CZ20014498A3 - Způsob stanovení přítomnosti protilátky - Google Patents
Způsob stanovení přítomnosti protilátky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20014498A3 CZ20014498A3 CZ20014498A CZ20014498A CZ20014498A3 CZ 20014498 A3 CZ20014498 A3 CZ 20014498A3 CZ 20014498 A CZ20014498 A CZ 20014498A CZ 20014498 A CZ20014498 A CZ 20014498A CZ 20014498 A3 CZ20014498 A3 CZ 20014498A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibodies
- sample
- lymphocytes
- assay
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 122
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 144
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 71
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 70
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 44
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 44
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 38
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 2
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 77
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 6
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 5
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- -1 slices Substances 0.000 description 2
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 229940124739 inactivated trivalent influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
- Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Devices For Conveying Motion By Means Of Endless Flexible Members (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
Způsob stanovení přítomnosti protilátky
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká detekce protilátek, zejména detekce nedávno syntetizovaných protilátek, vytvářených v odpovědi na infekci nebo očkování a podobně, ve vzorcích, prostřednictvím jednoduché metody, zahrnující rozrušení lymfocytů před delegováním přítomnosti protilátky.
Dosavadní stav techniky
ELISA, heterogenní enzymové immunostanovení, se již dlouho používá k detegování a měření hladin protilátek (nebo antigenu). Obvykleji se ELISA používá jako serologické stanovení, ovšem rovněž se používá ke studiu imunochemických vlastností antigenů nebo protilátek- a často nachází uplatnění, například při hodnocení a charakterizaci imunitních odpovědí, při stanovení produkce protilátek buněčnými kulturami, v hybridomové technologii a podobně.
Stanovení ELISA má jednoduché použití, je citlivé a poměrně rychlé, je ale schopné pouze jednoduchého změření přítomnosti cílové protilátky ve vzorku. Nedokáže rozlišovat mezi probíhající syntézou protilátek v odpovědi na antígen a protilátkami již přítomnými od minulé infekce, nebo pasivním přenosem a podobně. Zatímco v některých případech může dostačovat získání jednoduché informace, která se týká přítomnosti protilátek, v jiných případech je žádoucí mít schopnost stanovit, zda jsou delegované cílové protilátky akutně syntetizovány lymfocyty v době testování, například v průběhu očkování, nebo při diagnóze infekce u kojenců rozlišit pasivně přenesené mateřské protilátky. Toho nelze dosáhnout klasickou metodou ELISA.
• A
A A
AA AAAA
A « AAAA
Proto byly vyvinuty další metody, které umožňují detekci právě probíhající syntézy protilátek. V tomto ohledu lze zvláště zmínit stanovení enzymově vázaného imunitního spotu (ELISPOT, známé rovněž jako spot ELISA nebo plakové stanovení ELISA), jak je shrnuto například Czerkínskym se spoluautory v ELISA and other Solid Phase Immunoassays, vydavatelé D.M. Kenneny a S.J. Challacombe, 1988, kapitola 10, 217-239. Tento postup, založený na metodě ELISA, umožňuje výčet lymfocytů, vylučujících protilátky vůči jednomu nebo více cílovým antígenům. V zásadě je ELISPOT variantou metody ELISA, kde buňky vylučující protilátky (ASC, antibody secreting cells) mohou být odhaleny kultivací lymfocytů ve speciálně modifikovaných jamkách ELISA, povlečených cílovým antigenem a náhradou standardních reakčních činidel ELISA komplexy enzymu a substrátu, což poskytuje zbarvené sraženiny (spoty), přiléhající k sekrečním buňkám. Spoty potom mohou být počítány k zjištění množství buněk, produkujících protilátky. Inhibitory syntézy bílkovin lze přidat do kultivačního média k potvrzení toho, že detegované spoty vznikly syntézou protilátek de novo během inkubační doby in vitro.
Zatímco technika ELISPOT byia potvrzena jako velmi užitečná při studiu dynamiky humorálních imunitních odpovědí a používala se k detekci spontánních ASC, vyskytujících se dočasně v periferním oběhu imunizovaných subjektů, určité znaky této metody vyvolávaly omezení při jejím použití v klinické diagnostice. Jednak, vzhledem k tomu, že je potřeba počítat každý vzorek jednotlivého spotu, což je časově náročné a pracné, tato metoda není zvláště vhodná pro analýzu velkých množství vzorků, což je běžné v laboratoři pro klinickou diagnostiku. Za druhé je možné počítat pouze množství buněk vylučujících protilátky v každém vzorku a obecně řečeno to vyžaduje přijatelně velké objemy vzorků, například v několika mililitrech. Destičky ELISPOT jsou rovněž drahé a stanovení není snadné přizpůsobit automatizaci.
« ·
- 3 * • · *« « · · · · « · · • ·4 ··· »· ···· 4« <···
WO 96/26443 popisuje použití modifikovaného testu ELISA, který lze použit k detekci probíhající syntézy protilátek, V tomto stanovení se lymfocyty po izolaci kultivují a stanovují se hladiny protilátek, produkovaných během této doby kultivace. Tato technika tedy nezbytně vyžaduje inkubaci lymfocytů v testovaném vzorku při teplotě přibližně 37°C k umožnění změření protilátek, vylučovaných během inkubace. Střední doba inkubace činí 2 až 5 hodin, což představuje významné omezení rychlosti provedení takového měření. Inkubace rovněž vyžaduje vhodné vybavení na místě testování, tak, aby mohla být prováděna bezprostředně před průběhem stanovení. To obecně znamená, že stanovení lymfocytů musí být prováděno krátce po odebrání vzorku subjektu, neboť uchovávání vzorků, například zamražením, není přijatelné vzhledem k vyplývajícímu snížení živostnosti buněk. Vyčištěné buňky mohou být udržovány živoucí pouze po poměrně krátké období skladováním v ledu při 0°C nebo při nižší teplotě, s výhodou při 4 °C.
Je tedy zřejmé, že navzdory pokrokům v technikách stanovení protilátek stále přetrvává potřeba dalšího zlepšeného stanovení, které by bylo jednoduché, rychlé a cenově výhodné, které by spolehlivě poskytlo přesnou kvantifikací spontánně vylučovaných protilátek, které by bylo schopné rozlišit syntézu protilátek de novo a které by mohlo být prováděno ve vzorcích, například ve vzorcích krve, k diagnostickým účelům. Předkládaný vynález reaguje na tuto potřebu.
Ve výše popsané technice byla používána doba kultivace ve shodě s tehdy běžným úsudkem, za předpokladu, že to bylo nezbytné k získání dostatečného titru protilátek pro získání výsledků k imunodiagnostickým účelům.
« · • · • · • ···
V literatuře bylo již dříve prokázáno, že biosyntéza protilátek (imunoglobulinů) se uskutečňuje v lymfocytech B ( viz: I. Roitt, J. Brostoff, D. Male: Immunology, 4. vydání, vydavatel Mosby, Londýn 1996, 6.12-6.13), z nichž jsou poté vylučovány do krevního toku k boji s infekcí. V době kdy jsou vylučovány buňkami produkujícími protilátky (ASC,antibody-secreting celíš), jsou molekuly plně sestavené (například molekula IgG má dva těžké řetězce a dva lehké řetězce, spojené disulfidovými můstky) a glykosilované. Jako krok limitující rychlost biosyntézy protilátek byly prokázány nitrobuněčný transport a glykosilace prostřednictvím endoplasmatického retikula a Golgiho aparátu (což trvá jednu hodinu či více), zatímco biosyntéza různých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů vyžaduje ke svému dokončení pouze minuty. Odhaduje se, že průběh syntézy a vylučování protilátek vyžaduje celkově dvě hodiny (Melchers, Histochemical J. 3, 389-397, 1971).
V důsledku rychlého vylučování imunoglobulinu z buněk se dříve nikdy neočekávalo, že funkční protilátky nebo i částečně syntetizované protilátky (například před glykosilací) by mohly být přítomny v buňkách lymfocytů v jakémkoliv významnějším množství. Dále se neočekávalo, že rozrušení lymfocytů ve vzorku by mohlo poskytnout dostatečná množství nově syntetizovaných protilátek pro umožnění detekce k imunodiagnostickým účelům.
Překvapivě bylo zjištěno, že buněčný obsah lymfocytů obsahuje dostatek protilátek k umožnění detekce a dokonce ke kvantifikaci akutní syntézy protilátek u subjektu, pokud jsou vzorky k analýze odebírány během akutní fáze imunitní odpovědi. Obecně k tomu dochází v přibližně stejném časovém intervalu, v jakém lze očekávat, že se buňky, které vylučují protilátky, objeví v periferní krvi. To tedy poskytuje užitečnou informaci, kterou lze využít diagnosticky.
- 5 9 9
9 9
Výhodně se tak obchází potřeba diouhé inkubace vzorku, například přípravku vyčištěných lymfocytů, před samotným stanovením, neboť toto stanovení žádnou inkubaci lymfocytů nevyžaduje.
Stanovením podle vynálezu se rovněž poskytuje spolehlivé stanovení, v němž mohou být vzorky před přípravou stanovení skladovány, například v ledničce (s výhodou přibližně při 4 °C), nebo zamražené, například při teplotě menší než 0°C. Odborníci v oboru ocení, že se spíše než zamražování celé krve s výhodou používá ochlazení celé krve {například jak je popsáno dále), neboť takové zamražování vyvolává lyži buněk. Ovšem vzorky, jako jsou vyčištěné lymfocyty, mohou být zamraženy nebo uchovávány v chladu před prováděním stanovení podle vynálezu, aniž by to ovlivnilo výsledky testu. Vzorky tedy mohou být před stanovením skladovány po delší časové období dokonce za použití metod, které mohou záporně ovlivnit životnost buněk (například podobným způsobem, jako se skladují vzorky séra nebo plasmy). V důsledku toho metoda stanovení podle vynálezu poskytuje významné výhody pro odebírání vzorku, jeho skladování a zpracovávání a zvláště umožňuje významně pozdržet provedení stanovení, což může být nezbytné při laboratorním testování vzorku, který byl získán v terénu.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález v jednom ohledu poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek ve vzorku v odpovědi na imunogen, což zahrnujekroky, v nichž:
se získá vzorek, obsahující lymfocyty;
se rozruší uvedené lymfocyty k uvolnění protilátek nebo jejich částí, asociovaných s uvedenými lymfocyty;
• · • ·
- 6 fc fc • fcfcfc • fcfcfc • · fcfcfcfc • · fc··· se delegují uvolněné protilátky nebo jejich části pro stanovení přítomnosti či množství nově syntetizovaných protilátek ve zmíněném vzorku.
Tak, jak je zde používán, týká se výraz nově syntetizované protilátky antigenně aktivních protilátek (to znamená schopných rozpoznání a navázání se na antigen, odpovídající imunogenu), které byly vytvořeny (produkovány) nebo syntetizovány buňkami Iymfocytů a v buňkách Iymfocytů jako odpověď na přítomnost imunogenu in vivo, jako část probíhající imunitní odpovědi. Protilátky jsou tedy syntetizovány lymfocyty v průběhu imunitní odpovědi vyvolané přítomností imunogenu in vivo, to jest syntetizované předtím, než je vzorek, obsahující lymfocyty, odebrán z živočišného subjektu a v době takového odběru.
