ES2257095T3 - Especificidad mejorada en la deteccion de anticuerpos igm de anti-rubeola. - Google Patents
Especificidad mejorada en la deteccion de anticuerpos igm de anti-rubeola.Info
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Abstract
Un método para la detección de anticuerpos IgM de anti-rubéola que ccomprende Poner en contacto una muestra sospechosa de contener anticuerpos IgM de anti-rubéola con antígenos de rubéola que comprenden glicoproteína El de rubéola y glicoproteína E2 de rubéola carente de proteína cápsida de rubéola para formar un complejo binario. Las glicoproteínas E1 y E2 se preparan de cualquier cepa del virus de rubéola; dicho complejo binario es un complejo de antígenos de la rubéola e IgM; poniendo en contacto el complejo binario con un reactivo indicador y en donde el reactivo indicador es capaz de formar un complejo con los IgM anti-rubéola, para formar un complejo ternario, detectando la presencia o ausencia de un complejo temario.
Description
Especificidad mejorada en la detección de
anticuerpos IgM de anti-rubéola.
Se revelan métodos mejorados para la detección
específica de anticuerpos IgM de anti-rubéola en
muestras biológicas.
El virión de la rubéola es un miembro de la
familia Togavirus, y es un virus de forma esférica cuya envoltura
es de aproximadamente 60 nm de diámetro. El virión consiste de una
molécula de RNA de cadena sencilla de 10 kb encapsidada en un
nucleocápsido icosaédrico y circundado por una envoltura lipídica.
Copias múltiples de una proteína (C) de la cápsida componen el
nucleocápsido. La envoltura consiste en lipoproteínas derivadas de
la célula huésped infectada y dos glicoproteínas víricas, designadas
E1 (53-58 kDa) y E2 (42-48 kDa)
(Waxham and Wolinsky, Virology 143:153-165,
1985).
La infección primaria de la rubéola se
caracteriza en la mayoría de los individuos por la presencia de una
erupción cutánea macropapular, fiebre, malestar y linfadenopatía. La
Rubéola es típicamente una enfermedad benigna y autolimitante que
se contrae de manera más frecuente durante la infancia. La
infección primaria en adultos es menos común y puede tener serias
consecuencias en mujeres embarazadas. La infección de un feto
durante el primer trimestre de embarazo puede conducir a un aborto
espontáneo o a severas anormalidades del feto.
Un niño infectado congénitamente puede presentar
una o más de una variedad de defectos de nacimiento, conocidos
colectivamente como síndrome de rubéola congénita (SRC). Defectos de
nacimiento comunes asociados con SRC incluyen cataratas,
deficiencias en el sistema nervioso central, microcefálea,
deficiencias motoras, sordera, enfermedad cardiaca congénita y
retardo mental.
A causa del riesgo fetal asociado con la
infección primaria de rubéola maternal se toman de forma rutinaria
muestras de ensayo de mujeres embarazadas para establecer la
presencia de anticuerpos IgM de anti-rubéola
durante el primer semestre de embarazo. La infección primaria de la
rubéola se asocia con una respuesta específica pronunciada al
anticuerpo IgM, mientras que la reinfección (a menudo asintomática)
se caracteriza por niveles elevados de anticuerpos específicos IgG
en la ausencia de niveles detectables de anticuerpos específicos
IgM. Al contrario de la infección primaria, generalmente se piensa
que la reinfección de mujeres inmunes embarazadas no es perjudicial
para el desarrollo del feto. Cuando exploraciones prenatales
indican que una mujer ha adquirido una infección primaria de rubéola
durante etapas tempranas del embarazo, se recomienda a menudo un
aborto terapéutico. Por esta razón es imperativo que los resultados
de la prueba sean precisos.
Se han descrito una variedad de métodos
relacionados con la detección de anticuerpos IgM de antirrubéola.
Los ensayos iniciales dependen de la prueba de la inhibición de la
hemaglutinación (MA), que a su vez depende de las propiedades
hemaglutinantes de las proteínas víricas E1 y E2. Si una muestra
biológica que va a ser analizada contiene anticuerpos dirigidos
contra estos hemaglutininos víricass, el virus de la rubéola no
puede ligarse por más tiempo a los glóbulos rojos (usualmente de
sangre de pollo) y esto inhibe la hemaglutinación (ver, por
ejemplo, Peetermans and Huygelen, Presse Med.
75:2177-2178, 1967).
Infortunadamente, los títulos de estos
anticuerpos de anti-hemaglutinina se incrementan
significativamente siguiendo a esto la infección primaria y la
reinfección y por lo tanto este método no puede emplearse para
distinguir entre infecciones maternales, lo que conduce
probablemente a defectos fetales e infecciones maternales que
probablemente no afecten el feto.
Más recientemente, las pruebas de inmunoabsorción
enzimática (ELISA) se han convertido en el método seleccionado para
el diagnóstico de la infección primaria de rubéola (ver por ejemplo.
Steece et al., J Clin. Microbiol, 21(1):
140-143, 1985). En la mayoría de los casos la
cápsida vírica de la rubéola o los antígenos de envoltura de la
glicoproteína (proteínas totales, extractos virales o péptidos) son
inmovilizados sobre un soporte sólido y expuestos a una muestra
biológica que se somete a prueba para establecer la presencia de
anticuerpos de anti-rubéola. Los antígenos
previamente descritos incluyen novedosos péptidos lineares y
cíclicos que corresponden a regiones de la rubéola E1 y C proteínas
(patente U.S. Nos 5,164,481 y 5,298,596), novedosos péptidos
lineares y cíclicos que corresponden a las regiones de las
glicoproteínas E1 y E2 (Patente U.S. No. 5,427,792) y virus de
rubéola intactos (o antígenos o fragmentos de estos) en los cuales
las fracciones de oligosacáridos han sido modificadas para un mejor
reconocimiento por los anticuerpos (U.S. Patente No. 4,965,069).
