第一”和“第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“第一”“第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。
本发明一实施例公开了一种同时检测多种抗原抗体的方法，其包括，将多种抗原载体和抗体载体分别置于检测芯片上对应的反应腔内；
将待测样品处理后加入至样稀储存腔内并混匀，得到待反应样品；
将所述待反应样品分别加入抗原载体和抗体载体所在的反应腔内样品反应；
样品反应完成后，对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行初次清洗；
初次清洗完成后，将酶标试剂注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行酶标反应；
酶标反应完成后，对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行二次清洗；
二次清洗完成后，将发光底物注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔；
发光底物注入完成后，在避光条件下采用CCD获取发光信号，从而得到检测结果；
其中，所述酶标试剂为标记了HRP的抗原和抗体。
如图1，图2所示，一些实施例中，在用于优生优育五项IgM和IgG两种抗体10项指标检测时，该检测芯片可包含液体分配腔和连通所述液体分配腔5的样稀储存腔1，酶标试剂储存腔2，洗液储存腔3，发光底物储存腔4，弓形虫IgM反应腔6，风疹IgM反应腔7，巨细胞IgM反应腔8，单纯疱疹Ⅰ型IgM反应腔9，单纯疱疹Ⅱ型IgM反应腔10，弓形虫IgG反应腔11，风疹IgG反应腔12，巨细胞IgG反应腔13，单纯疱疹Ⅰ型IgG反应腔14，单纯疱疹Ⅱ型IgG反应腔15；其中，样稀储存腔1上设置有用于加入处理后的待测样品的进样口；所述弓形虫IgM反应腔6，风疹IgM反应腔7，巨细胞IgM反应腔8，单纯疱疹Ⅰ型IgM反应腔9，单纯疱疹Ⅱ型IgM反应腔10，弓形虫IgG反应腔11，风疹IgG反应腔12，巨细胞IgG反应腔13，单纯疱疹Ⅰ型IgG反应腔14，单纯疱疹Ⅱ型IgG反应腔15内分别安置有弓形虫IgM载体，风疹IgM载体，巨细胞IgM载体，单纯疱疹Ⅰ型IgM载体，单纯疱疹Ⅱ型IgM载体，弓形虫IgG载体，风疹IgG载体，巨细胞IgG载体，单纯疱疹Ⅰ型IgG载体，单纯疱疹Ⅱ型IgG载体。
在一些实施例中，可在每个反应腔内各放置一个微球载体，微球载体的大小约为1-3mm。检测芯片的材料可以为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺。
上述实施例中的抗原载体和抗体载体，为将抗原、抗体负载于载体上制成，所述载体为玻片、微球或硝酸纤维素膜。
一些实施例中，上述抗原载体和抗体载体的制备方法可包括如下步骤：
步骤一 对抗原、抗体进行前处理，得到前处理溶液，对载体进行前处理，得到前处理载体；
其中，对抗原、抗体进行前处理包括：
将抗原或抗体放入透析袋并置于前处理缓冲液中在2-8℃下保持10-48小时；
所述前处理缓冲液为0.02mmol/L PH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液、0.05mmol/LPH7.0-10.0碳酸盐缓冲液或0.05-0.1mmol/L PH7.0-9.0Tris盐缓冲液。
步骤二 将前处理溶液稀释后作为包被缓冲液，将前处理载体置于包被缓冲液中进行包被，得到包被载体；
其中，将前处理溶液稀释后作为包被缓冲液包括：将抗原或抗体的前处理处理溶液采用1x磷酸盐缓冲液和/或1x碳酸盐缓冲液稀释至溶液中抗原或抗体含量为0.1-10ug/ml。所述包被包括：在温度为35-40℃条件下处理1-4小时，然后再温度为2-8℃下处理8-30小时。
步骤三 将包被载体清洗后进行封闭处理并烘干，得到抗原载体和抗体载体；
其中，所述将包被载体清洗为使用pH6.5-7.5之间的磷酸盐缓冲液清洗3-5次。所述封闭处理包括使用含蛋白的保护液进行封闭，封闭条件为30-40℃温度处理1-4小时。所述含蛋白的保护液为含0.1-1％BSA的PBS缓冲液。
所述抗原可包括：弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原；
所述抗体为抗人IgMμ链抗体。
实施例1前处理溶液的制备
磷酸盐缓冲液前处理：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型5种抗原和抗人IgMμ链抗体。将弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型5种抗原和抗人IgM抗体放入透析袋在0.02mmol/L PH7.0-8.0磷酸盐缓冲液中置于2-8℃10-48小时。
实施例2前处理溶液的制备
碳酸盐缓冲液前处理：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型5种抗原和抗人IgMμ链抗体。将弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型5种抗原和抗人IgM抗体放入透析袋在0.05mmol/L PH7.0-10.0碳酸盐缓冲液中置于2-8℃10-48小时。
