CZ299065B6 - Zpusob stanovení prítomnosti protilátky - Google Patents

Abstract

Zpusob stanovení prítomnosti nebo množství nove syntetizované protilátky ve vzorku telesné tekutinyv odpovedi na imunogen spocívá v detegování uvolnených protilátek nebo jejich cástí ve vzorku obsahujícím lymfocyty, které byly rozrušeny k uvolnení syntetizovaných protilátek nebo jejich cástí a spojených se zmínenými lymfocyty pro stanovení prítomnosti ci množství nove syntetizované protilátky v uvedeném vzorku. Zpusob muže být rovnež upraven pro umožnení detekce nespecifických indikátoru infekce.

Description

Předkládaný vynález se týká detekce protilátek, zejména detekce nedávno syntetizovaných protilátek, vytvářených v odpovědi na infekci nebo očkování a podobně, ve vzorcích, prostřednictvím jednoduché metody, zahrnující rozrušení lymfocytů před detegováním přítomnosti protilátky.

Dosavadní stav techniky

ELISA, heterogenní enzymové imunostanovení, se již dlouho používá k detegování a měření hladin protilátek (nebo antigenu). Obvykleji se ELISA používá jako serologické stanovení, ovšem rovněž se používá ke studiu imunochemických vlastností antigenů nebo protilátek a často nachází uplatnění, například při hodnocení a charakterizaci imunitních odpovědí, při stanovení produkce protilátek buněčnými kulturami, v hybridomové technologii a podobně.

Stanovení ELISA má jednoduché použití, je citlivé a poměrně rychlé, je ale schopné pouze jednoduchého změření přítomnosti cílové protilátky ve vzorku. Nedokáže rozlišovat mezi probíhající syntézou protilátek v odpovědi na antigen a protilátkami již přítomnými od minulé infekce, nebo pasivním přenosem a podobně. Zatímco v některých případech může dostačovat získání jednoduché informace, která se týká přítomnosti protilátek, v jiných případech je žádoucí mít schopnost stanovit, zda jsou detegované cílové protilátky akutně syntetizovány lymfocyty v době testování, například v průběhu očkování, nebo při diagnóze infekce u kojenců rozlišit pasivně přenesené mateřské protilátky. Toho nelze dosáhnout klasickou metodou ELISA.

Proto byly vyvinuty další metody, které umožňují detekci právě probíhající syntézy protilátek.

V tomto ohledu lze zvláště zmínit stanovení enzymově vázaného imunitního spotu (ELISPOT, známé rovněž jako spot ELISA nebo plakové stanovení ELISA), jakje shrnuto například Czerkinskym se spoluautory v „ELISA and other Solid Phase Immunoassays“, vydavatelé D. M. Kenneny a S. J. Challacombe, 1988, kapitola 10, 217-239. Tento postup, založený na metodě ELISA, umožňuje výčet lymfocytů, vylučujících protilátky vůči jednomu nebo více cílovým antigenům.

V zásadě je ELISPOT variantou metody ELISA, kde buňky vylučující protilátky (ASC, antibody secreting cells) mohou být odhaleny kultivací lymfocytů ve speciálně modifikovaných jamkách

ELISA, povlečených cílovým antigenem a náhradou standardních reakčních činidel ELISA komplexy enzymu a substrátu, což poskytuje zbarvené sraženiny (spoty), přiléhající k sekrečním buňkám. Spoty potom mohou být počítány k zjištění množství buněk, produkujících protilátky. Inhibitory syntézy bílkovin lze přidat do kultivačního média k potvrzení toho, že detegované spoty vznikly syntézou protilátek de novo během inkubační doby in vitro.

Zatímco technika ELISPOT byla potvrzena jako velmi užitečná při studiu dynamiky humorálních imunitních odpovědí a používala se k detekci spontánních ASC, vyskytujících se dočasně v periferním oběhu imunizovaných subjektů, určité znaky této metody vyvolávaly omezení při jejím použití v klinické diagnostice. Jednak, vzhledem ktomu, žeje potřeba počítat každý vzorek jednotlivého spotu, což je časově náročné a pracné, tato metoda není zvláště vhodná pro analýzu velkých množství vzorků, což je běžné v laboratoři pro klinickou diagnostiku. Za druhé je možné počítat pouze množství buněk vylučujících protilátky v každém vzorku a obecně řečeno to vyžaduje přijatelně velké objemy vzorků, například v několika mililitrech. Destičky ELISPOT jsou rovněž drahé a stanovení není snadné přizpůsobit automatizaci.

WO 96/26443 popisuje použití modifikovaného testu ELISA, který lze použít k detekci probíhající syntézy protilátek. V tomto stanovení se lymfocyty po izolaci kultivují a stanovují se hladiny protilátek, produkovaných během této doby kultivace. Tato technika tedy nezbytně vyžaduje inkubaci lymfocytů v testovaném vzorku při teplotě přibližně 37 °C k umožnění změření protilá-1 CZ 299065 B6 tek, vylučovaných během inkubace. Střední doba inkubace činí 2 až 5 hodin, což představuje významné omezení rychlosti provedení takového měření. Inkubace rovněž vyžaduje vhodné vybavení na místě testování, tak, aby mohla být prováděna bezprostředně před průběhem stanovení. To obecně znamená, že stanovení lymfocytů musí být prováděno krátce po odebrání vzorku subjektu, neboť uchovávání vzorků, například zamražením, není přijatelné vzhledem k vyplývajícímu snížení životnosti buněk. Vyčištěné buňky mohou být udržovány živoucí pouze po poměrně krátké období skladováním v ledu při 0 °C nebo při nižší teplotě, s výhodou při 4 °C.

Je tedy zřejmé, že navzdory pokrokům v technikách stanovení protilátek stále přetrvává potřeba ío dalšího zlepšeného stanovení, které by bylo jednoduché, rychlé a cenově výhodné, které by spolehlivě poskytlo přesnou kvantifikaci spontánně vylučovaných protilátek, které by bylo schopné rozlišit syntézu protilátek de novo a které by mohlo být prováděno ve vzorcích, například ve vzorcích krve, k diagnostickým účelům. Předkládaný vynález reaguje na tuto potřebu.

Ve výše popsané technice byla používána doba kultivace ve shodě s tehdy běžným úsudkem, za předpokladu, že to bylo nezbytné k získání dostatečného titru protilátek pro získání výsledků k imunodiagnostickým účelům.

V literatuře bylo již dříve prokázáno, že biosyntéza protilátek (imunoglobulinů) se uskutečňuje v lymfocytech B (viz: I. Roitt, J. Brostoff, D. Male: Immunology, 4. vydání, vydavatel Mosby,

Londýn 1996, 6.12-6.13), z nichžjsou poté vylučovány do krevního toku k bóji s infekcí. V době kdy jsou vylučovány buňkami produkujícími protilátky (ASC, antibody-secreting cells), jsou molekuly plně sestavené (například molekula IgG má dva těžké řetězce a dva lehké řetězce, spojené disulfidovými můstky) a glykosilované. Jako krok limitující rychlost biosyntézy protilá25 tek byly prokázány nitrobuněčný transport a glykosilace prostřednictvím endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu (což trvá jednu hodinu či více), zatímco biosyntéza různých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů vyžaduje ke svému dokončení pouze minuty. Odhaduje se, že průběh syntézy a vylučování protilátek vyžaduje celkově dvě hodiny (Melchers, Histochemical J. 3,389-397, 1971).

V důsledku rychlého vylučování imunoglobulinů z buněk se dříve nikdy neočekávalo, že funkční protilátky nebo i částečně syntetizované protilátky (například před glykosilací) by mohly být přítomny v buňkách lymfocytů v jakémkoliv významnějším množství. Dále se neočekávalo, že rozrušení lymfocytů ve vzorku by mohlo poskytnout dostatečná množství „nově syntetizovaných protilátek“ pro umožnění detekce k imunodiagnostickým účelům.

Překvapivě bylo zjištěno, že buněčný obsah lymfocytů obsahuje dostatek protilátek k umožnění detekce a dokonce ke kvantifikaci akutní syntézy protilátek u subjektu, pokud jsou vzorky k analýze odebírány během akutní fáze imunitní odpovědi. Obecně k tomu dochází v přibližně stejném časovém intervalu, v jakém lze očekávat, že se buňky, které vylučují protilátky, objeví v periferní krvi. To tedy poskytuje užitečnou informaci, kterou lze využít diagnosticky.

Výhodně se tak obchází potřeba dlouhé inkubace vzorku, například přípravku vyčištěných lymfocytů, před samotným stanovením, neboť toto stanovení žádnou inkubaci lymfocytů nevyžaduje.

Stanovením podle vynálezu se rovněž poskytuje spolehlivé stanovení, v němž mohou být vzorky před přípravou stanovení skladovány, například v ledničce (s výhodou přibližně při 4 °C), nebo zamražené, například při teplotě menší než 0 °C. Odborníci v oboru ocení, že se spíše než zamražování celé krve s výhodou používá ochlazení celé krve (například jak je popsáno dále), neboť takové zamražování vyvolává lyži buněk. Ovšem vzorky, jako jsou vyčištěné lymfocyty, mohou být zamraženy nebo uchovávány v chladu před prováděním stanovení podle vynálezu, aniž by to ovlivnilo výsledky testu. Vzorky tedy mohou být před stanovením skladovány po delší časové období dokonce za použití metod, které mohou záporně ovlivnit životnost buněk (například podobným způsobem, jako se skladují vzorky séra nebo plazmy). V důsledku toho metoda stano55 vení podle vynálezu poskytuje významné výhody pro odebírání vzorku, jeho skladování a zpra-2CZ 299065 B6 covávání a zvláště umožňuje významně pozdržet provedení stanovení, což může být nezbytné při laboratorním testování vzorku, který byl získán v terénu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález v jednom ohledu poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek ve vzorku v odpovědi na imunogen, což zahrnuje kroky, v nichž:

se získá vzorek, obsahující lymfocyty;

se rozruší uvedené lymfocyty k uvolnění protilátek nebo jejich částí, asociovaných s uvedenými lymfocyty;

se detegují uvolněné protilátky nebo jejich části pro stanovení přítomnosti či množství nově syntetizovaných protilátek ve zmíněném vzorku.