Odkaz na protilátky nebo jejich části, spojené s uvedenými lymfocyty, se týká nově syntetizovaných protilátek nebo jejich částí, které jsou antigenně aktivní (to znamená schopné rozpoznat antigen a navázat se na něj) a které dosud nebyly z buněk uvolněny. Jak bylo dříve zmíněno, obecně to odpovídá protilátkám, produkovaným v předcházejících dvou hodinách (což může nastat pouze in vivo nebo alespoň částečně in vitro před rozrušením buněk, v případě, že buňky jsou uchovávány ve vhodných podmínkách), ačkoliv časový průběh sekrece se může odlišovat. Zatímco protilátky mohou být buňkami produkovány rychle (například během jedné až dvou minut, sekrece je spíše pomalejší), volné řetězce, které vytvářejí protilátky, nebo neglykosilované či částečně glykosilované protilátky anebo řetězce protilátek, mohou být v lymfocytech přítomny a tedy z nich i uvolňovány při jejich rozrušení. Pokud je to vhodné, tyto částí mohou být delegovány a zahrnuty v měření přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek za předpokladu, že jsou antigenně aktivní, jak bylo popsáno výše. Protilátky nebo jejich části, uvolňované z Iymfocytů, zahrnují nově syntetizované protilátky. Stanovení hladin
4 4 4 44 · 4 4 4 4 • 4 44 4 4 4 4 4 4
V 4444 4444 • ·444 444
444· 444 ·* 4·44 44 4444
- 7 takto nově syntetizovaných protilátek poskytuje odpovídající informaci o množství produkovaných aktivních protilátek, které vzniká v odpovědi na zvláštní imunogen, to znamená, že protilátky jsou produkovány jako část probíhající, například chronické nebo akutní, imunitní odpovědi. Předkládaný vynález tedy poskytuje rovněž způsob stanovení přítomnosti nebo množství produkce aktivních protilátek ve vztahu k hladinám nově syntetizovaných protilátek ve vhodných kontrolních vzorcích.
Vzorek, obsahující lymfocyty, může být odebrán každému živočichu, s výhodou savci, například lidskému subjektu, který byl před odebráním vzorku vystaven imunogenu. Obvykle, když má být imunitní odpověď detegována způsobem podle vynálezu bude způsobena nedávnou infekcí nebo očkováním a je žádoucí odebrat vzorek v průběhu několika týdnů nebo v průběhu několika dnů od vystavení imunogenu. Optimální doba k odebrání vzorku od subjektu bude záviset na povaze infekce nebo na typu použité vakciny a je dále určena účinností mechanismu imunitní odpovědi subjektu, která se mezi jednotlivci může lišit. Ovšem žádoucí je odebírat vzorek v době, kdy jsou lymfocyty imunitního systému subjektu ve fázi akutní syntézy protilátek v odpovědi na daný imunogen. Obecně tak bude zjištěno, že se vzorek výhodně odebírá v průběhu tří týdnů od vystavení subjektu působení imunogenu, ještě lépe v průběhu 8 až 12 dnů od infekce nebo očkování. V některých případech ovšem dostatečná produkce protilátek pro získání významných výsledků ze stanovení podle vynálezu nastane v průběhu 1 až 5 dnů nebo ještě specifičtěji 2 až 3 dnů po infikaci nebo očkování.
Vzorkem může být vzorek krve nebo vzorek odvozený od lymfatického systému subjektu. Obecně může být vhodná jakákoliv tělesná tekutina nebo tkáňový vzorek, obsahující lymfocyty imunitního • · » « * * • fcfcfc
- ň - ·* · · · · « ······· ι» »··* *· ··** systému subjektu. Zvláště výhodně mohou být odebírány lymfa či periferní krev subjektu v klinickém nebo experimentálním prostředí, ale stejně vhodné jsou jakékoliv lymfatické nebo lymfoidní tkáně nebo jakýkoliv zdroj krve obsahující lymfocyty, včetně vzorků, získaných z lymfatických uzlin či žláz nebo lymfatických uzlíků, například tonsil. Byly vyvinuty chirurgické intervenční techniky, které umožňují odběr bioptického materiálu subjektu a takové postupy mohou být použity, pokud je to vhodné, i k odběru vzorku pro použití ke způsobu podle vynálezu. V závislosti za zdroji lymfocytů může a nemusí být nezbytné oddělit a vyčistit lymfocyty před stanovením způsobem podle vynálezu. Ovšem pokud je to nezbytné nebo žádoucí, mohou být lymfocyty vyčištěny. Výhodně tedy je vzorek, použitý ve stanovení, lymfocytovým přípravkem, připraveným z jednoho z výše uvedených zdrojů postupy známými v oboru.
Rozrušením lymfocytů se rozumí to, že obsah buněk, včetně syntetizovaných protilátek, je uvolněn za hranici buněčné membrány a vnitřních membránových struktur, takže ho lze detegovat jakýmkoliv běžným biochemickým nebo chemickým stanovením. Je známo, že imunoglobuliny jsou syntetizovány a vylučovány během průchodu endoplasmatickým retikulem a Golgiho aparátem. Rozrušení tedy nezbytně vyžaduje uvolnění z těchto vnitřních struktur. Proto může být rozrušení lymfocytů dosaženo známými postupy rozrušování buněk, umožňujícími uvolnění obsahu membránových struktur, například buněčnou lyží za použití například fyzikálních rozrušovacích prostředků, jako je cyklus zmražení a roztátí, nebo chemickými prostředky, za použiti pufrů nebo roztoků rozrušující buňky.
Tak, jak jsou zde použity, výrazy detegování a ''stanovení přítomnosti nebo množství znamenají oba jak kvantitativní, tak kvalitativní určení hladiny produkce protilátek, ve smyslu získání • * · · » 9 » • 9 »9 « 9 9 9 9 ·
- Q - < · » 9 9 9*9 ν 9«·9 199 9« 9··9 I* 9«99 absolutní hodnoty pro množství produkovaných protilátek ve vzorku a rovněž index, poměr, procentní množství nebo podobné určení hladiny produkce protilátek, stejně jako semikvantitativní nebo semikvalitativní určení. Výraz stanovení přítomnosti zahrnuje rovněž situace, kdy se uplatňuje negativní výsledek, naznačující nepřítomnost syntetizovaných protilátek při stanovení imunitní odpovědi subjektu. Negativní výsledek může například ukazovat na nepřítomnost imunitní odpovědi vůči danému imunogenu nebo může být příznakem chronické infekce, pokud jsou protilátky vůči zmíněnému imunogenu přítomné v séru.
Detekce nově syntetizovaných protilátek umožňuje spíše než stanovení veškerých protilátek, přítomných v buňkách, stanovení hladin takových protilátek, které jsou specifické vůči jednomu imunogenu či většímu počtu imunogenů.
Detekce syntetizovaných protilátek může probíhat jakýmkoliv způsobem, který je přípustný k identifikaci takových protilátek, které se navazují na imunogen, vyvolávající imunitní odpověď. Lze tedy použít jakoukoliv detekční techniku, jejímž výsledkem je poskytnutí signálu, který odráží přítomnost cílových protilátek. Použita mohou být například enzymová stanovení, v nichž může být ze substrátu vytvářen rozpustný nebo nerozpustný produkt, jehož množství lze stanovit.
Výhodně mohou být syntetizované protilátky detegovány například prostřednictvím vazebného stanovení na pevné fázi, například ELISA, kde se navážou na antígen použitý ve stanovení, i když tento použitý antigen se může odlišovat od imunogenu, prvotně stimulujícího imunitní odpověď. Takže zatímco jak antigen použitý ve stanovení, tak i imunogen, který stimuloval nebo stimuluje produkci protilátek in vivo, by měly být k protilátkám, jež mají být detegovány, vázány vzhledem k identickým nebo velmi podobným epitopům, v jiných ohledem nemusejí
- 10 • 4 4 4 4 4 4 «*44 4 4 4
4 4 · ·
4 4 4 4
4444 4*4 44 444«
4·4 «4 «444 být antigen a imunogen shodné. Takže zatímco antigenem, použitým ve způsobu podle vynálezu, může být materiál, obsahující veškeré nebo některé části odpovídajícího imunogenu, odvozené například od infikovaných jedinců, nebo od vyčištěných částí ze stejného nebo podobného materiálu, podobně může být antigen připraven synteticky, například chemickou syntézou nebo rekombinantní expresí s přidanými nebo vypuštěnými částmi, vztahujícími se k přírodnímu antigenu. Lze tedy použít spojené bílkoviny (fusion proteins), nebo molekuly, vykazující pouze vhodný epitop či epitopy.
Oproti známým technikám stanovení protilátek poskytuje předkládaný vynález několik výhod. Jednak, na rozdíl od technik, které detegují hladiny sérových protilátek (například ELISA v séru) předkládané stanoveni deteguje protilátky, které dokládají probíhající infekci/imunitní stimulaci, nebo v případě novorozenců umožňují oddělení mateřských a novorozeneckých protilátek. Je to umožněno tím, že lymfocyty vzorku jsou používány přímo ve způsobu stanovení podle vynálezu, bez použití jakékoliv jiné formy předchozího stanovení nebo stimulace, například stimulace in vitro antigenem. Jsou tedy detegovány protilátky, které byly lymfocyty syntetizovány v době odběru vzorku. (Tímto způsobem a při použití i malých objemů vzorku může být odlišena spontáně probíhající syntéza protilátek v odpovědi na daný imunogen od předchozí aktivace lymfocytů). Stanovení se rovněž provádí na lymfocytech, které byly rozrušeny během stadia, kdy spontánně produkovaly a vylučovaly, nebo počínaly vylučovat protilátky, bez stimulace buněk k vynaložení paměti. To se odlišuje od jiných zveřejněných způsobů, které využívají antigenní stimulaci in vitro, která může zvýšit citlivost testu, ale zahrnuje buněčnou paměť a proto není přesnou nebo vhodnou technikou k detegování akutně vytvořených nebo nově syntetizovaných protilátek v odpovědi na probíhající infekci, nebo na nedávné očkování.
- 11 • · · · · ····«·· Μ · · · ·
Předkládaný vynález na druhé straně využívá spontánního vylučování (sekrece) protilátek k umožnění detekce protilátek v krvi, což charakterizuje probíhající infekci, vyvolanou testovaným antigenem; plasmatické lymfocyty budou vylučovat protilátky vůči testovanému antigenu během prvních několika týdnů po infekci, nebo očkování a podobně. Detekce takových protilátek způsobem podle předkládaného vynálezu umožňuje diagnostikování nebo stanovení infekce nebo monitorováni imunitní odpovědi na očkování.