Cualquiera de los anticuerpos de anti-rubéola
presentes en la muestra de ensayo se unen al antígeno inmovilizado.
Después de un apropiado lavado, la presencia o ausencia de un
anticuerpo ligado se detecta mediante el uso de un reactivo
indicador capaz de formar un complejo con un anticuerpo IgM de
antirubéola. Este reactivo indicador es normalmente conjugado a un
marcador detectable. Después del lavado, el marcador detectable
ligado se cuantifica directa o indirectamente y el resultado se
emplea para determinar si la muestra inicial contenía o no
anticuerpos específicos IgM de anti-rubéola. La
presencia de anticuerpos específicos IgM de
anti-rubéola en una muestra, es la base para el
diagnóstico de una infección primaria de rubéola.
Infortunadamente, hay una carencia perturbadora
de especificidad en los inmunoensayos que existen de IgM de
anti-rubéola. Resultados falsos positivos se
obtienen tan frecuentemente que la mayoría de los laboratorios usan
una complicada prueba de algoritmos para confirmar la presencia de
la infección primaria de rubéola. Este algoritmo incluye pruebas
repetidas de cada muestra, empleando diferentes kits de diagnóstico
de IgM de anti-rubéola, un proceso costoso y que
consume tiempo. El algoritmo también puede incluir una prueba
complementaria para la avidez del anticuerpo específico IgG de
anti-rubéola. La respuesta inmune inicial que sigue
a la exposición a un antígeno novedoso se caracteriza por la
producción en abundancia de anticuerpos IgM, mientras que la
respuesta específica a los anticuerpos IgG de elevada avidez se
caracteriza por respuestas secundarias y reinfección.
Consecuentemente, si los anticuerpos IgG de una muestra de un
paciente tomados durante las primeras etapas del embarazo se unen a
antígenos de la rubéola con alta avidez, es improbable que se
presente la infección materna inicial durante las criticas etapas
tempranas del desarrollo fetal. En cambio, si los anticuerpos IgG en
la muestra del paciente se ligan al antígeno con baja avidez, puede
ser un indicio de una infección primaria reciente con el virus de
la rubéola.
Varios factores causativos potenciales han sido
implicados en la carencia de especificidad en los
inmuno-ensayos de IgM de
anti-rubéola y previamente se han realizado intentos
para reducir la incidencia de resultados de ensayos falsos
positivos. Por ejemplo, Macioszek et al. (Patente U.S. No.
5,698,393, emitida en December 16, 1997; "Macioszek") revela
un método para reducir o eliminar los resultados de inmunoensayos de
IgM falsos positivos causados por la presencia de factores
reumatóideos (autoanticuerpos contra IgG humanos, usualmente del
isotipo IgM) en muestras analizadas. Este método involucra un
tratamiento de muestras sospechosas de contener factores
reumatóideos (FR), ya sea directamente o mientras está en forma de
complejo ligado a la fase sólida, con una solución reguladora de
neutralización FR de citrato a un pH entre 3.5 y 5.0 más
preferiblemente. Macioszek enseña que la unión de moléculas IgM no
específicas tales como moléculas FR a moléculas IgG
anti-rubéola capturadas por el antígeno fijado, se
rompe normalmente dentro de este rango de pH, mientras que no se
rompe al unir los anticuerpos específicos IgM con el antígeno de la
rubéola inmovilizado. Esta patente no encara el problema de la no
especificidad del ensayo, como producto de la presencia de factores
causativos aparte de FR y FR que estén presentes únicamente en un
subconjunto de los sueros probados.
Fabrizi et al (Patente U.S. No. 5,300,427,
emitida el 5 de Abril de 1994; "Fabrizi") revela también un
método para reducir señales no específicas generadas en ELISAS IgM.
Ejemplos incluyen un ensayo para moléculas de IgM que reconocen
"antígenos extractivos" de rubéola. Este método comprende la
dilución del suero con una solución reguladora que contiene
colagenasa de tipo IV antes de colocar el suero en contacto con el
soporte sólido sobre el cual se fijan los anticuerpos IgM. El
sistema de complemento está compuesto por un conjunto de proteínas
de plasma que atacan los patógenos extracelulares. Una de estas
proteínas complemento, C1q, que es capaz de unir los anticuerpos IgM
del suero, supuestamente interactúa de forma no específica con el
anticuerpo secundario de la enzima conjugada. Fabrizi hace saber
que la colagenasa favorece la separación de moléculas IgM del suero,
de las moléculas del complemento C1q anexas, y con ello mejora la
especificidad del inmunoensayo eliminando señales falsas positivas
que resultan de la interacción no específica arriba mencionada.
Aparte de la reacción cruzada de la proteína C1q en la muestra
biológica, esta patente no encara el problema de la no
especificidad del ensayo que resulta de la presencia de otros
factores.
Existe la necesidad de un inmunoensayo mejorado
para la detección de anticuerpos IgM de
anti-rubéola que elimine todos o la mayoría de los
resultados falsos positivos generados por ensayos comunes sin
afectar la sensibilidad del ensayo.
Van Sommeren et al, J. Virol. Methods
(1997), 63 p37-46 describe la purificación de los
complejos de la proteína El-E2 del virus de la
rubéola y la evaluación de su uso en los ensayos ELISA.