Tak, jak je zde používán, týká se výraz „nově syntetizované protilátky“ antigenně aktivních protilátek (to znamená schopných rozpoznání a navázání se na antigen, odpovídající imunogenu), které byly vytvořeny (produkovány) nebo syntetizovány buňkami lymfocytů a v buňkám lymfocytů jako odpověď na přítomnosti imunogenu in vivo, jako část probíhající imunitní odpovědi. Protilátky jsou tedy syntetizovány lymfocyty v průběhu imunitní odpovědi vyvolané přítomnosti imunogenu in vivo, to jest syntetizované předtím, než je vzorek, obsahující lymfocyty, odebrán z živočišného subjektu a v době takového odběru.

Odkaz na protilátky nebo jejich části, spojené s uvedenými lymfocyty, se týká nově syntetizovaných protilátek nebo jejich částí, které jsou antigenně aktivní (to znamená schopné rozpoznat antigen a navázat se na něj) a které dosud nebyly z buněk uvolněny. Jak bylo dříve zmíněno, obecně to odpovídá protilátkám, produkovaným v předcházejících dvou hodinách (což může nastat pouze in vivo nebo alespoň částečně in vitro před rozrušením buněk, v případě, že buňky jsou uchovávány ve vhodných podmínkách), ačkoliv časový průběh sekrece se může odlišovat. Zatímco protilátky mohou být buňkami produkovány rychle (například během jedné až dvou minut, sekrece je spíše pomalejší), volné řetězce, které vytvářejí protilátky, nebo neglykosilované či částečně glykosilované protilátky anebo řetězce protilátek, mohou být v lymfocytech přítomny a tedy z nich i uvolňovány při jejich rozrušení. Pokud je to vhodné, tyto „části“ mohou být detegovány a zahrnuty v měření přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek za předpokladu, že jsou antigenně aktivní, jak bylo popsáno výše. Protilátky nebo jejich části, uvolňované z lymfocytů, zahrnují nově syntetizované protilátky. Stanovení hladin takto nově syntetizovaných protilátek poskytuje odpovídající informaci o množství produkovaných aktivních protilátek, které vzniká v odpovědi na zvláštní imunogen, to znamená, že protilátky jsou produkovány jako část probíhající, například chronické nebo akutní, imunitní odpovědi. Předkládaný vynález tedy poskytuje rovněž způsob stanovení přítomnosti nebo množství produkce aktivních protilátek ve vztahu k hladinám nově syntetizovaných protilátek ve vhodných kontrolních vzorcích.

Vzorek, obsahující lymfocyty, může být odebrán každému živočichu, s výhodou savci, například lidskému subjektu, který byl před odebráním vzorku vystaven imunogenu. Obvykle, když má být imunitní odpověď detegována způsobem podle vynálezu bude způsobena nedávnou infekcí nebo očkováním aje žádoucí odebrat vzorek v průběhu několika týdnů nebo v průběhu několika dnů od vystavení imunogenu. Optimální doba k odebrání vzorku od subjektu bude záviset na povaze infekce nebo na typu použité vakcíny aje dále určena účinností mechanismu imunitní odpovědi subjektu, která se mezi jednotlivci může lišit. Ovšem žádoucí je odebírat vzorek v době, kdy jsou lymfocyty imunitního systému subjektu ve fázi akutní syntézy protilátek v odpovědi na daný imunogen. Obecně tak bude zjištěno, že se vzorek výhodně odebírá v průběhu tří týdnů od vystavení subjektu působení imunogenu, ještě lépe v průběhu 8 až 12 dnů od infekce nebo očkování.

V některých případech ovšem dostatečná produkce protilátek pro získání významných výsledků

-3 CZ 299065 B6 ze stanovení podle vynálezu nastane v průběhu 1 až 5 dnů nebo ještě specifičtěji 2 až 3 dnů po infikaci nebo očkování.

Vzorkem může být vzorek krve nebo vzorek odvozený od lymfatického systému subjektu. Obec5 ně může být vhodná jakákoliv tělesná tekutina nebo tkáňový vzorek, obsahující lymfocyty imunitního systému subjektu. Zvláště výhodně mohou být odebírány lymfa či periferní krev subjektu v klinickém nebo experimentálním prostředí, ale stejně vhodné jsou jakékoliv lymfatické nebo lymfoidní tkáně nebo jakýkoliv zdroj krve obsahující lymfocyty, včetně vzorků, získaných z lymfatických uzlin či žláz nebo lymfatických uzlíků, například tonsil. Byly vyvinuty chirurgicío ké intervenční techniky, které umožňují odběr bioptického materiálu subjektu a takové postupy mohou být použity, pokud je to vhodné, i k odběru vzorku pro použití ke způsobu podle vynálezu. V závislosti za zdroji lymfocytů může a nemusí být nezbytné oddělit a vyčistit lymfocyty před stanovením způsobem podle vynálezu. Ovšem pokud je to nezbytné nebo žádoucí, mohou být lymfocyty vyčištěny. Výhodně tedy je vzorek, použitý ve stanovení, lymfocytovým připravíš kem, připraveným z jednoho z výše uvedených zdrojů postupy známými v oboru.

Rozrušením lymfocytů se rozumí to, že obsah buněk, včetně syntetizovaných protilátek, je uvolněn za hranici buněčné membrány a vnitřních membránových struktur, takže ho lze detegovat jakýmkoliv běžným biochemickým nebo chemickým stanovením. Je známo, že imunoglobuliny jsou syntetizovány a vylučovány během průchodu endoplazmatickým retikulem a Golgiho aparátem. Rozrušení tedy nezbytně vyžaduje uvolnění z těchto vnitřních struktur. Proto může být rozrušení lymfocytů dosaženo známými postupy rozrušování buněk, umožňujícími uvolnění obsahu membránových struktur, například buněčnou lyží za použití například fyzikálních rozrušovacích prostředků, jako je cyklus zmražení a roztátí, nebo chemickými prostředky, za použití pufrů nebo roztoků rozrušující buňky.

Tak, jak jsou zde použity, výrazy „detegování“ a „stanovení“ přítomnosti nebo množství“ znamenají oba jak kvantitativní, tak kvalitativní určení hladiny produkce protilátek, ve smyslu získání absolutní hodnoty pro množství produkovaných protilátek ve vzorku a rovněž index, poměr, pro30 centní množství nebo podobné určení hladiny produkce protilátek, stejně jako semikvantitativní nebo semikvalitativní určení. Výraz „stanovení přítomnosti“ zahrnuje rovněž situace, kdy se uplatňuje negativní výsledek, naznačující nepřítomnost syntetizovaných protilátek při stanovení imunitní odpovědi subjektu. Negativní výsledek může například ukazovat na nepřítomnost imunitní odpovědi vůči danému imunogenu nebo může být příznakem chronické infekce, pokud jsou protilátky vůči zmíněnému imunogenu přítomné v séru.

Detekce nově syntetizovaných protilátek umožňuje spíše než stanovení veškerých protilátek, přítomných v buňkách, stanovení hladin takových protilátek, které jsou specifické vůči jednomu imunogenu či většímu počtu imunogenů.

Detekce syntetizovaných protilátek může probíhat jakýmkoliv způsobem, který je přípustný k identifikaci takových protilátek, které se navazují na imunogen, vyvolávající imunitní odpověď. Lze tedy použít jakoukoliv detekční techniku, jejímž výsledkem je poskytnutí signálu, který odráží přítomnost cílových protilátek. Použita mohou být například enzymová stanovení, v nichž může být ze substrátu vytvářen rozpustný nebo nerozpustný produkt, jehož množství lze stanovit.

Výhodně mohou být syntetizované protilátky detegovány například prostřednictvím vazebného stanovení na pevné fázi, například ELISA, kde se navážou na antigen použitý ve stanovení, i když tento použitý antigen se může odlišovat od imunogenu, prvotně stimulujícího imunitní odpověď. Takže zatímco jak antigen použitý ve stanovení, tak i imunogen, který stimuloval nebo stimuluje produkci protilátek in vivo, by měly být k protilátkám, jež mají být detegovány, vázány vzhledem k identickým nebo velmi podobným epitopům, v jiných ohledem nemusejí být antigen a imunogen shodné. Takže zatímco antigenem, použitým ve způsobu podle vynálezu, může být materiál, obsahující veškeré nebo některé části odpovídajícího imunogenu, odvozené například od infikovaných jedinců, nebo od vyčištěných částí ze stejného nebo podobného materiálu,

-4CZ 299065 B6 podobně může být antigen připraven synteticky, například chemickou syntézou nebo rekombinantní expresí s přidanými nebo vypuštěnými částmi, vztahujícími se k přírodnímu antigenu. Lze tedy použít spojené bílkoviny (fusion proteins), nebo molekuly, vykazující pouze vhodný epitop či epitopy.

