JPH0328766A - Ｈｉｖ抗体の検出方法およびそれに用いるアッセイキット - Google Patents
Ｈｉｖ抗体の検出方法およびそれに用いるアッセイキットInfo
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- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、一般に、ヒト血清中ての後天性免疫不全症候
群（ＡＩＤＳ）の病因ウイルスに対する抗体の検出のた
めの改良アッセイ法に関する。さらに詳しくは、安全な
細菌で製造された組換えＨ １■タンパク質を用いたヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体の特異的で
感度の優れた検出法に関する。
群（ＡＩＤＳ）の病因ウイルスに対する抗体の検出のた
めの改良アッセイ法に関する。さらに詳しくは、安全な
細菌で製造された組換えＨ １■タンパク質を用いたヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体の特異的で
感度の優れた検出法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）後天
性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、米国、ヨ１’ｍｌ
ノバわよび中央アフリカにおいて流行性の比率に達して
いるか、日和見感染および／または腫瘍に関連する免疫
系の異常疾患である。当面する挑臥の一つとして、ＡＩ
ＤＳの病因ウィルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）による汚染から血液製剤を保護することか挙げられ
る。ＨＩＶの変異体には、ヒｌ−Ｔ細胞ソンバ球ウイル
スタイブＴｉｔ （＋１ １’ ｌ． Ｖ − ＩＩ＋
）、ＡＩＤＳ関連ウイルス（八Ｒ■）、リンパ節障害
関連ウイルス（ＬＡＶ）などと一般に呼ばれるウイルス
か含まれる。
性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、米国、ヨ１’ｍｌ
ノバわよび中央アフリカにおいて流行性の比率に達して
いるか、日和見感染および／または腫瘍に関連する免疫
系の異常疾患である。当面する挑臥の一つとして、ＡＩ
ＤＳの病因ウィルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）による汚染から血液製剤を保護することか挙げられ
る。ＨＩＶの変異体には、ヒｌ−Ｔ細胞ソンバ球ウイル
スタイブＴｉｔ （＋１ １’ ｌ． Ｖ − ＩＩ＋
）、ＡＩＤＳ関連ウイルス（八Ｒ■）、リンパ節障害
関連ウイルス（ＬＡＶ）などと一般に呼ばれるウイルス
か含まれる。
ウイルスケノムのヌクレオチド分析に基づき、５′末端
から開始してＨＩＶゲノムＲＮＡは、（ｉ）ヌクレオチ
ド３１０〜Ｌ８６９の間に広がり、内部構造コアまたは
ヌクレオカプンドタンパク質（最も抗原性の高いコアタ
ンパク質てあるｐ２４を含む）をコードするｇａｇ遺伝
子、 （ｉｉ）ヌクレオカプンド１，６２９〜４，６７３の間
に広がり、酵素、逆転写酵素をコートするｐｏｌ遺伝子
、および （ｉｉｉ）ヌクレオチド５，７８１〜８，３６９の間に
広かり、エンヘロープ糖タンパク質（最も抗原性の高い
エンベロープタンパク質であるｇｐ４１ヲ含む）をコー
ドするｅｎｖ遺伝子 をコードする［ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、Ｎ ａｔ
ｕｒｅ，主１１、２７７〜２８４（１９８５）］。
から開始してＨＩＶゲノムＲＮＡは、（ｉ）ヌクレオチ
ド３１０〜Ｌ８６９の間に広がり、内部構造コアまたは
ヌクレオカプンドタンパク質（最も抗原性の高いコアタ
ンパク質てあるｐ２４を含む）をコードするｇａｇ遺伝
子、 （ｉｉ）ヌクレオカプンド１，６２９〜４，６７３の間
に広がり、酵素、逆転写酵素をコートするｐｏｌ遺伝子
、および （ｉｉｉ）ヌクレオチド５，７８１〜８，３６９の間に
広かり、エンヘロープ糖タンパク質（最も抗原性の高い
エンベロープタンパク質であるｇｐ４１ヲ含む）をコー
ドするｅｎｖ遺伝子 をコードする［ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、Ｎ ａｔ
ｕｒｅ，主１１、２７７〜２８４（１９８５）］。
ＨＩＶがＡＩＤＳ患者の培養Ｔ細胞から単離され、おそ
ら＜ＡＩＤＳの病因であることが決定された晴点て、該
疾患の診断指示薬として有用でありかつ血液製剤をスク
リーニングずるためにも有用なアッセイ法の研究か開始
された。イムノアッセイは、その感度のゆえに適当な選
択であった。
ら＜ＡＩＤＳの病因であることが決定された晴点て、該
疾患の診断指示薬として有用でありかつ血液製剤をスク
リーニングずるためにも有用なアッセイ法の研究か開始
された。イムノアッセイは、その感度のゆえに適当な選
択であった。
１つのイムノアッセイ法として、ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら
の米国特許第／１，５２０，１１３号明細書には３つの
抗Ｈ Ｉ Ｖアソセイ法か記載されている。これらは、
ウエスタンブロツティング法に基づいたストリノプラジ
オイムノアノセイ、酵素結合免疫吸着ア，セイ（ＥＩＩ
ＳＡ）、および間接免疫蛍光アソセイである。これらの
イムノアソセイに用いるウイルスタンパク質試薬は、不
死化した腫瘍ヒｌ−Ｔ細胞株てあるＨＴの細胞培養岐か
ら単離した不活化全ウイルスからなる。
の米国特許第／１，５２０，１１３号明細書には３つの
抗Ｈ Ｉ Ｖアソセイ法か記載されている。これらは、
ウエスタンブロツティング法に基づいたストリノプラジ
オイムノアノセイ、酵素結合免疫吸着ア，セイ（ＥＩＩ
ＳＡ）、および間接免疫蛍光アソセイである。これらの
イムノアソセイに用いるウイルスタンパク質試薬は、不
死化した腫瘍ヒｌ−Ｔ細胞株てあるＨＴの細胞培養岐か
ら単離した不活化全ウイルスからなる。
ヒト血清中のＨＩＶウィルスに対する抗体の存在を検出
するための現在のイムノア，セイ法では、ウイルスの複
製が可能な細胞株中で培養した不活化全ウイルスを抗原
試薬として利用したＥ Ｌ Ｉ ＳＡ法を用いている。
するための現在のイムノア，セイ法では、ウイルスの複
製が可能な細胞株中で培養した不活化全ウイルスを抗原
試薬として利用したＥ Ｌ Ｉ ＳＡ法を用いている。
この方法は極めて高感度であり、実際の感染患者を検出
する可能性も高い。しかしながら、非感染者もときに陽
性の結果を与えることがある。
する可能性も高い。しかしながら、非感染者もときに陽
性の結果を与えることがある。
血液製剤のスクリーニングアッセイにおける偽陽性の検
出は、一般に用いられている方法の最も切羽詰まった問
題のーってある。現在のところ、試料をＥ Ｌ Ｉ Ｓ
Ａ法によりスクリーニングし、結果か陽性であるとき
にさらに２つの試験をその試料についで行っている。い
ずれかが陽性であるときは、その試料は再反応性を有す
るとされる。この再反応性を有するとされた試料がＨＩ
Ｖに対する抗体を含んでいるかどうかを決定するための
方法として、ウヱスタンプ口ツティング法か一般に用い
られている。しかしなから、低い値の再反応性の試料は
、しばしばウェスタンブロノティング法によっては陽性
の結果が得られない。にもかかわらず、その血液製剤は
、感染性についで疑いかあるため廃棄しなければならな
いしチャルマーズ（ｃｈａｌｍｅｒｓ）ら、ＪＡＭＡ，
２５６、１７７８ 〜１７８３（１９８６）］。これら
の偽陽性は、ウィルス単離物中の細胞タンパク質への免
疫グロブリンの非特異的結合によるものであることかし
ばしばである。
出は、一般に用いられている方法の最も切羽詰まった問
題のーってある。現在のところ、試料をＥ Ｌ Ｉ Ｓ
Ａ法によりスクリーニングし、結果か陽性であるとき
にさらに２つの試験をその試料についで行っている。い
ずれかが陽性であるときは、その試料は再反応性を有す
るとされる。この再反応性を有するとされた試料がＨＩ
Ｖに対する抗体を含んでいるかどうかを決定するための
方法として、ウヱスタンプ口ツティング法か一般に用い
られている。しかしなから、低い値の再反応性の試料は
、しばしばウェスタンブロノティング法によっては陽性
の結果が得られない。にもかかわらず、その血液製剤は
、感染性についで疑いかあるため廃棄しなければならな
いしチャルマーズ（ｃｈａｌｍｅｒｓ）ら、ＪＡＭＡ，
２５６、１７７８ 〜１７８３（１９８６）］。これら
の偽陽性は、ウィルス単離物中の細胞タンパク質への免
疫グロブリンの非特異的結合によるものであることかし
ばしばである。
？在利用されているアッセイの他の関心領域は、偽陽性
を解明するのに役立つ便利な確認アソセイか存在しない
ことである。現在用いられている方法であるウエスタン
ブロノティング法はタウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）らのＰ
ｒｏｃ． Ｎａｐ’ ｌ． Ａｃａｄ． Ｓ ｃｉ．
Ｕ Ｓ Ａ，７６、４３５０（１９７９）に一般に記載
されているか、ＨＩＶタンパク質を分子量に基づいて分
離するためにドデンル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドケル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を必要とする。
を解明するのに役立つ便利な確認アソセイか存在しない
ことである。現在用いられている方法であるウエスタン
ブロノティング法はタウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）らのＰ
ｒｏｃ． Ｎａｐ’ ｌ． Ａｃａｄ． Ｓ ｃｉ．
Ｕ Ｓ Ａ，７６、４３５０（１９７９）に一般に記載
されているか、ＨＩＶタンパク質を分子量に基づいて分
離するためにドデンル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドケル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を必要とする。
分離したＨ Ｉ Ｖタンパク質は、電気泳動によりゲル
から二１・ロセルロースンートに移される。
から二１・ロセルロースンートに移される。
この二１・ロセルロースをストリップにカッティングし
、試験試料、ついで抗ヒ｝ＩｇＧ標識抗体と反応させる
。ウイルスタンパク質の移動したストリソプ上の領域に
標識が現れることが陽性結果を示す。抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
を検出するためのこの方法の不利な点としては、主観的
な解釈か必要てあること、操作広か複雑で面倒であるこ
と、およびＨ Ｉ■タンパク質の組戊の変化をコントロ
ールすることか本来的に困難であることが挙げられる■
。
、試験試料、ついで抗ヒ｝ＩｇＧ標識抗体と反応させる
。ウイルスタンパク質の移動したストリソプ上の領域に
標識が現れることが陽性結果を示す。抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
を検出するためのこの方法の不利な点としては、主観的
な解釈か必要てあること、操作広か複雑で面倒であるこ
と、およびＨ Ｉ■タンパク質の組戊の変化をコントロ
ールすることか本来的に困難であることが挙げられる■
。