En una modalidad preferida, la presente invención
proporciona inmunoensayos mejorados para la detección de
anticuerpos IgM de anti-rubéola. Estos ensayos
comprenden poner en contacto una muestra de ensayo en la que se
sospecha que hay anticuerpos IgM de anti-rubéola con
antígenos de rubéola que comprenden glicoproteínas E1 y E2 de
rubéola sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola. El
presente inventor ha encontrado que la proteína cápsida de la
rubéola puede estar involucrada en interacciones
proteína-proteína no específicas lo que conduce a
resultados de ensayos falsos positivos.
Estos ensayos pueden comprender adicionalmente el
uso de urea en un diluyente de la muestra. La incorporación de urea
puede además reducir la unión no específica de moléculas de IgM a
las glicoproteínas E1 y E2 de la rubéola usadas como antígenos en
el inmunoensayo mejorado, y con ello se reduce además la incidencia
de resultados de ensayo falsos positivos.
En modalidades adicionales preferidas, se proveen
kits y composiciones para facilitar el desempeño de los
inmunoensayos revelados.
Se dan las siguientes definiciones con el fin de
ayudar a aquellos diestros en el oficio a entender la descripción
detallada de la presente invención.
La "aglutinación" se refiere a la agrupación
de partículas, usualmente por moléculas de anticuerpo que se unen a
antígenos sobre las superficies de las partículas adyacentes.
El "anticuerpo" se refiere a una proteína
que se une específicamente a un antígeno dado y es producido en
respuesta al contacto inicial con ese antígeno.
El "antígeno" se refiere a una molécula o
segmento diferenciado de ella capaz de obtener una respuesta
inmune, en donde la respuesta inmune conduce a la producción de
anticuerpos que reaccionan con el epítopo antigénico.
La "avidez" se refiere a la suma total de la
fuerza de enlace de dos moléculas recíprocamente.
"Complejo binario" se refiere a un complejo
de antígeno e IgM, por ejemplo, a) la glicoproteína El de la
rubéola y un anticuerpo IgM anti-rubéola que
reconoce específicamente la glicoproteína E1; b) la glicoproteína E2
de la rubéola y los anticuerpos IgM de la
anti-rubéola que reconocen específicamente la
glicoproteína E2; o c) una combinación de E1 y E2 e IgM.
El "Punto de turbidez" se refiere a la
temperatura en la cual aparece de repente la turbidez durante el
calentamiento de una solución detergente micelar clara, el resultado
de una separación microscópica de la fase.
El "Marcador detectable" se refiere a la
molécula, proteína o ácido nucleico que puede ser detectado ya sea
directa o indirectamente mediante el uso de un agente de detección o
dispositivo de detección apropiado.
El "agente de detección" se refiere a una
composición que proporciona condiciones apropiadas para detectar un
marcador detectable. Tales composiciones permiten a menudo la
observación de un marcador colorimétrico, fluorescente o
quimioluminiscente cuando el marcador detectable entra en contacto
con el agente de detección.
"IgM" se refiere al anticuerpo isotípico
característico de la respuesta primaria del anticuerpo que se
produce tras la exposición inicial a un antígeno dado.
"IgG" se refiere al isotipo dominante de la
inmunoglobulina del suero, el cual se produce característicamente
en fases secundarias de la infección inicial y en reinfecciones
posteriores.
El "reactivo indicador" se refiere a una
molécula, proteína, o ácido nucleico capaz de formar un complejo
con un anticuerpo IgM de anti-rubéola. El componente
del enlace puede ser conjugado a un marcador detectable.
"Hemoaglutinación" se refiere a la
aglutinación de glóbulos rojos.
Las glicoproteínas de envoltura E1 y E2 de la
rubéola sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola se
refieren a la preparación de las glicoproteínas de envoltura de la
rubéola, en la cual ninguna proteína cápsida es detectable cuando la
preparación es sometida a SDS-PAGE seguida de
tintura de plata.
"Complejo temario" se refiere a un complejo
de antígeno, IgM y un reactivo indicador, por ejemplo, a) la
glicoproteína El, un anticuerpo IgM anti-rubéola que
reconoce específicamente la glicoproteína E1 y un reactivo
indicador: b) la glicoproteína E2, un anticuerpo IgM
anti-rubéola que reconoce específicamente la
glicoproteína E2 y un reactivo indicador, o c) E1 y E2 en
combinación con IgM y un reactivo indicador.
Las muestras biológicas que se van a analizar
mediante el presente ensayo se ponen en contacto con las
glicoproteínas de envoltura E1 y E2 sustancialmente libres de
proteína cápsida de rubéola, como las pruebas Western blot
realizadas por los presentes inventores sugieren que algunos de los
resultados falsos positivos generados en otros ensayos pueden
resultar de uniones no específicas de moléculas de IgM a la
proteína cápsida de la rubéola. Los ensayos de la presente invención
pueden comprender además la adición de urea al diluyente de la
muestra, con el fin de reducir adicionalmente la incidencia de
interacciones no específicas proteína-proteína, lo
que conduce a resultados falsos positivos. El método del presente
inmunoensayo mejorado comprende normalmente varias etapas como se
señalará más adelante.