实施例3前处理溶液的制备
Tis盐缓冲液前处理：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型5种抗原和抗人IgMμ链抗体。将弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型5种抗原和抗人IgM抗体放入透析袋在0.05-0.1mmol/L PH7.0-9.0Tris盐缓冲液中置于2-8℃下10-48小时。
实施例4前处理载体的制备
载体前处理(以微球为例)，将微球放入含0.01-1％吐温20的磷酸盐缓冲液中，2-8℃浸泡10-30小时。
实施例5抗原微球制备
1、使用TOX-Ag、RUB-Ag、CMV-Ag、HSV1-Ag、HSV2-Ag(来源于国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)的5个项目的原料在聚氯乙烯材质的微球载体上进行包被。
2、包被缓冲液量：50个微球载体需加入包被液5ml-125ml之间，其中包被液为向前处理溶液中加入1x磷酸盐缓冲液和1x碳酸盐缓冲液中直至抗原含量为0.1-10ug/ml。
3、5种原料的包被液可使用pH8.0-pH10.0之间的碳酸盐缓冲液进行包被，包被温度35-40℃，包被时间在1-4小时；再置于2-8℃，放置8-30小时。
4、包被结束后使用Ph6.5-7.5之间的磷酸盐缓冲液清洗3-5次。
5、清洗后使用含蛋白的保护液进行封闭，封闭条件30-40℃温度下，放置1-4小时。封闭结束后反应板中封闭液取出进行烘干，其中含蛋白的保护液为含0.1-1％BSA的PBS缓冲液。
实施例6 IgM抗体(捕获)微球制备
1.使用抗人IgMμ链抗体(来源于国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)在聚氯乙烯材质的微球载体上进行包被。
2、包被缓冲液量：50个微球载体需加入包被液5ml-125ml之间，其中包被液为向前处理溶液中加入1x磷酸盐缓冲液直至抗体含量为0.1-10ug/ml。
3、包被液使用，pH8.0-pH10.0之间的磷酸盐缓冲液进行包被，包被温度35-40℃，包被时间在1-4小时。再置于2-8℃，放置8-30小时。
4、包被结束后使用Ph6.5-7.5之间的磷酸盐缓冲液清洗3-5次。
5、清洗后使用含蛋白的保护液进行封闭，封闭条件30-40℃温度下，放置1-4小时。封闭结束后反应板中封闭液取出进行烘干，其中含蛋白的保护液为含0.1-1％BSA的PBS缓冲液。
实施例7载体固定
1.固定方式包括：热键合固定、胶粘合固定和非限制性装载框固定。
2.热键合固定：图1所示芯片上制作1-3mm直径的十个半圆形凹槽，将载体微球放入芯片凹槽内，高温加热到100—1000℃后退火，使载体微球固定于芯片。
3.胶粘合固定：图1所示芯片上制作1-3mm直径的十个半圆形凹槽，凹槽中加入1-20ul乙晴后放入载体芯片，放置5-60分钟，使载体微球固定于芯片。
4.非限制性载框固定：图1所示芯片上制作3-5mm直径圆形装载框，直接放入微球。
5.已包被弓形虫、风疹、巨细胞、单纯疱疹1型、单纯疱疹2型抗原的载体微球分别放入弓形虫-IgG反应腔、风疹-IgG反应腔、巨细胞-IgG反应腔、单纯疱疹1型-IgG反应腔、单纯疱疹2型-IgG反应腔，抗人IgM抗体分别放入对应的反应腔。芯片面板键合通过热键合或胶粘合后完成固定。
实施例8芯片的使用
1、将待测样本进行10倍稀释后加入1000-1500μL到芯片样稀储备腔中，通过流体控制使样稀(样品稀释液)与样品充分混匀并分配至十个反应腔。
2、将芯片在35-40℃环境中孵育15分钟。
3、用芯片中洗液存储腔中的洗液清洗10个反应腔5-10次。
4、芯片反应腔清洗后，将酶标试剂存储腔内的酶标试剂注入10个反应腔。
5、将芯片放入35-40℃环境中孵育15分钟。
6、用芯片中洗液存储腔中的洗液清洗10个反应腔5-10次。
7、芯片中底物存储腔内发光底物A(含0.01g/L-10g/L鲁米诺盐溶液)和发光底物B(含0.01g/L-10g/L过氧化氢溶液)混合物通过流体控制注入10个反应腔。
8、在避光条件见下使用CCD获取发光信号。
9、酶标试剂：标记了HRP的抗人IgG、弓形虫抗原、风疹抗原、巨细胞抗原、单纯疱疹1型病毒抗原和单纯疱疹2型病毒抗原，保存于含保护蛋白的缓冲液中，含防腐剂；
10、样品稀释液：磷酸盐缓冲液，具体为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L；
11、洗液：Ph6.5-7.5之间的磷酸盐缓冲液。
实施例9芯片的液体驱动
芯片通过检测仪器的液体驱动控制从废液腔入口流入废液腔16(如图2所示)。
综上所述，本发明实施例所公开的同时检测多种抗原抗体的方法，抗原抗体载体及其制备方法，通过分区控制和特有的抗原抗体包被设计实现多项指标检测。通过采用同步反应过程，达到简化已有10项指标检测耗时的目的，可在极短时间(30分钟)内实现10项指标可同时出结果。
