ES2304965T3 - Ensayo. - Google Patents
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Abstract
Un método de determinación de la presencia o cantidad de anticuerpo recién sintetizado en una muestra de sangre en respuesta a un inmunógeno que comprende: detectar los anticuerpos liberados o partes de los mismos en una muestra que contiene linfocitos que se han fraccionado, con lo que se liberan los anticuerpos sintetizados o partes de los mismos asociados a dichos linfocitos, con lo que se determina la presencia o cantidad de anticuerpo recién sintetizado en dicha muestra de sangre, en el que dicha muestra que contiene linfocitos que se han fraccionado es dicha muestra de sangre o una preparación de linfocitos preparada a partir de dicha muestra de sangre, en el que dicho anticuerpo recién sintetizado es un anticuerpo antigénicamente activo que se ha producido o sintetizado por y en una célula linfocítica en respuesta a la presencia de un inmunógeno in vivo como parte de una respuesta inmunitaria en curso.
Description
Ensayo.
La presente invención se refiere a la detección
de anticuerpos, y en particular a la detección de anticuerpos
recién sintetizados producidos en respuesta a infección, vacunación,
etc. en muestras mediante un método sencillo que implica el
fraccionamiento de linfocitos antes de detectar la presencia de
anticuerpo.
Se ha usado ELISA durante mucho tiempo para
detectar y medir los niveles de anticuerpo (o antígeno). Lo más
habitualmente, se usa ELISA como ensayo serológico, pero se usa
también para estudiar las propiedades inmunoquímicas de antígenos o
anticuerpos, y ha encontrado aplicación frecuentemente, por ejemplo,
en la evaluación y caracterización de respuestas inmunitarias, para
investigar la producción de anticuerpo por cultivos celulares, en
tecnología de hibridoma, etc.
El ensayo ELISA es sencillo de usar, sensible y
relativamente rápido, pero sólo es capaz de medir simplemente la
presencia del anticuerpo diana en la muestra; no puede distinguir
entre la síntesis de anticuerpo en curso en respuesta al antígeno y
los anticuerpos ya presentes por infección pasada o por
transferencia pasiva, etc. Aunque en algunos casos puede bastar
simplemente con obtener información referente a la presencia de
anticuerpo, en otros casos es deseable poder determinar si los
anticuerpos diana detectados se sintetizan o no agudamente por los
linfocitos en el momento del ensayo, por ejemplo, durante un
tratamiento de vacunación, o en el diagnóstico de infección en
lactantes, para distinguir de los anticuerpos maternos transferidos
pasivamente. Esto no puede conseguirse en un método ELISA
clásico.
Se han desarrollado por lo tanto otros métodos
que posibilitan detectar la síntesis de anticuerpo en curso. Puede
mencionarse particularmente a este respecto el ensayo de
inmunosorción ligado a enzima de mancha (ELISPOT) (también conocido
como ELISA de mancha o ensayo de placa ELISA), como se revisa, por
ejemplo, por Czerkinsky et al. en "ELISA and other Solid
Phase Immunoassays", ed. D.M. Kenneny and S.J. Challacombe, 1988,
capítulo 10, 217-239. Esta técnica, basada en el
método ELISA, posibilita la enumeración de linfocitos que secretan
anticuerpos contra uno o más antígenos diana. Básicamente, ELISPOT
es una variante del método ELISA con la cual pueden revelarse las
células secretoras de anticuerpo (CSA) cultivando linfocitos en
pocillos ELISA especialmente modificados recubiertos con el
antígeno diana, y reemplazando los reactivos ELISA estándar por
complejos de enzima-sustrato que proporcionan un
precipitado coloreado (manchas) adyacente a la célula secretora.
Pueden contarse después las manchas para dar una medida del número
de células productoras de anticuerpo. Pueden incluirse inhibidores
de la síntesis de proteína en el medio de cultivo para confirmar que
las manchas detectadas son debidas a la síntesis de anticuerpo
de novo durante el periodo de incubación in vitro.
Aunque la técnica ELISPOT se ha probado muy útil
en el estudio de la dinámica de las respuestas inmunitarias
humorales, y se ha usado para detectar CSA espontáneas que aparecen
transitoriamente en la circulación periférica de sujetos
inmunizados, ciertos rasgos del método ponen limitaciones a su uso
en una situación de diagnóstico clínico. En primer lugar, puesto
que para cada muestra tienen que contarse las manchas individuales,
lo que puede consumir tiempo y ser laborioso, el método no es
particularmente adecuado para el análisis de grandes números de
muestras, tal como ocurre en un laboratorio de diagnóstico clínico.
En segundo lugar, sólo se enumera el número de células secretoras
de anticuerpo en cada muestra y, en términos generales, esto
requiere volúmenes de muestra razonablemente grandes, por ejemplo,
varios ml. Las placas ELISPOT son también caras y el ensayo no es
fácilmente susceptible de automatización.
El documento WO 96/26443 describe el uso de un
ensayo ELISA modificado que puede usarse para detectar la síntesis
de anticuerpo en curso. En este ensayo, se cultivan linfocitos
después de aislamiento y se determinan los niveles de anticuerpo
producido durante ese periodo de cultivo. Esta técnica requiere por
tanto necesariamente la incubación de los linfocitos de la muestra
de ensayo aproximadamente a 37ºC para permitir la medida de los
anticuerpos secretados durante la incubación. El periodo medio de
incubación es de 2-5 horas, lo que representa una
limitación significativa para la velocidad de realización del
ensayo. La incubación requiere también la provisión de un equipo
adecuado en el sitio de ensayo de modo que pueda llevarse a cabo
inmediatamente antes del procedimiento de ensayo. Esto significa
generalmente que el ensayo de linfocitos tiene que llevarse a cabo
poco después de haber tomado una muestra de un sujeto, debido a que
el almacenamiento de muestras, por ejemplo congelando, no es
aceptable debido a la reducción resultante de la viabilidad celular.
Las células purificadas pueden mantenerse viables sólo durante
periodos de tiempo relativamente cortos mediante almacenamiento en
hielo a 0ºC o menos favorablemente a 4ºC.
Se observará por lo tanto que, a pesar de los
avances en las técnicas de detección de anticuerpo, sigue habiendo
la necesidad de un ensayo mejorado adicionalmente que sea sencillo,
rápido y económico de realizar, que posibilite fiablemente la
cuantificación precisa de anticuerpo secretado espontáneamente, que
sea capaz de distinguir la síntesis de anticuerpo de novo y
que pueda realizarse en muestras, por ejemplo muestras de sangre,
con fines de diagnóstico. La presente invención responde a esta
necesidad.
En la técnica descrita anteriormente, se usó un
periodo de cultivo en consonancia con la opinión actual en el
momento, suponiendo que éste fuera necesario para obtener suficiente
título de anticuerpo para obtener resultados de ensayo con fines de
inmunodiagnóstico.
Se ha establecido en la bibliografía que la
biosíntesis de anticuerpos (inmunoglobulinas) tiene lugar en
linfocitos B (véase: Roitt I., Brostoff J., Male D.
"Immunology", 4ª edición publicada por Mosby, Londres 1996,
6.12-6.13), tras de lo cual se secretan a la
corriente sanguínea para luchar contra la infección. Cuando se
secretan por células secretoras de anticuerpo (CSA), las moléculas
están totalmente ensambladas (por ejemplo, para una molécula de
IgG, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas por enlaces
disulfuro) y glucosiladas. Se ha reivindicado que la etapa
limitante de la velocidad en la biosíntesis de anticuerpos es el
transporte intracelular y la glucosilación mediante el retículo
endoplásmico y el complejo de Golgi (que lleva 1 hora o más),
mientras que la biosíntesis de las diversas cadenas pesadas y
ligeras de las inmunoglobulinas necesita sólo minutos para su
terminación. En total, el proceso de síntesis y secreción se estima
que lleva del orden de 2 horas (Melchers, 1971, Histochemical
J., 3, pág. 389-397). Como consecuencia de la
rápida secreción de inmunoglobulinas por células, no se ha
apreciado nunca antes que podrían estar presentes anticuerpos
funcionales, o incluso anticuerpos parcialmente sintetizados (por
ejemplo, preglucosilación) en la célula linfocítica en cualquier
cantidad significativa. Además, no se ha apreciado que el
fraccionamiento de los linfocitos en una muestra podría
proporcionar suficientes cantidades de "anticuerpos recién
sintetizados" para permitir la detección con fines de
inmunodiagnóstico.
Atkinson et al. (1985, J.
Immunological Methods 76, pág. 365-373) midieron
la secreción de anticuerpo en suspensiones celulares usando un
ensayo de inmunosorción ligado a enzima. Se incubaron células de
bazo de ratones inmunizados durante 6 horas a 37ºC y se midió el
anticuerpo secretado por ELISA.
Sin embargo, se ha encontrado sorprendentemente
que el contenido celular de los linfocitos contiene suficientes
anticuerpos para permitir la detección e incluso la cuantificación
de la síntesis aguda de anticuerpo en un sujeto cuando las muestras
para análisis se toman durante la fase aguda de la respuesta
inmunitaria. Generalmente, éste es aproximadamente el mismo
intervalo de tiempo que se esperaría para la aparición de células
secretoras de anticuerpo en sangre periférica. Por tanto, esto
proporciona información útil que puede usarse en diagnóstico.
