BR102020021516A2 - Peptídeo sintético, método imunodiagnóstico para diferenciação de infecções por plasmodium vivax de infecções por plasmodium falciparum, e uso - Google Patents

Abstract

A presente tecnologia trata de um peptídeo sintético derivado da proteína 1 da superfície de merozoíto de Plasmodium vivax (PvMSP-1) capaz de diferenciar, através de ensaios sorológicos e imunocromatográficos, infecções por P. vivax de infecções por P. falciparum. Trata também de um método imunodiagnóstico utilizando tal peptídeo. O peptídeo se mostrou específico para diagnóstico de infecções por P. vivax, gerando resultado negativo para infecções por P. falciparum. Além disso, os níveis de anticorpos dos pacientes infectados por P. vivax caíram após o tratamento, o que indica que a resposta imunológica contra esse peptídeo não persiste, tornando-o, portanto, um bom marcador da infecção.

Description

PEPTÍDEO SINTÉTICO, MÉTODO IMUNODIAGNÓSTICO PARA DIFERENCIAÇÃO DE INFECÇÕES POR PLASMODIUM VIVAX DE INFECÇÕES POR PLASMODIUM FALCIPARUM, E USO

[01] A presente tecnologia trata de um peptídeo sintético derivado da proteína 1 da superfície de merozoíto de Plasmodium vivax (PvMSP-1) capaz de diferenciar, através de ensaios sorológicos e imunocromatográficos, infecções por P. vivax de infecções por P. falciparum. Trata também de um método imunodiagnóstico utilizando tal peptídeo. O peptídeo se mostrou específico para diagnóstico de infecções por P. vivax, gerando resultado negativo para infecções por P. falciparum. Além disso, os níveis de anticorpos dos pacientes infectados por P. vivax caíram após o tratamento, o que indica que a resposta imunológica contra esse peptídeo não persiste, tornando-o, portanto, um bom marcador da infecção.

[02] A malária é uma doença parasitária provocada por protozoários do gênero Plasmodium. Em 2017, a malária afetou cerca de 219 milhões de pessoas e provocando aproximadamente 435 mil mortes em todo o mundo. Dentre as espécies de parasito que causam a malária, Plasmodium vivax é a mais abundante e a principal espécie responsável pelos casos de malária no Brasil, sendo responsável por mais de 90% desses casos Ministério. Acreditava-se que a malária provocada por P. vivax era benigna, porém esse cenário vem mudando a nível mundial, uma vez que diversos casos de malária grave estão sendo reportados em infecções por essa espécie, inclusive no Brasil.

[03] Atualmente, o diagnóstico da malária é a principal forma de controle da doença e, o padrão ouro utilizado é o exame microscópico da gota espessa. Embora seja considerado como padrão ouro, essa técnica exibe uma série de limitações, principalmente em países subdesenvolvidos, uma vez que se necessita de um profissional treinado, além da utilização de um microscópio, o que dificulta o acesso a áreas remotas atingidas pela malária. Por esta razão, os testes rápidos, também conhecidos como testes de imunodiagnóstico, têm sido bastante utilizados, uma vez que eles são baratos e não precisam de profissionais altamente treinados para realizar a leitura dos resultados. No entanto, a maioria dos testes rápidos desenvolvidos para malária tem como base antígenos de P. falciparum, principal espécie causadora da malária grave, fazendo com que a sensibilidade e especificidade desses testes diminuam quando utilizados em infecções por outras espécies de Plasmodium, gerando resultados falso-positivos e falso-negativos. Além disso, muitos desses testes utilizam antígenos em que é necessário o parasito estar vivo para que seja detectado.

[04] A proteína 1 da superfície de merozoíto (MSP-1) é um antígeno interessante para compor um teste diagnóstico uma vez que estudos já demonstraram sua alta capacidade imunogênica, além de ser uma proteína essencial para o ciclo biológico do parasito. Diante do cenário demonstrado, presente tecnologia visa utilizar um peptídeo derivado da MSP-1 de P. vivax que se mostrou capaz de diferenciar infecções por essa espécie das provocadas por P. falciparum, além de ser fracamente reconhecida por pacientes não infectados, podendo se tornar, assim, um promissor antígeno para um kit rápido de diagnóstico da malária

