JP5805943B2 - 百日咳菌のFim3の製造方法、及び、百日咳の検出方法 - Google Patents
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Description
(1)菌体の調製
百日咳菌のFim3(以下、Fim3と記載した場合には、特に断らない限りは「百日咳菌のFim3」を意味するものとする)を製造するための原料となる菌体は、百日咳菌、又は、百日咳菌の線毛を発現している組換え菌体(以下、組換え菌体と記載した場合には、特に断らない限りは「百日咳菌の線毛を発現している組換え菌体」を意味するものとする)である。
次に、上記(1)により得られた菌体の溶解操作を行う。溶解操作は、菌体を溶解可能な水性溶媒中に菌体を懸濁させて行われ、当該水性溶媒は、水に加えて、変性剤(塩酸グアニジン、尿素等)、キレート剤(エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、エチレングリコールビス2アミノエチルエーテル四酢酸ナトリウム等)、界面活性剤(ラウリル硫酸ナトリウム、胆汁酸類、ポリオキシエチレンパライソオクチルフェノール、オクチルグルコシド等)、還元剤(2メルカプトエタノール、ヂチオトレイトール等)、タンパク質分解酵素阻害剤(フェニルメチルスルフォニルフルオリド等)を配合することができる。また、これらを混合した市販の菌体溶解試薬を使用することも可能である。ただし、細胞壁分解酵素であるリゾチーム等のプロテアーゼは、Fim3を分解してしまうので、これは当該水性溶媒の含有成分からは除外されるのは勿論のこと、本発明の製造方法全体においても「プロテアーゼフリー」の状態を保って操作を行うことが必要である。
次に、上記(2)より得られた可溶化画分の精製操作を行う。上述したように、尿素との接触を伴ったFim3蛋白質等のリフォールディング(再構成)を行うことが、本発明の製造方法における特徴の一つである。このようなリフォールディングを行うことにより、本来溶解度の低いFim3蛋白質等を可溶化状態で安定化することができる。この尿素接触を伴うリフォールディングは、典型的には透析時に行われる。すなわち、透析膜内に上記(2)により得られた可溶化画分、又は、それに引き続く精製工程を施した可溶化画分を封入して、これを、尿素を含有する透析液に浸漬することにより、所望の尿素接触を伴うリフォールディングを行うことができる。この場合、透析液の尿素濃度は、透析操作全工程で用いる透析液の平均として2〜8Mが好適であり、同2〜6Mが特に好適である。このような可溶化済み画分と尿素との接触を行った後、段階的に尿素の除去操作を行うことが好適である。特に好適な操作態様として、段階的に透析液の尿素濃度を低減していくことが挙げられる。例えば、2,3,4,5および6Mの濃度の尿素を含有する透析液を、第 1番目に最も尿素濃度が高い透析液を用いて透析を行い、順次、尿素濃度が低くなるように透析液を選択して用いて透析を行うことにより、Fim3蛋白質等のリフォールディングを好適に行うことができる。透析は、通常行われる透析条件に従って行われる。すなわち、透析液は、トリス緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液を基礎としたものとすることが可能であり、上記の尿素の他、必要に応じてプロテアーゼ阻害剤等を添加して用いることも可能である。全体の透析時間は、特に限定されるものではないが、通常尿素濃度の異なる緩衝液あたり3時間程度であり、概ね3〜16時間が好適である。また、透析温度範囲は、常法と同様に2〜6℃程度が好適である。
本発明の検出方法は、検体において存在する抗Fim2抗体及び抗Fim3抗体の双方の検出、あるいは、抗Fim3抗体の検出を、それぞれの抗線毛抗体について行う方法である。検体は、百日咳ワクチンの投与を含め、百日咳に関連する抗体が存在し得るものであれば、特に限定されず、例えば、血清、血漿等の血液検体;肺洗浄液、唾液、乳汁、涙液等が例示されるが、血液検体を用いることが好適である。
この工程(a)においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレート等の固相を洗浄し、未反応の検体は、反応系から除去される。
この工程(b)においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の二次抗体は、反応系から除去される。
(1)Fim3発現菌株の作成
百日咳菌東浜株から常法によりDNAを抽出し、このFim3をコードする遺伝子(配列番号1)を含むDNAを、
プライマー(配列番号3: AGGATCCATGTCCAAGTTTTCATACCCT、及び、
配列番号4: AGCGGCCGCTCTGAGACCCTTCGTCTGA)を、