Oproti známým technikám stanovení protilátek poskytuje předkládaný vynález několik výhod. Jednak, na rozdíl od technik, které detegují hladiny sérových protilátek (například ELIS A v séru) předkládané stanovení deteguje protilátky, které dokládají probíhající infekci/imunitní stimulaci, nebo v případě novorozenců umožňují oddělení mateřských a novorozeneckých protilátek. Je to umožněno tím, že lymfocyty vzorku jsou používány přímo ve způsobu stanovení podle vynálezu, bez použití jakékoliv jiné formy předchozího stanovení nebo stimulace, například stimulace in vitro antigenem. Jsou tedy detegovány protilátky, které byly lymfocyty syntetizovány v době odběru vzorku. (Tímto způsobem a při použití i malých objemů vzorku může být odlišena spontánně probíhající syntéza protilátek v odpovědi na daný imunogen od předchozí aktivace lymfo15 cytů). Stanovení se rovněž provádí na lymfocytech, které byly rozrušeny během stadia, kdy spontánně produkovaly a vylučovaly, nebo počínaly vylučovat protilátky, bez stimulace buněk k vynaložení paměti. To se odlišuje od jiných zveřejněných způsobů, které využívají antigenní stimulaci in vitro, která může zvýšit citlivost testu, ale zahrnuje buněčnou paměť a proto není přesnou nebo vhodnou technikou k detegování akutně vytvořených nebo nově syntetizovaných protilátek v odpovědi na probíhající infekci, nebo na nedávné očkování.

Předkládaný vynález na druhé straně využívá spontánního vylučování (sekrece) protilátek k umožnění detekce protilátek v krvi, což charakterizuje probíhající infekci, vyvolanou testovaným antigenem; plazmatické lymfocyty budou vylučovat protilátky vůči testovanému antigenu během prvních několika týdnů po infekci, nebo očkování a podobně. Detekce takových protilátek způsobem podle předkládaného vynálezu umožňuje diagnostikování nebo stanovení infekce nebo monitorování imunitní odpovědi na očkování.

Předkládaný vynález tedy v dalším aspektu poskytuje způsob diagnostikování nebo monitorování infekce u lidí nebo zvířat nebo v určité části uvedeného zvířete, pomocí imunogenu za využití způsobu podle vynálezu a stanovení přítomnosti nebo rozsahu infekce uvedeným imunogenem ve srovnání s vhodnými kontrolami a/nebo srovnávacími vzorky.

Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný u kojenců a novorozenců, kde je důležité rozlišit nově syntetizované protilátky od pasivně přenesených protilátek. Stejný vzorek obsahující lymfocyty může být analyzován vzhledem k protilátkám vůči několika odlišným infekčním agens buď v oddělených stanoveních, nebo v jediném stanovení za použití několikanásobných odpovídajících antigenů, což umožňuje použití odpovídajících kontaktních antigenů souvisejících s klinickým příznakem, který pacient vykazuje.

Při diagnóze infekcí je rovněž důležité mít možnost rozlišit probíhající syntézu protilátek od protilátek již existujících z doby infekce předchozí. Opětné vyvolání imunologické paměti antigenní stimulací in vitro není v souladu se stanovením, majícím za cíl identifikovat probíhající akutní infekci a proto tuto výhodu nesdílejí dřívější způsoby, založené na antigenní stimulaci. Zařazení kroku antigenní stimulace by také ohrozilo výhodný časový faktor stanovení podle vynálezu, které se provádí velmi rychle ve srovnání s předchozími způsoby.

Dále na rozdíl od postupů, které detegují buňky, vylučující protilátky nebo protilátky aktivně vyloučené, v předkládaném vynálezu není potřebné udržovat vzorek za podmínek, podporujících syntézu a/nebo sekreci protilátek, ačkoliv akutní syntéza protilátek vytváří základní parametr detekce. To značně zjednodušuje test aje to velkým přínosem ve srovnání s dříve známým stanovením, uvedeným ve WO 96/26443, které vyžaduje inkubaci lymfocytů po odebrání vzorku a rovněž jejich uchovávání během stanovení v takových podmínkách, které umožňují pokračující vylučování protilátek lymfocyty.

-5CZ 299065 B6

Zvláště překvapujícím přínosem předkládaného vynálezu bylo vyhnutí se jakémukoliv kroku inkubace nebo jakýmkoliv speciálním podmínkám stanovení, a to znamená, že vzorky mohou po svém odebrání být výhodně upravovány k jejich rozrušení nebo k lyži buněk a vzniklý lyzát může být poté uchováván například zamražením nebo ochlazením po dobu před prováděním stanovení.

Jinou možností, jak bylo uvedeno dříve, je skladování vzorku například celé krve nebo vyčištěného přípravku například zamražením či ochlazením (jak je potřeba, v závislosti na vzorku) po časové období například až do několika hodin či dnů, například více než po 4 hodiny, než je proio vedeno rozrušení buněk. Vyčištěný přípravek lymfocytů může být například uchováván zamražený po dobu například několika hodin či dnů, nebo ochlazený, například po několik hodin, je-li to nezbytné nebo žádoucí, před ovlivněním vzorku k rozrušení buněk. Například vyčištěné lymfocyty mohou být skladovány při teplotě 4 °C po dobu několika hodin, například až do 4 či 6 hodin před jejich ovlivněním, vyvolávajícím rozrušení nebo lyži buněk.

Bylo ovšem překvapivě zjištěno, že některé vzorky, například přípravky celé krve, mohou být uchovávány schlazené po delší časová období, aniž by byly buňky poškozeny a narušovaly výsledky testu. Bylo například zjištěno, že vzorky celé krve mohou být ochlazené uchovávány (například při 4 °C) po dobu alespoň 6 dnů a pokud je to žádoucí, mohou být mezitím vzorky uchovávány při teplotě místnosti (18 až 25 °C) po dobu alespoň 6 hodin před zahájením postupu vyčištění lymfocytů, aniž by došlo k zápornému ovlivnění účinnosti testu. To je zvláště výhodné, pokud jsou vzorky krve odebírány v laboratoři a skladují se v ochlazeném stavu do té doby, dokud nejsou získány výsledky rutinního nebo přídavného testování plazmy/séra. Je to překvapující a neočekávané, neboť to naznačuje, že fyzikální integrita (celistvost) lymfocytů se během skladování zachovává, což umožňuje následně vyčištění lymfocytů z uchovávané krve (pokud je to žádoucí) a rozrušení lymfocytů, aniž by došlo k významnému snížení detegovaných protilátek.

V upřednostňovaném ztělesnění před rozrušením lymfocytů například pokud je vzorkem krev, může tedy být vzorek skladován po několik dnů, například přibližně až 6 dnů či více, zvláště pokud je skladován v ochlazeném stavu při teplotě přibližně 4 °C a dokonce je možné vyjmout vzorek ze studeného prostředí po opakující se časová období, například 4 až 6 hodin, například při teplotě místnosti, při dvou či více příležitostech během období jeho skladování, aniž by došlo k zápornému ovlivnění výsledku stanovení. To je zvláště vhodné pokud jsou vzorky krve skladovány za chlazení a současně je nevyhnutelné, aby byl vzorek ponechán na stole při teplotě míst35 nosti po krátké časové období. Překvapivě bylo zjištěno, že životnost buněk není natolik ovlivněna, aby ovlivnila přijatelné výsledky, získané způsobem podle vynálezu. V dalším upřednostňovaném ztělesnění, kdy se používají vyčištěné přípravky lymfocytů, mohou být tyto vzorky uchovávány při teplotě nižší než 4 °C (například po několik dnů nebo déle) nebo uchovávány při teplotě vyšší než 4 °C (po dobu do 6 hodin). Možnost skladování různých vzorků pro použití ve stanovení činí způsob podle vynálezu zvláště vhodným pro větší diagnostické laboratoře, kde nákladné automatické laboratorní vybavení, například hardware pro ELISA, může být nejúčinněji využíváno za použití značného množství vzorku současně. To také znamená, že vzorky mohou být odebírány na mnoha různých místech a posílány nebo dodávány do centrální diagnostické laboratoře k analýze podobným způsobem, jako je tomu u postupů k analyzování chemických sérových vzorků v j iných typech testů.

Z jiného pohledu tedy vynález poskytuje způsob stanovení přítomnosti či množství nově syntetizovaných protilátek ve vzorku, vzniklých jako odpověď vůči imunogenu, který obsahuje kroky, v nichž se:

detegují uvolňované protilátky nebo jejich části ve vzorku obsahujícím lymfocyty, které byly rozrušeny pro uvolnění syntetizovaných protilátek nebo jejich částí, spojených s uvedenými lymfocyty, k tomu, aby bylo možné stanovit přítomnosti či množství nově syntetizovaných protilátek v uvedeném vzorku.