抗Ｈ Ｉ Ｖアソセイが陽性であることを告げることは
、患者にとってショソクである。さらに、血液製剤試料
における偽陽姓は、せっかく提供された血液を破棄しな
ければならないので望ましくない。それゆえ、偽陽性を
なくすことは研究するだけの価値がある。
、患者にとってショソクである。さらに、血液製剤試料
における偽陽姓は、せっかく提供された血液を破棄しな
ければならないので望ましくない。それゆえ、偽陽性を
なくすことは研究するだけの価値がある。
現在のアソセイ方法では生きたウイルスをインビ１・ロ
で培養し、ついで単離および不活化を行って全ウイルス
試薬を得るため、安全性ということが他の関心事である
。ＨＩＶ感染は潜在的に致死性であるのて、ウイルスの
培養および単剛「法はともに本来的に危険である。
で培養し、ついで単離および不活化を行って全ウイルス
試薬を得るため、安全性ということが他の関心事である
。ＨＩＶ感染は潜在的に致死性であるのて、ウイルスの
培養および単剛「法はともに本来的に危険である。
ＨＩＶ感染を検出する最も特異的な試験はウィルスの単
離であるが、培養液中でのＨ Ｉ Ｖの単離の複雑さお
よび困難さのため、この方法は大規模に使用するには実
際的な方法ではない。感度および特異性の高い幾つかの
形態のＥ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法は、血液製剤を大規模にス
クリーニングするのに最も実用的で容易な方法である。
離であるが、培養液中でのＨ Ｉ Ｖの単離の複雑さお
よび困難さのため、この方法は大規模に使用するには実
際的な方法ではない。感度および特異性の高い幾つかの
形態のＥ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法は、血液製剤を大規模にス
クリーニングするのに最も実用的で容易な方法である。
アソセイ法において、遺伝子組換えにより製造したＨＩ
Ｖタンパク質を抗原として用いることにより」二記問題
は解決される。まず、組換えタンパク質は本来非感染性
であり、それゆえ、そのようなタンパク質を製造および
単離することは全ウイルスを培養することに比へれば安
全である。第二に、組換え庄により得られた純粋なウイ
ルスタンパク質を用いることにより、汚染タンパク質に
伴う非特異的反応による偽陽性をある程度除くこどかで
きる。第三に、試薬を標準化することにより、アソセイ
の特異性および予測値を向上させることができる。
Ｖタンパク質を抗原として用いることにより」二記問題
は解決される。まず、組換えタンパク質は本来非感染性
であり、それゆえ、そのようなタンパク質を製造および
単離することは全ウイルスを培養することに比へれば安
全である。第二に、組換え庄により得られた純粋なウイ
ルスタンパク質を用いることにより、汚染タンパク質に
伴う非特異的反応による偽陽性をある程度除くこどかで
きる。第三に、試薬を標準化することにより、アソセイ
の特異性および予測値を向上させることができる。
ｐ２４を含むＨ Ｉ Ｖ ｇａｇ遺伝子の大腸菌内での
発現により、ｒＤＮＡ法により製造されたＨＩＶｇａｇ
タンパク質は潜在的な診断価値を有すること一ルド・ス
プリング・ハーバー ニューヨーク、５月２２〜２６日
、１９８５；タウヘクノ（ Ｄ ｏｗｂｅｋｎｏ）ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２、７７４８〜７７５２、（１．９８５）；グラエブ
（Ｇｈｒａｙｅｂ）ら、ＤＮＡ，５、９３ 〜９９（１
９８６）；スタイ？ （Ｓ ｔｅｉｍｅｒ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ， ］ ５ ０、２８３〜２ ９
０（１． ９ ８ ６）］。同様に、ｇｐ４１またはｇ
ｐ４ １の一部の発現によってもまた、ｒＤＮＡ法で得
られたＨＩＶエンベロープ配列か診断アッセイにおいて
有用であることが示された［ウノドコールド●スプリン
グ●ハーバー、ニューヨーク、５月２２〜２６日、１９
８５：チャング（ｃ ｈａｎｇ）ら、Ｂ ｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙｓ ３、９０５ 〜９０９（１９８５）
；クロール（ｃｒｏｗｌ）ら、Ｃｅｌｌ、４１、９７９
〜９８６（１９８５）；カブラディラ（ｃａｂｒａｄｉ
ｌｌａ）ら、Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ， ４、
１２８〜１３３（］９８６）］。大腸閑で発現されたウ
ィルスタンパク質か診断アノセイにおいて潜在的な有用
性を有することは一般に知られていても、細胞培養岐か
ら得られた天然のウイルスタンパク質と同等もしくはそ
れ以上の特異性および感度を有する試薬を用いたイムノ
アッセイを開発することは困難な仕事てあった。
発現により、ｒＤＮＡ法により製造されたＨＩＶｇａｇ
タンパク質は潜在的な診断価値を有すること一ルド・ス
プリング・ハーバー ニューヨーク、５月２２〜２６日
、１９８５；タウヘクノ（ Ｄ ｏｗｂｅｋｎｏ）ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２、７７４８〜７７５２、（１．９８５）；グラエブ
（Ｇｈｒａｙｅｂ）ら、ＤＮＡ，５、９３ 〜９９（１
９８６）；スタイ？ （Ｓ ｔｅｉｍｅｒ）ら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ， ］ ５ ０、２８３〜２ ９
０（１． ９ ８ ６）］。同様に、ｇｐ４１またはｇ
ｐ４ １の一部の発現によってもまた、ｒＤＮＡ法で得
られたＨＩＶエンベロープ配列か診断アッセイにおいて
有用であることが示された［ウノドコールド●スプリン
グ●ハーバー、ニューヨーク、５月２２〜２６日、１９
８５：チャング（ｃ ｈａｎｇ）ら、Ｂ ｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙｓ ３、９０５ 〜９０９（１９８５）
；クロール（ｃｒｏｗｌ）ら、Ｃｅｌｌ、４１、９７９
〜９８６（１９８５）；カブラディラ（ｃａｂｒａｄｉ
ｌｌａ）ら、Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ， ４、
１２８〜１３３（］９８６）］。大腸閑で発現されたウ
ィルスタンパク質か診断アノセイにおいて潜在的な有用
性を有することは一般に知られていても、細胞培養岐か
ら得られた天然のウイルスタンパク質と同等もしくはそ
れ以上の特異性および感度を有する試薬を用いたイムノ
アッセイを開発することは困難な仕事てあった。
（課題を解決するための手段）
本発明は、生物学的試料中のＨＩＶに対する抗体を検出
するための改良されたイムノアッセイ法を提供するもの
であり、該方法は少なくとも２つの検出系からなる。
するための改良されたイムノアッセイ法を提供するもの
であり、該方法は少なくとも２つの検出系からなる。
すなわち、本発明は、第一固相支持体および第二固相支
持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にｐ２４タンパク質を、該第二
固相支持体にｇｐ／ｌ ｌタンパク質をそれぞれ結合さ
せ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体を除き、（ｄ）標識
を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し
、 （ｅ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｆ）該第二固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の標識抗ＨＩＶｇｐ／ＩＩ抗体を除き、ついで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法；固相支持体
を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体にｐ２４タンパク質およびｇｐ４１
タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶ
ｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ
、 （ｃ）該固相支持体から未結合の生物学的試料および未
結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体を除き、ついで （ｄ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在を決定し、
抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗１−［ Ｉ Ｖ ｇｐ４
１抗体のいずれか、または両抗体の存在により試料中の
抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法生物学的
試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を検出するためのイムノアッ
セイキットであって、 （ａ）それぞれ、組換えｐ２４タンパク質および組換え
ｇｐ４１タンパク質をコーティングした第一固相支持体
および第二固相支持体、および （ｂ）標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体 からなることを特徴とするイムノアッセイキット生物学
的試料中の抗１−１ １ Ｖ抗体を検出するためのイム
ノアッセイキットであって、 （ａ）組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４１タ
ンパク質をコーティングした固相支持体、および（ｂ）
標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗１−１ １ Ｖｇ
ｐ４１抗体 からなることを特徴とするイムノアッセイキット第一固
相支持体および第二固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗
体の検出方法であって、 （ａ）第一のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体
をコーティングしたのち組換えｐ２４タンパク質をオー
バーコーティングし、 （ｂ）該第一のポリスチレンヒーズを生物学的試料の第
一のアリコートおよび西洋ワザビペル才キンダーゼに結
合した抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触さ０゜、（ｃ）該第一
のポリスチレンビーズを洗浄し、（ｄ）該洗浄した第一
のポリスチレンビーズを０−フェニレンジアミンの過酸
化水素溶肢と接触させて黄色の生成物を生成させ、 （ｅ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｆ）第二のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体をコーティングしたのち組換えｇｐ４１タンパク質を
オーバーコーティングし、 （ｇ）該第二のボリスチレンビーズを生物学的試料の第
二のアリコートおよび西洋ワザビペルオキンダーゼに結
合した抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｈ）該第二のポリスチレンビーズを洗浄し、（１）該