Se proporciona una muestra de ensayo sospechosa
de contener anticuerpos IgM de anti-rubéola. La
muestra del ensayo se pone en contacto con antígenos de la rubéola
que comprenden glicoproteínas de envoltura E1 y E2 sustancialmente
libres de proteína cápsida de la rubéola. Esto conduce a la
formación de un complejo binario que comprende a) la glicoproteína
E1 y un anticuerpo IgM de anti-rubéola específico
para la glicoproteína E1; b) la glicoproteína E2 y un anticuerpo IgM
de anti- rubéola específico para la glicoproteína E2; o c) una
combinación de E1 y E2 enlazado al IgM. El complejo binario puede
ser lavado varias veces para remover efectivamente cualquier
material no-complejo.
El complejo binario se pone en contacto
posteriormente con un reactivo indicador. El reactivo indicador
comprende normalmente una molécula de ligado capaz de formar un
complejo con un anticuerpo de anti-rubéola. Esto
conduce a la formación de un complejo temario que comprende a) la
glicoproteína E1, un anticuerpo IgM de anti-rubéola
específico para la glicoproteína E1 y el reactivo indicador, b) la
glicoproteína E2, un anticuerpo IgM de anti-rubéola
específico para la glicoproteína E2 y el reactivo indicador o c) E1
y E2 ligados a IgM y el reactivo indicador. El reactivo indicador es
generalmente conjugado a un marcador detectable. Este complejo
temario puede ser lavado varias veces para remover cualquier
sustancia no-compleja. El complejo temario se lavará
preferiblemente antes de la etapa de detección.
De forma altemada, la muestra de ensayo puede ser
puesta en contacto con glicoproteínas de envoltura E1 Y E2
sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola y del
indicador reactivo en una etapa simple simultánea. Puede formarse
(como se ha descrito anteriormente) un complejo temario. Un complejo
formado de esta manera puede lavarse para remover el material que no
se ha convertido en complejo. El complejo temario se lavará
preferiblemente antes de la etapa de la detección.
Los complejos ternarios pueden detectarse ya sea
directamente o por medio de un agente de detección apropiado. El
agente particular de detección seleccionado dependerá del tipo de
marcador detectable que se utilice. Una señal positiva indica la
presencia de anticuerpos IgM de anti-rubéola en la
muestra de ensayo, y con ello se sugiere que el individuo que
proporciona la muestra de ensayo puede haber adquirido recientemente
una infección primaria de rubéola. Recíprocamente, la ausencia de un
marcador indica la ausencia de anticuerpos IgM de
anti-rubéola en la muestra del ensayo.
El organismo que proporciona la muestra de ensayo
es generalmente cualquier organismo que contenga anticuerpos.
Preferiblemente el organismo es un mamífero, y más preferiblemente
un ser humano.
Por lo general la muestra de ensayo puede ser
cualquier material biológico que contenga anticuerpos. Tales
materiales pueden estar procesados para que se provean de una manera
adecuada. La muestra de ensayo se provee preferiblemente de un
fluido corporal, más preferiblemente se provee de sangre aunque la
manera que más se prefiere de todas es de suero. La muestra de
ensayo puede diluirse con un diluyente de la muestra, que puede
comprender urea (N_{2}H_{4}CO). La incorporación de urea, un
compuesto con actividad caotrópica, reduce el ligado no específico
de IgM a las ya mencionadas glicoproteínas de envoltura E1 y E2 y/o
un material de soporte de fase sólida usado en el ensayo. La urea
incrementa la restrictividad de la interacción
anticuerpo-antígeno, con el efecto de que son
excluidos los complejos de baja avidez que conducen a ensayos falsos
positivos. Tales complejos de baja avidez pueden estar compuestos de
moléculas de IgM no específicas que se han ligado con epítopos de
reacción cruzada sobre las glicoproteínas E1 y E2 de la rubéola.
Preferiblemente, el diluyente de la muestra comprenderá una
concentración entre aproximadamente 1 M y 5 M aproximadamente de
urea, más preferiblemente entre 2 M aproximadamente y 4 M
aproximadamente aunque la concentración más preferida es 3M
aproximadamente.
La solución reguladora de lavado que se utiliza
para lavar los complejos de ligado binarios y/o temarios arriba
descritos, puede comprender urea. La solución reguladora de lavado
comprenderá preferiblemente entre 1 M aproximadamente de urea a 5 M
aproximadamente de urea. Más preferiblemente, la solución
reguladora de lavado comprenderá entre 2 M aproximadamente de urea a
4 M aproximadamente de urea, aunque lo que más se prefiere es que
tenga una concentración de 3 M aproximadamente de urea. Una persona
con habilidades ordinarias en el oficio es consciente de que estas
soluciones reguladoras de lavado pueden de alguna manera variar en
su composición, pero aún así ser compatibles con la presente
invención.
Las glicoproteínas de envoltura E1 y E2 de la
rubéola sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola
pueden ser preparadas a partir de cualquier cepa del virus de la
rubéola, incluyendo las cepas de Therien, Judith, M33 y HPV77. Estas
glicoproteínas de envoltura E1 y E2 pueden ser purificadas de la
proteína cápsida por cualquier método compatible con el ensayo de la
presente invención. Preferiblemente, estas glicoproteínas serán
purificadas en ausencia de la proteína cápsida mediante una
separación de la fase en las micelas de detergente, aunque lo más
preferible es que estas glicoproteínas se purifiquen de acuerdo con
el método descrito en el ejemplo 1. De forma alternativa, las
glicoproteínas E1 y E2 de la rubéola sustancialmente libres de
proteína cápsida de rubéola pueden obtenerse también por otros
métodos bien conocidos para aquellos diestros en el oficio, que
incluyen metodologías de purificación alternativas, translación en
sistemas de translación in vitro y expresión en bacterias,
levaduras, células de CHO, células de insecto u otros sistemas
celulares. Todas estas variaciones son consideradas como
equivalentes para los propósitos de la presente invención.