-6CZ 299065 B6

Hlavní výhodou předkládaného vynálezu je to, že je vyžadován pouze malý objem vzorku. Ve způsobu podle vynálezu může detegovatelný signál poskytnout dokonce pouze 100 000 lymfocytů nebo ještě méně než 50 000 lymfocytů. Vzhledem ktomu, že například 1 ml krve obsahuje lxlO⁶ lymfocytů, pokud se použije způsob podle vynálezu ke stanovení lymfocytů odvozených z krve, dostačuje pouze 50 nebo 100 μΐ krve k poskytnutí dostatečného počtu lymfocytů pro dané stanovení. I když se počítá s příslušnými kontrolními testy (například srovnávacím vzorkem), poskytnutí diagnostických výsledků může být použito 150 až 300 μΐ. Jakmile je test jednou standardizován, mohou být alespoň některé kontrolní vzorky vynechány. Test podle vynálezu tedy výhodně vyžaduje například 50 až 500 μΐ, lépe 100 až 300 μΐ a běžně 100 až 200 μΐ vzorku obsaio hujícího lymfocyty ve srovnatelném objemu se zdrojem celého vzorku. Způsob podle vynálezu může tedy využívat například 5x10⁴ až 5x10⁵ a lépe 1 až 2x10⁵ lymfocytů. Tím se liší od klasických diagnostických testů, které obecně vyžadují několika mililitrové objemy séra nebo jiné tekutiny. Je to zvláště výhodné v případě odebírání krevních vzorků, kdy jsou dostupné pouze malé vzorky, například od novorozenců, neboť způsob podle vynálezu vyžaduje pouze objemy vyjádřené v mikrolitrech, které lez odebrat například kapilárou z vhodného místa, jako je špička prstu nebo ušní lalůček nebo pata.

Způsob podle vynálezu dovoluje použití malých objemů krevních vzorků (například mikrolitrových objemů, menších než 1 ml, s výhodou než 500 μΐ, například menších než 100 μΐ) přímo ke stanovení spontánní nebo de novo produkce protilátek nestimulovanými lymfocyty bez předchozího kroku předběžné kultivace lymfocytů před stanovením.

Antigeny nebo imunogeny, vůči nimž jsou protilátky pro detekci způsobem podle vynálezu zacíleny, zahrnují jak bakteriální, tak i virové antigeny. Klinicky důležité antigeny zahrnují, ale neomezují se na ně, antigeny například z viru Herpes Simplex, z cytomegaloviru, z viru lidské imunodeficience (HIV) a jakékoliv antigeny virů hepatitidy, stejně jako toxoplazmy a viru Epstein-Barr (EBV). Obecně však může být způsobem podle vynálezu detegován jakýkoliv imunogen, vzniklý v důsledku infekce nebo očkování, vyvolávající čistě protilátkovou odpověď. V případech, kde chronická infekce vyvolává detegovatelné hladiny cílových protilátek v lymfo30 cytech, může být stanovení těchto protilátek rovněž provedeno způsobem podle vynálezu. Protilátky vůči jakémukoliv imunogenu, které mohou být detegovány za použití běžné metody ELISA, lze tedy například detegovat způsobem podle předkládaného vynálezu. Detekce protilátek vůči takovým antigenům je možné použít k rychlému určení, zda jsou pacienti infikováni, například pro účely krevního stanovení nebo pro potvrzení a/nebo monitorování infekce.

Předkládaný vynález tedy dále poskytuje způsob diagnózy nebo monitorování infekce u lidí nebo zvířat nebo v části živočicha, způsobené bakterií či virem, přičemž uvedený způsob zahrnuje stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek nebo jejich částí zaměřených proti tomuto imunogenu, spojených s lymfocyty ve vzorku odvozeném z lymfatických uzlin člověka nebo zvířete, a stanovení přítomnosti nebo rozsahu infekce tímto imunogenem ve vztahu ke vhodné kontrole a/nebo srovnávacím vzorkům.

Způsob je zvláště výhodný vzhledem ke své jednoduchosti a může být použit i v nepřítomnosti laboratorního vybavení, například v polních podmínkách. S ohledem na nulové požadavky na inkubaci vzorku jako části stanovení je způsob snadno přizpůsobitelný automatizovaným postupům, je však také poměrně rychlý a snadno se jím provádí buněčná lyže a detekce protilátek v situacích, kdy není dostupné kompletní vybavení.

Způsob podle vynálezu bude nyní podrobněji popsán. První krok způsobu s výhodou zahrnuje izolaci lymfocytů ze vzorku. Jak bylo dříve uvedeno, není nezbytně vyžadován vyčištěný přípravek lymfocytů a místo něho může být použit přípravek, z něhož byla většina plazmatických protilátek odstraněna. Takový přípravek může s výhodou obsahovat méně než 15 % protilátek, podílejících se na množství plazmatických protilátek přítomných ve vzorku, například méně než 5 % a s výhodou méně než 1 %. Toho může být výhodně dosaženo použitím přípravku v podstatě neobsahujícího plazmu (obsahujícím například méně než 5 %, objem/objem), například přípravku

-7CZ 299065 B6 bez obsahu séra. Lymfocytový přípravek může být připraven za použití standardních postupů, které jsou v oboru dobře známé, například za použití filtračních metod, nebo postupů využívajících absorpční materiál nebo sady lymfocytových přípravků. K získání lymfocytů, například z heparinizované krve, krve ošetřené EDTA a podobně, tak mohou být například použity různé přípravky celé krve, jaké se rutinně připravují v klinických laboratořích. Je nutno ocenit, že veškeré obohacené nebo vyčištěné přípravky musí obsahovat lymfocyty přítomné ve vzorku, ze kterého je přípravek získán k umožnění detekce spontánní nebo de novo produkce protilátek.

Lymfocyty jsou s výhodou odděleny, například za použití standardního média pro separaci lymfocytů, jako je Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norsko), nebo za použití imunomagnetické separace (IMS) nebo podobných separačních systémů na základě pevné fáze, nebo jiných běžných postupů. V případě IMS nebo podobných separačních postupů lze k výběrovému oddělení vhodných lymfocytů použít pevné fáze, například magnetických perliček povlékaných protilátkami, specifickými vůči určitým typům leukocytů. Pokud se používají oddělené lymfocy15 ty, mohou být buňky před použitím promyty za použití standardních promývacích metod. Lymfocyty se s výhodou promývají k odstranění jakýchkoliv plazmatických protilátek, které mohou být přítomny po oddělení buněk. Obecně se k provedení vynálezu udržuje kontaminace lymfocytárních buněk plazmovými protilátkami na minimu a s výhodou je nižší než 20 ng plazmatického IgG na 100 μΐ vzorku, což představuje přibližně faktor konečného naředění plazmy 1:50 000;

například je nižší než asi 0,5 ng sérového IgG na 100 μΐ vzorku. Bylo ovšem pozorováno, že pro dosažení tohoto minima není nezbytné přídavné nebo důkladné promývání buněk. Například bylo zjištěno, že lymfocytový přípravek dostatečně neobsahující kontaminující sérové a/nebo plazmatické protilátky lze získat trojnásobným jednoduchým odstředěním celé krve po naředění pufry za přibližně stejných podmínek otáčení. Další podrobnosti viz příklad 3.

Obecně řečeno, způsob podle vynálezu se vyhýbá potřebě inkubovat lymfocyty ze vzorku před prováděním stanovení. Je ovšem nutné ocenit, že pokud jsou buňky udržovány po krátká časová období za podmínek, umožňujících spojitou produkci nebo sekreci protilátek před rozrušením lymfocytů, bude způsob podle vynálezu stále umožňovat stanovení nově syntetizovaných protilá30 tek spojených s lymfocyty.

Analyzovaný vzorek, který byl ovlivňován tak, jak je zmíněno výše, je v případě potřeby získat oddělené lymfocyty poté rozrušen k uvolnění nově syntetizovaných protilátek. To se provádí jakýmkoliv vhodným postupem známým z dosavadního stavu techniky, který účinně rozrušuje vnější a vnitřní membránové struktury, aniž by narušoval schopnost uvolněných protilátek vázat se na komplementární epitopy, například použitím detergentů chaotropních činidel, rozrušovacích pufrů obsahujících například EDTA (kyselinu ethylendiamintetraoctovou), nebo alternativními postupy rozrušen, jako je sonikace (rozrušení ultrazvukem) nebo fyzickým rozrušením, vytvářejícím střihové napětí. S výhodou se ovšem používá rozrušovací pufr, neboť je to obecně nej výhodnější technika, popsaná například v příkladech, to znamená pufr s obsahem detergentu, jako je 0,5% deoxychelát. Vhodné rozrušovací pufry mohou být použity ke stabilizaci uvolněných protilátek, například k řízení pH nebo degradace pufry obsahující proteázové inhibitory. V případě nezbytnosti lze použít například pufry, obsahující proteázové inhibitory. Alternativní metody rozrušení zahrnují například použití cyklů zmražení a rozmražení nebo dokonce použití kapalného dusíku. Výsledkem je lyzát, v němž se uvolněné protilátky nacházejí v roztoku, který se používá pro následující kroky. Je nutné zmínit, že k získání dostatečných množství nově syntetizovaných protilátek ve vzorku, jež mají být detegovány, je žádoucí, aby bylo co největší množství buněk lymfocytů rozrušeno pro uvolnění protilátek. Prostředky k rozrušení jsou proto s výhodou směřovány k tomuto cíli a ve vzorkuje rozrušeno alespoň 40 nebo 50 %, lépe alespoň 60, 70 nebo 80 % a ještě lépe alespoň 90 z 95 % lymfocytů, přítomných ve vzorku. Po rozrušení lymfocytů je obsah protilátek ve vzorku stanoven vhodným postupem, který umožňuje detekci cílových protilátek. Vzorek je proto s výhodou uveden do styku s pevnou fází, nesoucí vhodný vazebný člen k imobilizování detegovaných protilátek nebo protilátky. Vazebným členem jsou s výhodou antigen (imunogen) nebo antigeny (tj. jeden nebo více) rozpoznávané protilátkou nebo protilátka55 mi či jejich částmi, které mají být detegovány. V jednom ztělesnění tedy předkládaný vynález

-8CZ 299065 B6 poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizované protilátky ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje kroky, ve kterých:

se uvedou do styku alikvotní podíly uvedeného vzorku nebo volitelně lymfocytů přímo izolova5 ných ze zmíněného vzorku, kde uvedené lymfocyty byly rozrušeny k uvolnění protilátek nebo jejich částí spojených s uvedenými lymfocyty, s jedním nebo více zantigenů, s výhodou nesených pevnou fází, rozpoznávanými protilátkou nebo protilátkami, které mají být detegovány;

se deteguje vazba protilátky na uvedený antigen či antigeny;

a srovná se vazba uvedené protilátky ke kontrolním a/nebo referenčním vzorkům pro stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizované protilátky v odpovědi vůči zmíněnému antigenu či antigenům. V tomto způsobu mohou být kontrolním nebo srovnávacími vzorky vhodné negativní nebo pozitivní kontroly, například slepé vzorky, normální vzorky nebo rozvolněné vzorky.