Ventajosamente, esto evita la necesidad de
llevar a cabo una larga incubación de la muestra, por ejemplo una
preparación de linfocitos purificada, antes del ensayo, puesto que
el ensayo no requiere ninguna incubación de los linfocitos.
El ensayo de la invención proporciona también un
ensayo fiable en el que las muestras pueden almacenarse antes de
preparar el ensayo, por ejemplo, mediante refrigeración
(preferiblemente aproximadamente a 4ºC) o congelación, por ejemplo,
a menos de 0ºC. Se apreciará por los expertos en la técnica que la
sangre completa preferiblemente se refrigera (por ejemplo, como se
describe más adelante en la presente memoria) en lugar de
congelarse, ya que la congelación de sangre completa dará como
resultado la lisis de las células. Sin embargo, muestras tales como
linfocitos purificados pueden congelarse o refrigerarse antes de
realizar el ensayo de la invención sin interferir en los resultados
de ensayo. Por tanto, las muestras pueden almacenarse durante un
periodo prolongado de tiempo antes del ensayo incluso mediante
métodos que puedan afectar a la viabilidad de las células (por
ejemplo, de manera similar al almacenamiento de muestras de suero o
plasma). Como consecuencia, el método de ensayo de la invención
ofrece ventajas significativas para la recogida, almacenamiento y
procesamiento de muestras, permitiendo particularmente un retraso
significativo en la realización del ensayo que puede ser necesario
para ensayos de laboratorio de muestras obtenidas en el campo.
En un aspecto, la presente invención proporciona
por lo tanto un método de determinación de la presencia o cantidad
de anticuerpo recién sintetizado en una muestra de sangre en
respuesta a un inmunógeno que comprende:
detectar los anticuerpos liberados o partes de
los mismos en una muestra que contiene linfocitos que se han
fraccionado, con lo que se liberan los anticuerpos o partes de los
mismos sintetizados asociados a dichos linfocitos, con lo que se
determina la presencia o cantidad de anticuerpo recién sintetizado
en dicha muestra de sangre, en los que dicha muestra que contiene
linfocitos que se han fraccionado es dicha muestra de sangre o una
preparación de linfocitos preparada a partir de dicha muestra de
sangre,
en el que dicho anticuerpo recién sintetizado es
un anticuerpo antigénicamente activo (concretamente, capaz de
reconocer y unirse al antígeno correspondiente al inmunógeno) que se
ha producido o sintetizado por y en una célula linfocítica en
respuesta a la presencia de un inmunógeno in vivo como parte
de una respuesta inmunitaria en curso. Por tanto, el anticuerpo se
sintetiza por un linfocito durante el transcurso de una respuesta
inmunitaria desencadenada por la presentación de un inmunógeno in
vivo, concretamente, sintetizado antes y en el momento en que
la muestra que contiene linfocito se retira del sujeto animal.
La referencia en la presente memoria a
anticuerpos o partes de los mismos asociados a dichos linfocitos
designa anticuerpos recién sintetizados o partes de los mismos que
son antigénicamente activos (concretamente, capaces de reconocer y
unirse al inmunógeno) que no se han secretado todavía por las
células. Como se menciona anteriormente, esto corresponderá
generalmente a anticuerpos producidos en las 2 horas precedentes
(que puede ocurrir exclusivamente in vivo o al menos
parcialmente in vitro antes del fraccionamiento celular si
las células se mantienen en las condiciones apropiadas), aunque el
transcurso temporal de la ruta de secreción puede variar. Aunque
los anticuerpos pueden producirse rápidamente en las células (por
ejemplo, 1-2 min, aunque la secreción es bastante
más lenta), pueden estar presentes cadenas libres que constituyen
anticuerpos o anticuerpos no glucosilados o parcialmente
glucosilados o cadenas de anticuerpo en los linfocitos, y por tanto
liberarse a su fraccionamiento. Cuando sea apropiado, estas
"partes" pueden detectarse e incluirse en la medida de la
presencia o cantidad de anticuerpos recién sintetizados a condición
de que sean antigénicamente activos como se describe anteriormente.
Los anticuerpos o partes de los mismos liberados por los linfocitos
comprenden anticuerpos recién sintetizados. La valoración de los
niveles de dichos anticuerpos recién sintetizados proporciona
información respecto a la cantidad de producción de anticuerpo
activo que ocurre en respuesta a un inmunógeno particular,
concretamente, anticuerpos que se están produciendo como parte de
una respuesta inmunitaria en curso, por ejemplo crónica o aguda. La
presente invención proporciona por tanto también un método de
determinación de la presencia o cantidad de producción de
anticuerpo activo mediante la correlación con los niveles de
anticuerpos recién sintetizados con respecto a las muestras de
control apropiadas.
La muestra que comprende linfocitos puede
tomarse de cualquier animal, preferiblemente mamífero, por ejemplo
un sujeto humano, al que se ha presentado un inmunógeno antes de
tomar la muestra. Habitualmente, cuando la respuesta inmunitaria va
a detectarse mediante el método de la invención, ésta estará causada
por infección o vacunación reciente, y es deseable tomar la muestra
al cabo de pocas semanas o al cabo de pocos días de la exposición
al inmunógeno. El tiempo óptimo para tomar la muestra del sujeto
dependerá de la naturaleza de la infección o del tipo de vacuna
usada, y se determina adicionalmente por la eficacia del mecanismo
de respuesta inmunitaria del sujeto, y ésta puede variar entre
individuos. Sin embargo, lo que se requiere es que la muestra se
tome en un momento en que los linfocitos del sistema inmunitario del
sujeto estén en una fase de síntesis de anticuerpo aguda en
respuesta al inmunógeno de interés. Por tanto, en general, se ha
encontrado que la muestra se toma convenientemente al cabo de 3
semanas de la presentación al sujeto del inmunógeno, más
preferiblemente al cabo de 8-12 días de la infección
o vacunación, pero en algunos casos ocurrirá una producción
suficiente de anticuerpo al cabo de 1-5 días; o más
específicamente 2-3 días después de la infección o
vacunación, para obtener resultados significativos de un ensayo
según la invención.
La muestra es una muestra de sangre. Puede ser o
no necesario separar y purificar los linfocitos antes del ensayo en
el método de la invención. Sin embargo, cuando sea necesario o
deseable, pueden purificarse los linfocitos. Por tanto,
preferiblemente la muestra usada en el ensayo es una preparación de
linfocitos preparada a partir de la fuente anteriormente mencionada
mediante técnicas conocidas en la técnica.
Por "fraccionar" los linfocitos se pretende
que los contenidos celulares, incluyendo cualquier anticuerpo
sintetizado, se liberen de los confines de la membrana celular y las
estructuras de membrana interna de tal modo que puedan detectarse
mediante cualquier ensayo bioquímico o químico conveniente. Es
conocido que las inmunoglobulinas se sintetizan y secretan durante
una ruta a través del retículo endoplásmico y el complejo de Golgi.
Por tanto, el fraccionamiento requiere necesariamente la liberación
de estas estructuras internas. Por tanto, el fraccionamiento de los
linfocitos puede conseguirse mediante métodos conocidos de
fraccionamiento celular que permiten la liberación de los
contenidos de los compartimentos de membrana, por ejemplo mediante
lisis celular, por ejemplo usando medios de fraccionamiento físico,
por ejemplo ciclos de congelación-descongelación o
por medios químicos usando tampones o disoluciones de
fraccionamiento celular.
Como se usan en la presente memoria, los
términos "detectar" y "determinar la presencia o cantidad
de" comprenden la valoración tanto cuantitativa como cualitativa
del nivel de producción de anticuerpo, en el sentido de obtener un
valor absoluto para la cantidad de anticuerpo producida en la
muestra, y también un índice, relación, porcentaje o indicación
similar del nivel de producción de anticuerpo, así como valoraciones
semicuantitativas o cualitativas. El término "determinar la
presencia de" comprende también situaciones en que un valor
negativo, indicativo de la ausencia de anticuerpos sintetizados, es
valioso en la valoración de la respuesta inmunitaria de un sujeto.
Por ejemplo, un resultado negativo puede ser indicativo de la
ausencia de una respuesta inmunitaria ante el inmunógeno de interés
o puede ser indicativo de una infección crónica si los anticuerpos
del inmunógeno de interés están presentes en el suero.
La detección de anticuerpos recién sintetizados
permite la valoración de los niveles de dichos anticuerpos
específicos de uno o más inmunógenos, en lugar de la valoración de
todos los anticuerpos presentes en la célula.
La detección de los anticuerpos recién
sintetizados puede ser mediante cualquier método que permita la
identificación de aquellos anticuerpos que se unen al inmunógeno de
interés causando la respuesta inmunitaria. Por tanto, puede usarse
cualquier técnica de detección que dé como resultado la producción
de una señal que refleje la presencia del anticuerpo diana. Por
ejemplo, pueden usarse ensayos ligados a enzima en los que puede
producirse un producto soluble o insoluble a partir de un sustrato
cuya cantidad puede valorarse.
Convenientemente, los anticuerpos sintetizados
pueden detectarse, por ejemplo, mediante un ensayo de unión en fase
sólida, por ejemplo un ELISA, en el que se unen al antígeno usado en
el ensayo, aunque el antígeno usado puede ser diferente del
inmunógeno que estimuló la respuesta inmunitaria en primer lugar.