Las glicoproteínas víricas E1 y E2
sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola pueden ser
inmovilizadas sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede ser
proporcionado en una de muchas variadas formas. Ejemplos
representativos de materiales de soporte sólido incluyen membranas,
filtros, vidrio, plástico, bolas de plástico, bolas de agarosa,
bolas de SEFAROSA, (la SEFAROSA es una marca registrada de Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ) y bolas magnéticas.
Además de diferentes formas, el soporte sólido
puede estar compuesto de una variedad de materiales. El soporte
sólido es preferiblemente nitrocelulosa, difluoruro de
polivinilideno, nylon, rayón, acetato de celulosa, agarosa,
SEFAROSA, metal, polipropileno, polietileno, poliestireno, cloruro
de polivinilo, acetato de polivinilo, poliamida, polimida,
policarbonato, polieter, poliéster, polisulfona, poliacetal,
poliestireno, o polimetil metacrilato, pero más preferiblemente es
polipropileno, poliestireno, cloruro de polivinilo, poliamida,
policarbonato, polieter, polimetil metacrilato, nitrocelulosa,
difluoruro de polivinilideno o nylon; aunque el material que más se
prefiere es polipropileno o poliestireno.
El reactivo indicador es normalmente conjugado a
un marcador detectable. El marcador detectable puede ser una
enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la
\beta-galactosidasa, o la peroxidasa; una
proteína, tal como la biotina o la digoxina; un fluorocromo, tal
como la rodamina, la ficoeritrina, o la fluoresceina; una proteína
fluorescente tal como la GFP o una de sus muchas formas modificadas,
un radioisótopo, o un segmento de ácido nucleico.
Algunos de estos marcadores detectables pueden
ser detectados directamente. Los fluorocromos (Wells and Johnson.
En Three-Dimensional Confocal Microscopy, pp.
101-129, 1994) y las proteínas fluorescentes (Sakai
et al., J. Cell Biol.
139(6):1465-1476, 1997) pueden ser detectadas
directamente con un dispositivo de detección apropiado, tal como un
microscopio fluorescente, Separador de células activado por
fluorescencia (SCAF), o un fluorómetro. Los radioisótopos (tal como
el ^{32}P o ^{125}I) pueden ser detectados por medio del uso de
un contador de centelleo o un contador Geiger.
Otros marcadores pueden ser detectados
indirectamente. Estos marcadores pueden requerir el uso de un
agente de detección adecuado. La selección de un agente de detección
apropiado depende generalmente del marcador detectable que se
utilice.
Por ejemplo, si una proteína tal como la biotina
se emplea como marcador detectable, se emplea generalmente un
agente de detección que comprende la avidina o la estreptavidina
(Bayer et al, Meth. Biochem.Anal, 26: 1-10,
1980). En tales casos, un agente de detección apropiado comprende
generalmente un componente de ligado capaz de formar complejos con
la proteína. Este componente de ligado puede ser detectado
posteriormente poniéndolo en contacto con un segundo marcador
detectable.
Las enzimas, tales como la peroxidasa de rábano
picante, la fosfatasa alcalina y la
\beta-galactosidasa, pueden emplearse también como
marcadores detectables. Los agentes de detección para enzimas
generalmente utilizan una forma del sustrato de la enzima. El
sustrato se modifica normalmente, o se provee bajo un conjunto de
condiciones, de tal forma que un marcador quimioluminiscente,
colorimétrico, o fluorescente sea observado luego de que la enzima y
el sustrato hayan sido puestos en contacto (Vargas et al.,
Anal Biochem, 209: 323, 1993).
Los ácidos nucleicos, cuando se utilizan como
marcadores detectables pueden ser detectados por medio del uso de
la sonda de hibridación. Esta sonda puede ser conjugada a un
marcador detectable adicional, el cual cuando se coloca bajo
condiciones apropiadas provee una señal fluorescente,
quimioluminiscente, colorimétrica o radioactiva. De forma
alternativa, el ácido nucleico puede amplificarse por medio de una
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (Dirks et al., J.
Histochem. Cytochem. 38:467-476, 1990). El ácido
nucleico amplificado puede ser fácilmente detectado por
electroforesis de gel.
Los radioisótopos pueden ser detectados
alternativamente de forma indirecta por autoradiografia (i.e
exposición a película de rayos X).
Existen otros muchos métodos de detección
apropiados compatibles con la presente invención. En cada caso, el
agente de detección y su método de empleo son bien conocidos para el
individuo que tenga una habilidad ordinaria en el oficio.
Un kit de diagnóstico puede ser diseñado para
ayudar en el desempeño del método arriba citado. Tal kit contiene
recipientes con glicoproteínas de envoltura E1 y E2 de rubéola,
sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola y el reactivo
indicador, respectivamente. El kit puede contener además un
diluyente de la muestra de prueba, varias soluciones reguladoras de
bloqueo, soluciones reguladoras para favorecer la formación de
complejos binarios y ternarios, soluciones reguladoras de lavado y
agentes de detección. Una persona de ordinaria habilidad en el
oficio es consciente de que el diluyente y soluciones reguladoras
pueden variar en su composición exacta, pero aún así ser compatibles
con la presente invención. Todas estas variaciones son consideradas
como equivalentes para los propósitos de la presente invención. El
diluyente de la muestra de prueba y/o soluciones reguladoras de
lavado pueden comprender urea como se ha descrito anteriormente.
Las glicoproteínas de envoltura E1 y E2 de
rubéola sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola que
van junto con el kit de diagnóstico pueden ser purificadas, como se
señaló anteriormente, a partir de cualquier cepa del virus de la
rubéola.