[05] O documento de patente BR1020130268976, depositado em 18 de outubro de 2013, intitulado “Kit imunodiagnóstico para detecção de malária em pacientes anêmicos, peptídeo sintético e usos”, descreve um kit imunodiagnóstico para a detecção de malária causada por Plasmodium vivax, utilizando como antígeno marcador um peptídeo que compõe a proteína 1 da superfície de merozoíto de Plasmodium vivax (PvMSP-1). A sequência compreendida no documento citado se difere do presente pedido por apresentar a metionina na extremidade. A metionina é um aminoácido que oxida muito fácil (por possuir um átomo de enxofre em sua composição). Por esse motivo na presente tecnologia esse aminoácido foi substituído por uma Serina. Além disso, a presença da Serina aumenta a adesão do peptídeo à placa de ELISA, uma vez que se trata de um aminoácido polar (a metionina é apolar). Portanto, essa substituição se fez somente após a confirmação de que tal modificação não alteraria o epítopo do peptídeo. A mudança dos aminoácidos também não alterou os resultados referentes à análise por bioinformática (BLAST), evidenciando que o Plasmodium falciparum não possui qualquer sequência similar, seja com o Metionina ou o Serina.

[06] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia similar a do presente pedido contendo a sequência sintética para uso em diagnóstico diferencial entre infecções por Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum.

[07] A presente tecnologia trata de um peptídeo sintético derivado da proteína 1 da superfície de merozoíto de Plasmodium vivax (PvMSP-1) capaz de diferenciar, através de ensaios sorológicos e imunocromatográficos, infecções por P. vivax de infecções por P. falciparum. Trata também de um método imunodiagnóstico utilizando tal peptídeo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[08] A Figura 1 representa a predição in silico de epítopos lineares de células B na proteína PvMSP-1, cepa Sal I. O peptídeo 70 é constituído pelos aminoácidos 146 a 160 da PvMSP-1 e se encontra localizado em uma porção considerada como potencial epítopo de células B. A porção laranja indica os epítopos preditos na proteína nativa pelo software BepiPred 2.0, a porção laranja hachurada indica os epítopos preditos nos peptídeos e, a porção azul indica os epítopos preditos na proteína inteira refletidos nos peptídeos.

[09] A Figura 2 representa a comparação da resposta de IgG contra o peptídeo 70 entre pacientes infectados por P. vivax e por P. falciparum, utilizando-se duas concentrações distintas de antígeno, 12,5 e 25 ng/orifício. Cada losango representa a média da DO obtida para cada paciente infectado por P. vivax, e cada hexágono, a média da DO para cada paciente infectado por P. falciparum. As linhas vermelhas indicam a mediana. Outliers foram retirados utilizando-se o método de ROUT (Q = 1%). Foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney para comparar os dois grupos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[010] A presente tecnologia trata de um peptídeo sintético derivado da proteína 1 da superfície de merozoíto de Plasmodium vivax (PvMSP-1) capaz de diferenciar, através de ensaios sorológicos e imunocromatográficos, infecções por P. vivax de infecções por P. falciparum. Trata também de um método imunodiagnóstico utilizando tal peptídeo. O peptídeo se mostrou específico para diagnóstico de infecções por P. vivax, gerando resultado negativo para infecções por P. falciparum. Além disso, os níveis de anticorpos dos pacientes infectados por P. vivax caíram após o tratamento, o que indica que a resposta imunológica contra esse peptídeo não persiste, tornando-o, portanto, um bom marcador da infecção.

[011] Mais especificamente, o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID No 1.

[012] O método imunodiagnóstico de Plasmodium vivax permite a diferenciação de infecções por Plasmodium vivax de infecções por Plasmodium falciparum e compreende as seguintes etapas:

• a) Exposição de uma amostra de sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal ao peptídeo sintético definido pela SEQ ID N°1, estando tal antígeno ligado a um suporte sólido ou a um carreador;
• b) Adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
• c) Detecção dos anticorpos específicos para P. vivax, gerando resultado negativo para infecções por P. falciparum, na amostra citada na etapa (a) utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).

[013] Na etapa “a”, a amostra pode ser selecionada do grupo compreendendo sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal, sem a necessidade de grandes quantidades desta.

[014] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses; a proteína pode ser Proteína A e/ou Proteína G; a enzima pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

[015] Na etapa “c”, a detecção pode ser realizada por fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou pelo uso de radioisótopos.

[016] O peptídeo sintético definido na presente tecnologia pode ser utilizado para o imunodiagnóstico de Plasmodium vivax e é capaz de permitir a diferenciação de infecções por Plasmodium vivax de infecções por Plasmodium falciparum.