Por tanto, aunque tanto el antígeno usado en el ensayo como el
inmunógeno que ha estimulado o está estimulando la producción de
anticuerpos in vivo se unirían a los anticuerpos a detectar
en virtud de sus epítopos idénticos o muy similares, en otros
aspectos el antígeno y el inmunógeno pueden no ser idénticos. Por
tanto, aunque el antígeno usado en el método de la invención puede
ser material que contiene todas o algunas partes del inmunógeno
relevante, por ejemplo, derivado de individuos infectados, o partes
purificadas del mismo o similar material, el antígeno puede
prepararse sintéticamente de forma similar, por ejemplo, mediante
síntesis química o expresión recombinante, con porciones añadidas o
eliminadas respecto al antígeno nativo. Por tanto, pueden usarse
proteínas de fusión o moléculas que expresan sólo el(los)
epítopo(s) apropiado(s).
La presente invención proporciona varias
ventajas frente a las técnicas de ensayo de anticuerpo conocidas.
En primer lugar, en contraposición con técnicas que detectan los
niveles de anticuerpo sérico (por ejemplo, ELISA séricas), el
presente ensayo detecta anticuerpos que son indicativos de una
infección/estimulación inmunitaria actual, o en el caso de
neonatos, permite la separación de los anticuerpos maternos y
neonatales. Esto es posible puesto que los linfocitos de la muestra
se usan directamente en el método de ensayo de la invención sin
ninguna otra forma de tratamiento o estimulación anterior, por
ejemplo, estimulación in vitro por antígeno. Pueden
detectarse así los anticuerpos que se están sintetizando por los
linfocitos en el momento del muestreo. (De este modo, incluso
usando volúmenes de muestra pequeños, puede distinguirse la síntesis
de anticuerpo en curso espontánea en respuesta al inmunógeno de
interés de la activación de linfocitos presente). Además, el ensayo
se lleva a cabo en linfocitos que se han fraccionado durante la
etapa en que producen y secretan espontáneamente, o están empezando
a secretar, anticuerpos, sin estimular a las células a revelar
ninguna memoria. Esto está en contraposición con otros métodos
publicados que aprovechan la estimulación antigénica in
vitro que puede aumentar la sensibilidad del ensayo, pero que
revela la memoria celular y por lo tanto no es una técnica exacta o
adecuada para detectar anticuerpos preparados agudamente o recién
sintetizados en respuesta a una infección actual o vacunación
reciente.
La presente invención aprovecha por otro lado la
secreción espontánea de anticuerpo para permitir la detección de
anticuerpos en la sangre indicativos de una infección en curso por
el antígeno de ensayo; los linfocitos plasmáticos secretarán
anticuerpo contra el antígeno de ensayo en las primeras pocas
semanas después de la infección o vacunación, etc. La detección de
dichos anticuerpos mediante el método de la presente invención
posibilita diagnosticar o determinar la infección o monitorizar la
respuesta de anticuerpo a la vacunación, etc.
Por tanto, en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona un método de diagnóstico o monitorización de
la infección de un animal humano o no humano o una parte de dicho
animal por un inmunógeno realizando el método de la invención y
determinando la presencia o extensión de la infección por dicho
inmunógeno por referencia a controles y/o muestras de referencia
apropiados.
El método de la invención es particularmente
útil en lactantes y neonatos, en los que es importante distinguir
el anticuerpo recién sintetizado de los anticuerpos maternos
transferidos pasivamente. En la misma muestra que contiene
linfocitos pueden analizarse los anticuerpos contra varios agentes
infecciosos distintos en ensayos separados o en el mismo ensayo
usando múltiples antígenos relevantes, permitiendo así el uso de
antígenos de contacto relevantes coherentes con el síndrome clínico
que se presenta en el paciente.
En el diagnóstico de infecciones, es también
importante ser capaz de distinguir la síntesis de anticuerpo en
curso de anticuerpos ya existentes de una infección anterior. Evocar
la memoria inmunitaria por estimulación antigénica in vitro
no es coherente con un ensayo dirigido a identificar una infección
aguda en curso, y por tanto los métodos anteriores basados en la
estimulación antigénica no comparten esta ventaja. Además, incluir
la etapa de estimulación antigénica comprometería el factor tiempo
beneficioso del ensayo de la invención, que es muy rápido de
realizar comparado con métodos de la técnica anterior.
En segundo lugar, en contraposición con técnicas
que detectan células secretoras de anticuerpo o anticuerpos
secretados activamente, en la presente invención, aunque la síntesis
aguda de anticuerpo forma el parámetro básico de detección, no hay
necesidad de mantener la muestra en condiciones que promuevan la
síntesis y/o secreción de anticuerpos. Esto simplifica en gran
medida el ensayo y es particularmente beneficioso en comparación
con el ensayo anteriormente conocido dado a conocer en el documento
WO 96/26443, que requiere la incubación de los linfocitos después
del muestreo, y también el mantenimiento de condiciones durante el
ensayo que permitan que los linfocitos continúen secretando
anticuerpos.
Ha sido un beneficio particularmente
sorprendente de la presente invención la evitación de cualquier
etapa de incubación o condiciones de ensayo especiales, y esto
significa que las muestras pueden tratarse convenientemente después
de muestrear para efectuar el fraccionamiento o lisis de las
células, y el lisado puede almacenarse, por ejemplo mediante
congelación o refrigeración, durante un periodo de tiempo antes de
llevar a cabo la etapa de ensayo.
Como alternativa, como se menciona
anteriormente, la muestra, por ejemplo sangre completa o una
preparación purificada, puede almacenarse, por ejemplo congelando o
por refrigeración (según sea apropiado, dependiendo de la muestra),
durante un periodo de tiempo de, por ejemplo, hasta varias horas o
días, por ejemplo, durante más de 4 horas, antes de fraccionar las
células. Por ejemplo, podría almacenarse una preparación de
linfocitos purificada congelando durante un periodo de tiempo, por
ejemplo, durante varias horas o días, o mediante refrigeración, por
ejemplo, durante unas pocas horas, si es necesario o deseable, antes
de tratar la muestra para fraccionar las células. Por tanto, por
ejemplo, los linfocitos purificados podrían almacenarse a 4ºC
durante varias horas, por ejemplo durante hasta 4 a 6 horas, antes
de tratarlos para fraccionar o lisar las células.
Sin embargo, se ha encontrado sorprendentemente
que algunas muestras, por ejemplo preparaciones de sangre completa,
pueden almacenarse con refrigeración durante periodos de tiempo más
largos sin afectar adversamente a las células ni interferir en los
resultados de ensayo. Por ejemplo, se ha encontrado que las muestras
de sangre completa pueden almacenarse con refrigeración (por
ejemplo, a 4ºC) durante al menos 6 días, y si se desea las muestras
pueden mantenerse intermitentemente a temperatura ambiente
(18-25ºC) durante al menos 6 horas, antes de
iniciar los procedimientos de purificación de linfocitos sin afectar
adversamente a la actuación del ensayo. Esto es particularmente
útil cuando las muestras de sangre están retenidas en el laboratorio
y se almacenan con refrigeración mientras están pendientes los
resultados de procedimientos de ensayo plasmáticos/séricos
rutinarios o suplementarios. Esto es sorprendente e inesperado,
puesto que implica que se mantiene la integridad física de los
linfocitos durante el almacenamiento, permitiendo así tener lugar la
purificación posterior de linfocitos a partir de la sangre
almacenada (si se desea) y el fraccionamiento de los linfocitos sin
una reducción significativa de los anticuerpos que se están
detectando.
Por tanto, en una realización preferida, antes
del fraccionamiento de los linfocitos, por ejemplo cuando la
muestra es sangre, la muestra puede almacenarse durante varios días,
por ejemplo, hasta aproximadamente 6 días o más, específicamente
cuando se almacena con refrigeración aproximadamente a 4ºC,
permitiendo incluso la retirada de la muestra de su entorno
refrigerado durante periodos intermitentes de, por ejemplo, 4 a 6
horas, por ejemplo a temperatura ambiente en dos o más ocasiones
durante el periodo de almacenamiento, sin afectar adversamente a
los resultados del ensayo. Esto es particularmente útil cuando se
almacenan muestras de sangre con refrigeración pero cuando es
inevitable dejar la muestra en la mesa de trabajo a temperatura
ambiente durante un tiempo corto. Sorprendentemente, se ha
encontrado que la viabilidad celular no se afecta suficientemente
para interferir o evitar obtener resultados aceptables según el
método de ensayo de la invención. En una realización preferida
adicional, cuando se usan preparaciones de linfocitos purificadas,
estas muestras pueden almacenarse a menos de 4ºC (por ejemplo,
durante varios días o más) o almacenarse a más de 4ºC (durante
hasta 6 horas). La posibilidad de almacenar diversas muestras para
uso en el ensayo hace al método de la invención particularmente
adecuado para laboratorios de diagnóstico grandes en que el equipo
de laboratorio de diagnóstico automatizado costoso, por ejemplo
hardware ELISA, puede operarse más eficazmente usando un número
sustancial de muestras cada vez. Significa también que las muestras
pueden tomarse en muchas localizaciones diferentes y enviarse o
expedirse a un laboratorio de diagnóstico central para análisis de
manera similar a los procedimientos fijados para análisis de
muestras de sueros químicos en otros tipos de
ensayos.
ensayos.