洗浄した第二のポリスチレンビーズを０−フェニレンジ
アミンの過酸化水素溶肢と接触させて黄色の生成物を生
成させ、ついで （ｊ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ
）〜工程（ｊ）の方法により試験したときに生成する黄
色の生成物の量に比べて、該第一の固相支持体または該
第二の固相支持体のいずれかまたは両方で生成ずる黄色
の生成物の量が減少することにより試料中の抗Ｈ Ｉ
Ｖ抗体の存在を決定することを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の検出方法：固相支持体を用いた抗１−１ Ｔ Ｖ
抗体の検出方法であって、 （ａ）ポリスチレンビーズに抗トＩｒＶｐ２４抗体およ
び抗ｒ−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体をコーティングし
たのち組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４ １
タンパク質をオーバーコーティングし、 （ｂ）該ポリスチレンビーズを生物学的試料のアリコー
トおよび西洋ワザビペルオキンダーゼに結合した抗Ｉ−
｛ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触さ
せ、 （ｃ）該ポリスチレンビーズを洗浄し、（ｄ）該洗浄し
たポリスチレンビーズを。＝フェニレンジアミンの過酸
化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生成させ、つい
で （ｅ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決
定し、 抗Ｉ｛ Ｉ Ｖ抗体を含有しないコントロールを工程（
ａ）〜工程（ｅ）の方法にｊ；り試験したときに生成す
る黄色の生成物の量に比べて、生成ずる黄色の生成物の
量が減少することにより試粗中の抗Ｉ−｛ Ｉ Ｖ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法２つの固
相支持体を用いた抗１−Ｉ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であ
って、 （ａ）第一固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体を結合させ
、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび組換えＩ｛［Ｖｐ２４タンパク質と接触させ
、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接
触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体を除き、（ｆ）
標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決
定し、 （ｇ）第二固相支持体に抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を結合さ
せ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび組換えＩ−（ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １タンパク
質と接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料および未結合の組換え１−
｛ ｒ Ｖ ｇｐ４． ｌを除き、（ｊ）該第二固相支
持体を標識抗Ｉ−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体と接触さ
せ、 （ｋ）未結合の標識抗１−Ｉ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １抗体
を除き、ついで ＣＱ）標識を検出して試料中の抗Ｈ Ｔ Ｖ ｇｐ４
１抗体の存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗１−］ Ｉ Ｖ ｇｐ４
． Ｉ抗体の存在、または両抗体の存在により試料中の
抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法固相支持
体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗１−Ｉ
Ｉ Ｖ ｇｐ’！ Ｉ抗体を結合させ、（ｂ）該固相支
持体を生物学的試料および組換えＨＩＶｐ２４タンパク
質および組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質および組換えＩ｛ＩＶｇｉ｝７Ｉ＋
タンパク質を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識抗ＨＩＶｐ２／Ｉ抗体および
標識抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体と接触させ、つ
いで（ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体
および抗＋−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在を決定
し、抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗１｛ Ｉ Ｖ ｇｐ
４ １抗体の存在、または両抗体の存在により試料中の
抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｔ−１ １ Ｖ抗体の検出方法；第
一固相支持体および第二固相支持体を用いた生物学的試
料中の抗１｛ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）
該第一固相支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、（ｂ）該
第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコートと接
触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、（ｆ）標識を検
出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｇ）該第二固相支持体にＩ｛ Ｉ Ｖ ｇｐ４． ｌ
を結合させ、（ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の
第二のアリコートと接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｋ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、ついで（Ｑ）標
識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決
定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法；固相支持体
を用いた生物学的試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法
であって、 （ａ）該固相支持体にＨＩＶｐ２４およびｌ｛ＩＶｇｐ
４１を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、（ｃ）
未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、（ｅ
）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、ついで（ｆ）標識を
検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗Ｈ Ｉ
Ｖ ｇｐ４． Ｉ抗体の存在を決定し、抗Ｔ−｛ＩＶｐ
２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、また
は両抗体の存在により試料中の抗］｛ Ｉ Ｖ抗体の存
在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法；第一固相支
持体および第二固相支持体を用いた生物学的試料中の抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）該第一固相
支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、（ｂ）該第一固相支
持体を生物学的試料の第一のアリコートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識ＨＩＶｐ２４と接触させ
、 （ｅ）未結合の標識ＨＩＶｐ２４を除き、（ｆ）標識を
検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｇ）該第二固相支持体にｌ｛ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １を
結合させ、（ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第
二のアリコートと接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識１−ｔ Ｉ Ｖ ｇｐ４
１と接触させ、 （ｋ）未結合の標識１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １を除き
、ついで（Ｑ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４
１抗体の存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法固相支持体を
用いた生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法であっ
て、 （ａ）該固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４
１を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、（ｃ）
未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識ＨＩＶｐ２４および標識ｉ−
ｒｉＶｇｐ４１と接触させ、 （ｅ）未結合の標識ＨＩＶｐ２４および標識ＨＩＶｇｐ
４ １を除き、ついで （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在を決定し、
抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４． Ｉ
抗体のいずれか、または両抗体の存在により試料中の抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法第一固相
支持体および第二固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にｐ２４タンパク質を、該第二