Použít lze rovněž alternativních vazebných partnerů, například bílkoviny A, bílkoviny G, nebo protilátek, které rozpoznávají protilátku, která má být detegována a vážou se kní. V posledním případě není vyžadována vysoce specifická vazba, neboť v tomto ztělesnění způsobu stanovení je specifičnost vnesena následnou vazbou antigenů, které se vážou specificky na protilátky, které mají být detegovány. Ve všech ztělesněních je tedy vytvořen komplex specifického antigenu a protilátky. Přítomnost takových komplexů, s výhodou imobilizovaných (znehybněných) na pevné podložce, se zjišťuje v detekčním kroku způsobu podle vynálezu. V upřednostňovaném rysu tedy detekční krok způsobu podle vynálezu zahrnuje detekci uvolněných protilátek nebo jejích částí vytvořením komplexu antigenu a protilátky, kde zmíněný antigen (který s výhodou není protilátkou) zahrnuje nebo obsahuje imunogen nebo jeho část, obsahující alespoň epitop tohoto imunogen u.

Pevnou fází, pokud je použita, může být kterákoliv z dobře známých podložek nebo matricí, které se běžně široce používají nebojsou navrhovány k imobilizaci, separaci a podobně. Mohou také nabývat formy částic plátků, gelů, filtrů, membrán nebo mikrotitračních proužků, zkumavek nebo destiček a podobně a vhodně mohou být vyrobeny z polymemího materiálu. Pro snadnost provedení a jednoduchost však mohou být vhodně použity standardní mikrotitrační destičky a jamky, s výhodou standardní destičky ELISA.

Pevná fáze může být také upravena k umožnění detekce protilátek, specifických vůči škále různých antigenů. Například disky nebo kroužky a podobně z vhodného materiálu pevné fáze, například nitrocelulózy nebo podobně, mohou být povlékány různými antigeny a souběžně přidávány do mikrotitrační jamky nebo jiné vhodné nádoby, neobsahující žádný kontaktní antigen. Metody detekce vazby protilátky mohou tedy být použity k rozlišení různých antigenů. Pokud jsou použita stanovení sendvičového typu, pevná fáze výhodně nese jeden nebo více antigenů (antigeny pevné fáze), rozpoznávající protilátku nebo protilátky, nebo jejich části, které mají být detegovány (cílové protilátky). Pevná fáze může alternativně nést jednu nebo více protilátek (protilátky pevné fáze), které rozpoznávající protilátku nebo protilátky, nebo jejich části, které mají být detegovány (cílové protilátky). K umožnění detekce způsobem podle vynálezu, se přiměřeně, v závislosti na tom, zda uvedená pevná podložka nese protilátky nebo antigeny jak bylo popsáno výše, jeden nebo více antigenů, rozpoznávaných cílovými protilátkami imobilizovanými na uvedené pevné fázi, uvede do styku s uvedenou pevnou fází nebo alternativně se jedna či více protilátek, které rozpoznávají cílové protilátky imobilizované na zmíněné pevné fázi, uvede do styku se zmíněnou pevnou fází. Tyto antigeny nebo protilátky, které se po té navážou na pevnou podložku, mohou být vhodně označeny k umožnění detekce, jak bude popsáno dále.

Sady nebo disky, každý povlečený odpovídajícími antigeny ve shodě s určitým klinickým stavem nebo příznakem, mohou být použity k identifikaci toho, které z podezřelých agens vyvolává onemocnění. Disky mohou být poté jednotlivě zpracovány v oddělených jamkách. Je to postup, který zvláště šetří materiál, neboť testy lze provádět pro souběžné testování mnohočetných nebo

-9CZ 299065 B6 odlišných antigenů (buď stejného infekčního agens, nebo různých agens, odpovídajících klinickému příznaku nebo stavu v každém jednotlivém případě) za použití stejného malého objemu krve. Alternativním přístupem je použití vícečetných vzorků rozrušených lymfocytů, tj. v oddělených jamkách, každé povlečené odlišnými vazebnými partnery, například antigeny nebo protilátkami, a použití obdobného průběhu testu.

Techniky pro navázání vazebného partnera, například antigenu na pevnou fázi, jsou také velmi dobře známé a široce popsané v literatuře. Mnoho standardních postupů povlékání antigenem je popsáno například v „ELISA and other solid phase Immunoassays“, Theoretical and Practical

Aspects; 1998, vyd. D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley & Sons. Pokud je to žádoucí, destičky mohou být promývány a blokovány, opět za použití standardních postupů. Tedy například standardní mikrotitrační destičky, například ELISA destičky, mohou být jednoduše povlečeny vazebným partnerem tak, že se destičky inkubují přes noc při 4 °C ve vhodném pufru, například fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS), obsahujícím vazebného partnera, napří15 klad v koncentracích od 0,01 do 150 pg/ml bílkoviny, a následně se blokují za použití vhodného blokačního média (obecně neutrálního pufru, jako je PBS, obsahujícího blokující bílkovinu, například telecí sérum, nebo bílkoviny ze sušeného mléka) a inkubují se například při 37 °C po dobu jedné až pěti hodin. Po odstranění blokačního roztoku jsou destičky připraveny k použití.

Vhodně však materiály vyžadované k provádění způsobu podle vynálezu, mohou být dodávány ve formě sady, v níž je pevná podložka dodávána již povlečená vazebným partnerem a příslušně blokována.

Suspenzi vzorku rozrušených lymfocytů může být žádoucí před prováděním kontaktního kroku zředit a vhodně lze použít celou škálu naředění buněk/vzorku. Naředění bude obecně prováděno použitím pufru, v němž jsou lymfocyty rozrušeny, jako ředicího činidla.

Poté je detegována vazba protilátky na její antigen. Detekční krok, pokud se jedná o čtení signálu, se vhodně uskutečňuje v roztoku. Ovšem vytvářen může být i nerozpustný produkt nebo signál, který v roztoku nelze odečítat. Použít lze kterýkoliv ze známých prostředků detekce vazby protilátky, pokud je vytvářen odečitatelný signál; například v závislosti na fluorescenci, chemiluminiscenci, kolorimetrii, nebo enzymové reakci k poskytnutí zachytitelného signálu. Pokud není použita pevná fáze, mohou být uvolněné protilátky detegovány jakoukoliv jinou citlivou serologickou metodou, jako je rozptyl světla (například nefelometrie) a rezonančními postupy. Vhodně lze použít imunitní stanovení jako prostředek detekce a s výhodou s enzymem spojené imunosorpční stanovení (ELISA). Ovšem v rozsahu vynálezu se k detekci protilátek uvažují i jiné testovací postupy než ELISA. Vhodné mohou být techniky, které používají povlékané disky nebo skleněné destičky, například zaplavované suspenzí rozrušených lymfocytů. Jakýkoliv standardní postup pro detekci protilátek, známý v tomto oboru, jako jsou postupy, jejíž výsledkem je neroz40 pustný nebo rozpustný produkt lze přizpůsobit pro použití ve způsobu podle vynálezu buď ke kvantitativní analýze, nebo k testu kvality (například typu ano či ne).

Techniky imunitního stanovení a zvláště ELISA jsou v oboru dobře známé a popsané v literatuře (viz například „ELISA and other solid phase Immunoassays“, Theoretical and Practical Aspects;

1998, vyd. D. M. Kemeny & S. J. Challacombe, John Wiley & Sons.).

Následně po styku se vzorkem rozrušených lymfocytů může být přidán konjugát enzymu a protilátky, například v detekčním způsobu ELISA, který se váže k protilátce, navázané na antigen na pevné fázi. Podobně, pokud je protilátka, jež má být detegována, vázána nespecificky na pevnou fázi prostřednictvím vazebného partnera, například protilátkou vůči protilátkám různých typů, může být přidán konjugát enzymu a antigenu, který se bude specificky vázat na imobilizovanou protilátku, jež má být detegována. Poté se přidá enzymový substrát k poskytnutí zachytitelného signálu. V předkládaném vynálezu se vhodně používá rozpustný substrát poskytující signál, který je detegovatelný v roztoku. Je to výhodné, neboť to usnadňuje a zjednodušuje zpracování velkého množství vzorků a manipulaci s nimi a umožňuje odhad produkce protilátek, i když, jak bylo

-10CZ 299065 B6 uvedeno výše, není nezbytné určit absolutní množství a pokud je to žádoucí, lze získat kvalitativní nebo semikvantitativní výsledky. Pro usnadnění může být substrát zvolen tak, aby poskytoval spektrofotometricky detegovatelný signál, který může být jednoduše odečítán sledováním absorbance, například za použití zařízení, odečítajícího standardní destičky ELISA. Je možné použít standardních reagencí testu ELISA, které mají tu výhodu, že umožňují srovnat stanovení podle vynálezu s existujícími způsoby a postupy, rutinně používanými v klinických laboratořích. Samozřejmě mohou být použity i jiné systémy, vytvářející detekci/signál, které poskytují signály detegovatelné fluorescencí, chemiluminiscencí a podobně.