Předkládaný vynález tedy v dalším aspektu poskytuje způsob diagnostikování nebo monitorování infekce u lidí nebo zvířat nebo v určité části uvedeného zvířete, pomocí ímunogenu za využití způsobu podle vynálezu a stanovení přítomnosti nebo rozsahu infekce uvedeným imunogenem ve srovnání s vhodnými kontrolami a/nebo srovnávacími vzorky.
Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný u kojenců a novorozenců, kde je důležité rozlišit nově syntetizované protilátky od pasivně přenesených mateřských protilátek. Stejný vzorek obsahující lymfocyty může být analyzován vzhledem k protilátkám vůči několika odlišným infekčním agens buď v oddělených stanoveních, nebo v jediném stanovení za použití několikanásobných odpovídajících antigenu, což umožňuje použití odpovídajících kontaktních antigenu souvisejících s klinickým příznakem, který pacient vykazuje.
Při diagnóze infekcí je rovněž důležité mít možnost rozlišit probíhající syntézu protilátek od protilátek již existujících z doby infekce předchozí. Opětné vyvolání imunologické paměti antigenní stimulací in vitro není v souladu se stanovením, majícím za cíl identifikovat probíhající akutní infekci a proto tuto výhodu nesdílejí dřívější způsoby, založené na antigenní stimulaci. Zařazení kroku antigenní stimulace by
- 12 44 4444 také ohrozilo výhodný časový faktor stanovení podle vynálezu, které se provádí velmi rychle ve srovnání s předchozími způsoby.
Dále na rozdíl od postupů, které delegují buňky, vylučující protilátky nebo protilátky aktivně vyloučené, v předkládaném vynálezu není potřebné udržovat vzorek za podmínek, podporujících syntézu a/nebo sekreci protilátek, ačkoliv akutní syntéza protilátek vytváří základní parametr detekce. To značně zjednodušuje test a je to velkým přínosem ve srovnání s dříve známým stanovením, uvedeným ve WO 96/26443, které vyžaduje inkubaci lymfocytů po odebrání vzorku a rovněž jejich uchovávání během stanovení v takových podmínkách, které umožňují pokračující vylučování protilátek lymfocyty.
Zvláště překvapujícím přínosem předkládaného vynálezu bylo vyhnutí se jakémukoliv kroku inkubace nebo jakýmkoliv speciálním podmínkám stanovení a to znamená, že vzorky mohou po svém odebrání být výhodně upravovány k jejich rozrušení nebo k lyži buněk a vzniklý lyzát může být poté uchováván například zamražením nebo ochlazením po dobu před prováděním stanovení.
Jinou možností, jak bylo uvedeno dříve, je skladování vzorku například celé krve nebo vyčištěného přípravku například zamražením či ochlazením (jak je potřeba, v závislosti na vzorku) po časové období například až do několika hodin či dnů, například více než po 4 hodiny, než je provedeno rozrušení buněk. Vyčištěný přípravek lymfocytů může být například uchováván zamražený po dobu například několika hodin či dnů, nebo ochlazený, například po několik hodin, je-li to nezbytné nebo žádoucí, před ovlivněním vzorku k rozrušení buněk. Například vyčištěné lymfocyty mohou být skladovány při teplotě 4 °C po dobu několika hodin, například až do 4 či 6 hodin před jejich ovlivněním, vyvolávajícím rozrušení nebo lyži buněk.
- 13 • · • ···
• · ·· ··♦·
Bylo ovšem překvapivě zjištěno, že některé vzorky, například přípravky celé krve, mohou být uchovávány schlazené po delší časová období, aniž by byly buňky poškozeny a narušovaly výsledky testu. Bylo například zjištěno, že vzorky celé krve mohou být ochlazené uchovávány (například při 4 °C) po dobu alespoň 6 dnů a pokud je to žádoucí, mohou být mezitím vzorky uchovávány při teplotě místnosti (18 až 25 °C) po dobu alespoň 6 hodin před zahájením postupu vyčištění Iymfocytů, aniž by došlo k zápornému ovlivnění účinnosti testu. To je zvláště výhodné, pokud jsou vzorky krve odebírány v laboratoři a skladují se v ochlazeném stavu do té doby, dokud nejsou získány výsledky rutinního nebo přídavného testování plasmy/séra. Je to překvapující a neočekávané, neboť to naznačuje, že fyzikální integrita (celistvost) Iymfocytů se během skladování zachovává, což umožňuje následné vyčištění Iymfocytů z uchovávané krve (pokud je to žádoucí) a rozrušení Iymfocytů, aniž by došlo k významnému snížení delegovaných protilátek.
V upřednostňovaném ztělesnění před rozrušením Iymfocytů, například pokud je vzorkem krev, může tedy být vzorek skladován po několik dnů, například přibližně až 6 dnů či více, zvláště pokud je skladován v ochlazeném stavu při teplotě přibližně 4 °C a dokonce je možné vyjmout vzorek ze studeného prostředí po opakující se časová období, například 4 až 6 hodin, například při teplotě místnosti, při dvou či více příležitostech během období jeho skladování, aniž by došlo k zápornému ovlivnění výsledku stanovení. To je zvláště vhodné pokud jsou vzorky krve skladovány za chlazení a současně je nevyhnutelné, aby byl vzorek ponechán na stole při teplotě místnosti po krátké časové období. Překvapivě bylo zjištěno, že životnost buněk není natolik ovlivněna, aby ovlivnila přijatelné výsledky, získané způsobem podle vynálezu. V dalším upřednostňovaném ztělesnění, kdy se používají vyčištěné přípravky Iymfocytů, mohou být tyto vzorky uchovávány pří
A A
I *·« ·
- 14 ♦ · ·· teplotě nižší než 4°C (například po několik dnů nebo déle) nebo uchovávány při teplotě vyšší než 4 °C (po dobu do 6 hodin). Možnost skladování různých vzorků pro použití ve stanovení činí způsob podle vynálezu zvláště vhodným pro větší diagnostické laboratoře, kde nákladné automatické laboratorní vybavení, například hardware pro ELISA, může být nejúčinněji využíváno za použití značného množství vzorku současně. To také znamená, že vzorky mohou být odebírány na mnoha různých místech a posílány nebo dodávány do centrální diagnostické laboratoře k analýze podobným způsobem, jako je tomu u postupů k analyzování chemických sérových vzorků v jiných typech testů.
Z jiného pohledu tedy vynález poskytuje způsob stanovení přítomnosti či množství nově syntetizovaných protilátek ve vzorku, vzniklých jako odpověď vůči imunogenu, který obsahuje kroky, v nichž se:
detegují uvolňované protilátky nebo jejich části ve vzorku obsahujícím lymfocyty, které byly rozrušeny pro uvolnění syntetizovaných protilátek nebo jejich částí, spojených s uvedenými lymfocyty, k tomu, aby bylo možné stanovit přítomnost či množství nově syntetizovaných protilátek v uvedeném vzorku.
Hlavní výhodou předkládaného vynálezu je to, že je vyžadován pouze malý objem vzorku. Ve způsobu podle vynálezu může detegovatelný signál poskytnout dokonce pouze 100 000 lymfocytů nebo ještě méně než 50 000 lymfocytů. Vzhledem k tomu, že například 1 ml krve obsahuje 1x106 lymfocytů, pokud se použije způsob podle vynálezu ke stanovení lymfocytů odvozených z krve, dostačuje pouze 50 nebo 100 μΐ krve k poskytnutí dostatečného počtu lymfocytů pro dané stanovení. I když se počítá s příslušnými kontrolními testy (například srovnávacím vzorkem), k poskytnutí diagnostických výsledků může být
- 15 • 9 4 4 94 • 4 · * 4
4 4 4 4 * · · · · 4 4
4 9 4 4 9 •4 9444 44 994« použito 150 až 300 μΙ. Jakmile je test jednou standardizován, mohou být alespoň některé kontrolní vzorky vynechány. Test podle vynálezu tedy výhodně vyžaduje například 50 až 500 μΙ, lépe 100 až 300 μΙ a běžně 100 až 200 μΙ vzorku obsahujícího lymfocyty ve srovnatelném objemu se zdrojem celého vzorku. Způsob podle vynálezu může tedy využívat například 5x104 až 5x105 a lépe 1 až 2x10s lymfocytů. Tím se liší od klasických diagnostických testů, které obecně vyžadují několika mililitrové objemy séra nebo jiné tekutiny. Je to zvláště výhodné v případě odebírání krevních vzorků, kdy jsou dostupné pouze malé vzorky, například od novorozenců, neboť způsob podle vynálezu vyžaduje pouze objemy vyjádřené v mikrolitrech, které lze odebrat například kapilárou z vhodného místa, jako je špička prstu nebo ušní lalůček nebo pata.
Způsob podle vynálezu dovoluje použití malých objemů krevních vzorků (například mikrolitrových objemů, menších než 1 ml, s výhodou než 500 μΙ, například menších než 100 μΙ) přímo ke stanovení spontánní nebo de novo produkce protilátek nestimulovanými lymfocyty bez předchozího kroku předběžné kultivace lymfocytů před stanovením.
Antigeny nebo imunogeny, vůči nimž jsou protilátky pro detekci způsobem podle vynálezu zacíieny, zahrnují jak bakteriální, tak i virové antigeny. Klinicky důležité antigeny zahrnují, ale neomezují se na ně, antigeny například z viru Herpes Simplex, z cytomegaloviru, z viru lidské imunodeficience (HIV) a jakékoliv antigeny virů hepatitidy, stejně jako toxoplasmy a viru Epstein-Barr (EBV). Obecně však může být způsobem podle vynálezu detegován jakýkoliv imunogen, vzniklý v důsledku infekce nebo očkování, vyvolávající čistě protilátkovou odpověď. V případech, kde chronická infekce vyvolává detegovatelné hladiny cílových protilátek v lymfocytech, může být stanovení těchto protilátek rovněž provedeno způsobem podle vynálezu. Protilátky vůči φ φ
Φ φφφφ
- 16 jakémukoliv imunogenu, které mohou být detegovány za použití běžné metody ELISA, lze tedy například detegovat způsobem podle předkládaného vynálezu. Detekce protilátek vůči takovým antigenům je možné použít k rychlému určení, zda jsou pacienti infikováni, například pro účely krevního stanovení nebo pro potvrzení a/nebo monitorování infekce.
Předkládaný vynález tedy dále poskytuje způsob diagnózy nebo monitorování infekce u lidí či zvířat nebo v části uvedeného zvířete, způsobené bakterií či virem, přičemž uvedený způsob zahrnuje získání vzorku s obsahem lymfocytů od uvedeného zvířete, stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizovaných protilátek nebo jejich částí, spojených se zmíněnými lymfocyty, působících vůči uvedené bakterii či viru způsobem zde popsaným a stanovení přítomnosti nebo rozsahu infekce zmíněnou bakterií či virem ve vztahu ke vhodné kontrole a/nebo srovnávacím vzorkům.