\newpage
Las glicoproteínas víricas E1 y E2
sustancialmente libres de proteína cápsida de rubéola que van junto
con el kit de diagnóstico pueden ser proveídas de forma que se
encuentren ya inmovilizadas sobre un soporte sólido. Este soporte
sólido puede ser proporcionado en una o muchas formas diferentes y
puede estar compuesto de una variedad de materiales como se ha
descrito anteriormente.
El kit de diagnóstico puede comprender además un
agente de detección. Como se mencionó previamente, la selección de
un agente de detección apropiado depende generalmente del marcador
detectable que se emplea. Muchos y diferentes marcadores detectables
y agentes de detección son compatibles con la presente
invención.
Los componentes del kit de diagnóstico pueden ser
proporcionados en muchas formas y cantidades diferentes. También
pueden ser empleados varios tipos de empaque. Las instrucciones para
la correcta utilización del kit pueden ser suplidas con éste.
Cualesquiera de tales modalidades alternativas se consideran como
equivalentes para la presente invención.
En una posterior modalidad preferida, la
invención se relaciona con una composición que comprende
glicoproteínas de envoltura E1 y E2 de rubéola sustancialmente
libres de proteína cápsida de rubéola, como se describió
anteriormente.
En otra modalidad preferida, la invención se
relaciona con un material de soporte sólido en donde se han
inmovilizado las glicoproteínas de envoltura E1 y E2 de rubéola,
sustancialmente libres de la proteína cápsida de rubéola. Las
glicoproteínas E1 y E2 de la rubéola sustancialmente libres de
proteína cápsida de rubéola pueden ser preparadas de acuerdo con
cualquiera de los métodos arriba descritos y pueden ser fijadas a
cualquiera de los materiales de soporte sólido previamente
señalados.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar las modalidades preferidas de la invención. Las personas
diestras en el oficio deberían observar que las técnicas reveladas
en los ejemplos que siguen, representan técnicas descubiertas por el
inventor para que funcionen bien en la práctica de la invención, y
pueden ser así consideradas por constituir modos preferidos en su
práctica.
Ejemplo
1
Virus de la rubéola parcial o altamente
purificados en una solución reguladora que contiene 150 mM de NaCl,
10 mM de Tris-HCI (pH 8.15), 10 mM de EDTA, y 1.0 M
de KC1 (NTE/KC1) se ajustó a 0.1 a 1.0 mg/ml de proteína por
dilución en la misma solución reguladora de NTE/KC1. TRITON
X-114 (El TRITON X-114 es una marca
registrada de Rohm y Haas Co., Spring House, PA) se agregó luego a
una concentración final de 1% (vol/vol). La solución se colocó en un
baño de hielo-agua durante 30 minutos y se mezcló a
intervalos por medio de un vórtex después de lo cual se incubó a
temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Al calentarse la solución
se volvió túrbida debido a una separación microscópica de la fase
que ocurrió cuando la temperatura de la solución traspasó el punto
de turbidez. Durante la incubación a temperatura ambiente, la
solución se mezcló vigorosamente dos veces por medio de un vórtex
durante 30 a 60 segundos para maximizar la interacción de las
glicoproteínas con las micelas que se forman. Posteriormente la
solución se centrifugó durante un tiempo de 10 minutos a 1000 x g a
temperatura ambiente para recoger la fase del detergente al fondo
del recipiente. La fase acuosa superior, que contiene la proteína
cápsida se removió y la fase detergente se solubilizó en el volumen
original de solución fría de NTE/KC1. Mezclando y después de unos
pocos minutos en el baño hielo-agua, se dejó subir
la temperatura de la fase detergente solubilizada por encima del
punto de turbidez, ocurriendo de este modo la separación de las
fases como se ha descrito anteriormente. La fase del detergente fue
recogida y solubilizada repitiéndose dos veces la separación de la
fase. Después de la tercera separación de la fase, la fase del
detergente que contiene las glicoproteínas se solubilizó en la mitad
del volumen original de la solución reguladora fría NTE. El
detergente se removió mediante tres extracciones con éter frío,
después de lo cual las glicoproteínas del virus de la rubéola
quedaron en la fase acuosa. La proteína cápsida no fue detectable
como impureza en las glicoproteínas extraídas como ha sido
demostrado por SDS-PAGE seguido de tintura de
plata.
Ejemplo
2
Las glicoproteínas del virus de la rubéola fueron
probadas en una dilución de antígeno IgM ELISA con el fin de
determinar la concentración óptima de antígeno para la
sensibilización de la fase sólida. La solución de glicoproteína fue
diluida en una solución reguladora
bicarbonato-carbonato, pH 9.5, hasta estar dentro
del rango de 0.1 mcg/ml a 10 mcg/ml, normalmente 1 mcg/ml. Luego fue
colocado 0.1 ml en cada pocillo de un placa microtituladora de 96
pozos. Las placas fueron incubadas a 4-7ºC durante
la noche para permitir que las glicoproteínas se adsorbieran a la
superficie del plástico. Después de la adsorción, se removió el
fluido de los pozos de la placa. Una solución reguladora de bloqueo
de fosfato salino, de pH 7.0 que contiene 1% peso/volumen de
albúmina de suero bovino y 5% peso/volumen de sacarosa (0.2 ml) se
adicionó posteriormente a cada pocillo y las placas se incubaron
durante la noche a 4-7ºC. La solución de bloqueo
contenía proteínas que se adsorbían a los lugares que quedaban sobre
los pocillos plásticos y ayudaban a bloquear la adsorción posterior
de las globulinas del suero de la prueba a la superficie del
plástico. Después del bloqueo, el fluido se removió de las celdas y
las placas se secaron al aire. Posteriormente las placas se sellaron
dentro de una bolsa laminada junto con una bolsita desecante.