Ke zlepšení signálu a zvýšení citlivosti mohou být použity imunoenzymové amplifikační metody, například metoda používající komplex avidin-biotin, jako je „Extravidin systém“, dostupný od firmy Sigma. Biotinované druhotné protilátky se používají jako reakční činidla ELISA, v kombinaci s komplexem peroxidázy a avidinu. Vzhledem k tomu, že jedna molekula avidinu je schopna navázat několik molekul biotinu, zvyšuje použití avidin-biotin-peroxidázového komplexu povr15 chovou koncentraci peroxidázových molekul, což tomuto způsobu dodává ještě větší citlivost.

Materiály a prostředky, vyžadované v kroku rozrušení lymfocytů a v kroku detekce vazby protilátky mohou být vhodně dodávány také ve formě sady spolu s pevnou fází, potaženou vazebným partnerem.

Informace, získaná ze stanovení podle vynálezu, může být doplněna za použití jiných metod stanovení. Přídavné a užitečné údaje o předem existujících sérových/plazmových protilátkách mohou být získány v klasickém testu ELISA. Nadto může být po oddělení lymfocytů ze vzorku krve, zbývající tekutina plazmy použita k detekci předem existujících protilátek za použití stejné pevné fáze potažené vazebným partnerem, jaká byla použita ve stanovení podle vynálezu.

Pro ujištění, že způsob stanovení podle vynálezu pracuje spolehlivě, mohou být zahrnuty příslušné kontroly a použity k určení přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek. Například pro zjištění, že zaznamenávaný signál z testovaných jamek není vyvoláván nepravidelně a nespecificky (okolními aktivovanými lymfocyty, se používá antigen negativní kontroly. Tento antigen by měl být z infekčního agens, které je jen zcela nepravděpodobně odpovědné za akutní onemocnění pacienta, například tetanový toxoid. Počet takových okolních aktivovaných lymfocytů bude v každém případě za všech okolností mnohem nižší, než se vyžaduje pro kladný výsledek testu v použití způsobu podle vynálezu. Uspořádání vynálezu bere tento bod v úvahu.

Jak bylo výše zmíněno, vzhledem ke své jednoduchosti, rychlosti a snadnosti provedení předurčuje stanovení podle vynálezu samo sebe k diagnostickému nebo jinému klinickému či veterinárnímu použití, například při chovu ryb. Kromě malého obsahu vzorkuje další výhodou to, že je potřebný pouze jeden vzorek a nikoli dva vzorky séra odebírané v intervalu dvou až tří týdnů, jak je nezbytné pro většinu běžných serologických testů. Není potřebné ani komplikované vybavení a stanovení je snadno automatizováno. Nadto by mělo být možné, pokud je to žádoucí, testovat odlišné izotypy imunoglobulinu.

Výše uvedený způsob testování podle vynálezu poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo rozsahu probíhající infekce díky analýze spontánní exprese specifických protilátek vůči definovanému antigenu. Takový způsob je dobře použitelný k určení podmínek onemocnění, které jsou známé a kde antigeny, vztahující se k odpovídajícímu imunogenu, jsou dostupné a slouží tedy jako specifické označení infekce. Ovšem v některých klinických situacích nemusejí být specifické onemocnění nebo infekce identifikovány a/nebo vhodný antigen nemusí být dostupný pro použití ve stanovení. V takových případech může být stanovení upraveno k určení přítomnosti nebo rozsahu nespecifických indikátorů infekce. Vzorky obsahující lymfocyty, například celá krev nebo vyčištěné či obohacené lymfocytové přípravky z ní získané, mohou tedy být testovány například s ohledem na produkci infekčních markérů (označovačů), například cytokinů nebo interferonů, například IL-2, IL-M nebo interferonu gama.

- 11 CZ 299065 B6

V dalším provedení tedy vynález poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo množství indikátorů infekce ve vzorku jako odpověď vůči imunogenu, zahrnující kroky, při kterých se ve vzorku rozruší lymfocyty, čímž se uvolní indikátory infekce, které mají být detekovány, a uvolněné indikátory infekce se detekují, aby byla určena přítomnost či množství indikátorů infekce v uvede5 ném vzorku.

K provádění tohoto způsobu může být pevná fáze vybavena vhodnými zachycovacími molekulami, například protilátkami vůči indikátorům infekce pro detekci. Pro detekci přítomnosti zmíněných indikátorů infekce, imobilizovaných na pevné fázi, lze použít způsobů jak byly popsány výše, například použití označených protilátek nebo ligandů. V tomto způsobu mohou být specifické markéry identifikovány vhodným výběrem imobilizující částice nebo detekční molekuly. Veškerá bílkovina ve vzorku může tedy být například imobilizována na pevné podložce a detekce se může provádět za použití označených specifických protilátek nebo ligandů. Alternativně lze použít specifického vazebného partnera k imobilizování odpovídajících indikátorů infekce, které mohou být příslušně označeny, buď pozitivně, nebo negativně, v prvním případě například vazbou k doméně, přítomné na indikátoru infekce, nikoli však výhradně k této molekule, ve druhém případě označením nenavázaného vazebného partnera na pevné fázi. Sady k provádění tohoto způsobu rovněž představují část tohoto vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1 až 9 znázorňují výsledky klinického pokusu s vakcínou vůči chřipce, v němž byly vzorky od devíti subjektů (osob 2 až 10) testovány za použití metody rozrušení lymfocytů. Měřít25 ko na levé straně každého sloupcového grafu znázorňuje H3N2 IgG, vynesené v nanogramech vůči dnům po očkování na rovnoběžné ose. Na každém sloupcovém grafu je plnou čarou vyznačena linie, ukazující HI titr na pravé straně měřítka pro virus A/Nanchong. Viz příklady 1 a 2.

Vynález bude nyní podrobněji popsán ve vztahu k následujícím příkladům, které ho neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Specifičnost

Subjekt: LOH muž, 25 let. Krevní vzorek byl odebrán 9 dní po prvním dnu klasického klinického onemocnění podobného chřipce. V místním společenství bylo zaznamenáno směsné šíření chřipky A a B.

Separace lymfocytů: Shromážděny byly krevní vzorky periferní heparinizované žilní krve. Lymfocyty byly odděleny za pomoci „Lymphoprep (Nycomed Pharma AS; Oslo) podle instrukcí výrobce, s tím rozdílem, že heparinizované krevní vzorky byly smíchány s dvojitým (namísto jednoduchým) objemem fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS, pH 7,2) před prvním krokem odstředění. Provedeny byly dva přídavné cykly promývání buněčného peletu. Počet Iymfocytů byl stanoven v hemocytometru za použití metody vyloučení Blue Dextranu.

Rozrušení lymfocytů: Rostoucí množství lymfocytů byla rozrušena rozrušovacím pufrem (disruption buffer) 10 mM Tris HC1 (pH 7,4) obsahujícím 0,5 % deoxycholátu, 2 pg/ml pepstatinu A (Sigma-P-4265, šarže 18H0551), 2 pg/ml leupeptinu (Sigma L-0649, šarže 77H86221), 0,5% aprotininu (Sigma A-6279, šarže 87H7010), 1 mM PMSF (Sigma P-7626, šarže 48H1265) (na základě odkazu: D. L. Spector, R. D. Goldman, Leinwand LA: „Cells.“ Laboratorní příručka,

- 12CZ 299065 B6

Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998, díl 1: 74.6) a podrobeny testování ELISA (viz tabulka 1).

Potahování a blokování destiček ELISA: F-forma Greinerovy mikrodestičky, střední vazebná kapacita, číslo katalogu 655001 (šarže 98 26 01 48), D-72636 Frickenhausen, Německo. Virové antigeny (dar od Solvay-Duphar, Holandsko) pro testování protilátek vůči chřipce: A/Nanchang/933/95 (H3N2) povrchové antigeny, 10 pg/ml v PBS, 100 pl/jamku. B/Harbin/07/94 povrchové antigeny, 10 pg/ml v PBS, 100 pl/jamku. Pro testování obecných protilátek IgG: kozí antilidské IgG (specifické vůči gama řetězci) Sigma 1-7883 (šarže 76H8895) použité v ředění 1:500 v PBS, 100 pl/jamku. Potahování přes noc při 4 °C. Blokování v PBS s 10% fetálním telecím sérem (FCS) po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Mezi veškerými následnými kroky byly imunodestičky promývány pětinásobně pomocí PBS s 0,05% Tween 20.

Uspořádání vzorků na destičce: testy obecných protilátek IgG a protilátek IgG vůči chřipce byly prováděny na stejné imunodestičce, stejně jako lidské standardy IgG. Veškeré vzorky byly testovány duplicitně.

Testované vzorky: Vzorky pro testování: LOH „sérum“ (zředění plazmy 1:3). Vzorky bez příměsi a desetinásobně zředěné v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS (ředidlo), 100 pl/jamku. IgG standard: Sigma 1-4506 (šarže 96H8840): 10 pg IgG/ml, desetinásobné zředění v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS, 100 pl/jamku.

Konečný buněčný pelet v množství 300 pl byl v roztoku PBS, obsahujícím zředění séra 1:9,368. Ktomu peletu bylo přidáno 700 pl PBS (= zředění 1:3,33). Konečný pelet měl 2,0x10⁷ buněk a obsahoval sérovou kontaminaci 1:31 200. Konečný testovaný supematant byl rovnocenný naředění séra 1:9 370.