固相支持体にｇｐ４１タンパク質をそれぞれ結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗
体と接触させ、 （ｃ）該第一固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の第一ハプテンに結合させた抗Ｈ ＩＶｐ２４
抗体を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｆ）該第二固相支持体を生物学的試籾の第二のアリコ
ートおよび第二ハプテンに結合させた抗１−１ １Ｖ
ｇｐ４ １抗体と接触させ、 （ｇ）該第二固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の第二ハプテンに結合さＵた抗１−１ １Ｖ
ｇｐ４ １抗体を除き、 （ｈ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、ついで （ｉ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在に上り試粗中の抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法固相支持
体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体に９２４タンパク質およびｇｐ４
１タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および第一ハプテン
に結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗体および第二ハプテンに
結合させた抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該固相支持体から未結合の生物学的試料および未
結合の第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶ１）２４抗体
および未結合の第二ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体を除き、 （ｄ）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体
および該第二ハプテンに対する標識抗体と接触させ、つ
いで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、または
両抗体の存在により試料中の抗Ｈ ｒ Ｖ抗体の存在を
決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法；第一固
相支持体および第二固相支持体を用いた抗１−Ｉ Ｔ
Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）第一のポリスチレン
ビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体をコーティングしたのち組
換えｐ２４タンパク質をオーバーコーティングし、 （ｂ）該第一のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
一のアリコートおよび第一ハプテンに結合した抗ＨＩＶ
ｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一のポリスチレンビーズを西洋ワザビペルオ
キシダーゼに結合した抗第一ハプテン抗体と接触させ、 （ｄ）該第一のポリスチレンビーズを次浄し、（ｅ）該
洗浄した第一のポリスチレンビーズを０−フェニレンジ
アミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生
成させ、 （ｆ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｇ）第二のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体をコーティングしたのち組換えｇｐ４１タンパク質を
オーバーコーティングし、 （ｈ）該第二のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
二のアリコートおよび第二ハプテンに結合した抗１−１
１ Ｖ ｇｐ４ １抗体と接触させ、（ｉ）該第二の
ポリスチレンビーズを西洋ワザビペルオキンダーゼに結
合した抗第二ハプテン抗体と接触させ、 （ｊ）該第二のポリスチレンビーズを洗浄し、（ｋ）該
洗浄した第二のポリスチレンヒーズをＯ−フエニレンノ
アミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生
成させ、ついで （１２）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗
１−＋ １ Ｖ ｇｐ’ｌ Ｉ抗体の存在を決定し、抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）
〜工程（ｌ）の方法により試験したときに生戚する黄色
の生成物の量に比べて、該第一の固相支持体または該第
二の固相支持体のいずれかまたは両方で生成する黄色の
生成物の量が減少することにより試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定することを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗
体の検出方法固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検
出方法であって、 （ａ）ポリスチレンビーズに抗１ｔＴＶｐ２４抗体およ
び抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４． ｌ抗体をコーティングした
のち組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４ １タ
ンパク質をオーバーコーティングし、 （ｂ）該ポリスチレンビーズを生物学的試料およびハプ
テンに結合した抗ＨＩＶｐ２４抗体およびハプテンに結
合した抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該ポリスチレンビーズを西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合した抗ハプテン抗体と接触させ、（ｄ）該ポ
リスチレンヒーズを洗浄し、（ｅ）該洗浄したポリスチ
レンヒーズを０−フェニレンジアミンの過酸化水素溶液
と接触させて黄色の生成物を生成させ、ついで （ｆ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｌ１４１抗体の存在を
決定し、 抗ＨＩＶ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）〜
工程（ｆ）の方法により試験したときに生成する黄色の
生成物の量に比べて、生成ずる黄色の生成物の量が減少
することにより試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定
する ことを特徴とする抗１−１ １ Ｖ抗体の検出方法２つ
の固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であ
って、 （ａ）第一固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体を結合させ
、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび第一ハプテンに結合した組換えＨＩＶｐ２４
タンパク質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の第一ハプテ
ンに結合した組換えＨＩＶｐ２４タンパク質を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｇ）第二固相支持体に抗１−Ｉ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １
抗体を結合させ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび第二ハプテンに結合した組換えｔＴＩ Ｖ
ｇｐ４ １タンパク質と接触させ、（ｉ）未結合の生物
学的試料および未結合の第二ハプテンに結合した組換え
Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １タンパク質を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｋ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｌ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４ｉ抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗１−Ｉ Ｔ
Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗１−１ １ Ｖ抗体の検出方法固相
支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体に抗ｔｌｌＶｐ２４抗体および抗Ｈ
ＩＶｇｐ４１抗体を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および第一ハプテン
に結合した組換え＋４１Ｖｐ２４タンパク質および第二
ハプテンに結合した組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質と
接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の第一ハプテ
ンに結合した組換えＩ−［Ｖｐ２４タンパク質および未
結合の第二ハプテンに結合した組換えＩ］Ｉ Ｖ ｇｌ
ｌｌ’ｌ ＋タンパク質を除き、（ｄ）該固相支持体を
該第一ハプテンに対する標識抗体および該第二ハプテン
に封ずる標識抗体と接触させ、ついで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗＋｛ＩＶｐ
２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在、または
両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を
決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法第一固相支持
体および第二固相支持体を用いた生物学的試料中の抗Ｈ
Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）第一固相支持
体にＨＩＶｐ２４を結合させ、（ｂ）該第一固相支持体
を生物学的試料の第一のアリコートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を第一ハプテンに結合した抗ヒ
ト抗体と接触さＵ・、 （ｅ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｈ）第二固相支持体にＨＩＶｇｐ４１を結合させ、（