Způsob je zvláště výhodný vzhledem ke své jednoduchosti a může být použit i v nepřítomnosti laboratorního vybavení, například v polních podmínkách. S ohledem na nulové požadavky na inkubaci vzorku jako části stanovení je způsob snadno přizpůsobitelný automatizovaným postupům, je však také poměrně rychlý a snadno se jím provádí buněčná lyže a detekce protilátek v situacích, kdy není dostupné kompletní vybavení.
Způsob podle vynálezu bude nyní podrobněji popsán. První krok způsobu s výhodou zahrnuje izolaci lymfocytů ze vzorku. Jak bylo dříve uvedeno, není nezbytně vyžadován vyčištěný přípravek lymfocytů a místo něho může být použit přípravek, z něhož byla většina plasmatických protilátek odstraněna. Takový přípravek může s výhodou obsahovat méně než 15 % protilátek, podílejících se na množství
- 17 4» 44 4
4 • ·*· • 4 »
4 ·
4 4
4· ·4 4 4 plasmatických protilátek přítomných ve vzorku, například méně než 5 % a s výhodou méně než 1 %. Toho může být výhodně dosaženo použitím přípravku v podstatě neobsahujícího plasmu {obsahujícím například méně než 5 %, objem/objem), například přípravku bez obsahu séra. Lymfocytový přípravek může být připraven za použití standardních postupů, které jsou v oboru dobře známé, například za použití filtračních metod, nebo postupů využívajících absorbční materiál nebo sady lymfocytových přípravků. K získání lymfocytů, například z heparinizované krve, krve ošetřené EDTA a podobně, tak mohou být například použity různé přípravky celé krve, jaké se rutinně připravují v klinických laboratořích. Je nutno ocenit, že veškeré obohacené nebo vyčištěné přípravky musí obsahovat lymfocyty přítomné ve vzorku, ze kterého je přípravek získán k umožnění detekce spontánní nebo de novo produkce protilátek.
Lymfocyty jsou s výhodou odděleny, například za použití standardního media pro separací lymfocytů, jako je Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norsko), nebo za použiti imunomagnetické separace (IMS) nebo podobných separačních systémů na základě pevné fáze, nebo jiných běžných postupů. V případě IMS nebo podobných separačních postupů lze k výběrovému oddělení vhodných lymfocytů použít pevné fáze, například magnetických perliček povlékaných protilátkami, specifickými vůči určitým typům leukocytů. Pokud se používají oddělené lymfocyty, mohou být buňky před použitím promyty za použití standardních promývacích metod. Lymfocyty se s výhodou promývají k odstranění jakýchkoliv plasmatických protilátek, které mohou být přítomny po oddělení buněk. Obecně se k provedení vynálezu udržuje kontaminace lymfocytárních buněk plasmovými protilátkami na minimu a s výhodou je nižší než 20 ng plasmatického IgG na 100 μΙ vzorku, což představuje přibližně faktor konečného naředění plasmy 1:50 000; například je nižší než asi 0,5 ng sérového toto·
- 18 to to to toto· * »to« · • to * · · · « · · · to to toto toto·· ·· ····
IgG na 100 μΙ vzorku. Bylo ovšem pozorováno, že pro dosažení tohoto minima není nezbytné přídavné nebo důkladné promývání buněk. Například bylo zjištěno, že lymfocytový přípravek dostatečně neobsahující kontaminující sérové a/nebo plasmatické protilátky lze získat trojnásobným jednoduchým odstředěním celé krve po naředění pufry za přibližně stejných podmínek otáčení. Další podrobnosti viz příklad 3.
Obecně řečeno, způsob podle vynálezu se vyhybá potřebě inkubovat lymfocyty ze vzorku před prováděním stanovení. Je ovšem nutné ocenit, že pokud jsou buňky udržovány po krátká časová období za podmínek, umožňujících spojitou produkci nebo sekreci protilátek před rozrušením lymfocytů, bude způsob podle vynálezu stále umožňovat stanovení nově syntetizovaných protilátek spojených s lymfocyty.
Analyzovaný vzorek, který byl ovlivňován tak, jak je zmíněno výše, je v případě potřeby získat oddělené lymfocyty poté rozrušen k uvolnění nově syntetizovaných protilátek. To se provádí jakýmkoliv vhodným postupem známým z dosavadního stavu techniky, který účinně rozrušuje vnější a vnitřní membránové struktury, aniž by narušoval schopnost uvolněných protilátek vázat se na komplementární epitopy, například použitím detergentů, chaotropních činidel, rozrušovacích pufrů obsahujících například EDTA {kyselinu ethylendiamintetraoctovou), nebo alternativními postupy rozrušení, jako je sonikace (rozrušení ultrazvukem) nebo fyzickým rozrušením, vytvářejícím střihové napětí. S výhodou se ovšem používá rozrušovací pufr, neboť je to obecně nejvýhodnější technika, popsaná například v příkladech, to znamená pufr s obsahem detergentů, jako je 0,5% deoxychelát. Vhodné rozrušovací pufry mohou být použity ke stabilizaci uvolněných protilátek, například k řízení pH nebo degradace, pufry obsahující proteázové inhibitory V případě nezbytnosti lze použít napříkiad pufry, obsahující proteázové inhibitory. Alternativní metody rozrušení zahrnují například použiti cyklů zmražení a rozmražení nebo dokonce použití kapalného dusíku. Výsledkem je lyzát, v němž se uvolněné protilátky nacházejí v roztoku, který se používá pro následující kroky. Je nutné zmínit, že k získání dostatečných množství nově syntetizovaných protilátek ve vzorku, jež mají být detegovány, je žádoucí, aby bylo co největší množství buněk lymfocytů rozrušeno pro uvolnění protilátek. Prostředky k rozrušení jsou proto s výhodou směřovány k tomuto cíli a ve vzorku je rozrušeno alespoň 40% nebo 50%, lépe alespoň 60%, 70% nebo 80% a ještě lépe alespoň 90% z 95% lymfocytů, přítomných ve vzorku. Po rozrušení lymfocytů je obsah protilátek ve vzorku stanoven vhodným postupem, který umožňuje detekci cílových protilátek. Vzorek je proto s výhodou uveden do styku s pevnou fází, nesoucí vhodný vazebný člen k imobilizování detegovaných protilátek nebo protilátky. Vazebným členem jsou s výhodou antigen (imunogen) nebo antigeny (tj. jeden nebo více) rozpoznávané protilátkou nebo protilátkami či jejich částmi, které mají být detegovány. V jednom ztělesnění tedy předkládaný vynález poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizované protilátky ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje kroky, ve kterých:
se uvedou do styku alikvotní podíly uvedeného vzorku nebo volitelně lymfocytů přímo izolovaných ze zmíněného vzorku, kde uvedené lymfocyty byly rozrušeny k uvolnění protilátek nebo jejich Částí spojených s uvedenými lymfocyty, s jedním nebo více z antigenů, s výhodou nesených pevnou fází, rozpoznávanými protilátkou nebo protilátkami, které mají být detegovány;
se deteguje vazba protilátky na uvedený antigen či antigeny;
a srovná se vazba uvedené protilátky ke kontrolním a/nebo referenčním vzorkům pro stanovení přítomnosti nebo množství nově
- 20 9 ·*·« • 9 • 999
9 • 9
I 9*99 syntetizované protilátky v odpovědi vůči zmíněnému antigenu či antigenům. V tomto způsobu mohou být kontrolními nebo srovnávacími vzorky vhodné negativní nebo pozitivní kontroly, například slepé vzorky, normální vzorky nebo rozvolněné vzorky.
Použít lze rovněž alternativních vazebných partnerů, například bílkoviny A, bílkoviny G, nebo protilátek, které rozpoznávají protilátku, která má být detegována a vážou se k ní. V posledním případě není vyžadována vysoce specifická vazba, neboť v tomto ztělesnění způsobu stanovení je specifičnost vnesena následnou vazbou antigenů, které se vážou specificky na protilátky, které mají být detegovány. Ve všech ztělesněních je tedy vytvořen komplex specifického antigenu a protilátky. Přítomnost takových komplexů, s výhodou imobilizovaných (znehybněných) na pevné podložce, se zjišťuje v detekčním kroku způsobu podle vynálezu. V upřednostňovaném rysu tedy detekční krok způsobu podle vynálezu zahrnuje detekci uvolněných protilátek nebo jejích částí vytvořením komplexu antigenu a protilátky, kde zmíněný antigen (který s výhodou není protilátkou) zahrnuje nebo obsahuje imunogen nebo jeho část, obsahující alespoň epitop tohoto imunogenu.
Pevnou fází, pokud' je použita, může být kterákoliv z dobře známých podložek nebo matricí, které se běžně široce používají nebo jsou navrhovány k imobilizaci, separaci a podobně. Mohou také nabývat formy částic plátků, gelů, filtrů, membrán nebo mikrotitračních proužků, zkumavek nebo destiček a podobně a vhodně mohou být vyrobeny z polymerního materiálu. Pro snadnost provedení a jednoduchost však mohou být vhodně použity standartní mikrotitrační destičky a jamky, s výhodou standartní destičky ELISA.
Pevná fáze může být také upravena k umožnění detekce protilátek, specifických vůči škále různých antigenů. Například disky • fc · • * · fcfcfc fcfcfc fc* fcfc*·
- 21 » · • fcfcfc nebo kroužky a podobně z vhodného materiálu pevné fáze, například nitrocelulózy nebo podobně, mohou být povlékány různými antigeny a souběžně přidávány do mikrotitrační jamky nebo jiné vhodné nádoby, neobsahující žádný kontaktní antigen. Metody detekce vazby protilátky mohou tedy být použity k rozlišení různých antigenů. Pokuď jsou použita stanoveni sendvičového typu, pevná fáze výhodně nese jeden nebo více antigenů (antigeny pevné fáze), rozpoznávající protilátku nebo protilátky, nebo jejich části, které mají být detegovány (cílové protilátky). Pevná fáze může alternativně nést jednu nebo více protilátek (protilátky pevné fáze), které rozpoznávajcí protilátku nebo protilátky, nebo jejich části, které mají být detegovány (cílové protilátky). K umožněni detekce způsobem podle vynálezu, se přiměřeně, v závislosti na tom, zda uvedená pevná podložka nese protilátky nebo antigeny jak bylo popsáno výše, jeden nebo více antigenů, rozpoznávaných cílovými protilátkami imobiltzovanými na uvedené pevné fázi, uvede do styku s uvedenou pevnou fází nebo alternativně se jedna či více protiláte, které rozpoznávají cílové protilátky imobilizované na zmíněné pevné fázi, uvede do styku se zmíněnou pevnou fázi. Tyto antigeny nebo protilátky, které se po té navážou na pevnou podložku, mohou být vhodně označeny k umožnění detekce, jak bude popsáno dále.
Sady nebo disky, každý povlečený odpovídajícími antigeny ve shodě s určitým klinickým stavem nebo příznakem, mohou být použity k identifikaci toho, které z podezřelých agens vyvolává onemocnění. Disky mohou být po té jednotlivě zpracovány v oddělených jamkách. Je to postup, který zvláště šetří materiál, neboť testy lze provádět pro souběžné testování mnohočetných nebo odlišných antigenů (buď stejného infekčního agens nebo různých agens, odpovídajících klinickému příznaku nebo stavu v každém jednotlivém případě) za použití stejného malého objemu krve. Alternativním přístupem je použití • 9 ·· ····
- 22 • * ·
9 9 • « * ·*·· vícečetných vzorků rozrušených lymfocytů, tj. v oddělených jamkách, každé povlečené odlišnými vazebnými partnery, například antigeny nebo protilátkami, a použití obdobného průběhu testu.