Buněčné lyzáty: Lyzáty byly upraveny tak, aby odpovídaly 800 000, 200 000 a 50 000 buňkám/jamku, 100 pl/jamku.

Tabulka 1. Směsi buněčného lyzátu pro testování.

počet buněk/ jamku	pl buněč. peletu	pl rozruš. pufru	pl ředidla	celkové pl	zředěni vzhledem ke konečnému promytí buněk
800 000	240	240	126	606	1 :(2,53x3,33)
200 000	60	60	486	606	1:(10.1x3,33)
50 000	15	15	576	606	1:40,4x3,33)

Kontaminace buněčných preparátů sérovými protilátkami, vzhledem ke konečnému promytí buněk, byly vypočítány jako:

1:8,4 (10,6%) pro 800 000 buněk 40 1:33,7 (2,9%) pro 200 000 buněk, a

1:134,8 (0,7%) pro 50 000 buněk.

Veškeré vzorky protilátek byly inkubovány po dobu 90 minut při teplotě místnosti.

- 13 CZ 299065 B6

Sekundární protilátky: Biotinem označené kozí anti-lidské IgG (specifické vůči řetězci gama), Sigma B-1140 (šarže 96H8886), používané v naředění 1:500 v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS, 100 μΐ/jamku. Inkubovány po dobu 60 minut při teplotě místnosti.

Konjugát: ExtrAvidin-peroxidázový konjugát, Sigma E-2886 (šarže 28H 4824) zředěný 1:1000 v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS, 100 μΐ/jamku. Inkubován po dobu 60 minut při teplotě místnosti.

Vyvíjení: Tablety substrátu (dihydrochlorid o-fenylendiaminu), Sigma P-8287 (šarže 88H8250). io Jedna tableta (10 mg) byla rozpuštěna ve 25 ml 0,1 mol χ Γ¹ fosfáto-citrátového pufru, pH 5,0, a doplněna 20 μΐ perhydrolu (30% peroxid vodíku). Přidáno bylo 100 μΐ/jamku roztoku substrátu a reakce byla zastavena po 10 minutách přídavkem 50 μΐ/jamku 1 mol χ T¹ kyseliny sírové.

Optická hustota byla odečítána při vlnové délce 492 nm v zařízení Titertek Multiskan PLUS (Flow Laboratories).

Výsledky

Odhady množství IgG byly založeny na interpolaci ze standardní křivky, získané z různých naředění standardu IgG. Veškeré testované vzorky byly testovány duplicitně a průměry odečtených hodnot optické hustoty byly použity k následným výpočtům.

Tabulka 2. Sérové protilátky IgG

I Protilátky	Sérové protilátky (gg/ml)	%
1 Obecně IgG	2 365	100
1 Chřipka B	70	3,0
I Chřipka A	112	4,8

Tabulka 4. Shrnutí: detekce IgG v lymfocytech periferní krve a séra.

lil. 1 !—II ' Specifičnost protilátky	Čisté IgG z lymfocytů v každé jamce (10'5 ng)	%	Sérové IgG (pg/ml)	%
Chřipka A	3,74	15,4	112	4,8
Chřipka B	0,18	0,7	70	3,0
Obecně IgG	24,28	100,0	2 365	100,0

-14CZ 299065 B6

Tabulka 3.

Uvolnění protilátek IgG z rozrušených lymfocytů.

-15CZ 299065 B6

Závěr: Subjekt LOH byl infikován virem chřipky A, jakje zřejmé z tabulky 3. Za využití těchto údajů lze usoudit, že 100 000 lymfocytů/jamku by mělo poskytnout přibližně 20 ng/ml IgG protilátek vůči chřipce A, oproti přibližně 2 ng/ml protilátek vůči chřipce B. První koncentrace buněk bude pro praktické účely poskytovat signál ELISA protilátek specifických vůči chřipce A, který může být běžně měřen, ne však protilátek vůči chřipce B. To je v kontrastu s hladinami protilátek vůči chřipce, měřených v séru (tabulka 2), kde byly hladiny protilátek vůči chřipce A i B velmi podobné. Takovými sérovými protilátkami by nej pravděpodobněji měly být předem existující křížově reagující protilátky z předchozích expozic. Je známé a doložené po mnoho let, že paměť, io týkající se chřipky, může být opětně aktivována následnou expozicí (vystavením) heterogenním virům, tak zvaným „antigenním prohřeškem“, nej pravděpodobněji prostřednictvím místního „náhodného vedlejšího“ účinku v lymfoidní tkáni, v níž probíhá původní imunitní zpracování.

Důvodem, proč protilátky z rozrušených lymfocytů v našem testu rovněž poskytují měřitelný, ačkoliv malý signál ELISA s antigenem chřipky B, tj. virem nepůsobícím na subjekt LOH, může být důsledek takové nespecifické opětovně aktivace paměťových lymfocytů, způsobené imunitním působením viru chřipky A. Ovšem taková neobvyklá opětná aktivace paměťových buněk je pokládána zajev týkající se chřipky a nebude platit pro jiná infekční agens. Je tedy třeba předpokládat, že budou pozorována dokonce jasnější odlišení signálů poskytovaných pro antigeny z infekčního činidla, které je testováno a z jiných činidel.

Předkládaný způsob vyžaduje přibližně 100 μΐ heparinizované krve (= 100 000 lymfocytů) pro každou antigenně specifickou protilátku jež má být testována, což umožňuje použití vzorku kapilární krve.

Příklad 2

Kinetika

Pokus se týká klinické chřipkové vakcíny. Testováno bylo devět zdravých subjektů: 6 žen ve stáří 24 až 27 let (průměr 26,2) a 3 muži ve věku 24 až 31 let (průměr 28,3). Lékařem byli všichni informováni o kontraindikacích, vztahujících se kočkování, a všichni informovali lékaře, že si nejsou žádných takových kontraindikací vědomi. Nikdo z nich nebyl předtím vůči chřipce očko35 ván. Všechny vakcíny odpovídaly pokusu, umožňovaly začlenění vzorku periferní krve tak, jakje popsáno níže. Subjekty obdržely povolenou trivalentní vakcínu inaktivovaného celého viru (Vaxigrip), obsahující:

virus, podobný A/Sydney/5/97 (H3N2), obsahující 15 pg hemaglutininu na dávku virus, podobný A/Beijing/262/95(HlNl), obsahující 15 pg hemaglutininu na dávku virus, podobný B/Beijing/184/93, obsahující 15 pg hemaglutininu na dávku; všechny od firmy Mériex Sérums & Vaccines (Francie).

Vzorky heparinizované krve byly odebrány tak, jakje popsáno v příkladu 1. Veškeré postupy byly stejné jako je popsáno v příkladu 1, s tou výjimkou, že lymfocyty byly rozrušeny zmražením/roztátím (dvojnásobně) vystavením lahviček s lymfocyty působení kapalného dusíku a podržením lahviček v proudu tekoucí vody z kohoutku.

Nádavkem byl proveden test inhibice hemaglutinace (HI) se vzorky plazmy, ovlivněné enzymem ničícím receptory, podle standardních postupů Kendala a spoluautorů, „Concepts and Procedures for Laboratory-Based Influenza Surveillance“, 1982, Viral Disease Unit, WHO, Ženeva, za použití 4 hemaglutinačních jednotek virů A/Nanchang a 0,7% krocaních erytrocytů. Plazmy byly testovány v krocích dvojnásobného zředění a titry byly hodnoceny jako převrácená hodnota nej vyššího zředění, poskytujícího úplnou inhibici hemaglutinace viru.

-16CZ 299065 B6

Byly použity vzorky, získané v den očkování, po 7 dnech a po 13 dnech.

Výsledky

Obrázek 1 znázorňuje množství (v nanogramech) IgG vůči povrchovým antigenům z odpovídajících A/Nanchang/933/95(H3N2) (viz příklad 1), za použití roztoků, získaných z 300K rozrušených lymfocytů pro každý z devíti očkovaných subjektů (sloupce). Jsou rozděleny podle množství protilátek IgG specifických vůči chřipce, získaných z rozrušených lymfocytů. Měřítko na levé ío straně grafu, týkající se nanogramů IgG, není stejné pro všechny subjekty. Superpozicí jsou znázorněny HI titry (plná čára) vůči viru A/Nanchang. Titr větší nebo rovnající se 40 je podle mezinárodní dohody považován za ochranný.

Závěr

Klasicky jsou HI protilátky považovány za „zlatý standard“ chřipkových protilátek, společně s protilátkami neutralizujícími virus. HI titry > 40 jsou podle mezinárodní dohody považovány za ochranné. Obrázek 1 ukazuje, že 4 z 9 subjektů (osoby 2, 5 až 7), které získaly takové protilátky v den 7 a veškeré subjekty, kromě osob 3 a 10 měly takové HI titry v den 13. U všech subjektů byly vysoké hladiny IgG specifických vůči chřipce detegovány v rozrušených lymfocytech již v den 7 a u 5 subjektů (osoby 3, 4, 8 až 10) byly v den 7 detegovány pouze protilátky z rozrušených lymfocytů a nikoli ochranné hladiny HI protilátek.

Nadto byla specifičnost IgG protilátek vůči chřipce zřejmá z výskytu takových protilátek v den 7 a vymizení stejných protilátek v den 13, zatímco v den 13 většina subjektů vykazovala významné hladiny sérových protilátek.