Ejemplo
3
El diluyente del suero para la prueba de ELISA
IgM consistía de una solución salina reguladora de fosfato que
contenía 1 M KCI, IgG cabra antihumana (Fc específico) y 3 M de
urea. La IgG cabra antihumana obtenido a partir de DiaSorin,
Stillwater, Minnesota fue primero adsorbido por especies cruzadas
con globulina gamma de bovino, globulina gamma de conejo, etc y se
ajustó en una concentración para precipitar el IgG humano en un
rango de 5 a 20 mg/ml.
Ejemplo
4
Las muestras de suero para la prueba, un suero de
calibración IgM y un suero positivo de control de IgM se diluyeron
individualmente de 1:10 o más en el diluyente de suero de IgM del
ejemplo 3. Las diluciones se incubaron a temperatura ambiente por 10
a 60 minutos, después de lo cual 0.1 ml de cada suero diluido se
colocó en un pocillo separado de la placa con antígeno recubierto
descrito en el ejemplo 2. Después de añadir todas las muestras de
suero, la placa fue incubada en una cámara húmeda a temperatura
ambiente por 30 minutos. El fluido se removió invirtiendo la placa
sobre un lavaplatos o vaso de precipitado y luego se golpeó la placa
con la mano sobre toallas de papel para remover cualquier exceso de
suero diluido. Cada pocillo se lavó tres veces con una solución
reguladora de lavado que consistía en una solución salina reguladora
de fosfato y que contenía 0.1% (peso/volumen) de albúmina de suero
bovino y 0.05% (volumen/volumen) de TWEEN-20 (TWEEN
es una marca registrada de Rohm and Haas Co., Spring House, PA). Los
pocillos se llenaron con la solución reguladora de lavado y el
fluido se removió como se ha descrito anteriormente. Después de que
el lavado final se removió de los pocillos, 0.1 ml de IgM cabra
antihumana conjugado con fosfatasa alcalina obtenida de Kirkegaard y
Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland (IgM conjugado) fue
colocado en cada pocillo. El conjugado IgM se diluyó en una
solución salina reguladora de fosfato que contenía 1% (peso/volumen)
de albúmina de suero bovino y 0.05% de TWEEN-20
antes de usarse. El conjugado se incubó durante 30 minutos a
temperatura ambiente en una cámara de humedad. Después de la
incubación, el conjugado se removió de los pocillos y cada pocillo
se lavó tres veces con la solución reguladora de lavado como se
anotó previamente. Después de que el último lavado fue removido de
los pocillos, se colocó en cada uno de ellos 0.1 ml de la solución
de sustrato de fosfatasa alcalina y la placa se incubó durante 30
minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda para permitir el
desarrollo del color. El color se leyó a 405 nm mediante el uso de
un espectrofotómetro.
Los valores de absorbancia de la prueba fueron
convertidos a Valores ELISA Relativos (VER) expresando el valor de
la absorbancia del suero de la prueba como una relación de la
absorbancia del suero de calibración. Esto se logró de la siguiente
forma:
(i) obtener el valor de absorbancia para el o los
pocillos que tienen el blanco, que contienen todo menos el
suero,
(ii) obtener los valores de absorbancia para la
muestra del ensayo y las muestras de calibración,
(iii) restar el valor de absorbancia del blanco
de cada uno de los valores de la muestra de calibración y de la
muestra prueba para obtener así los valores corregidos;
(iv) multiplicar la absorbancia de la muestra de
calibración por el factor de calibración (el factor de calibración
es el factor por el cual debe ser multiplicada la absorbancia de la
muestra de calibración [un suero bajo positivo] para alcanzar el
punto de corte, que está en tres desviaciones estándar por encima de
la absorbancia negativa media de una población) indicado en el suero
de calibración para obtener el valor de corte de ELISA y
(v) dividir la absorbancia corregida para cada
suero de prueba por el valor de corte con el fin de obtener los VER.
VER iguales o superiores a 1.0 se consideran positivos para
anticuerpos IgM contra el virus de la rubéola, mientras que los
inferiores a 1.0 se consideran negativos.
Ejemplo
5
Un panel de 102 muestras de suero que se sabía
daban negativo para anticuerpos IgM y 25 muestras de suero que se
sabía daban positivo para anticuerpos IgM fueron sometidas a prueba
por los métodos descritos en la presente invención. Los mismos
sueros fueron probados con un kit disponible comercialmente y por
medio de un ELISA que ya existía en nuestra empresa; ambos empleaban
virus purificado de detergente-desintegrado como el
antígeno; y un diluyente de suero carente de urea. Todas las tres
pruebas identificaron correctamente los sueros positivos.