需要特别指出的是，上述各个实施例中的各个组件或步骤均可以相互交叉、替换、增加、删减，因此，这些合理的排列组合变换形成的组合也应当属于本发明的保护范围，并且不应将本发明的保护范围局限在所述实施例之上。
以上是本发明公开的示例性实施例，上述本发明实施例公开的顺序仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。但是应当注意，以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明实施例公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子，在不背离权利要求限定的范围的前提下，可以进行多种改变和修改。根据这里描述的公开实施例的方法权利要求的功能、步骤和/或动作不需以任何特定顺序执行。此外，尽管本发明实施例公开的元素可以以个体形式描述或要求，但除非明确限制为单数，也可以理解为多个。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明实施例公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明实施例的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明实施例的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种抗原抗体载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一 对抗原、抗体进行前处理，得到前处理溶液，对载体进行前处理，得到前处理载体；
步骤二 将前处理溶液稀释后作为包被缓冲液，将前处理载体置于包被缓冲液中进行包被，得到包被载体；
步骤三 将包被载体清洗后进行封闭处理并烘干，得到抗原载体和抗体载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对抗原、抗体进行前处理包括：
将抗原或抗体放入透析袋并置于前处理缓冲液中在2-8℃下保持10-48小时；
其中，所述前处理缓冲液为0.02mmol/L PH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液、0.05mmol/LPH7.0-10.0碳酸盐缓冲液或0.05-0.1mmol/L PH7.0-9.0Tris盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将前处理溶液稀释后作为包被缓冲液包括：将抗原或抗体的前处理处理溶液采用1x磷酸盐缓冲液和/或1x碳酸盐缓冲液稀释至溶液中抗原或抗体含量为0.1-10ug/ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述包被包括：
在温度为35-40℃条件下处理1-4小时，然后再温度为2-8℃下处理8-30小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将包被载体清洗为使用pH6.5-7.5之间的磷酸盐缓冲液清洗3-5次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述封闭处理包括使用含蛋白的保护液进行封闭，封闭条件为30-40℃温度处理1-4小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含蛋白的保护液为含0.1-1％BSA的PBS缓冲液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原包括：弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原；
所述抗体为抗人IgMμ链抗体。
9.一种抗原载体或抗体载体，其特征在于，采用权利要求1-8任意一项所述的制备方法制得。
10.一种同时检测多种抗原抗体的方法，其特征在于，
将权利要求9所述的抗原载体和抗体载体分别置于对应的反应腔内；
将待测样品处理后加入至样稀储存腔内并混匀，得到待反应样品；
将所述待反应样品分别加入抗原载体和抗体载体所在的反应腔内样品反应；
样品反应完成后，对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行初次清洗；
初次清洗完成后，将酶标试剂注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行酶标反应；
酶标反应完成后，对抗原载体和抗体载体所在的反应腔进行二次清洗；
二次清洗完成后，将发光底物注入抗原载体和抗体载体所在的反应腔；
发光底物注入完成后，在避光条件下采用CCD获取发光信号，从而得到检测结果；
其中，所述酶标试剂为标记了HRP的抗原和抗体。
11.采用权利要求10所述的方法同时检测优生优育五项IgM和IgG两种抗体10项指标。
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