Techniky pro navázání vazebného partnera, například antigenu na pevnou fázi, jsou také velmi dobře známé a široce popsané v literatuře. Mnoho standartních postupů povlékání antigenem je popsáno například v ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1998, vyd. D.M. Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons. Pokud je to žádoucí, destičky mohou být promývány a blokovány, opět za použití standartních postupů. Tedy například standartní mikrotitrační destičky, například ELISA destičky, mohou být jednoduše povlečeny vazebným partnerem tak, že se destičky inkubují přes noc při 4°C ve vhodném pufru, například fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS), obsahujícím vazebného partnera, například v koncentracích od 0,01 do 150 pg/ml bílkoviny, a následně se blokují za použití vhodného blokačního média (obecně neutrálního pufru, jako je PBS, obsahujícího blokující bílkovinu, například telecí sérum, nebo bílkoviny ze sušeného mléka) a inkubují se například při 37°C po dobu jedné až pěti hodin. Po odstranění blokačního roztoku jsou destičky připraveny k použití.
Vhodně však materiály vyžadované k provádění způsobu podle vynálezu, mohou být dodávány ve formě sady, v níž je pevná podložka dodávána již povlečená vazebným partnerem a příslušně blokována.
Suspenzi vzorku rozrušených lymfocytů může být žádoucí před prováděním kontaktního kroku zředit a vhodně lze použít celou škálu naředění buněk/vzorku. Naředění bude obecně prováděno použitím pufru, v němž jsou lymfocyty rozrušeny, jako ředícího činidla.
• · ·
9 4 4
9 9 >4 4444 • · · • 4 4 ♦ 4 ··<♦
- 23 • · · • 4 44 • · · • *
Po té je delegována vazba protilátky na její antigen. Detekční krok, pokud se jedná o čtení signálu, se vhodně uskutečňuje v roztoku. Ovšem vytvářen může být i nerozpustný produkt nebo signál, který v roztoku nelze odečítat. Použít lze kterýkoliv ze známých prostředků detekce vazby protilátky, pokud je vytvářen odečitatelný signál; například v závislosti na fluorescenci, chemiluminiscenci, kolorimetrii, nebo enzymové reakci k poskytnutí zachytitelného signálu. Pokud není použita pevná fáze, mohou být uvolněné protilátky detegovány jakoukoliv jinou citlivou serologickou metodou, jako je rozptyl světla (například nefelometrie) a rezonančními postupy. Vhodně lze použít imunitní stanovení jako prostředek detekce a s výhodou s enzymem spojené imunosorbční stanovení (ELISA). Ovšem v rozsahu vynálezu se k detekci protilátek uvažují i jiné testovací postupy než ELISA. Vhodné mohou být techniky, které používají povlékané disky nebo skleněné destičky, například zaplavované suspenzí rozrušených lymfocytů. Jakýkoliv standartní postup pro detekci protilátek, známý v tomto oboru, jako jsou postupy, jejíž výsledkem je nerozpustný nebo rozpustný produkt, lze přizpůsobit pro použití ve způsobu podle vynálezu buď ke kvantitativní analýze, nebo k testu kvality (například typu ano či ne).
Techniky imunitního stanovení a zvláště ELISA jsou v oboru dobře známé a popsané v literatuře (viz například ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1998, vyd. D.M. Kemeny & S.J. Challacombe, John Wiley & Sons.)
Následně po styku se vzorkem rozrušených lymfocytů může být přidán konjugát enzymu a protilátky, například v detekčním způsobu ELISA, který se váže k protilátce, navázané na antigen na pevné fázi. Podobně, pokud je protilátka, jež má být detegována, vázána nespecificky na pevnou fázi prostřednictvím vazebného partnera, například protilátkou vůči protilátkám různých typů, může být přidán
- 24 β 9 9
999 · * ·
«9
99« · · · • 99
9 9
9999 konjugát enzymu a antigenu, který se bude specificky vázat na imobilizovanou protilátku, jež má být detegována. Po té se přidá enzymový substrát k poskytnutí zachytitelného signálu. V předkládaném vynálezu se vhodně používá rozpustný substrát poskytující signál, který je detegovatelný v roztoku. Je to výhodné, neboť to usnadňuje a zjednodušuje zpracování velkého množství vzorků a manipulaci s nimi a umožňuje odhad produkce protilátek, i když, jak bylo uvedeno výše, není nezbytné určit absolutní množství a pokud je to žádoucí, lze získat kvalitativní nebo semikvantitativní výsledky. Pro usnadnění může být substrát zvolen tak, aby poskytoval spektrofotometricky detegovatelný signál, který může být jednoduše odečítán sledováním absorbance, například za použití zařízení, odečítajícího standartní destičky ELISA. Je možné použít standartních reagencí testu ELiSA, které mají tu výhodu, že umožňují srovnat stanovení podle vynálezu s existujícími způsoby a postupy, rutinně používanými v klinických laboratořích. Samozřejmě mohou být použity i jiné systémy, vytvářející detekci/signál, které poskytují signály detegovatelné fluorescencí, chemiluminiscencí a podobně.
Ke zlepšení signálu a zvýšení citlivosti mohou být použity imunoenzymové amplifikační metody, například metoda používající komplex avidin-biotin, jako je Extravidin systém, dostupný od firmy Sigma. Biotinované druhotné protilátky se používají jako reakční činidla ELISA, v kombinaci s komplexem peroxidázy a avidinu. Vzhledem k tomu, že jedna molekula avidinu je schopna navázat několik molekul biotinu, zvyšuje použití avidin-biotin-peroxidázového komplexu povrchovou koncentraci peroxidázových molekul, což tomuto způsobu dodává ještě větší citlivost.
Materiály a prostředky, vyžadované v kroku rozrušení lymfocytů a v kroku detekce vazby protilátky mohou být vhodně dodávány také ve formě sady spolu s pevnou fází, potaženou vazebným partnerem.
• · · ·»*» ’ - » τ • ··· * · · · · · . * » · « » * · ·
-25- ······· ·· ···· ·· ····
Informace, získaná ze stanovení podle vynálezu, může být doplněna za použití jiných metod stanovení. Přídavné a užitečné údaje o předem existujících sérových/plasmových protilátkách mohou být získány v klasickém testu ELISA. Nadto může být po oddělení lymfocytů ze vzorku krve, zbývající tekutina plasmy použita k detekcí předem existujících protilátek za použití stejné pevné fáze potažené vazebným partnerem, jaká byla použita ve stanovení podle vynálezu.
Pro ujištění, že způsob stanovení podle vynálezu pracuje spolehlivě, mohou být zahrnuty příslušné kontroly a použity k určení přítomností nebo množství nově syntetizovaných protilátek. Například pro zjištění, že zaznamenávaný signál z testovaných jamek není vyvoláván nepravidelně a nespecificky (okolními) aktivovanými lymfocyty, se používá antigen negativní kontroly. Tento antigen by měl být z infekčního agens, které je jen zcela nepravděpodobně odpovědné za akutní onemocnění pacienta, například tetanový toxoid. Počet takových okolních aktivovaných lymfocytů bude v každém případě za všech okolností mnohem nižší, než se vyžaduje pro kladný výsledek testu v použití způsobu podle vynálezu. Uspořádání vynálezu bere tento bod v úvahu.
Jak bylo výše zmíněno, vzhledem ke své jednoduchosti, rychlosti a snadnosti provedení předurčuje stanovení podle vynálezu samo sebe k diagnostickému nebo jinému klinickému či veterinárnímu použití, například při chovu ryb. Kromě malého obsahu vzorku je další výhodou to, že je potřebný pouze jeden vzorek a nikoli dva vzorky séra odebírané v intervalu dvou až tří týdnů, jak je nezbytné pro většinu běžných serologických testů. Není potřebné ani komplikované vybavení a stanovení je snadno automatizováno. Nad to by mělo být možné, pokud je to žádoucí, testovat odlišné izotypy imunoglobulinu.
φ φ φ φφφ φφφ φφ φφφφ φ φ φ
Φφφ • φ φ φφ φφφφ
- 26 • φ · • ··♦ φ · φ • φ
Výše uvedený způsob stanovení podle vynálezu poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo rozsahu probíhající infekce díky analýze spontánní exprese specifických protilátek vůči definovanému antigenu. Takový způsob je dobře použitelný k určení podmínek onemocnění, které jsou známé a kde antigeny, vztahující se k odpovídajícímu imunogenu, jsou dostupné a slouží tedy jako specifické označení infekce. Ovšem v některých klinických situacích nemusejí být specifické onemocnění nebo infekce identifikovány a/nebo vhodný antigen nemusí být dostupný pro použití ve stanovení. V takových případech může být stanovení upraveno k určení přítomnosti nebo rozsahu nespecifických indikátorů infekce. Vzorky obsahující lymfocyty, například celá krev nebo vyčištěné či obohacené lymfocytové přípravky z ní získané, mohou tedy být testovány například s ohledem na produkci infekčních markérů (označovačů), například cytokinů nebo interferonů, například 1L-2, IL-4 nebo interferonů gama.
Nazírán z ještě dalšího aspektu tedy vynález poskytuje způsob stanovení přítomnosti nebo množství indikátorů (ukazatelů) infekce ve vzorku v odpovědi vůči imunogenu, zahrnující kroky v nichž:
se získá vzorek s obsahem lymfocytů;
se uvedené lymfocyty rozruší k uvolnění indikátorů infekce, tak, aby byla určena přítomnost či množství indikátorů infekce v uvedeném vzorku.
K provádění tohoto způsobu může být pevná fáze vybavena vhodnými zachycovacími molekulami, například protilátkami vůči indikátorům infekce pro detekci. Pro detekci přítomnosti zmíněných indikátorů infekce, imobilizovaných na pevné fázi, lze použít způsobů jak byly popsány výše, například použití označených protilátek nebo ligandů. V tomto způsobu mohou být specifické markéry identifikovány vhodným výběrem imobilizujíci částice nebo detekční molekuly. Veškerá
AA
A*
A •
• A
A
- 27 ♦ ·-·* • fc • AAA
AAAA ··· ·· * A • A A • A A A A A • AAA
A· A· • A « • A
AAA A A A A aa aaaa bílkovina ve vzorku může tedy být například imobilízována na pevné podložce a detekce se může provádět za použití označených specifických protilátek nebo ligandů. Alternativně lze použít specifického vazebného partnera k imobilizování odpovídajících indikátorů infekce, které mohou být příslušně označeny, buď pozitivně nebo negativně, v prvním případě například vazbou k doméně, přítomné na indikátoru infekce, nikoli však výhradně k této molekule, ve druhém případě označením nenavázaného vazebného partnera na pevné fázi. Sady k provádění tohoto způsobu rovněž představují část tohoto vynálezu.