Es una ventaja importante de la presente
invención que sólo son necesarios volúmenes pequeños de muestra.
Tan pocos como 100.000 linfocitos o incluso menos de 50.000
linfocitos pueden producir una señal detectable en el método de la
invención. Puesto que, por ejemplo, 1 ml de sangre comprende 1 x
10^{6} linfocitos, si se usa el método de la invención para
ensayar linfocitos derivados de la sangre, puede usarse tan pocos
como 50 ó 100 \mul de sangre para proporcionar suficientes
linfocitos para la realización de la invención. Incluso teniendo en
cuenta los ensayos de control apropiados (por ejemplo, blancos y
positivos de ensayo), pueden usarse tan pocos como 150 a 300 \mul
para proporcionar resultados de diagnóstico. Claramente, se renuncia
al menos a algunas muestras de control una vez se estandariza el
ensayo. Por tanto, el ensayo de la invención requiere
convenientemente, por ejemplo, 50-500 \mul,
preferiblemente 100-300 \mul y habitualmente
100-200 \mul de muestra que contiene linfocitos
en un volumen comparable con la fuente de muestra completa. Por
tanto, el método de la invención puede usar, por ejemplo, 5 x
10^{4} a 5 x 10^{5}, preferiblemente 1 a 2 x 10^{5}
linfocitos. Esto está en contraposición con los ensayos de
diagnóstico clásicos que generalmente se basan en volúmenes de
varios ml de suero u otro fluido. Esto es especialmente útil en el
caso de muestreos de sangre en que sólo están disponibles muestras
pequeñas, por ejemplo, de neonatos, ya que el método de la
invención requiere sólo volúmenes de \mul que pueden tomarse, por
ejemplo, por tubo capilar de un sitio adecuado tal como del lóbulo
de la oreja, punta del dedo o talón.
Por tanto, el método de la invención permite el
uso de volúmenes de muestra de sangre pequeños (por ejemplo,
volúmenes de \mul, menos de 1 ml, preferiblemente menos de 500
\mul, por ejemplo, menos de 100 \mul) directamente para
detectar la producción de anticuerpo espontánea o de novo por
linfocitos no estimulados, sin una etapa anterior de precultivo de
linfocitos antes del ensayo.
Los antígenos o inmunógenos a los que están
dirigidos los anticuerpos para detección según el método de la
invención incluyen tanto antígenos bacterianos como víricos. Los
antígenos clínicamente importantes incluyen, pero sin limitación,
aquellos de, por ejemplo, herpesvirus simple, citomegalovirus, virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH) y cualquiera de los virus de
la hepatitis, así como Toxoplasma y virus de
Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, en general, puede
detectarse mediante el método de la invención cualquier inmunógeno
que surja como resultado de una infección o vacunación que
desencadene una clara respuesta de anticuerpo (por ejemplo, durante
la fase aguda). En casos en que la infección crónica da como
resultado niveles detectables de anticuerpos diana en los
linfocitos, el ensayo de estos anticuerpos puede realizarse también
según el método de la invención. Por tanto, por ejemplo, los
anticuerpos de cualquier inmunógeno que pueda detectarse usando un
método ELISA convencional pueden detectarse mediante el método de
la presente invención. La detección de anticuerpos de dichos
antígenos podría usarse para establecer rápidamente si los pacientes
están infectados, por ejemplo, con fines de examen de sangre o para
comprobar y/o monitorizar la infección.
La presente invención proporciona por tanto
adicionalmente un método de diagnóstico o monitorización de
infección de un animal humano o no humano o una parte de dicho
animal por una bacteria o virus, en el que dicho método comprende
determinar en una muestra que contiene linfocitos de dicho animal la
presencia o cantidad de anticuerpos recién sintetizados o partes de
los mismos asociados a linfocitos dirigidos a dicha bacteria o virus
según el método descrito en la presente memoria, y determinar la
presencia o extensión de la infección por dicha bacteria o virus
por referencia a muestras de control y/o referencia apropiadas.
El método es particularmente útil debido a su
simplicidad y puede usarse cuando no está disponible un equipo
elaborado, por ejemplo, en situaciones de campo. Sin el requisito de
incubar la muestra como parte del método de ensayo, el método es
rápidamente susceptible de procedimientos automatizados, pero es
también relativamente rápido y sencillo llevar a cabo la lisis
celular y la detección de anticuerpo en situaciones en que no está
disponible un equipo complejo.
El método de la invención se describirá ahora
con más detalle. Preferiblemente, la primera etapa del método
comprende el aislamiento de linfocitos de la muestra. Sin embargo,
como se menciona anteriormente, no se requiere necesariamente una
preparación de linfocitos purificada y, en lugar de ello, puede
usarse una preparación en la que se hayan retirado la mayoría de
los anticuerpos plasmáticos. Preferiblemente, dicha preparación
puede contener menos de un 15% de los anticuerpos contribuidos por
los anticuerpos plasmáticos presentes en la muestra, por ejemplo,
menos de un 5%, preferiblemente menos de un 1%. Convenientemente,
esto puede conseguirse empleando una preparación esencialmente
exenta de plasma (por ejemplo, menos de 5% (v/v), por ejemplo, una
preparación exenta de plasma. Puede prepararse una preparación de
linfocitos usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica,
por ejemplo, usando métodos de filtración o técnicas que usan
material absorbente o kits de preparación de linfocitos. Por tanto,
pueden usarse convenientemente diversas preparaciones de sangre
completa para obtener los linfocitos, por ejemplo, a partir de
sangre heparinizada, sangre con EDTA, etc., tales como se preparan
rutinariamente en laboratorios clínicos. Se apreciará que todas las
preparaciones enriquecidas o purificadas deben contener los
linfocitos presentes en la muestra de la que deriva la preparación
para permitir la detección de la producción de anticuerpos
espontánea o de novo.
Preferiblemente, se separan los linfocitos, por
ejemplo usando medios de separación de linfocitos estándar, por
ejemplo, Lymphoprep® (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega), o usando
separación inmunomagnética (IMS) o un sistema de separación basado
en fase sólida similar u otras técnicas comunes. En el caso de IMS o
técnicas de separación similares, puede usarse una fase sólida, por
ejemplo perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo específico de
ciertos conjuntos de leucocitos, para separar selectivamente los
linfocitos útiles. Cuando se usan linfocitos separados, las células
pueden lavarse antes del uso, usando métodos de lavado estándar.
Preferiblemente, se lavan los linfocitos para retirar cualquier
anticuerpo plasmático que pueda estar presente después de la
separación celular. En general, para realizar la invención, la
contaminación de las células linfocíticas por anticuerpos
plasmáticos se mantiene al mínimo, preferiblemente por debajo de 20
ng de IgG plasmática por muestra de 100 \mul, que representa
aproximadamente un factor de dilución final del plasma de 1:50.000,
por ejemplo, por debajo de aproximadamente 0,5 ng de IgG sérica por
muestra de 100 \mul. Sin embargo, se ha observado que para
conseguir esto no es necesario un lavado excesivo o extenso de las
células. Por ejemplo, se ha encontrado que centrifugando
simplemente sangre completa diluida con tampones tres veces
aproximadamente en las mismas condiciones de giro, puede obtenerse
una preparación de linfocitos suficientemente exenta de anticuerpos
séricos/plasmáticos contaminantes. Véase el ejemplo 3 para detalles
adicionales.
En términos generales, el método de la invención
evita la necesidad de incubar linfocitos de la muestra antes de
realizar el ensayo. Se apreciará sin embargo que si las células se
mantienen durante cortos periodos de tiempo en condiciones que
permitan una producción o secreción continuada de anticuerpos antes
del fraccionamiento de los linfocitos, el método de la invención
seguirá permitiendo la valoración de anticuerpos recién sintetizados
asociados a los linfocitos.
Las muestras a analizar, que se han tratado como
se menciona anteriormente si es necesario para obtener los
linfocitos separados, se fraccionan después para liberar anticuerpos
recién sintetizados. Esto puede realizarse mediante cualquier
técnica conveniente conocida en la técnica anterior que fraccione
eficazmente las estructuras de membrana externa e interna sin
afectar a la capacidad de los anticuerpos liberados de unirse a sus
epítopos complementarios, por ejemplo, mediante el uso de
detergentes, agentes caotrópicos, tampones de fraccionamiento, por
ejemplo que contienen EDTA, o métodos alternativos de
fraccionamiento tales como sonicación o fraccionamiento físico
mediante la generación de estrés de cizallamiento. Sin embargo,
preferiblemente se usa un tampón de fraccionamiento ya que ésta es
generalmente la técnica más sencilla y más conveniente, por ejemplo,
como se describe en los ejemplos de la presente memoria,
concretamente, tampón que contiene detergente tal como desoxicolato
al 0,5%. Pueden usarse tampones de fraccionamiento apropiados para
estabilizar los anticuerpos liberados, por ejemplo, para controlar
el pH o la degradación. Por tanto, por ejemplo, pueden emplearse
tampones que contienen inhibidores de proteasa si es necesario. Los
métodos alternativos de fraccionamiento incluyen, por ejemplo, el
uso de ciclos de congelación/descongelación o incluso el uso de
nitrógeno líquido. Esto da como resultado un lisado en el que los
anticuerpos liberados están en disolución que se usa para etapas
posteriores. Se apreciará que, para obtener cantidades suficientes
de anticuerpos recién sintetizados en la muestra para detectar, es
deseable que se fraccionen todas las células linfocíticas posibles
para liberar los anticuerpos. Preferiblemente entonces, el medio de
fraccionamiento es adecuado con este fin y se fraccionan al menos un
40% ó 50%, más preferiblemente al menos un 60%, 70% u 80% y más
preferiblemente al menos un 90% ó 95% de los linfocitos en la
muestra. Después del fraccionamiento de los linfocitos, se valora el
contenido de anticuerpo de la muestra mediante una técnica
apropiada que permita la detección de los anticuerpos diana.