遺伝子増幅用プライマーとして使用して、PCR法により増幅して得た遺伝子増幅産物に対して、Topo cloning kit(Invitrogen社)を使用してクローニング後、シークエンス解析を行って確かに当該クローニング配列がFim3遺伝子に相当する配列であることを確認した。その後、得られたFim3遺伝子を、制限酵素(BamHI及びNotI)を使用して、pGEX-6P-2(GEヘルスケア社)に組み込み、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合蛋白質としてFim3蛋白質を発現させるプラスミドを構築した。一方、グルタチオン-S-トランスフェラーゼを含有しないFim3を発現させるため、
プライマー(配列番号5:GGGCATATGTCCAAGTTTTCATACCCT、及び、
配列番号6:GGAAGCTTCTGAGACCCTTCGTCTGA)を、
遺伝子増幅用プライマーとして使用し、上記と同様にPCR法とクローニングを行った。その後、得られたFim3遺伝子を、制限酵素(NdeI及びHindIII)を使用して、pET22bベクター(Novagen社:Merck社に合併された。以下同様である。)に組み込み、Fim3蛋白質を発現させるプラスミドを構築した。これらプラスミドを使用してRossetta2 (DE3)(菌株名:Novagen社)を形質転換し、Fim3等の発現大腸菌を得た。
上記により得られたFim3等の発現大腸菌を、Overnight Expression Autoinduction System(Novagen社)及びアンピシリン(100 μg/mL)含有LB培地10 mLに植菌し、往復振とう(200回/分)下で培養を行うことで、当該大腸菌にFim3等を発現(1日間、37℃)させた。この培養工程により得られた菌体は、遠心(10000 rpm, 20分間, 4℃)し、上清を除いて菌体を得た。菌体は−20℃で凍結保存した。
室温で融解した、上記(2)の凍結菌体に、B-PER II bacterial protein extraction reagent(Thermo社)を1 mL加え、菌体を均一になるように懸濁した。その後、遠心(13000 rpm、30分間、4℃)し、Fim3蛋白質等を含む沈殿を得た。当該沈殿を5% B-PER II 5 mLに懸濁し、均一に分散後、遠心(13000 rpm、10分間、4℃)して、可溶性物質を洗浄する過程を3回以上繰り返した。最後の遠心で上清を除き、Fim3蛋白質等を含む沈殿を得た。
得られた沈殿に、Inclusion body solubilization reagent(Thermo社)5 mLを加えた。その後、室温で30分間転倒混和し、沈殿を溶解した後、遠心(13000 rpm、10分間、4℃)して、Fim3蛋白質等を含む上清(可溶化画分)を回収した。
可溶化されたFim3蛋白質等に、最終濃度 5 mMとなるようにジチオトレイトールを添加し、室温で5分間放置した。放置後、6 M尿素含有トリス緩衝生理食塩水(pH 7.2)2 Lに対し、4℃で3時間透析を行った。その後尿素を、5, 4, 3, 2 M含有したトリス緩衝生理食塩水(pH 7.3)それぞれに対し、尿素濃度の高い方から順番に3時間以上透析 を行った。2 M尿素含有トリス緩衝生理食塩水(pH 7.2)に対する透析が終了した後遠心(13000 rpm, 30分間, 4℃)し、上清を精製Fim3等として使用した。得られた精製GST−Fim3及び精製Fim3のSDS-PAGEデータを、それぞれ図1と図2に示す。
上記の実施例1−1は代表的な具体例であって、本発明の製造方法に則った精製Fim3蛋白質等の製造に際し、適宜適切な手段を選択することができる。例えば、上記の実施例1−1の(3)の「溶菌」と(4)の「可溶化」の工程を下記の要領で行うことができる。
Stainer-Sholte液体培地を使用して静置培養した百日咳菌東浜株を出発材料とし、Zhangらの方法(Dev Biol Stand 61:173-185,1984)に基づいて精製した。すなわち、百日咳菌菌体10 gを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムマグネシウム不含、以下DPBS(-))に懸濁し、遠心(10000 rpm, 20分, 4℃)して上清を除くことで洗浄した。この操作を3回繰り返し、洗浄菌体を得た。洗浄菌体を50 mLのDPBS(-)に懸濁し、超音波処理(20 kHz, 10分間, 0℃)を行ってFim2を遊離させた。その後遠心(15000 rpm, 30分間, 4℃)し、上清を得た。この上清にDPBS(-)を適宜加え、容量を50 mLとし、硫酸アンモニウムを12 g加えて溶解後、30分間4℃で放置した。