Obrázek 1 znázorňuje výsledky klinického pokusu s vakcínou vůči chřipce, v němž byly vzorky od devíti subjektů ( osob 2 až 10) testovány za použití metody rozrušení lymfocytů. Měřítko na levé straně každého sloupcového grafu znázorňuje H3N2 IgG, vynesené v nanogramech vůči dnům po očkování na rovnoběžné ose. Na každém sloupcovém grafu je plnou čarou vyznačena linie, ukazující Hl titr na pravé straně měřítka pro virus A/Nanchong. Viz příklady 1 a 2.
Vynález bude nyní podrobněji popsán ve vztahu k následujícím příkladům, které ho neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Specifičnost
Subjekt: LOH muž, 25 tet. Krevní vzorek byl odebrán 9 dní po prvním dnu klasického klinického onemocnění podobného chřipce. V místním společenství bylo zaznamenáno směsné šíření chřipky A a B.
- 28 « ··*
Separace lymfocytů: Shromážděny byty krevní vzorky periferní heparinizované žitní krve. Lymfocyty byly odděleny za pomoci Lymphoprep (Nycomed Pharma AS; Oslo) podle instrukcí výrobce, s tím rozdílem, že heparinizované krevní vzorky byly smíchány s dvojitým (namísto jednoduchým) objemem fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS, pH 7,2) před prvním krokem odstředění. Provedeny byly dva přídavné cykly promývání buněčného peletu. Počet lymfocytů byl stanoven v hemocytometru za použití metody vyloučení Blue Dextranu.
Rozrušení lymfocytů: Rostoucí množství lymfocytů byla rozrušena rozrušovacím pufrem (disruption buffer) 10 mM Tris HCI (pH 7,4) obsahujícím 0,5 % deoxycholátu, 2 μς/πιΐ pepstatinu A (Sigma-P-4265, šarže 18H0551), 2 pg/ml leupeptinu (Sigma L-0649, šarže 77H86221), 0,5% aprotininu (Sigma A-6279, šarže 87H7010), 1 mM PMSF (Sigma P-7626, šarže 48H1265) (na základě odkazu: D.L. Spector, R.D. Goldman, Leínwand LA: Celíš. Laboratorní příručka, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998, díl 1: 74.6) a podrobeny testování ELISA (viz tabulka 1).
Potahování a blokování destiček ELISA: F-forma Greinerovy mikrodestičky, střední vazebná kapacita, číslo katalogu 655001 (šarže 98 26 01 48), D-72636 Frickenhausen, Německo. Virové antigeny (dar od Solvay-Duphar, Holandsko) pro testování protilátek vůči chřipce: A/Nanchang/933/95 (H3N2) povrchové antigeny, 10 pg/ml v PBS, 100 μΙ/jamku. B/Harbin/07/94 povrchové antigeny, 10 pg/ml v PBS, 100 μί/jamku. Pro testování obecných protilátek IgG: kozí anti-lidské IgG (specifické vůči gama řetězci) Sigma I-7883 (šarže 76H8895) použité v ředění 1:500 v PBS, 100 μΙ/jamku. Potahování přes noc při 4°C. Blokování v PBS s 10% fetálním telecím sérem (FCS) po dobu jedné hodiny při teplotě místností. Mezi veškerými následnými kroky byly imunodestičky promývány pětinásobně pomocí PBS s 0,05% Tween 20.
- 29 « fc ·· fcfcfcfc • · · · · · fcfcfc fcfcfcfc · • fcfc· · · · fc* * • fcfcfcfc ··»· · • fcfcfcfc fcfcfc • fcfcfc fcfc· fcfc ·*·· fcfc fcfcfcfc
Uspořádání vzorků na destičce: testy obecných protilátek IgG a protilátek IgG vůči chřipce byly prováděny na stejné imunodestičce, stejně jako lidské standardy IgG. Veškeré vzorky byly testovány duplicitně.
Testované vzorky: Vzorky pro testování: LOH sérum (zředění plasmy 1:3). Vzorky bez příměsí a desetinásobně zředěné v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS (ředidlo), 100 μΙ/jamku. IgG standard: Sigma I-4506 (šarže 96H8840): 10 pg IgG/ml, desetinásobné zředění v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS, 100 μΙ/jamku.
Konečný buněčný pelet v množství 300 μΙ byl v roztoku PBS, obsahujícím zředění séra 1:9,368. K tomu peletu bylo přidáno 700 μΙ PBS (= zředění 1:3,33). Konečný pelet mě! 2,0x107 buněk a obsahoval sérovou kontaminaci 1:31 200. Konečný testovaný supernatant byl rovnocený naredění séra 1:9 370.
Buněčné lyzáty: Lyzáty byly upraveny tak, aby odpovídaly 800 000, 200 000 a 50 000 buňkám/jamku, 100 μΙ/jamku.
Tabulka 1. Směsi buněčného lyzátu pro testování.
| počet ' buněk/ jamku | μΙ buněč. peletu | μΙ rozruš. pufru | μΙ ředidla | celkové μΙ | zředění vzhledem ke konečnému promyti buněk |
| 800 000 | 240 | 240 | 126 | 606 | 1:(2,53x3,33) |
| 200 000 | 60 | 60 | 486 | 606 | 1:(10,1x3,33) |
| 50 000 | 15 | 15 | 576 | 606 | 1:40,4x3,33) |
Kontaminace buněčných preparátů sérovými protilátkami, vzhledem ke konečnému promyti buněk, byly vypočítány jako:
0*0 0 » » * , - , , «0·· 00 · 0* * 0 0000 0000 0 0 *000 00· 0000 000 «0 0000 0 0 0000
- 30 1:8,4 (10,6%) pro 800 000 buněk
1:33,7 (2,9%) pro 200 000 buněk, a
1:134,8 (0,7%) pro 50 000 buněk.
Veškeré vzorky protilátek byly unkubovány po dobu 90 minut při teplotě místnosti.
Sekundární protilátky: Biotinem označené kozí anti-lidské IgG (specifické vůči řetězci gama), Sigma B-1140 (šarže 96H8886), používané v naředění 1:500 v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS, 100 μΙ/jamku. Inkubovány po dobu 60 minut při teplotě místnosti.
Konjugát: ExtrAvidin-peroxidázový konjugát, Sigma E-2886 (šarže 28H 4824) zředěný 1:1 000 v PBS s 0,05% Tween 20 a 5% FCS, 100 μΙ/jamku. Inkubován po dobu 60 minut při teplotě místnosti.
Vyvíjení: Tablety substrátu (dihydrochlorid o-fenylendiaminu), Sigma P-8287 (šarže 88H8250). Jedna tableta (10 mg) byla rozpuštěna ve 25 ml 0,1 mol χ Γ1 fosfáto-citrátového pufru, pH 5,0, a doplněna 20 μΙ perhydroiu (30% peroxid vodíku). Přidáno bylo 100 μΙ/jamku roztoku substrátu a reakce byla zastavena po 10 minutách přídavkem 50 μΙ/jamku 1 mol χ Γ1 kyseliny sírové. Optická hustota byla odečítána při vlnové délce 492 nm v zařízení Titertek Multiskan PLUS (Flow Laboratories).
Výsledky
Odhady množství IgG byly založeny na interpolaci ze standartní křivky, získané z různých naředění standardu IgG. Veškeré testované vzorky byly testovány duplicitně a průměry odečtených hodnot optické hustoty byly použity k následným výpočtům.
* ·
- 31 ♦ 4 * 444 • · 4 · · 4 »· 4444 4· «·44
Tabulka 2. Sérové protilátky IgG
| Protilátky | Sérové protilátky (pg/ml) | % |
| Obecně IgG | 2 365 | 100 |
| Chřipka B | 70 | 3,0 |
| Chřipka A | 112 | 4,8 |
Tabulka 4. Shrnutí: detekce IgG v lymfocytech periferní krve a séra.
| Specifičnost! Čisté IgG z | % | Sérové IgG (pg/ml) | % | |
| protilátky | lymfocytů v každé jamce (10'5 ng) | |||
| Chřipka A | 3,74 | 15,4 | 112 | 4,8 |
| Chřipka B | 0,18 | 0,7 | 70 | 3,0 |
| Obecně IgG | 24,28 | 100,0 | 2 365 | 100,0 |
* * • ··* • * • · to • to ··«·
Tabulka 3.
Uvolnění protilátek IgG z rozrušených lymfocytů.
444 |»44 444»
4*4« 4» * 4> * *44· · 4 4 4 4
QO · 4444 4 4 4
- Ου - *··4 «· »4 4444 4 · 4444
Závěr: Subjekt LOH byl infikován virem chřipky A, jak je zřejmé z tabulky 3. Za využití těchto údajů lze usoudit, že 100 000 lymfocytů/jamku by mělo poskytnout přibližně 20 ng/mí IgG protilátek vůči chřipce A, oproti přibližně 2 ng/ml protilátek vůči chřipce B. První koncentrace buněk bude pro praktické účely poskytovat signál ELISA protilátek specifických vůči chřipce A, který může být běžně měřen, ne však protilátek vůči chřipce B. To je v kontrastu s hladinami protilátek vůči chřipce, měřených v séru (tabulka 2), kde byly hladiny protilátek vůči chřipce A i B velmi podobné. Takovými sérovými protilátkami by nejpravděpodobněji měly být předem existující křížově reagující protilátky z předchozích expozic. Je známé a doložené po mnoho let, že paměť, týkající se chřipky, může být opětně aktivována následnou expozicí (vystavením) heterogenním virům, tak zvaným antigenním prohřeškem, nejpravděpodobněji prostřednictvím místního náhodného vedlejšího účinku v lymfoidní tkáni, v níž probíhá původní imunitní zpracování.
Důvodem, proč protilátky z rozrušených lymfocytů v našem testu rovněž poskytují měřitelný, ačkoliv malý, signál ELISA s antigenem chřipky B, tj. virem nepůsobícím na subjekt LOH, může být důsledek takové nespecifické opětovně aktivace paměťových lymfocytů, způsobené imunitním působením viru chřipky A. Ovšem taková neobvyklá opětná aktivace paměťových buněk je pokládána za jev týkající se chřipky a nebude platit pro jiná infekční agens. Je tedy třeba předpokládat, že budou pozorována dokonce jasnější odlišení signálů poskytovaných pro antigeny z infekčního činidla, které je testováno a z jiných činidel.
Předkládaný způsob vyžaduje přibližně 100 μΐ heparinizované krve (= 100 000 lymfocytů) pro každou antigenně specifickou protilátku jež má být testována, což umožňuje použití vzorku kapilární krve.