ｉ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコー
トと接触させ、 （ｊ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｋ）該第二固相支持体を第二ハプテンに結合した抗ヒ
ト抗体と接触させ、 （Ｑ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｍ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｎ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在に上り試料中の抗１｛ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法：固相支
持体を用いた生物学的試料中の抗１−１ １ Ｖ抗体の
検出方法であって、 （ａ）固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４１
を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、（ｃ）
未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体をハプテンに結合した抗ヒト抗体と
接触させ、 （ｅ）該固相支持体を該ハプテンに対する標識抗体と接
触させ、 （ｆ）未結合の該ハプテンに対する標識抗体を除き、つ
いで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２４抗
体の存在、抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在、
または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法：第一固
相支持体および第二固相支持体を用いた生物学的試料中
の抗Ｈ ｒ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）第一固
相支持体にＨＩＶｐ２４タンパク質を結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を第一ハプテンに結合したＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質と接触させ、 （ｅ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに封ずる標識
抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｈ）第二固相支持体にＩＩＩＶｇｐ４１タンパク質を
結合させ、 （ｉ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートと接触させ、 （ｊ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｋ）該第二固相支持体を第二ハプテンに結合した１−
１ １ Ｖ ｇｐ４ １タンパク質と接触させ、（ｌ）
該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識抗体と
接触させ、 （ｍ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｎ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｔ Ｖ抗
体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法：および 固相支持体を用いた生物学的試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
の検出方法であって、 （ａ）固相支持体にＨＩＶｐ２４タンパク質およびＨＩ
Ｖｇｐ４１タンパク質を結合させ、（ｂ）該固相支持体
を生物学的試料と接触させ、（ｅ）未結合の生物学的試
料を除き、 （ｄ）該固相支持体を第一ハプテンに結合したＩ−１
１Ｖｐ２４タンパク質および第二ハプテンに結合したＩ
−１ １ Ｖ ｇｐ４ １タンパク質と接触させ、（ｅ
）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体およ
び該第二ハプテンに対する標識抗体ど接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体および
未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き、つい
で （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １の存在を決定し、抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在、
または両抗体の存在により試料中の抗１−｛ Ｉ Ｖ抗
体の存在を決定ずる ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法を提供ず
るものである。
持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にｐ２４タンパク質を、該第二
固相支持体にｇｐ／ｌ ｌタンパク質をそれぞれ結合さ
せ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体を除き、（ｄ）標識
を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し
、 （ｅ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｆ）該第二固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の標識抗ＨＩＶｇｐ／ＩＩ抗体を除き、ついで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法；固相支持体
を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体にｐ２４タンパク質およびｇｐ４１
タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶ
ｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ
、 （ｃ）該固相支持体から未結合の生物学的試料および未
結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体を除き、ついで （ｄ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在を決定し、
抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗１−［ Ｉ Ｖ ｇｐ４
１抗体のいずれか、または両抗体の存在により試料中の
抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法生物学的
試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を検出するためのイムノアッ
セイキットであって、 （ａ）それぞれ、組換えｐ２４タンパク質および組換え
ｇｐ４１タンパク質をコーティングした第一固相支持体
および第二固相支持体、および （ｂ）標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体 からなることを特徴とするイムノアッセイキット生物学
的試料中の抗１−１ １ Ｖ抗体を検出するためのイム
ノアッセイキットであって、 （ａ）組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４１タ
ンパク質をコーティングした固相支持体、および（ｂ）
標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗１−１ １ Ｖｇ
ｐ４１抗体 からなることを特徴とするイムノアッセイキット第一固
相支持体および第二固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗
体の検出方法であって、 （ａ）第一のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体
をコーティングしたのち組換えｐ２４タンパク質をオー
バーコーティングし、 （ｂ）該第一のポリスチレンヒーズを生物学的試料の第
一のアリコートおよび西洋ワザビペル才キンダーゼに結
合した抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触さ０゜、（ｃ）該第一
のポリスチレンビーズを洗浄し、（ｄ）該洗浄した第一
のポリスチレンビーズを０−フェニレンジアミンの過酸
化水素溶肢と接触させて黄色の生成物を生成させ、 （ｅ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｆ）第二のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体をコーティングしたのち組換えｇｐ４１タンパク質を
オーバーコーティングし、 （ｇ）該第二のボリスチレンビーズを生物学的試料の第
二のアリコートおよび西洋ワザビペルオキンダーゼに結
合した抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｈ）該第二のポリスチレンビーズを洗浄し、（１）該
洗浄した第二のポリスチレンビーズを０−フェニレンジ
アミンの過酸化水素溶肢と接触させて黄色の生成物を生
成させ、ついで （ｊ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ
）〜工程（ｊ）の方法により試験したときに生成する黄
色の生成物の量に比べて、該第一の固相支持体または該
第二の固相支持体のいずれかまたは両方で生成ずる黄色
の生成物の量が減少することにより試料中の抗Ｈ Ｉ
Ｖ抗体の存在を決定することを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の検出方法：固相支持体を用いた抗１−１ Ｔ Ｖ
抗体の検出方法であって、 （ａ）ポリスチレンビーズに抗トＩｒＶｐ２４抗体およ
び抗ｒ−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体をコーティングし
たのち組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４ １
タンパク質をオーバーコーティングし、 （ｂ）該ポリスチレンビーズを生物学的試料のアリコー
トおよび西洋ワザビペルオキンダーゼに結合した抗Ｉ−
｛ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触さ
せ、 （ｃ）該ポリスチレンビーズを洗浄し、（ｄ）該洗浄し
たポリスチレンビーズを。＝フェニレンジアミンの過酸
化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生成させ、つい