Convenientemente, para conseguir esto la muestra puede ponerse en
contacto con una fase sólida que porta una pareja de unión
apropiada para inmovilizar el anticuerpo o anticuerpos para
detectar. Convenientemente, la pareja de unión es el antígeno
(inmunógeno) o antígenos (concretamente uno o más) reconocidos por
el anticuerpo o anticuerpos o partes de los mismos para detectar.
Se da a conocer también un método de determinación de la presencia o
cantidad de anticuerpo recién sintetizado en una muestra,
comprendiendo dicho método:
poner en contacto alícuotas de dicha muestra, u
opcionalmente de linfocitos aislados directamente de dicha muestra,
en las que dichos linfocitos se han fraccionado para liberar
anticuerpos o partes de los mismos asociados a dichos linfocitos,
con uno o más antígenos, preferiblemente portados en una fase
sólida, reconocidos por el anticuerpo o anticuerpos para
detectar;
detectar la unión de anticuerpo a
dicho(s) antígeno(s); y
comparar dicha unión de anticuerpo con muestras
de control y/o referencia, con lo que se obtiene una determinación
de la presencia o cantidad de anticuerpo recién sintetizado en
respuesta a dicho(s) antígeno(s). En el método
anterior, las muestras de control o referencia pueden ser controles
negativos o positivos apropiados, por ejemplo, blancos, muestras
normales o muestras adicionadas.
Pueden usarse también parejas de unión
alternativas, por ejemplo, proteína A, proteína G o anticuerpos que
reconocen y se unen al anticuerpo para detectar. En el último caso,
no se requiere una unión altamente específica ya que la
especificidad se introduce en esta realización del método de ensayo
mediante la unión posterior de antígenos que se unen
específicamente a los anticuerpos para detectar. Por tanto, en todas
las realizaciones se crea un complejo
antígeno-anticuerpo específico. La presencia de
dichos complejos, preferiblemente inmovilizados en un soporte
sólido, se comprueba en la etapa de detección del método de la
invención. Por tanto, en un rasgo preferido, la etapa de detección
del método de la invención comprende la detección de los anticuerpos
liberados o partes de los mismos mediante la formación de un
complejo anticuerpo:antígeno en la que dicho antígeno (que
preferiblemente no es un anticuerpo) comprende o contiene el
inmunógeno o una parte del mismo que contiene al menos el epítopo
del inmunógeno.
La fase sólida, cuando se emplea, puede ser
cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos que se usan
ampliamente en la actualidad o se proponen para inmovilización,
separación, etc. Estos pueden tomar la forma de partículas,
láminas, geles, filtros, membranas o tiras, tubos o placas de
microvaloración, etc. y pueden estar constituidos convenientemente
por un material polimérico. Sin embargo, por facilidad de operación
y simplicidad, pueden usarse convenientemente placas y pocillos de
microvaloración estándar, preferiblemente placas ELISA
estándar.
La fase sólida puede modificarse también para
permitir la detección de anticuerpos específicos de una serie de
antígenos diferentes. Por tanto, por ejemplo, pueden recubrirse
discos o tiras, etc. de un material en fase sólida adecuado, por
ejemplo nitrocelulosa o similares, con diferentes antígenos y
añadirse simultáneamente a un pocillo de microvaloración u otro
recipiente adecuado que no contenga antígeno de contacto. Pueden
usarse entonces métodos de detección de unión de anticuerpo para
distinguir entre los diferentes antígenos. Convenientemente, cuando
se emplean ensayos de tipo sándwich, la fase sólida porta uno o más
antígenos (antígenos en fase sólida) reconocidos por el anticuerpo
o anticuerpos o partes de los mismos para detectar (anticuerpos
diana). Como alternativa, la fase sólida puede portar uno o más
anticuerpos (anticuerpos en fase sólida) que reconocen el
anticuerpo o anticuerpos o partes de los mismos para detectar
(anticuerpos diana). Para permitir la detección según el método de
la invención, según sea apropiado, dependiendo de si dicho soporte
sólido porta anticuerpos o antígenos como se describe
anteriormente, se ponen en contacto uno o más antígenos, reconocidos
por los anticuerpos diana inmovilizados sobre dicha fase sólida,
con dicha fase sólida o como alternativa se ponen en contacto uno o
más anticuerpos, que reconocen anticuerpos diana inmovilizados sobre
dicha fase sólida, con dicha fase sólida. Estos antígenos o
anticuerpos que se unen después al soporte sólido pueden marcarse
apropiadamente para permitir la detección como se describe en
adelante en la presente memoria.
Pueden usarse conjuntos de discos recubiertos
cada uno con antígenos relevantes coherentes con cierta afección o
síndrome clínico para identificar cuál de los agentes sospechosos
está causando la enfermedad. Los discos se procesarían entonces
individualmente en pocillos separados. Este es un procedimiento
particularmente ahorrativo de material, puesto que pueden
realizarse ensayos para el ensayo simultáneo de una multiplicidad de
antígenos diferentes (del mismo agente infeccioso o de agentes
diferentes relevantes para el síndrome o afección clínica en cada
caso) usando el mismo pequeño volumen de sangre. Es un enfoque
alternativo usar múltiples muestras de linfocitos fraccionados,
concretamente en pocillos separados, cada uno recubierto con
diferentes parejas de unión, por ejemplo, antígenos o anticuerpos,
y desarrollar el ensayo en consecuencia.
Las técnicas para unir la pareja de unión, por
ejemplo antígeno, a la fase sólida son también extremadamente bien
conocidas y están ampliamente descritas en la bibliografía. Se
describen muchos procedimientos de recubrimiento de antígeno
estándar, por ejemplo en "ELISA and other solid phase
Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects", 1988, ed. D.M.
Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons. Si se desea,
las placas pueden lavarse y bloquearse, usando de nuevo técnicas
estándar. Por tanto, por ejemplo, pueden recubrirse simplemente
placas de microvaloración estándar, por ejemplo placas ELISA, con
pareja de unión incubando las placas durante una noche a 4ºC en un
tampón adecuado, por ejemplo, disolución salina tamponada con
fosfato (DSTF) que contiene la pareja de unión, por ejemplo, a
concentraciones de 0,01 a 150 \mug/ml de proteína, seguido de
bloqueo usando medios de bloqueo apropiados (generalmente un tampón
neutro tal como DSTF que contiene una proteína de bloqueo, por
ejemplo, suero bovino o proteínas de leche en polvo) e incubando,
por ejemplo, a 37ºC durante 1 a 5 horas. Después de retirar la
disolución de bloqueo, las placas están listas para usar.
Sin embargo, convenientemente los materiales
necesarios para realizar el método de la invención pueden
proporcionarse en forma de kit, en la que el soporte sólido se
suministra listo recubierto con pareja de unión y apropiadamente
bloqueado.
Puede ser deseable diluir la suspensión de
muestra linfocítica fraccionada antes de la etapa de contacto, y
convenientemente pueden usarse una serie de diluciones de
célula/muestra. La dilución se realizará generalmente usando el
tampón en el que se fraccionan los linfocitos como diluyente.
Se detecta entonces la unión del anticuerpo a su
antígeno. La etapa de detección, en términos de lectura de la
señal, tiene lugar convenientemente en disolución. Sin embargo,
puede generarse un producto o señal insoluble que no se lee en
disolución. Puede usarse cualquiera de los medios conocidos de
detección de unión de anticuerpo siempre que se genere una señal
legible, por ejemplo, dependiente de fluorescencia,
quimioluminiscencia, colorometría o una reacción enzimática para
producir la señal detectable. Cuando no se usa una fase sólida, los
anticuerpos liberados pueden detectarse mediante cualquier otro
método serológico sensible tal como dispersión de luz (por ejemplo,
nefelometría) y procedimientos de resonancia. Convenientemente,
puede usarse un inmunoensayo como medio de detección, y
preferiblemente un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA).
Sin embargo, están contemplados procedimientos de ensayo distintos
de ELISA dentro del alcance de la invención para detectar
anticuerpos. Pueden ser adecuadas técnicas que usan discos o placas
de vidrio recubiertos, por ejemplo, inundados con una suspensión de
linfocitos fraccionados. Puede adoptarse cualquier técnica estándar
para detectar anticuerpos conocida en la técnica, tales como
técnicas que den como resultado un producto insoluble o soluble,
para uso en el método de la invención para análisis cuantitativo o
para un tipo de ensayo cualitativo (por ejemplo, sí/no).
Las técnicas de inmunoensayo, y particularmente
ELISA, son bien conocidas en la técnica y se describen en la
bibliografía (véase, por ejemplo, "ELISA and other solid phase
Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects", 1988, ed. D.M.
Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons).
Después de poner en contacto con la muestra de
linfocitos fraccionados, puede añadirse un conjugado de
enzima-anticuerpo, por ejemplo en el método de
detección ELISA, que se une al anticuerpo unido al antígeno en la
fase sólida. De forma similar, si el anticuerpo a detectar está
unido a la fase sólida no específicamente mediante una pareja de
unión, por ejemplo mediante un anticuerpo contra anticuerpos de una
especie diferente, puede añadirse un conjugado de
enzima-antígeno que se unirá específicamente con el
anticuerpo inmovilizado para detectar. Se añade entones un sustrato
enzimático para desarrollar la señal detectable. En la presente
invención, se usa convenientemente un sustrato soluble,
proporcionando una señal detectable en disolución. Esto es ventajoso
puesto que facilita y simplifica el manejo y procesamiento de un
gran número de muestras y permite la estimación de la producción de
anticuerpo, aunque como se menciona anteriormente no sea necesaria
la cuantificación absoluta, y si se desea puede obtenerse un
resultado cualitativo o semicuantitativo. Por conveniencia, el
sustrato puede seleccionarse para proporcionar una señal
espectrofotométricamente detectable, que puede simplemente leerse
mediante lectura de absorbancia, por ejemplo, usando un lector de
placa ELISA estándar. Es más, pueden usarse reactivos ELISA
estándar, lo que tiene la ventaja de volver al ensayo de la
invención compatible con los métodos y técnicas existentes
empleados rutinariamente en laboratorios clínicos. Sin embargo,
pueden usarse otros sistemas de detección/generadores de señal,
proporcionando señales detectables por fluorescencia,
quimioluminiscencia, etc.
Pueden usarse también métodos de amplificación
inmunoenzimática para mejorar la señal y aumentar la sensibilidad,
por ejemplo, usando métodos de avidina-biotina tales
como el sistema Extravidin disponible en Sigma. Se usan anticuerpos
secundarios biotinilados como reactivos ELISA, en combinación con un
complejo de peroxidasa-avidina. Puesto que una
molécula de avidina es capaz de unirse a varias moléculas de
biotina, el uso de complejos de
peroxidasa-avidina-biotina aumenta
la concentración superficial de moléculas de peroxidasa, dando al
método una sensibilidad aún mayor.
Los materiales y medios requeridos para la etapa
de fraccionamiento de linfocitos y la etapa de detección de la
unión a anticuerpo pueden suministrarse también convenientemente en
forma de kit junto con la fase sólida recubierta con pareja de
unión.
La información obtenida a partir del ensayo de
la invención puede complementarse usando otros métodos de ensayo.
Pueden obtenerse datos adicionales y útiles de los anticuerpos
séricos/plasmáticos preexistentes en un ensayo ELISA clásico.
Adicionalmente, después de la separación de linfocitos de la muestra
de sangre, el fluido plasmático restante puede usarse para detectar
los anticuerpos preexistentes usando la misma fase sólida recubierta
de pareja de unión usada en el ensayo de la invención.
Para asegurar que el método de ensayo de la
invención está funcionando fiablemente, pueden incluirse controles
apropiados y usarse para determinar la presencia o cantidad de
anticuerpo recién sintetizado. Por ejemplo, para comprobar que la
señal registrada en los pocillos de ensayo no es debida a linfocitos
activados esporádica y no específicamente (presentes), se usa un
antígeno de control negativo. Este antígeno sería del agente
infeccioso más improbable que sea responsable de la enfermedad
infecciosa del paciente, por ejemplo, toxoide del tétanos. Los
números de dichos linfocitos activados presentes serán en cualquier
caso mucho menores en todas las circunstancias que los requeridos
para
un resultado de ensayo positivo usando el método de la invención. El diseño de la invención tiene en cuenta este punto.
un resultado de ensayo positivo usando el método de la invención. El diseño de la invención tiene en cuenta este punto.
Como se menciona anteriormente, debido a su
facilidad y velocidad de operación y simplicidad, el ensayo de la
invención se presta a usos de diagnóstico u otros clínicos o
veterinarios, por ejemplo, piscifactoría. Además de los pequeños
volúmenes de muestra, es una ventaja adicional que sólo se requiera
una muestra, en lugar de pares de suero tomados a un intervalo de 2
a 3 semanas, tal como se requiere en la mayoría de los ensayos
serológicos convencionales. No se requiere una instrumentación
elaborada, y el ensayo se automatiza fácilmente. Además, debería
ser posible ensayar diferentes isotipos de inmunoglobulina si es
necesario.
El método de ensayo de la invención
anteriormente mencionado proporciona un método para valorar la
presencia o extensión de la infección en curso en virtud del
análisis de la expresión espontánea de anticuerpos específicos de
un antígeno definido. Dicho método es claramente aplicable a la
valoración de condiciones patológicas que son conocidas y en las
que están disponibles antígenos relacionados con el inmunógeno
relevante, y por tanto se proporciona un marcador específico de
infección. Sin embargo, en algunas situaciones clínicas, la
enfermedad o infección específica puede no estar identificada y/o
el antígeno apropiado puede no estar disponible para uso en el
ensayo. En estos casos alternativos, puede usarse un ensayo
alternativo para valorar la presencia o extensión de indicadores no
específicos de infección. Por tanto, por ejemplo, pueden examinarse
muestras que contienen linfocitos, por ejemplo, sangre completa o
preparaciones de linfocitos purificadas o enriquecidas de la misma,
con respecto a su producción de marcadores de infección, por
ejemplo, citocinas o interferones, por ejemplo,
IL-2, IL-4 o interferón
\gamma.
Este ensayo proporciona un método de
determinación de la presencia o cantidad de indicadores de infección
en una muestra en respuesta a un inmunógeno que comprende:
obtener una muestra que contiene linfocitos;
fraccionar dichos linfocitos, con lo que se
liberan los indicadores de infección para detectar; y
detectar los indicadores de infección liberados,
con lo que se determina la presencia o cantidad de indicadores de
infección en dicha muestra.
Para realizar este método, la fase sólida puede
proporcionarse con moléculas de captura apropiadas, por ejemplo,
anticuerpos de los indicadores de infección para detección. Para la
detección de la presencia de dichos indicadores de infección
inmovilizados sobre la fase sólida, pueden usarse métodos como se
describen anteriormente en la presente memoria, por ejemplo,
mediante el uso de anticuerpos o ligandos marcados. En este método,
pueden identificarse marcadores específicos mediante la elección
apropiada del resto inmovilizante o molécula de detección. Por
tanto, por ejemplo, pueden inmovilizarse todas las proteínas de la
muestra sobre el soporte sólido y puede realizarse la detección
usando un anticuerpo o ligando marcado específico. Como alternativa,
puede usarse una pareja de unión específica para inmovilizar los
indicadores de infección pertinentes, que pueden marcarse entonces
apropiadamente, positiva o negativamente, por ejemplo en el primer
caso uniendo a un dominio presente en el indicador de infección,
pero no exclusivo de esa molécula, o en el segundo caso marcando
una pareja de unión no unida en la fase sólida. Se dan a conocer
también kits para realizar este método.
La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo
clínico de vacuna de la gripe en el que se ensayaron muestras de 9
sujetos (personas 2 a 10) usando el método de fraccionamiento de
linfocitos. La escala a la izquierda de cada gráfica de barras
muestra la IgG H3N2 representada en ng frente a los días
post-vacunación en la escala horizontal.
Superpuesta a cada gráfico de barras, hay una línea de puntos que
muestra el título de IH en la escala a la derecha para el virus
A/Nanchong. Véanse los ejemplos 1 y 2 para detalles adicionales.
Sujeto: Iniciales LOH, varón, 25 años.
Muestra de sangre tomada 9 días después del primer día de enfermedad
clínica seudogripal clásica. Se había registrado una epidemia mixta
de gripe A y B en la comunidad local.
Separación de linfocitos: Se recogió una
muestra de sangre venosa heparinizada periférica. Se separaron los
linfocitos mediante Lymphoprep® (Nycomed Pharma AS, Oslo) según las
instrucciones del fabricante, excepto porque se mezcló la muestra
de sangre heparinizada con un volumen doble (en lugar de igual) de
disolución salina tamponada con fosfato (DSTF, pH 7,2) antes de la
primera etapa de centrifugación. Se realizaron dos ciclos de lavado
extra del sedimento celular. Se contaron los números de linfocitos
en un hemocitómetro usando el método de exclusión por azul de
dextrano.
Fraccionamiento de linfocitos: Se
fraccionaron cantidades graduadas de linfocitos mediante el tampón
de fraccionamiento Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) que
contenía 0,5% de desoxicolato, pepstatina A 2 \mug/ml (Sigma
P-4265, lote 18H0551), leupeptina 2 \mug/ml
(Sigma L-0649, lote 77H86221), 0,5% de aprotinina
(Sigma A-6279, lote 87H7010), PMSF 1 mM (Sigma
P-7626, lote 48H1265) (basado en la referencia:
Spector D.L., Goldman R.D., Leinwand L.A., "Cells. A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1998,
vol. 1: 74.6) y se sometieron a ensayo ELISA (véase la Tabla
1).