Příklad 2
Kinetika • * β > V - - • ··· · · 4 · · · • 4 « 4 9 4*44 ·
Pokus se týká klinické chřipkové vakciny. Testováno bylo devět zdravých subjektů; 6 žen ve stáří 24 až 27 let (průměr 26,2) a 3 muži ve věku 24 až 31 let (průměr 28,3). Lékařem byli všichni informováni o kontraindikacích, vztahujících se k očkování, a všichni informovali lékaře, že si nejsou žádných takových kontraindikací vědomi. Nikdo z nich nebyl předtím vůči chřipce očkován. Všechny vakciny odpovídaly pokusu, umožňovaly začlenění vzorku periferní krve tak, jak je popsáno níže. Subjekty obdržely povolenou trivalentní vakcinu inaktivovaného celého viru (Vaxigňp), obsahující:
virus, podobný A/Sydney/5/97 (H3N2), obsahující 15 pg hemaglutininu na dávku virus, podobný A/Beijing/262/95(H 1N1), obsahující 15 pg hemaglutininu na dávku virus, podobný B/Beijing/184/93, obsahující 15 pg hemaglutininu na dávku;
všechny od firmy Mériex Sérums & Vaccines (Francie).
Vzorky heparinizované krve byly odebrány tak, jak je popsáno v příkladu 1. Veškeré postupy byly stejné jako je popsáno v příkladu 1, s tou výjimkou, že lymfocyty byly rozrušeny zmražením/roztátím (dvojnásobně) vystavením lahviček s lymfocyty působení kapalného dusíku a podržením lahviček v proudu tekoucí vody z kohoutku.
Nádavkem byl proveden test inhibice hemaglutinace (HI) se vzorky plasmy, ovlivněné enzymem ničícím receptory, podle standartních postupů Kendala a spoluautorů, Concepts and Procedures for Laboratory-Based Influenza Surveillance, 1982, Viral Disease Unit, WHO, Ženeva, za použití 4 hemaglutinačních jednotek virů A/Nanchang a 0,7% krocaních erytrocytů. Plasmy byly testovány v krocích dvojnásobného zředěni a titry byly hodnoceny jako převrácená hodnota nejvyššího zředění, poskytujícího úplnou inhibici hemaglutinace viru.
Byly použity vzorky, získané v den očkování, po 7 dnech a po 13 dnech.
• 0
- 35 • 0 * 4 * 4 44 0« · · ♦ » • 0 0 0 · * * · 0 · • 0 0 4 · 040
4400 404 ·· 4004 40 4444
Výsledky
Obrázek 1 znázorňuje množství (v nanogramech) IgG vůči povrchovým antigenům z odpovídajících A/Nanchang/933/95(H3N2) (viz příklad 1), za použití roztoků, získaných z 300K rozrušených lymfocytů pro každý z devíti očkovaných subjektů (sloupce). Jsou rozděleny podle množství protilátek IgG specifických vůči chřipce, získaných z rozrušených lymfocytů. Měřítko na levé straně grafu, týkající se nanogramů IgG, není stejné pro všechny subjekty. Superpozicí jsou znázorněny Hl titry (plná čára) vůči viru A/Nanchang. Titr větší nebo rovnající se 40 je podle mezinárodní dohody považován za ochranný.
Závěr
Klasicky jsou Hl protilátky považovány za zlatý standard chřipkových protilátek, společně s protilátkami neutralizujícími virus. Hl titry > 40 jsou podle mezinárodní dohody považovány za ochranné. Obrázek 1 ukazuje, že 4 z 9 subjektů (osoby 2, 5 až 7), které získaly takové protilátky v den 7 a veškeré subjekty, kromě osob 3 a 10 měly takové Hl titry v den 13. U všech subjektů byly vysoké hladiny IgG specifických vůči chřipce detegovány v rozrušených lymfocytech již v den 7 a u 5 subjektů ( osoby 3, 4, 8 až 10) byly v den 7 detegovány pouze protilátky z rozrušených lymfocytů a nikoli ochranné hladiny Hl protilátek.
Nadto byla specifičnost IgG protilátek vůči chřipce zřejmá z výskytu takových protilátek v den 7 a vymizení stejných protilátek v den 13, zatímco v den 13 většina subjektů vykazovala významné hladiny sérových protilátek.
Příklad 2 jasně ukazuje, že detegované protilátky z rozrušených lymfocytů nebyly kontaminovány sérovými protilátkami nachytanými na pelet lymfocytů, jak bylo jasně prokázáno v příkladu 1.
- 36 * · ··
9
9« 9
Příklad 3
Zjednodušený způsob vyčištění íymfocytů z látek kontaminujících sérum/plasmu.
Typicky mohou být lymfocyty, dostatečně neobsahující protilátky, které kontaminují sérum/plasmu, odděleny třemi následnými kroky odstředění. 300 μΙ celé krve se smíchá s 10 ml ředidla, sestávajícího ze dvou dílů PBS a jednoho dílu destilované vody. Směs se odstřeďuje 20 minut při 400 g a teplotě místnosti. Supernatant se vylije a k peletu se přidá 10 ml PBS. Suspenze se opět odstřeďuje za stejných podmínek a celý cyklus se ještě jednou opakuje. Konečný pelet, suspendovaný ve 100 μΙ PBS, se použije pro následující stanovení jako zdroj lymfocytu.
Příklad 4
Uchovávání krve před vyčištěním íymfocytů.
Mužský subjekt (EJAa, 20 let) dostal povolenou inaktivovanou trivalentní vakcínu vůči chřipce podle pokynů výrobce (viz příklad 2). Vzorky 5 ml heparinizované krve byly odebrány v den očkování (den 0) a v den 9 po očkováni. Bezprostředné po shromáždění bylo 300 μΙ krve podrobeno třem cyklům promytí/odstředění, jak bylo popsáno výše v příkladu 3 a lymfocyty byly rozrušeny tak, jak bylo popsáno v příkladu 1, Zbývající vzorek krve byl uchováván 4 dny při 4 °C a následně byl skladován při teplotě místnosti po dobu 4 hodin před tím, než bylo zahájeno nové kolo čištění lymfocytu. Veškeré následné testy ELISA byly prováděny tak, jak je popsáno v příkladu 1. Testy inhibice hemaglutinace (Hl) byly prováděny s homologními druhy vakciny, jak je popsáno v příkladu 2.
• fc « ·«· • fcfcfc « · I 9 fcfc · fc * * • · · · » · · • fcfc fcfcfc ·· fcfcfc · · · fcfc ··
Tabulka 5. Uchovávání krve po dobu 4 dní při 4 °C a následně po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Účinek na aktivitu protilátek z rozrušených iymfocytů.
| Dny po očkování | H3N2 | H1N1 | B | |||
| ihned | po 4 dnech | ihned | po 4 dnech | ihned | po 4 dnech | |
| Den 0 | Hl | 640 | < 10 | < 10 | ||
| buňky | 704 | 598 | 058 | 060 | 224 | 210 |
| Den 9 | Hl | 640 | 20 | 40 | ||
| buňky | 811 | 901 | 091 | 100 | 466 | 446 |
Veškeré zápisy udávají optickou hustotu při 492 nmxWOO a Hl titry plasmatických protilátek. Buňky” jsou protilátky z rozrušených lymfocytů, získaných ze 100 μ! krve.
Výsledky
U tohoto subjektu bylo předem zjištěno, že má významné titry Hl vůči A/Sydney/5/97 (H3N2) složce vakcíny již před očkováním a protilátky uvolněné z lymfocytů významně nevzrostly od dne 0 do dne 9, stejně jako titr Hl. Hl-vakcinační odpověď vůči H1N1 složce A/Beijing/262/95 byla slabá a totéž bylo pozorováno při buněčném stanovení. Nejjasnější odpověď byla pozorována vůči složce B/Beijing/184/93 chřipky B, kde titry Hl vzrostly od <10 do 40. Totéž bylo pozorováno i v buněčném stanovení.
Uchovávání krve po dobu 4 dnů při 4 °C a následně 4 hodiny při teplotě místnosti neovlivnilo zaznamenanou protilátkovou aktivitu z rozrušených lymfocytů. Výsledky získané ihned a výsledky získané po 4 denním uchovávání se významným způsobem nelišily.
to · to to
- 38 • toto « • · to* to to * ·· to
Jiné pokusy rovněž ukázaly, že dokonce po 6 dnech za podobných podmínek uchovávání (v ledničce a mezitím 6 hodin při teplotě místnosti) neovlivnilo následující měření protilátek z rozrušených lymfocytů.
Claims (24)
1. Způsob stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizované protilátky ve vzorku tělesné tekutiny nebo ve vzorku získaném z lymfatického systému v odpovědi na imunogen, vyznačující se t i m, že zahrnuje kroky v nichž:
se detegují uvolněné protilátky nebo jejich části ve vzorku obsahujícím lymfocyty, které byly rozrušeny k uvolnění syntetizovaných protilátek nebo jejích částí, spojených s uvedenými lymfocyty, ke stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizované protilátky v uvedeném vzorku.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky v nichž:
se získá vzorek obsahující lymfocyty;
se rozruší uvedené lymfocyty k uvolnění protilátek nebo jejich částí spojených s uvedenými lymfocyty; a se detegují uvolněné protilátky nebo jejich části ke stanovení přítomnosti nebo množství nově syntetizované protilátky v uvedeném vzorku.
3. Způsob stanovení podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že jako uvedený vzorek se použije lymfa nebo krev.
4. Způsob stanovení podle nároku 3, vyznačující se tím, že jako uvedený vzorek se použije periferní krev.
5. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároků 1 až4, vy znáčů j í c i se t i m, že uvedený vzorek se neinkubuje k podpoře syntézy a/nebo sekrecí protilátek před prováděním způsobu.
to · · toto · to · to * to • to··
6. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, v y znáčů j i c i se t í m, že lymfocyty se rozruší za použití fyzikálních rozrušovacích prostředků nebo pufrů či roztoků rozrušujících buňky.
7. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t i m, že uvedené protilátky nebo jejich části se detegují vazbou na jeden či více antigenú, které rozpoznávají zmíněné protilátky nebo jejich části.
8. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároků 1 až7, vy znáčů j í c í se t í m, že uvolněné protilátky se detegují prostřednictvím vazebného stanovení na pevné fázi.
9. Způsob stanovení podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená pevná fáze nese jeden nebo více antigenú, tj, antigenú pevné fáze, rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, či jejich částmi, které mají být detegovány, tj. cílovými protilátkami.
10. Způsob stanovení podle nároku 8, v y z n a č u j í c i se tím, že uvedená pevná fáze nese jednu nebo více protilátek, tj. protilátek pevné fáze, které rozpoznávají protilátku nebo protilátky či jejich části, které mají být detegovány, tj. cílové protilátky.
11. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až 10, vyznačující se t í m, že se provádí v krevních vzorcích novorozenců nebo batolat pro rozlišení nově syntetizovaných protilátek a pasivně přenesených mateřských protilátek.
12. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až 11, vy značující se tím, že před rozrušením lymfocytů, nebo po rozrušení ale před krokem detekce, se uvedený vzorek skladuje při teplotě přibližně 4 °C nebo nižší.
13. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedený vzorek krve pro použití ve stanovení nebo pro přípravu lymfocytů pro použiti ve stanovení má objem menši než 1 ml.
14. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až 13, vyznačující se tím, že se v něm používají lymfocyty přímo izolované z uvedeného vzorku.
15. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až 14, v y zn a č u j í c í s e t í m, že krok detekce se provádí imunostanovením, s výhodou enzymoimunostanovením ELISA.
16. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 8 až 15, v y z n a č u j í c í se t i m, že se jeden nebo více z antigenů. rozpoznávaných cílovými protilátkami, imobilizovanými na zmíněné pevné fázi, uvede do styku se zmíněnou pevnou fází.
17. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 8 až 15. v y - z n a č u j í c í se t í m, že se jedna nebo více z protilátek, které rozpoznávají cílové protilátky imobiiizované na zmíněné pevné fázi, uvede do styku se zmíněnou pevnou fází.
18. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až 17, v y z n a č u j í c í se t í m, že se pro krok detekce používá rozpustný substrát a poskytuje spektrofotometricky detegovatelný signál.
19. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároku 1 až18, vyznačuj í cí se t í m, že se používá negativní kontrolní antigen.
20. Způsob stanovení podle kteréhokoliv nároku 8 až 19, vyzná č u j í c í se t í m, že se používají vícečetné pevné fáze, nesoucí každá odlišný cílový antigen.
« A A A • · ·
A
A
- 42 • A A • AAA * · • A • · A
AA AAAA
A A AAAA
21. Způsob diagnózy či monitorování infekce u lidí nebo zvířat nebo v části uvedeného zvířete imunogenem, vyznačující se t í m, že tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se ze zmíněného zvířete získá vzorek obsahující lymfocyty, stanoví se přítomnost nebo množství nově syntetizovaných protilátek nebo jejich částí, spojených se zmíněnými lymfocyty, namířených vůči zmíněnému imunogenu, podle způsobu uvedeného ve kterémkoliv z nároků 1 až 20 a stanoví se přítomnost nebo rozsah infekce zmíněným imunogenem ve vztahu k příslušným kontrolním a/nebo referenčním vzorkům.
22. Způsob stanovení podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vy značující se tím, že jako zmíněný imunogen se používá bakteriální nebo virový antigen a diagnóza nebo monitorování infekce se určuje zdrojem bakterie nebo viru.
23. Způsob podle nároku 22, v y z n a č u j í c í se t í m, že zmíněný antigen se získá z viru zvoleného ze seznamu, který sestává z viru Herpes Simplex, cytomegaloviru, viru lidské imunodeficíence HIV a kteréhokoliv z virů hepatitidy, stejně jako viru toxoplasmy a viru Epstein-Barr, EBV.
24. Způsob stanovení přítomnosti nebo množství indikátoru infekce ve vzorku jako odpověď vůči imunogenu, vyznačující setím, že zahrnuje kroky v nichž:
se získá vzorek obsahující lymfocyty;
se rozruší uvedené lymfocyty k uvolnění indikátoru infekce, jež mají být delegovány; a se detegují uvolněné indikátory infekce pro stanovení přítomnosti či množství indikátoru infekce ve zmíněném vzorku způsobem stanoveným ve kterémkoliv z nároků 1 až 20.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9913819.0A GB9913819D0 (en) | 1999-06-14 | 1999-06-14 | Assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20014498A3 true CZ20014498A3 (cs) | 2002-06-12 |
| CZ299065B6 CZ299065B6 (cs) | 2008-04-16 |
Family
ID=10855326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20014498A CZ299065B6 (cs) | 1999-06-14 | 2000-06-14 | Zpusob stanovení prítomnosti protilátky |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7361479B1 (cs) |
| EP (1) | EP1192469B1 (cs) |
| JP (1) | JP3547729B2 (cs) |
| CN (1) | CN1322328C (cs) |
| AT (1) | ATE391914T1 (cs) |
| AU (1) | AU779524B2 (cs) |
| CA (1) | CA2375503C (cs) |
| CY (1) | CY1110429T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ299065B6 (cs) |
| DE (1) | DE60038557T2 (cs) |
| DK (1) | DK1192469T3 (cs) |
| ES (1) | ES2304965T3 (cs) |
| GB (1) | GB9913819D0 (cs) |
| HK (1) | HK1046439B (cs) |
| HU (1) | HUP0201661A2 (cs) |
| NO (1) | NO20016080L (cs) |
| NZ (1) | NZ516587A (cs) |
| PL (1) | PL352929A1 (cs) |
| PT (1) | PT1192469E (cs) |
| RU (1) | RU2234704C2 (cs) |
| WO (1) | WO2000077525A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200109790B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9913819D0 (en) * | 1999-06-14 | 1999-08-11 | Plasmacute As | Assay |
| GB0325483D0 (en) * | 2003-10-31 | 2003-12-03 | Plasmacute As | Assay |
| JP2010512534A (ja) | 2006-12-12 | 2010-04-22 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | ラベル粒子を検出するマイクロエレクトロニクスセンサデバイス |
| CN105510017B (zh) * | 2015-12-30 | 2018-02-09 | 瓦房店轴承集团有限责任公司 | 锥孔式轴承密封圈承压测试装置 |
| CN108507724B (zh) * | 2018-05-17 | 2020-01-14 | 安徽江淮汽车集团股份有限公司 | 发动机试漏工装 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0077525A3 (en) | 1981-10-15 | 1984-08-22 | Sakashita Co., Ltd. | Sweat-absorbent textile fabric |
| US5019497A (en) | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Lennart Olsson | Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies |
| US4707443A (en) | 1985-04-19 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Soluble interleukin-2 receptor as a disease indicator and a method of assaying the same |
| US4661445A (en) | 1985-05-24 | 1987-04-28 | Saxinger W Carl | Competitive ELISA for the detection of HTLV-III antibodies |
| CA1319593C (en) * | 1987-03-03 | 1993-06-29 | Kenji Chichibu | Method of assaying high molecular hyaluronic acid and kit of reagents for such assay |
| CA2011099A1 (en) | 1989-04-19 | 1990-10-19 | Stephen C. Wardlaw | Determination of lymphocyte reactivity to specific antigens in blood |
| US5188942A (en) | 1990-10-09 | 1993-02-23 | Consultants For Applied Biosciences, Inc. | Method for determining bluetongue virus antibodies in serum |
| ATE191791T1 (de) | 1991-11-25 | 2000-04-15 | Shiloov Medical Technologies L | Verfahren für die bestimmung von antikörpern in seronegativen personen |
| GB9503406D0 (en) * | 1995-02-21 | 1995-04-12 | Haaheim Lars R | Detection of antibody production |
| JP3249919B2 (ja) * | 1996-07-30 | 2002-01-28 | 株式会社堀場製作所 | 免疫測定方法 |
| GB9913819D0 (en) * | 1999-06-14 | 1999-08-11 | Plasmacute As | Assay |
-
1999
- 1999-06-14 GB GBGB9913819.0A patent/GB9913819D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-06-14 AT AT00942182T patent/ATE391914T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-14 AU AU56895/00A patent/AU779524B2/en not_active Ceased
- 2000-06-14 DE DE60038557T patent/DE60038557T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 JP JP2001503531A patent/JP3547729B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-14 CZ CZ20014498A patent/CZ299065B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-14 CN CNB008089787A patent/CN1322328C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-14 US US10/009,685 patent/US7361479B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-14 HU HU0201661A patent/HUP0201661A2/hu unknown
- 2000-06-14 NZ NZ516587A patent/NZ516587A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-14 ES ES00942182T patent/ES2304965T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 WO PCT/GB2000/002316 patent/WO2000077525A1/en active IP Right Grant
- 2000-06-14 PT PT00942182T patent/PT1192469E/pt unknown
- 2000-06-14 CA CA002375503A patent/CA2375503C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-14 EP EP00942182A patent/EP1192469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-14 PL PL00352929A patent/PL352929A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-06-14 DK DK00942182T patent/DK1192469T3/da active
- 2000-06-14 RU RU2002100350/15A patent/RU2234704C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-28 ZA ZA200109790A patent/ZA200109790B/en unknown
- 2001-12-13 NO NO20016080A patent/NO20016080L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-09-30 HK HK02107212.5A patent/HK1046439B/zh not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-02-28 US US12/073,003 patent/US20080206790A1/en not_active Abandoned
- 2008-07-08 CY CY20081100710T patent/CY1110429T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA200109790B (en) | 2002-11-28 |
| RU2234704C2 (ru) | 2004-08-20 |
| CN1322328C (zh) | 2007-06-20 |
| DK1192469T3 (da) | 2008-08-11 |
| AU779524B2 (en) | 2005-01-27 |
| ES2304965T3 (es) | 2008-11-01 |
| US7361479B1 (en) | 2008-04-22 |
| DE60038557T2 (de) | 2009-05-28 |
| CY1110429T1 (el) | 2015-04-29 |
| DE60038557D1 (en) | 2008-05-21 |
| JP2003502643A (ja) | 2003-01-21 |
| NO20016080D0 (no) | 2001-12-13 |
| US20080206790A1 (en) | 2008-08-28 |
| EP1192469B1 (en) | 2008-04-09 |
| WO2000077525A1 (en) | 2000-12-21 |
| PT1192469E (pt) | 2008-07-17 |
| CA2375503C (en) | 2006-04-11 |
| GB9913819D0 (en) | 1999-08-11 |
| PL352929A1 (en) | 2003-09-22 |
| EP1192469A1 (en) | 2002-04-03 |
| HK1046439B (zh) | 2008-08-01 |
| ATE391914T1 (de) | 2008-04-15 |
| NZ516587A (en) | 2003-07-25 |
| AU5689500A (en) | 2001-01-02 |
| CZ299065B6 (cs) | 2008-04-16 |
| CN1355887A (zh) | 2002-06-26 |
| HUP0201661A2 (en) | 2002-08-28 |
| HK1046439A1 (en) | 2003-01-10 |
| NO20016080L (no) | 2002-02-13 |
| CA2375503A1 (en) | 2000-12-21 |
| JP3547729B2 (ja) | 2004-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6916626B1 (en) | Detection of Candida | |
| US5514557A (en) | Method and kit for detecting antibodies specific for HLA and/or platelet glycoproteins | |
| US20070141055A1 (en) | Methods and compositions for protein-hydroxy apatite complexes and their application in testing and modulating immunological system including a novel in vitro test for the detection of antibodies against calcium binding protein-hydroxy apatite complexes | |
| WO1988007680A1 (en) | Immunoglobulin assay method | |
| IE63426B1 (en) | Immunometric assay kit and method applicable to whole cells | |
| US20080206790A1 (en) | Assay for determining the presence or amount of newly synthesized antibodies | |
| US20070292839A1 (en) | Assay | |
| EP0811165B1 (en) | Detection of antibody production | |
| US5192657A (en) | Stabilized proteolytic solution and reagent kit | |
| JP4491572B2 (ja) | 酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定試薬及び測定方法 | |
| JP3309900B2 (ja) | 抗ｆｋｂｐ１２自己抗体の検出方法 | |
| JP2001302697A (ja) | ポリクローナル抗体及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110614 |