放置後遠心(15000 rpm, 30分間, 4℃)し、Fim2を含有する沈殿を回収した。この沈殿を、50 mM トリス緩衝液(pH 9.5)5 mLを加えて溶解し、硫酸アンモニウムを除去するためにさらに同緩衝液に対して4℃、一晩透析した。この際、透析膜は排除限界分子量10kDaのものを使用した。透析後、遠心(15000 rpm, 30分間, 4℃)し、Fim2を含有する上清を回収した。得られた上清を酸性緩衝液(50 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 6.0)に対して4℃にて一晩透析し、Fim2を含む蛋白質を沈殿させた後、遠心(15000 rpm, 30分間, 4℃)し、Fim2蛋白質を含有する沈殿を回収した。沈殿を5 mLの50 mMトリス緩衝液pH 9.5に溶解後、希塩酸を加えてpH 7.6とし、塩酸マグネシウムを最終濃度0.1 Mになるよう添加し、4℃で一晩放置した。放置後遠心(15000 rpm, 30分間, 4℃)し、Fim2蛋白質を含有する沈殿を回収して50 mMトリス緩衝液pH 9.5に溶解、同様に遠心して上清を回収した。得られた上清をDPBS(-)に対し4℃一晩透析後遠心(15000 rpm, 30分間, 4℃)し、得られた上清を精製Fim2蛋白質として使用した。得られたFim2蛋白質のSDS-PAGEデータを図3に示す。
本実施例は、本発明の検出方法の操作手順を示し、かつ、その効果を示すことを目的とする。
本実施例において用いた試薬等は、下記の通りである。
(2)−1:コーティング操作
一連の滴下操作は、マイクロピペット及びマイクロピペット12チャンネルを用いて行った。また、一連の反応を行う平底96穴プレート(以下「プレート」という)のレイアウトを、図4に示す。
(i)A2〜H2、A7〜H7にPT抗原を100μl各wellに滴下。
(ii)A3〜H3、A8〜H8にFHA抗原を100μl各wellに滴下。
(iii)A4〜H4、A9〜H9にFim2抗原を100μl各wellに滴下。
(iv)A5〜H5、A10〜H10にGST-Fim3抗原を100μl各wellに滴下。
ブロッキングバッファー(3%BSA-PBS)を室温に調整して、プレートのシールを剥がし、マイクロピペット12チャンネルにて、全ウエルにブロッキングバッファーを100μl添加し、プレートをプレ−ト シェ−カ−にセットして、室温75分間ブロッキング反応を行った。
シングルマイクロピペットでDilution buffer(1%BSA-PBST)990μl、第1〜第15の被検血清をそれぞれ10μlと、コントロール(管理試料:ヒト既知コントロール血清)10μlを、ディスポ試験管にサンプリングを行い、100倍希釈とした。自動洗浄器を用い、プレ−トをWash buffer(PBST)で6回洗浄を行った。次いで、シングルマイクロピペットでA2〜A6に第1の検体を、B2〜B6に第2の検体を100μlサンプリングし、残りの検体(〜 G7〜G11に第15の検体)も、順次サンプリングを行った。また、H7〜H11にコントロールを100μlサンプリングした。さらに、A1〜H1、A12〜H12にDilution buffer(1%BSA−PBST)を100μl滴下した。次いで、プレートをプレ−ト シェ−カ−にセットし、室温で1時間反応を行った。図5に、当該サンプリング操作を行うプレートの割り当てを示した。図中ウエル内に示した番号は、検体の第1〜第15の番号と、コントロールを滴下した「H7〜H11」を「16」として構成されている。
シングルマイクロピペットを用い、Dilution buffer(1%BSA-PBST)で上記の濃度に希釈した2次抗体を、自動洗浄器により洗浄用バッファー(PBST)で6回洗浄を行ったプレートに、100μlずつ滴下した。次いで、プレートをプレ−ト シェ−カ−にセットし、室温で1時間反応を行った。
4MUG(4-Methylumbelliferyl-b-D-glucuronide.trihydrate)を37℃の恒温槽で加温し、自動洗浄器により洗浄用バッファー(PBST)で6回洗浄を行った上記プレートの全ウエルに、マイクロピペット12チャンネルにて4MUGを100μlずつ滴下した。次いで、プレートシェーカーで、室温で5分間反応を行った。
マイクロピペット12チャンネルで、プレートの全ウエルに、反応停止液(0.1M Glycine-NaOH)を100μlずつ添加し、プレートシェーカーで、室温で5分間反応を行った。
百日咳患者384症例の検体血清を用いて、EIA法と蛍光ELISA法による血中の抗PT抗体と抗FHA抗体の定量検出を行った。EIA法は市販のキットを用いて行った。EIAキットとしては、百日咳菌抗体キット「百日咳菌抗体価測定試薬ワコー」(和光純薬工業(株)製)を用い、具体的作業は添付マニュアルに従って行った。なお、標準血清は、マニュアル通りに国立予防研究所(現 国立感染症研究所)から入手した基準血清JNIH−1を用いて検量線を作成した。