La tabla 1 muestra que el kit comercial y el
ELISA de que disponíamos en nuestra empresa produjeron
significativos números de reacciones falsas positivas dentro del
panel de muestras de suero negativas, mientras que el ELISA de la
presente invención ("Nuevo" ELISA) identificó correctamente
todas las 102 muestras negativas.
| Ensayo | Positivo | Negativo |
| ELISA existente en la empresa | 16 | 86 |
| Kit comercial | 7 | 95 |
| ELISA "Nuevo" | 0 | 102 |
Ejemplo
6
Fueron probadas 100 muestras de suero negativas
usando el ELISA de la presente invención ("Nuevo" ELISA)
empleando como antígeno glicoproteínas E1 y E2 de rubéola. La urea
fue omitida del diluyente de la muestra. Resultados falsos positivos
no fueron obtenidos, pero los valores de ELISA relativos (VER)
oscilaban de 0 a 0.8, un rango bastante amplio. Las muestras que
producen VERs de 1.0 o superiores, (como se discutió arriba), se
consideran positivas para la presencia de anticuerpos IgM de
anti-rubéola. Sin embargo, aproximadamente el 90% de
los VER obtenidos, fueron de 0.2 o menos, lo que indica que el uso
de las glicoproteínas El y E2 como antígenos en
inmuno-ensayos es muy efectiva en la eliminación de
resultados falsos positivos aún cuando ninguna cantidad de urea se
adicione al diluyente de la muestra.
Ejemplo
7
Las mismas 100 muestras sero negativas fueron
probadas usando el ELISA de la presente invención ("Nuevo"
ELISA), empleando glicoproteínas E1 y E2 como antígeno y utilizando
además un diluyente de la muestra que contiene urea a una
concentración de 3M. Resultados falsos positivos no fueron obtenidos
y además, la distribución VER se redujo a un rango de 0 a 0.4%, con
resultados iguales a 0 superiores al 95%. Esto indica que el
"Nuevo" ELISA usando ambos antígenos de las glicoproteínas E1 y
E2 y urea en el diluyente de la muestra es superior en sensitividad
al ELISA que usa solamente los antígenos de las glicoproteínas E1 y
E2.
Todas las composiciones y métodos revelados y
reivindicados aquí pueden ser realizados y ejecutados sin una
indebida experimentación a la luz de la presente revelación.
Claims (17)
1. Un método para la detección de anticuerpos IgM
de anti-rubéola que comprende:
Poner en contacto una muestra sospechosa de
contener anticuerpos IgM de anti-rubéola con
antígenos de rubéola que comprenden glicoproteína El de rubéola y
glicoproteína E2 de rubéola carente de proteína cápsida de rubéola
para formar un complejo binario. Las glicoproteínas E1 y E2 se
preparan de cualquier cepa del virus de rubéola; dicho complejo
binario es un complejo de antígenos de la rubéola e IgM; poniendo en
contacto el complejo binario con un reactivo indicador y en donde el
reactivo indicador es capaz de formar un complejo con los IgM
anti-rubéola, para formar un complejo ternario,
detectando la presencia o ausencia de un complejo temario.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la
muestra del ensayo se obtiene a partir de un fluido corporal.
3. El método de la reivindicación 1 o 2 en donde
el fluido corporal es la sangre.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra del ensayo se diluye con
un diluyente que comprende urea antes de que entre en contacto la
muestra con los antígenos de la rubéola.
5. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende además el lavado del complejo
binario o complejo ternario con un líquido de lavado que comprende
urea.
6. Un kit de diagnóstico para facilitar la
detección de anticuerpos IgM anti-rubéola, que
comprenden: un primer recipiente que contiene antígenos de rubéola y
que comprenden la glicoproteína E1 de la rubéola y la glicoproteína
E2 de la rubéola y exenta de proteína cápsida de rubéola en donde
las glicoproteínas E1 y E2 se preparan de cualquier cepa del virus
de la rubéola; y un segundo recipiente que contiene un reactivo
indicador que forma un complejo con un anticuerpo IgM
anti-rubéola.
7. El kit de diagnóstico de la reivindicación 6,
que comprende además un diluyente de la muestra del ensayo que
contiene urea.
8. El kit de diagnóstico de la reivindicación 6 o
7, que comprende además una solución reguladora de lavado que
contiene urea.
9. El método de la reivindicación 4 o 5, o el kit
de diagnóstico de la reivindicación 7 u 8, en donde el diluyente,
el líquido de lavado o la solución reguladora de lavado comprende
urea a una concentración de 2 M a 4 M.
10. El método o el kit de diagnóstico de la
reivindicación 9 en donde la solución reguladora de lavado
comprende urea 3 M.
11. El método de alguna de las reivindicaciones 1
a 5, 9 o 10 o el kit de diagnóstico de cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en donde los antígenos de rubéola se
inmovilizan sobre un soporte sólido.
12. El método o el kit de diagnóstico de la
reivindicación 11 en donde el soporte sólido es una membrana, un
filtro, una pieza de plástico, una pieza de vidrio, una bola, una
bola de agarosa, o una bola magnética.
13. El método o el kit de diagnóstico de la
reivindicación 11, en donde el soporte sólido es polipropileno,
poliestireno, cloruro de polivinilo, poliamida, policarbonato,
polieter, polimetil metacrilato, nitrocelulosa, difluoruro de
polivinilideno, agarosa, metal o nylon.
14. El método o kit de diagnóstico de la
reivindicación 13, en donde el reactivo indicador está conjugado a
un marcador detectable.
15. El método o kit de diagnóstico de la
reivindicación 14 en donde el marcador detectable es una proteína,
una enzima, un radioisótopo, un segmento de ácido nucleico, un
fluorocromo, o una proteína fluorescente.
16. El método o kit de diagnóstico de la
reivindicación 14, en donde la enzima es la peroxidasa del rábano
picante, la fosfatasa alcalina o la
\beta-galactosidasa.
17. El método o kit de diagnóstico de la
reivindicación 14, en donde la enzima cataliza la conversión de un
reactivo no quimioluminiscente en un producto quimioluminiscente o
cataliza la conversión de un reactivo no colorimétrico en un
producto colorimétrico.
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