で （ｅ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決
定し、 抗Ｉ｛ Ｉ Ｖ抗体を含有しないコントロールを工程（
ａ）〜工程（ｅ）の方法にｊ；り試験したときに生成す
る黄色の生成物の量に比べて、生成ずる黄色の生成物の
量が減少することにより試粗中の抗Ｉ−｛ Ｉ Ｖ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法２つの固
相支持体を用いた抗１−Ｉ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であ
って、 （ａ）第一固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体を結合させ
、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび組換えＩ｛［Ｖｐ２４タンパク質と接触させ
、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接
触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体を除き、（ｆ）
標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決
定し、 （ｇ）第二固相支持体に抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を結合さ
せ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび組換えＩ−（ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １タンパク
質と接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料および未結合の組換え１−
｛ ｒ Ｖ ｇｐ４． ｌを除き、（ｊ）該第二固相支
持体を標識抗Ｉ−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体と接触さ
せ、 （ｋ）未結合の標識抗１−Ｉ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １抗体
を除き、ついで ＣＱ）標識を検出して試料中の抗Ｈ Ｔ Ｖ ｇｐ４
１抗体の存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗１−］ Ｉ Ｖ ｇｐ４
． Ｉ抗体の存在、または両抗体の存在により試料中の
抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法固相支持
体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗１−Ｉ
Ｉ Ｖ ｇｐ’！ Ｉ抗体を結合させ、（ｂ）該固相支
持体を生物学的試料および組換えＨＩＶｐ２４タンパク
質および組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質および組換えＩ｛ＩＶｇｉ｝７Ｉ＋
タンパク質を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識抗ＨＩＶｐ２／Ｉ抗体および
標識抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体と接触させ、つ
いで（ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体
および抗＋−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在を決定
し、抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗１｛ Ｉ Ｖ ｇｐ
４ １抗体の存在、または両抗体の存在により試料中の
抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｔ−１ １ Ｖ抗体の検出方法；第
一固相支持体および第二固相支持体を用いた生物学的試
料中の抗１｛ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）
該第一固相支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、（ｂ）該
第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコートと接
触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、（ｆ）標識を検
出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｇ）該第二固相支持体にＩ｛ Ｉ Ｖ ｇｐ４． ｌ
を結合させ、（ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の
第二のアリコートと接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｋ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、ついで（Ｑ）標
識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決
定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法；固相支持体
を用いた生物学的試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法
であって、 （ａ）該固相支持体にＨＩＶｐ２４およびｌ｛ＩＶｇｐ
４１を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、（ｃ）
未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、（ｅ
）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、ついで（ｆ）標識を
検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗Ｈ Ｉ
Ｖ ｇｐ４． Ｉ抗体の存在を決定し、抗Ｔ−｛ＩＶｐ
２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、また
は両抗体の存在により試料中の抗］｛ Ｉ Ｖ抗体の存
在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法；第一固相支
持体および第二固相支持体を用いた生物学的試料中の抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）該第一固相
支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、（ｂ）該第一固相支
持体を生物学的試料の第一のアリコートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識ＨＩＶｐ２４と接触させ
、 （ｅ）未結合の標識ＨＩＶｐ２４を除き、（ｆ）標識を
検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｇ）該第二固相支持体にｌ｛ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １を
結合させ、（ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第
二のアリコートと接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識１−ｔ Ｉ Ｖ ｇｐ４
１と接触させ、 （ｋ）未結合の標識１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １を除き
、ついで（Ｑ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４
１抗体の存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法固相支持体を
用いた生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法であっ
て、 （ａ）該固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４
１を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、（ｃ）
未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識ＨＩＶｐ２４および標識ｉ−
ｒｉＶｇｐ４１と接触させ、 （ｅ）未結合の標識ＨＩＶｐ２４および標識ＨＩＶｇｐ
４ １を除き、ついで （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在を決定し、
抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４． Ｉ
抗体のいずれか、または両抗体の存在により試料中の抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法第一固相
支持体および第二固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にｐ２４タンパク質を、該第二
固相支持体にｇｐ４１タンパク質をそれぞれ結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗
体と接触させ、 （ｃ）該第一固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の第一ハプテンに結合させた抗Ｈ ＩＶｐ２４
抗体を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｆ）該第二固相支持体を生物学的試籾の第二のアリコ
ートおよび第二ハプテンに結合させた抗１−１ １Ｖ
ｇｐ４ １抗体と接触させ、 （ｇ）該第二固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の第二ハプテンに結合さＵた抗１−１ １Ｖ
ｇｐ４ １抗体を除き、 （ｈ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、ついで （ｉ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在に上り試粗中の抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法固相支持
体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体に９２４タンパク質およびｇｐ４
１タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および第一ハプテン
に結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗体および第二ハプテンに