Recubrimiento y bloqueo de placas ELISA:
Microplacas Greiner en forma plana de capacidad de unión media, nº
de cat. 655001 (lote 98260148), D-72636
Frickenhausen, Alemania. Antígenos víricos (un obsequio de
Solvay-Duphar, Holanda) para ensayo de anticuerpos
de la gripe: antígenos de superficie A/Nanchang/933/95 (H3N2), 10
\mug/ml en DSTF, 100 \mul/pocillo. Antígenos de superficie
B/Harbin/07/94, 10 \mug/ml en DSTF, 100 \mul/pocillo. Para
ensayar anticuerpos IgG generales: IgG de cabra
anti-humana (específica de cadena \gamma) Sigma
I-7883 (lote 76H8895) usada a dilución 1:500 en
DSTF, 100 \mul/pocillo. Recubrimiento durante una noche a 4ºC.
Bloqueo con DSTF con 10% de suero fetal bovino (SFB) durante 1 hora
a temperatura ambiente. Entre todas las etapas posteriores, se
lavaron las inmunoplacas 5 veces con DSTF con 0,05% de Tween 20.
Disposición en placa de las muestras: Se
ensayaron los ensayos de anticuerpos IgG de la gripe y anticuerpos
IgG en general en la misma inmunoplaca, así como patrones de IgG
humana. Se ensayaron todas las muestras por duplicado.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Muestras de ensayo: Muestras para
ensayar: "suero" de LOH (dilución 1:3 de plasma). Puro y
diluciones de 10 veces en DSTF con 0,05% de Tween 20 y 5% de SFB
(diluyente), 100 \mul/pocillo. Patrón de IgG: Sigma
I-4506 (lote 96H8840): 10 \mug de IgG/ml,
diluciones de 10 veces en DSTF con 0,05% de Tween 20 y 5% de SFB,
100 \mul/pocillo.
El sedimento celular final de 300 \mul estaba
en una disolución de DSTF que contenía una dilución 1:9.368 de
suero. Se añadieron a este sedimento 700 \mul de DSTF (=dilución
1:3,33). El sedimento final tenía 2,0 x 10^{7} células y contenía
una contaminación sérica de 1:31.200. El sobrenadante final ensayado
era equivalente a una dilución 1:9.370 del suero.
Lisados celulares: Se ajustaron los
lisados para ser equivalentes a 800.00, 200.000 y 50.000
células/pocillo,
100 \mul/pocillo.
100 \mul/pocillo.
La contaminación por anticuerpos séricos,
respecto al lavado celular final, de las preparaciones celulares se
calculó que era: 1:8,4 (10,6%) para 800.000 células, 1:33,7 (2,9%)
para 200.000 células y 1:134,8 (0,7%) para 50.000 células. Todas las
muestras de anticuerpo se incubaron durante 90 minutos a temperatura
ambiente.
Anticuerpo secundario: IgG de cabra
anti-humana marcada con biotina (específica de
cadena \gamma), Sigma B-1140 (lote 96H8886),
usado a 1:500 en DSTF con 0,05% de Tween 20 y 5% de SFB, 100
\mul/pocillo. Incubado durante 60 minutos a temperatura
ambiente.
Conjugado: Conjugado de peroxidasa
ExtrAvidin, Sigma E-2886 (lote 28H4824) diluido
1:1000 en DSTF con 0,05% de Tween 20 y 5% de SFB, 100
\mul/pocillo. Incubado durante 60 minutos a temperatura
ambiente.
Desarrollo: Comprimidos de sustrato
(diclorhidrato de o-fenilendiamina), Sigma
P-8287 (lote 88H8250). Se disolvió un comprimido
(10 mg) en 25 ml de tampón fosfato-citrato 0,1 M, pH
5,0, y se complementó con 20 \mul de perhidrol (30% de
H_{2}O_{2}). Se añadieron 100 \mul/pocillo de disolución de
sustrato y se detuvo la reacción después de 10 minutos con 50
\mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1 M. Se leyó la densidad óptica a
492 nm en un lector Titertek Multiskan PLUS (Flow Laboratories).
Se basó la estimación de las cantidades de IgG
en la interpolación de una curva patrón obtenida a partir de las
diluciones de IgG patrón. Se ensayaron todas las muestras de ensayo
por duplicado y se usó la media de lecturas de densidad óptica para
los cálculos posteriores.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Liberación de anticuerpos IgG de
linfocitos
fraccionados
\vskip1.000000\baselineskip
Conclusión: El sujeto LOH estaba
infectado con el virus de la gripe A, como puede observarse
claramente en la Tabla 3. Usando estos datos, puede suponerse que
100.000 linfocitos/pocillo deberían dar aproximadamente 20 ng/ml de
anticuerpos IgG de gripe A, en contraposición con aproximadamente 2
ng/ml para anticuerpos de gripe B. La primera concentración de
células dará, con fines prácticos, una señal ELISA para anticuerpos
específicos de gripe A que puede medirse convenientemente, pero no
para anticuerpos de la gripe B. Esto está en contraposición con los
niveles de anticuerpos de la gripe medidos en suero (Tabla 2), en
que los niveles de anticuerpos de gripe A y B son muy similares.
Dichos anticuerpos séricos serían lo más probablemente anticuerpos
reactivos cruzados preexistentes de exposiciones anteriores. Se ha
conocido y demostrado durante muchos años que la memoria de la
gripe puede reactivarse mediante exposiciones posteriores a virus
heterólogos, el denominado "pecado antigénico original", lo
más probablemente mediante un efecto "presente" local en el
tejido linfoide en el que tiene lugar el procesamiento inmunitario
inicial.
Las razones por las que los anticuerpos de
linfocitos fraccionados en este ensayo daban también una señal
ELISA medible, aunque pequeña, con el antígeno de la gripe B,
concretamente el virus que no ataca al sujeto LOH, podría ser la
consecuencia de dicha reactivación no específica de los linfocitos
de memoria como consecuencia del ataque inmunitario por el virus de
la gripe A. Sin embargo, esta reactivación inusual de las células de
memoria se cree que es un fenómeno relacionado con la gripe y no
será relevante para otros agentes infecciosos. Por tanto, debe
esperarse que se observe una distinción aún más clara entre las
señales dadas por antígenos del agente infeccioso en cuestión y
otros agentes.
El método actual requiere aproximadamente 100
\mul de sangre heparinizada (igual a 100.000 linfocitos) para
cada anticuerpo específico de antígeno para ensayar, permitiendo el
uso de muestras de sangre capilar.
Este es un ensayo clínico de vacuna de la gripe.
Se incluyeron en el ensayo nueve sujetos sanos: 6 mujeres de
24-27 años de edad (media 26,2) y 3 hombres de
24-31 años (media 28,3). Fueron informados por el
médico a cargo de las contraindicaciones relevantes para
vacunación, y todos informaron al doctor que no conocían ninguna de
dichas contraindicaciones. Ninguno se había vacunado contra la gripe
anteriormente. Todos los vacunados completaron el ensayo y
permitieron extraer muestras de sangre periférica como se describe a
continuación. Se les dio a los sujetos vacuna vírica completa
inactivada trivalente autorizada (Vaxigrip®) que contenía
Virus similar a A/Sydney/5/97 (H3N2) que
contenía 15 \mug de hemaglutinina/dosis
Virus similar a A/Beijing/262/95 (H1N1) que
contenía 15 \mug de hemaglutinina/dosis
Virus similar a B/Beijing/184/93 que contenía 15
\mug de hemaglutinina/dosis
de Mériex Sérums & Vaccines (Francia).
Se tomaron muestras de sangre heparinizada como
se describe en el ejemplo 1. Todos los procedimientos fueron como
se describen en el ejemplo 1, excepto porque los linfocitos se
fraccionaron mediante congelación/descongelación (dos veces)
insertando los viales de linfocitos en N_{2} líquido y manteniendo
bajo agua del grifo corriente.
Adicionalmente, se realizó un ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (IH) con muestras de plasma
tratadas con enzima destructora del receptor según procedimientos
estándar (Kendal et al., 1982, en "Concepts and Procedures
for Laboratory-Based Influenza Surveillance",
Viral Disease Unit, OMS, Ginebra), usando 4 unidades de
hemaglutinación del virus A/Nanchang y 0,7% de eritrocitos de pavo.
Se ensayó el plasma en etapas de dilución doble y se apuntaron los
títulos como la inversa de la mayor dilución que da una inhibición
completa de la hemaglutinación vírica.
Se usaron muestras obtenidas el día de la
vacunación, después de 7 días y después de 13 días.
La Figura 1 muestra la cantidad (en ng) de IgG
frente a antígenos de superficie del A/Nanchang/933/95 (H3N2)
relacionado (véase el ejemplo 1) usando disoluciones obtenidas a
partir de linfocitos fraccionados de 300 K para cada uno de los
nueve sujetos vacunados (barras). Se clasifican según la cantidad de
anticuerpos IgG específicos de la gripe obtenidos de los linfocitos
fraccionados. La escala a la izquierda de ng de IgG no es la misma
para todos los sujetos. Se muestran superpuestos los títulos de IH
(línea de puntos) frente al virus A/Nanchang. Un título \geq40 se
considera protector por consenso internacional.
Clásicamente, se considera que los anticuerpos
IH son el "patrón oro" de los anticuerpos de la gripe, junto
con los anticuerpos neutralizantes de virus. Los títulos de IH
\geq40 se consideran protectores según el consenso internacional.