y=0.963x+4.1318 R2=0.8109、であり、
FHA抗原では、
y=0.9976x+2.3279 R2=0.8225、であり、
EIAと蛍光ELISAの測定値は、ほぼ等価であることが確認されている。
「検体血清測定蛍光単位÷検体血清対照蛍光単位=検体血清蛍光単位率(%)」として算出した。また、「卑近の感染」の陽性基準は、いわば直前の感染の意味であり、過去に百日咳に罹患して治癒した者や、百日咳の予防接種者等の、直接的な百日咳の発症に至らないと考えられる者を対象から排除する基準として設けられたものである。
臨床的に百日咳の罹患が疑われた患者に対して、常法による菌分離を行い、LAMP法又はPCR法により百日咳菌の存在の確認を行い、これにより確定診断がなされた百日咳患者79症例に対して、(a)凝集法と、(b)上記した測定方法(蛍光ELISA法)で、PT、FHA、Fim2、又は、Fim3の血中抗体の検出を行った。
凝集法は、百日咳菌の東浜株と山口株の凝集反応用抗原をそれぞれ含む市販のキット(百日せき凝集反応用抗原「生研」N、デンカ生研株式会社製)を用い、その添付マニュアルに従って、東浜株と山口株における凝集素価(凝集値)を求め、双方の菌株共、当該値が1280以上の場合を、凝集法による陽性の診断基準値として判定した(日本薬剤師会雑誌、岡田ら、61,1;59-62,2009より)。また、上記百日咳患者における、この凝集法による陽性率(%:陽性検体数/全検体数 ×100)を、(i)東浜株、(ii)山口株、及び、(iii)東浜株若しくは山口株、について求めた。その結果を、後述する表2に示す。
上記と同様に、波長460nmにセットしたFluoroscan IIでプレートの蛍光単位の測定を行い、判定は、百日咳抗体価を算出することにより行った。
下記表2に、上記試験の結果、すなわち、上記79症例の百日咳患者の蛍光ELISA系における陽性率を示した。上記と同様に、PTとFHAについては、蛍光ELISAによる検出値に対する上記のEIA換算式処理による値である。
Claims (8)
- 全工程においてプロテアーゼの非存在下で行う製造方法であって、百日咳菌、又は、百日咳菌の線毛を発現している組換え菌体を、当該菌体を溶解可能な水性溶媒中に懸濁させることにより溶解操作を行った後、当該菌体の不溶性画分を分取し、次いで当該不溶性画分の可溶化操作を行い、これにより得られる可溶化済み画分を6M以上8M以下の尿素と接触させ、次いで、高濃度(直前の尿素濃度以下)から低濃度への、段階的な尿素濃度の透析液を用いた透析操作を、各々の透析液の尿素濃度の平均が4M以上6M以下の範囲で行って、Fim3又はFim3と他の蛋白質との融合蛋白質を得る、百日咳菌のFim3の製造方法。
- 高濃度から低濃度への段階的な尿素濃度の透析操作は、最高濃度と最低濃度を含んで5段階の尿素濃度の透析液を用いた透析操作であることを特徴とする、請求項1に記載のFim3の製造方法。
- 可溶化済み画分の尿素との接触前に、ジチオトレイトールと接触させることを特徴とする、請求項1又は2に記載のFim3の製造方法。
- 百日咳菌、又は、百日咳菌の線毛を発現している組換え菌体は、百日咳菌の線毛を発現している大腸菌であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のFim3の製造方法。
- 血液検体における、抗Fim2抗体及び抗Fim3抗体の双方の検出、あるいは、抗Fim3抗体の検出を、それぞれの抗線毛抗体に対応する線毛成分と検体を接触させることによる抗原抗体反応をシグナルとして行われる、百日咳の検出方法であって、当該繊毛成分はFim2、又は、Fim3若しくはFim3と他の蛋白質との融合蛋白質であり、かつ、当該Fim3若しくはFim3と他の蛋白質との融合タンパク質は、請求項1〜4のいずれかに記載のFim3の製造方法により製造されたものであることを特徴とする、百日咳の検出方法。
- Fim2、又は、Fim3若しくはFim3と他の蛋白質との融合蛋白質は、固相に固定化されている、請求項5に記載の百日咳の検出方法。
- 少なくとも請求項1〜4のいずれかに記載のFim3の製造方法により製造されたFim3若しくはFim3と他の蛋白質との融合蛋白質が固定化された固相。
- 少なくとも請求項1〜4のいずれかに記載のFim3の製造方法により製造されたFim3若しくはFim3と他の蛋白質との融合蛋白質が固定化された固相を含む、請求項5又は6に記載の百日咳の検出方法を行うための、検出用キット。
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