[017] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

EXEMPLO 1. SÍNTESE DO PEPTÍDEO SINTÉTICO

[018] Em um estudo anterior, realizado pelo grupo de pesquisa da presente tecnologia, 580 peptídeos, contendo a sequência completamente da proteína 1 da superfície de merozoíto de Plasmodium vivax (PvMSP-1), foram sintetizados através da técnica de SPOT synthesis. Após resultados promissores, um desses peptídeos (peptídeo 70) foi selecionado para posterior análise do seu potencial como biomarcardor de infecções por P. vivax.

[019] Para tal, o peptídeo selecionado foi sintetizado em fase sólida por Fmoc. Para a síntese, optou-se por substituir um resíduo de metionina presente na porção C-terminal do peptídeo por um resíduo de serina para facilitar a sua adesão à placa de 96 poços utilizada nos ensaios de ELISA. É importante mencionar que a troca dos resíduos de aminoácidos só foi realizada após a confirmação de que o epítopo predito através da ferramenta online BepiPred 2.0 não sofreria alterações (Figura 1).

[020] Antes de começarmos a síntese do peptídeo 70, as propriedades físico-químicas dessa molécula como: massa molecular, ponto isoelétrico, carga líquida em pH neutro, hidrofilicidade média, relação de resíduos hidrofílicos em relação ao número total de resíduos, dentre outras características foram determinados utilizando-se a ferramenta online Peptide Property Calculator, da Innovagen (https://pepcalc.com/). Após a síntese a presença do peptídeo, bem como seu grau de pureza, foram avaliados por meio de espectrometria de massa. Como no espectro de massa, outros picos não correspondentes ao peptídeo 70 foram evidenciados, optamos por purificar a molécula através da cromatografia líquida de fase reversa em sistema HPLC (High Performance Liquid Chromatography). As frações obtidas na cromatografia foram novamente analisadas em espectrômetro de massa para averiguar a presença do peptídeo 70.

EXEMPLO 2. ANÁLISE DO POTENCIAL BIOMARCADOR DO PEPTÍDEO PARA MALÁRIA VIVAX

[021] Foram realizados ensaios imunoenzimáticos para detectar níveis de IgG contra a sequência do peptídeo 70 em plasmas de indivíduos infectados por P. vivax (n = 229). Como o objetivo era avaliar se esse peptídeo era exclusivamente reconhecido por pacientes infectados por P. vivax, foram utilizados como controle indivíduos infectados por P. falciparum (n = 22).

[022] Os resultados se mostraram promissores, uma vez que pacientes infectados por P. falciparum não reconheciam o peptídeo 70 (Figura 2). Como a MSP-1 é uma proteína presente em todas as espécies de Plasmodium, foi realizado um BLAST para verificar se a sequência do peptídeo 70 se encontrava no genoma de P. falciparum. Tanto a sequência original do peptídeo 70 (KIPEHLKISDKELDM) tanto a modificada durante a síntese (KIPEHLKISDKELDS) não foram encontrados no genoma de P. falciparum. Esse é um resultado promissor, uma vez que não existe no mercado um teste imunológico feito exclusivamente para P. vivax. Pretende-se dar continuidade aos estudos avaliando as diferentes subclasses de IgG contra esse peptídeo, além de sintetizarmos um outro peptídeo que também se mostrou promissor para utilizarmos ambos os peptídeos em um ensaio multiplex ou imunocromatográfico.

Claims (5)

1. PEPTÍDEO SINTÉTICO, caracterizado pela sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID No 1.
2. MÉTODO IMUNODIAGNÓSTICO PARA DETECÇÃO DE INFECÇÃO POR Plasmodium vivax, caracterizado por permitir a diferenciação de infecções por Plasmodium vivax de infecções por Plasmodium falciparum, e compreender as seguintes etapas:

   • a) Exposição de uma amostra de soro, plasma, sangue ou outro fluido corporal ao peptídeo sintético definido na reivindicação 1, estando tal antígeno ligado a um suporte sólido ou a um carreador;
   • b) Adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
   • c) Detecção dos anticorpos específicos para P. vivax, gerando resultado negativo para infecções por P. falciparum, na amostra citada na etapa (a) utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).
3. MÉTODO IMUNODIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 2, etapa “b”, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses; a proteína ser Proteína A e/ou Proteína G; a enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e o marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
4. MÉTODO IMUNODIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 2, etapa “c”, caracterizado pela detecção ser realizada por fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou pelo uso de radioisótopos.
5. USO do peptídeo definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para o imunodiagnóstico de Plasmodium vivax e para diferenciação de infecções por Plasmodium vivax de infecções por Plasmodium falciparum.

Images