Příklad 2 jasně ukazuje, že detegované protilátky z rozrušených lymfocytů nebyly kontaminovány sérovými protilátkami nachytanými na pelet lymfocytů, jak bylo jasně prokázáno v příkladu 1.

Příklad 3

Zjednodušený způsob vyčištění lymfocytů z látek kontaminujících sérum/plazmu.

Typicky mohou být lymfocyty, dostatečně neobsahující protilátky, které kontaminují sérum/plazmu, odděleny třemi následujícími kroky odstředění. 300 μΐ celé krve se smíchá s 10 ml ředidla, sestávajícího ze dvou dílů PBS a jednoho podílu destilované vody. Směs se odstřeďuje 20 minut při 400 g a teplotě místnosti. Supematant se vylije a k peletu se přidá 10 ml PBS. Suspenze se opět odstřeďuje za stejných podmínek a celý cyklus se ještě jednou opakuje. Konečný pelet, suspendovaný ve 100 μΐ PBS, se použije pro následující stanovení jako zdroj lymfocytů.

Příklad 4

Uchovávání krve před vyčištěním lymfocytů.

Mužský subjekt (EJAa, 20 let) dostal povolenou inaktivovanou trivalentní vakcínu vůči chřipce podle pokynů výrobce (viz příklad 2). Vzorky 5 ml heparinizované krve byly odebrány v den očkování (den 0) a v den 9 po očkování. Bezprostředně po shromáždění bylo 300 μΐ krve podrobeno třem cyklům promytí/odstředění, jak bylo popsáno výše v příkladu 3 a lymfocyty byly rozrušeny tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. Zbývající vzorek krve byl uchováván 4 dny při 4 °C a následně byl skladován při teplotě místnosti po dobu 4 hodin před tím, než bylo zahájeno nové kolo čištění lymfocytů. Veškeré následné testy ELISA byly prováděny tak, jak je popsáno v pří-17CZ 299065 B6 kladu 1. Testy inhibice hemaglutinace (HI) byly prováděny s homologními druhy vakcíny, jak je popsáno v příkladu 2.

Tabulka 5. Uchovávání krve po dobu 4 dní při 4 °C a následně po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Účinek na aktivitu protilátek z rozrušených lymfocytů.

Dny po očkování	H3N2	H1N1	B
ihned	po 4 dnech	ihned	po 4 dnech	ihned	po 4 dnech
Den 0	HI	640	< 10	< 10
buňky	704	598	058	060	224	210
Den 9	HI	640	20	40
buňky	811	901	091 | 100	466	446

Veškeré zápisy udávají optickou hustotu při 492 mmxlOOO a HI titry plazmatických protilátek. „Buňky“ jsou protilátky z rozrušených lymfocytů, získaných ze 100 μΐ krve.

Výsledky

U tohoto subjektu bylo předem zjištěno, že má významné titry HI vůči A/Sydney/5/97 (H3N2) složce vakcíny již před očkováním a protilátky uvolněné z lymfocytů významně nevzrostly od dne 0 do dne 9, stejně jako titr HI. HI-vakcinační odpověď vůči H1N1 složce A/Beijing/262/95 byla slabá a totéž bylo pozorováno při buněčném stanovení. Nejjasnější odpověď byla pozorována vůči složce B/Beijing/184/93 chřipky B, kde titry HI vzrostly od <10 do 40. Totéž bylo pozo20 rováno i v buněčném stanovení.

Uchovávání krve po dobu 4 dnů při 4 °C a následně 4 hodiny při teplotě místnosti neovlivnilo zaznamenanou protilátkou aktivitu z rozrušených lymfocytů. Výsledky získané ihned a výsledky získané po 4 denním uchovávání se významným způsobem nelišily.

Jiné pokusy rovněž ukázaly, že dokonce po 6 dnech za podobných podmínek uchovávání (v ledničce a mezitím 6 hodin při teplotě místnosti) neovlivnilo následující měření protilátek z rozrušených lymfocytů.

- 18CZ 299065 B6

Claims (23)

1. 5 1. Způsob stanovení přítomnosti nebo množství protilátky nově syntetizované jako odpověď na imunogen, ve vzorku tělesné tekutiny nebo vzorku odvozeném z lymfatických uzlin nebo uzlíků, vyznačující se t í m , že zahrnuje následující kroky:

   lymfocyty ve vzorku se rozruší, čímž se uvolní syntetizované protilátky, nebo jejich části, spojeio né s těmito lymfocyty; a uvolněné protilátky, nebo jejich části, se detekují, čímž se stanoví přítomnost nebo množství nově syntetizované protilátky ve vzorku,

   15 přičemž tato nově syntetizovaná protilátka byla vytvořena nebo syntetizována buňkami lymfocytů a v buňkách lymfocytů jako odpověď na přítomnost imunogenu in vivo jako součást probíhající imunitní odpovědi.
2. 2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj í c í se t í m , že vzorkem je lymfa nebo krev.
3. 3. Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m , že vzorkem je periferní krev.
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že inkubace vzorku k podpoře syntézy a/nebo sekrece protilátek před prováděním způsobu se vypouští.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že nově syntetizovaná protilátka je syntetizovaná in vivo.
6. 6. Způsob podle některého z nároků laž5, vyznačující se tím, že lymfocyty se

   30 rozruší za použití fyzikálních rozrušovacích prostředků nebo pufrů nebo roztoků rozrušujících buňky.
7. 7. Způsob stanovení podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že protilátky, nebo jejich části, se detekují vazbou najeden nebo více antigenů, které rozpoznávají tyto

   35 protilátky nebo jejich části.
8. 8. Způsob stanovení podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že uvolněné protilátky se detekují prostřednictvím vazebného stanovení na pevné fázi.

   40
9. 9. Způsob stanovení podle nároku 8, vyznačující se tím, že pevná fáze nese jeden nebo více antigenů, tj. antigenů pevné fáze, rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, nebo jejich částmi, které mají být detekovány, tj. cílovými protilátkami.
10. 10. Způsob stanovení podle nároku 8, vyznačující se tím, že pevná fáze nese jednu

    45 nebo více protilátek, tj. protilátek pevné fáze, které rozpoznávají protilátku nebo protilátky, nebo jejich části, které mají být detekovány, tj. cílové protilátky.
11. 11. Způsob stanovení podle některého z nároků lažlO, vyznačující se tím, že se provádí v krevních vzorcích novorozenců nebo batolat pro rozlišení nově syntetizovaných proti50 látek a pasivně přenesených mateřských protilátek.
12. 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se před rozrušením lymfocytů nebo po rozrušení, ale před krokem detekce, vzorek skladuje při teplotě 4 °C nebo nižší.

    - 19CZ 299065 B6
13. 13. Způsob stanovení podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že vzorek tělní tekutiny pro použití při stanovení, nebo pro přípravu lymfocytů pro použití při stanovení, je vzorek krve s objemem menším než 1 ml.

    5
14. 14. Způsob stanovení podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že se v něm používají lymfocyty přímo izolované ze vzorku.
15. 15. Způsob stanovení podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že krok detekce se provádí imunostanovením, s výhodou enzymoimunostanovením ELISA.
16. 16. Způsob stanovení podle některého z nároků 8 až 15, vyznačující se tím, že se jeden nebo více antigenů rozpoznávaných cílovými protilátkami imobilizovanými na pevné fázi uvede do styku s pevnou fází.

    15
17. 17. Způsob stanovení podle některého z nároků 8ažl5, vyznačující se tím, že se jedna nebo více protilátek, které rozpoznávají cílové protilátky imobilizované na pevné fázi, uvede do styku s pevnou fází.
18. 18. Způsob stanovení podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že pro

    20 krok detekce se používá rozpustný substrát a poskytuje spektrofotometricky detekovatelný signál.
19. 19. Způsob stanovení podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že se používá negativní kontrolní antigen.

    25
20. 20. Způsob stanovení podle některého z nároků 8 až 19, vyznačující se tím, že se používá větší počet pevných fází, z nichž každá nese odlišný cílový antigen.
21. 21. Způsob diagnostikování nebo monitorování infekce u lidí nebo zvířat nebo v části živočicha imunogenem, vy z n a č uj í c í se t í m , že zahrnuje následující kroky:

    stanoví se přítomnost nebo množství nově syntetizovaných protilátek, nebo jejich částí, zaměřených proti tomuto imunogenu, spojených s lymfocyty ve vzorku odvozeném z lymfatických uzlin člověka nebo zvířete, způsobem podle některého z nároků 1 až 20, a stanoví se přítomnost nebo rozsah infekce tímto imunogenem ve vztahu k příslušným kontrolním a/nebo referenčním vzor35 kům.
22. 22. Způsob stanovení podle některého z nároků laž21, vyznačující se tím, že imunogenem je bakteriální nebo virový antigen, a stanoví se diagnóza nebo monitorování infekce zdrojovou bakterií nebo virem.
23. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že antigen se odvodí z viru zvoleného ze skupiny virů zahrnující virus herpes simplex, cytomegalovirus, virus lidské imunodeficience HIV a kterýkoli z virů hepatitidy, a také virus toxoplazmy a virus Epstein-Barrové, EBV.

    45 24. Způsob stanovení přítomnosti nebo množství indikátorů infekce ve vzorku jako odpověď vůči imunogenu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    v tomto vzorku se rozruší lymfocyty, čímž se uvolní indikátory infekce, které mají být detekovány; a detekují se uvolněné indikátory infekce, čímž se stanoví přítomnost nebo množství indikátorů infekce ve vzorku, způsobem podle některého z nároků 1 až 20.