結合させた抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該固相支持体から未結合の生物学的試料および未
結合の第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶ１）２４抗体
および未結合の第二ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体を除き、 （ｄ）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体
および該第二ハプテンに対する標識抗体と接触させ、つ
いで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、または
両抗体の存在により試料中の抗Ｈ ｒ Ｖ抗体の存在を
決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法；第一固
相支持体および第二固相支持体を用いた抗１−Ｉ Ｔ
Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）第一のポリスチレン
ビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体をコーティングしたのち組
換えｐ２４タンパク質をオーバーコーティングし、 （ｂ）該第一のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
一のアリコートおよび第一ハプテンに結合した抗ＨＩＶ
ｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一のポリスチレンビーズを西洋ワザビペルオ
キシダーゼに結合した抗第一ハプテン抗体と接触させ、 （ｄ）該第一のポリスチレンビーズを次浄し、（ｅ）該
洗浄した第一のポリスチレンビーズを０−フェニレンジ
アミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生
成させ、 （ｆ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、 （ｇ）第二のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体をコーティングしたのち組換えｇｐ４１タンパク質を
オーバーコーティングし、 （ｈ）該第二のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
二のアリコートおよび第二ハプテンに結合した抗１−１
１ Ｖ ｇｐ４ １抗体と接触させ、（ｉ）該第二の
ポリスチレンビーズを西洋ワザビペルオキンダーゼに結
合した抗第二ハプテン抗体と接触させ、 （ｊ）該第二のポリスチレンビーズを洗浄し、（ｋ）該
洗浄した第二のポリスチレンヒーズをＯ−フエニレンノ
アミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生
成させ、ついで （１２）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗
１−＋ １ Ｖ ｇｐ’ｌ Ｉ抗体の存在を決定し、抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）
〜工程（ｌ）の方法により試験したときに生戚する黄色
の生成物の量に比べて、該第一の固相支持体または該第
二の固相支持体のいずれかまたは両方で生成する黄色の
生成物の量が減少することにより試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定することを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗
体の検出方法固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検
出方法であって、 （ａ）ポリスチレンビーズに抗１ｔＴＶｐ２４抗体およ
び抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４． ｌ抗体をコーティングした
のち組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４ １タ
ンパク質をオーバーコーティングし、 （ｂ）該ポリスチレンビーズを生物学的試料およびハプ
テンに結合した抗ＨＩＶｐ２４抗体およびハプテンに結
合した抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該ポリスチレンビーズを西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合した抗ハプテン抗体と接触させ、（ｄ）該ポ
リスチレンヒーズを洗浄し、（ｅ）該洗浄したポリスチ
レンヒーズを０−フェニレンジアミンの過酸化水素溶液
と接触させて黄色の生成物を生成させ、ついで （ｆ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｌ１４１抗体の存在を
決定し、 抗ＨＩＶ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）〜
工程（ｆ）の方法により試験したときに生成する黄色の
生成物の量に比べて、生成ずる黄色の生成物の量が減少
することにより試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を決定
する ことを特徴とする抗１−１ １ Ｖ抗体の検出方法２つ
の固相支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であ
って、 （ａ）第一固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体を結合させ
、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび第一ハプテンに結合した組換えＨＩＶｐ２４
タンパク質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の第一ハプテ
ンに結合した組換えＨＩＶｐ２４タンパク質を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｇ）第二固相支持体に抗１−Ｉ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １
抗体を結合させ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび第二ハプテンに結合した組換えｔＴＩ Ｖ
ｇｐ４ １タンパク質と接触させ、（ｉ）未結合の生物
学的試料および未結合の第二ハプテンに結合した組換え
Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １タンパク質を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｋ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｌ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４ｉ抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗１−Ｉ Ｔ
Ｖ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗１−１ １ Ｖ抗体の検出方法固相
支持体を用いた抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体に抗ｔｌｌＶｐ２４抗体および抗Ｈ
ＩＶｇｐ４１抗体を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および第一ハプテン
に結合した組換え＋４１Ｖｐ２４タンパク質および第二
ハプテンに結合した組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質と
接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の第一ハプテ
ンに結合した組換えＩ−［Ｖｐ２４タンパク質および未
結合の第二ハプテンに結合した組換えＩ］Ｉ Ｖ ｇｌ
ｌｌ’ｌ ＋タンパク質を除き、（ｄ）該固相支持体を
該第一ハプテンに対する標識抗体および該第二ハプテン
に封ずる標識抗体と接触させ、ついで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗＋｛ＩＶｐ
２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在、または
両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を
決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法第一固相支持
体および第二固相支持体を用いた生物学的試料中の抗Ｈ
Ｉ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）第一固相支持
体にＨＩＶｐ２４を結合させ、（ｂ）該第一固相支持体
を生物学的試料の第一のアリコートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を第一ハプテンに結合した抗ヒ
ト抗体と接触さＵ・、 （ｅ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｈ）第二固相支持体にＨＩＶｇｐ４１を結合させ、（
ｉ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコー
トと接触させ、 （ｊ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｋ）該第二固相支持体を第二ハプテンに結合した抗ヒ
ト抗体と接触させ、 （Ｑ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｍ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｎ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在に上り試料中の抗１｛ Ｉ Ｖ
抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法：固相支
持体を用いた生物学的試料中の抗１−１ １ Ｖ抗体の
検出方法であって、 （ａ）固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４１
を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、（ｃ）
未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体をハプテンに結合した抗ヒト抗体と
接触させ、 （ｅ）該固相支持体を該ハプテンに対する標識抗体と接
触させ、 （ｆ）未結合の該ハプテンに対する標識抗体を除き、つ