La Figura 1 muestra que 4 de los 9 sujetos (personas 2,
5-7) obtuvieron dichos anticuerpos el día 7 y todos
los sujetos, excepto las personas 3 y 10, tenían dichos títulos de
IH el día 13. Para todos los sujetos, había altos niveles de IgG
específica de la gripe detectada en linfocitos fraccionados ya el
día 7, y para 5 sujetos (personas 3, 4, 8-10), se
detectaron el día 7 sólo anticuerpos de linfocitos fraccionados, y
no niveles de anticuerpo IH protector.
Además, la especificidad de los anticuerpos IgG
de la gripe era evidente por la aparición de dichos anticuerpos el
día 7 y la desaparición de los mismos anticuerpos el día 13, puesto
que el día 13 la mayoría de los sujetos tenían niveles
significativos de anticuerpos séricos.
El ejemplo 2 enfatiza claramente que los
anticuerpos detectados de linfocitos fraccionados no estaban
contaminados con anticuerpos séricos atrapados en el sedimento
linfocítico, como se demostraba claramente también en el ejemplo
1.
Típicamente, pueden separarse linfocitos
suficientemente exentos de anticuerpos séricos/plasmáticos
contaminantes mediante tres etapas sucesivas de centrifugación. Se
mezclan 300 \mul de sangre completa con 10 ml de diluyente
consistente en 2 partes de DSTF y 1 parte de agua destilada. Se
centrifuga la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente a
400 x g. Se desecha el sobrenadante y se añaden al sedimento 10 ml
de DSTF. Se centrifuga la suspensión como anteriormente, y se
repite el ciclo una vez. Se usa el sedimento final, suspendido en
100 \mul de DSTF, como fuente de linfocitos para ensayos
posteriores.
Se le dio a un sujeto varón (EJAa, 20 años)
vacuna de la gripe trivalente inactivada autorizada según las
instrucciones del fabricante (véase el ejemplo 2). Se tomaron
muestras de 5 ml de sangre heparinizada el día de vacunación
(día 0) y el día 9 después de la vacunación. Inmediatamente después de la recogida, se sometieron 300 \mul de sangre a tres ciclos de lavado/centrifugación como se describe anteriormente en el ejemplo 3, y se fraccionaron los linfocitos como se describe en el ejemplo 1. Se almacenó la muestra de sangre restante a 4ºC durante 4 días, seguido de almacenamiento a temperatura ambiente durante 4 horas antes de iniciar una nueva ronda de purificación de linfocitos. Se realizaron todos los ensayos ELISA posteriores como se describe en el ejemplo 1. Se hicieron los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (IH) con las cepas de vacuna homólogas como se describe en el ejemplo 2.
(día 0) y el día 9 después de la vacunación. Inmediatamente después de la recogida, se sometieron 300 \mul de sangre a tres ciclos de lavado/centrifugación como se describe anteriormente en el ejemplo 3, y se fraccionaron los linfocitos como se describe en el ejemplo 1. Se almacenó la muestra de sangre restante a 4ºC durante 4 días, seguido de almacenamiento a temperatura ambiente durante 4 horas antes de iniciar una nueva ronda de purificación de linfocitos. Se realizaron todos los ensayos ELISA posteriores como se describe en el ejemplo 1. Se hicieron los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (IH) con las cepas de vacuna homólogas como se describe en el ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las entradas son densidad óptica a 492 nm
x 1000 y títulos de IH de anticuerpos plasmáticos. "Células"
son anticuerpos de linfocitos fraccionados obtenidos a partir de 100
\mul de sangre.
Se había encontrado también que este sujeto
tenía títulos de IH significativos contra el componente de vacuna
A/Sydney/5/97 (H3N2) antes de la vacunación, y los anticuerpos
liberados de linfocitos no aumentaron significativamente del día 0
al día 9, ni el título de IH. La respuesta de vacuna de IH ante el
componente H1N1 A/Beijing/262/95 fue mala, y esto se observó
también para el ensayo celular. La respuesta observada más
claramente fue contra el componente de la gripe B B/Beijing/184/93,
en que los títulos de IH subieron de <10 a 40. Esto se reflejó
también para el ensayo celular.
Dejar la sangre a 4ºC durante 4 días, seguido de
4 horas a temperatura ambiente, no afectó a la actividad de
anticuerpo registrada de los linfocitos fraccionados. Los resultados
inmediatos y aquellos obtenidos después de almacenamiento durante 4
días no variaron en ninguna medida significativa.
Otros experimentos han mostrado también que
incluso después de 6 días en condiciones de almacenamiento similares
(refrigeración interrumpida por 6 horas a temperatura ambiente), no
se afectaba la medida consiguiente de anticuerpos de linfocitos
fraccionados.
Claims (22)
1. Un método de determinación de la presencia o
cantidad de anticuerpo recién sintetizado en una muestra de sangre
en respuesta a un inmunógeno que comprende:
detectar los anticuerpos liberados o partes de
los mismos en una muestra que contiene linfocitos que se han
fraccionado, con lo que se liberan los anticuerpos sintetizados o
partes de los mismos asociados a dichos linfocitos, con lo que se
determina la presencia o cantidad de anticuerpo recién sintetizado
en dicha muestra de sangre, en el que dicha muestra que contiene
linfocitos que se han fraccionado es dicha muestra de sangre o una
preparación de linfocitos preparada a partir de dicha muestra de
sangre,
en el que dicho anticuerpo recién sintetizado es
un anticuerpo antigénicamente activo que se ha producido o
sintetizado por y en una célula linfocítica en respuesta a la
presencia de un inmunógeno in vivo como parte de una
respuesta inmunitaria en curso.
2. Un método según la reivindicación 1, que
comprende las etapas de:
fraccionar los linfocitos de dicha muestra que
contiene linfocitos, con lo que se liberan los anticuerpos o partes
de los mismos asociados a dichos linfocitos; y
detectar los anticuerpos liberados o partes de
los mismos, con lo que se determina la presencia o cantidad de
anticuerpo recién sintetizado en dicha muestra.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que dicha muestra es sangre periférica.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra no se incuba para
promover la síntesis y/o secreción de anticuerpos antes del
método.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los linfocitos se fraccionan
usando medios de fraccionamiento físico o tampones o disoluciones
de fraccionamiento celular.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos anticuerpos o partes de
los mismos se detectan mediante la unión a uno o más antígenos que
reconocen dichos anticuerpos o partes de los mismos.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que los anticuerpos liberados se
detectan mediante un ensayo de unión en fase sólida.
8. Un método según la reivindicación 7, en el
que dicha fase sólida porta uno o más antígenos (antígenos en fase
sólida) reconocidos por el anticuerpo o anticuerpos o partes de los
mismos para detectar (anticuerpos diana).
9. Un método según la reivindicación 7, en el
que dicha fase sólida porta uno o más anticuerpos (anticuerpos en
fase sólida) que reconocen el anticuerpo o anticuerpos o partes de
los mismos para detectar (anticuerpos diana).
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el método se realiza en muestras
de sangre de neonatos o lactantes para distinguir entre anticuerpos
recién sintetizados y anticuerpos maternos transferidos
pasivamente.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que antes del fraccionamiento de los
linfocitos, o después del fraccionamiento pero antes de la etapa de
detección, se almacena dicha muestra aproximadamente a 4ºC o
menos.
12. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha muestra de sangre para uso
en el método, o para preparar linfocitos para uso en el método,
tiene un volumen de menos de 1 ml.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que se usan en el método los
linfocitos directamente aislados de dicha muestra.
14. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la etapa de detección se realiza
mediante inmunoensayo, preferiblemente ELISA.
15. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 ó 9 a 14, en el que se ponen en contacto con
dicha fase sólida uno o más antígenos reconocidos por los
anticuerpos diana inmovilizados sobre dicha fase sólida.
16. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14, en el que se ponen en contacto con dicha
fase sólida uno o más anticuerpos que reconocen los anticuerpos
diana inmovilizados sobre dicha fase sólida.
\newpage
17. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que se usa un sustrato soluble para
la etapa de detección y proporciona una señal
espectrofotométricamente detectable.
18. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que se usa un antígeno de control
negativo.
19. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 18, en el que se emplean múltiples fases
sólidas que portan cada una un antígeno diana diferente.
20. Un método de diagnóstico o monitorización de
infección de un animal humano o no humano o parte de dicho animal
mediante un inmunógeno, en el que dicho método comprende determinar
en una muestra que contiene linfocitos de dicho animal la presencia
o cantidad de anticuerpos recién sintetizados o partes de los mismos
asociados a dichos linfocitos dirigidos a dicho inmunógeno según el
método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
19, y determinar la presencia o extensión de la infección por dicho
inmunógeno por referencia a muestras de control y/o referencia
apropiadas.
21. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho inmunógeno es un antígeno
bacteriano o vírico y se determina el diagnóstico o monitorización
de la infección por la bacteria o virus fuente.
22. Un método según la reivindicación 21, en el
que dicho antígeno deriva de un virus seleccionado de la lista
consistente en herpesvirus simple, citomegalovirus, virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) y cualquiera de los virus de la
hepatitis, así como Toxoplasma y virus de
Epstein-Barr (EBV).
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