いで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２４抗
体の存在、抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体の存在、
または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法：第一固
相支持体および第二固相支持体を用いた生物学的試料中
の抗Ｈ ｒ Ｖ抗体の検出方法であって、（ａ）第一固
相支持体にＨＩＶｐ２４タンパク質を結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を第一ハプテンに結合したＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質と接触させ、 （ｅ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに封ずる標識
抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｈ）第二固相支持体にＩＩＩＶｇｐ４１タンパク質を
結合させ、 （ｉ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートと接触させ、 （ｊ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｋ）該第二固相支持体を第二ハプテンに結合した１−
１ １ Ｖ ｇｐ４ １タンパク質と接触させ、（ｌ）
該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識抗体と
接触させ、 （ｍ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｎ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗Ｈ Ｔ Ｖ抗
体の存在を決定する ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法：および 固相支持体を用いた生物学的試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
の検出方法であって、 （ａ）固相支持体にＨＩＶｐ２４タンパク質およびＨＩ
Ｖｇｐ４１タンパク質を結合させ、（ｂ）該固相支持体
を生物学的試料と接触させ、（ｅ）未結合の生物学的試
料を除き、 （ｄ）該固相支持体を第一ハプテンに結合したＩ−１
１Ｖｐ２４タンパク質および第二ハプテンに結合したＩ
−１ １ Ｖ ｇｐ４ １タンパク質と接触させ、（ｅ
）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体およ
び該第二ハプテンに対する標識抗体ど接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体および
未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き、つい
で （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １の存在を決定し、抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在、
または両抗体の存在により試料中の抗１−｛ Ｉ Ｖ抗
体の存在を決定ずる ことを特徴とする抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の検出方法を提供ず
るものである。
本発明の好ましい態様において、一方の検出系は下記工
程からなる。
程からなる。
（ａ）固相支持体を組換えｐ２４タンパク質でコーティ
ングし、 （ｂ）該ｐ２４タンパク質をコーティングした固相支持
体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触
させ、 （ｃ）未結合の試料および未結合の抗ＨＩＶｐ２４抗体
を固相支持体から除き、ついで （ｄ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定する。
ングし、 （ｂ）該ｐ２４タンパク質をコーティングした固相支持
体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触
させ、 （ｃ）未結合の試料および未結合の抗ＨＩＶｐ２４抗体
を固相支持体から除き、ついで （ｄ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定する。
他方の検出系は、下記工程からなる。
（ａ）固相支持体を組換えｇｐ４１タンパク質でコーテ
ィングし、 （ｂ）該ｇｐ４１タンパク質をコーティングした固相支
持体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と
接触させ、 （ｃ）未結合の試料および未結合の抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体を固相支持体から除き、ついで （（Ｉ）標識を検出して試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４
１抗体の存在を決定する。
ィングし、 （ｂ）該ｇｐ４１タンパク質をコーティングした固相支
持体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と
接触させ、 （ｃ）未結合の試料および未結合の抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体を固相支持体から除き、ついで （（Ｉ）標識を検出して試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４
１抗体の存在を決定する。
抗１−＋ １ Ｖ抗体を含まないコントロールに比べて
、検出される標識の量が減少している試料は反応性とさ
れる。第一の検出系における抗ＨＩＶｐ２４抗体の検出
、または第二の検出系における抗Ｈ ＩＶ ｇＰ’ｌ
ｌ抗体の検出、または両系における両抗体の検出は、試
料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を示している。
、検出される標識の量が減少している試料は反応性とさ
れる。第一の検出系における抗ＨＩＶｐ２４抗体の検出
、または第二の検出系における抗Ｈ ＩＶ ｇＰ’ｌ
ｌ抗体の検出、または両系における両抗体の検出は、試
料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の存在を示している。
好ましい態様において、第一の検出系の固相支持体を、
まず抗ＨＩＶｐ２４抗体でコーティングし、ついでｐ２
４でコーティングしてＨＩＶｐ２４タンパク質の結合を
高める。同様に、第二の検出系の固相支持体を、まず抗
１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体でコーティングし、つ
いでｇｐ４１でコーティンクして組換えｇｐ４１タンパ
ク質の結合を高める。
まず抗ＨＩＶｐ２４抗体でコーティングし、ついでｐ２
４でコーティングしてＨＩＶｐ２４タンパク質の結合を
高める。同様に、第二の検出系の固相支持体を、まず抗
１−１ １ Ｖ ｇｐ４ １抗体でコーティングし、つ
いでｇｐ４１でコーティンクして組換えｇｐ４１タンパ
ク質の結合を高める。
他の好ましい態様においては、ｐ２４およびｇｐ４１は
同じ固相支持体上に存在していてよい。たとえば、コー
ティングした固相支持体（ｐ２４またはｇｐ’１ １ま
たは両方を含む）を生物学的試料と接触させ、ついで未
結合の試料を除く。つぎに、試料中の免疫グロブリンに
特異的な標識抗免疫グロブリンを固相支持体に加える。
同じ固相支持体上に存在していてよい。たとえば、コー
ティングした固相支持体（ｐ２４またはｇｐ’１ １ま
たは両方を含む）を生物学的試料と接触させ、ついで未
結合の試料を除く。つぎに、試料中の免疫グロブリンに
特異的な標識抗免疫グロブリンを固相支持体に加える。
未結合の標識抗免疫グロブリン試薬を除いた後、標識を
検出して試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ 抗体の存在を決定する
。このアッセイの変法においては、コーティングした固
相支持体（ｐ２４またはｇｐ’Ｉ １または両方を含む
）を生物学的試料と接触させ、ついで未結合試料を除く
。
検出して試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ 抗体の存在を決定する
。このアッセイの変法においては、コーティングした固
相支持体（ｐ２４またはｇｐ’Ｉ １または両方を含む
）を生物学的試料と接触させ、ついで未結合試料を除く
。
つぎに、ｐ２４またはｇｐ４１（または両者）を固相支
持体に加える。未結合標識試薬を除いた後、固相支持体
に結合した標識を検出して試料中の抗Ｈｉｖ抗体の存在
を決定する。
持体に加える。未結合標識試薬を除いた後、固相支持体
に結合した標識を検出して試料中の抗Ｈｉｖ抗体の存在
を決定する。
さらに別の好ましい態様においては、抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体
を検出するための二重検出系は少なくとも２つの検出系
からなり、一方の検出系は下記工程＝（ａ）固相支持体
を抗ＨＩＶｐ２４抗体でコーティングし、 （ｂ）該抗ＨＩＶｐ２４抗体をコーティングした固相支
持体を生物学的試料および組換え＋｛ＩＶｐ２４タンパ
ク質と接触させ、 （ｃ）未結合の試料および未結合の組換えＨＩＶＩ）２
４タンパク質を除き、 （ｄ）該抗ＨＩＶｐ２４抗体をコーティングした固相支
持体を標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触させ、（ｅ）未結
合の標識抗１４１Ｖｐ２４抗体を除き、（ｆ）標識を検
出して固相支持体に結合した標識抗ＨＩＶｐ２４抗体の
存在を決定する 工程からなり、他方の検出系は下記工程（ｇ）固相支持
体を抗ＨＩＶｇｐ４１抗体てコーティングし、 （ｈ）該抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １抗体をコーティング
した固相支持体を生物学的試料および組換えＩ−１ １
Ｖ ｇｐ４１タンパク質と接触させ、 （ｉ）未結合の試料および未結合の組換えＨＩＶｇｐ４
１タンパク質を除き、 （ｊ）該抗ＨＩＶｇｐ４１抗体をコーティングした固相
支持体を標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、（ｋ）
未結合の標識抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４． １抗体を除き、
（Ｑ）標識を検出して固相支持体に結合した標識抗ＨＩ
Ｖｇｐ４１抗体の存在を決定する 工程からなる。
を検出するための二重検出系は少なくとも２つの検出系
からなり、一方の検出系は下記工程＝（ａ）固相支持体
を抗ＨＩＶｐ２４抗体でコーティングし、 （ｂ）該抗ＨＩＶｐ２４抗体をコーティングした固相支
持体を生物学的試料および組換え＋｛ＩＶｐ２４タンパ
ク質と接触させ、 （ｃ）未結合の試料および未結合の組換えＨＩＶＩ）２
４タンパク質を除き、 （ｄ）該抗ＨＩＶｐ２４抗体をコーティングした固相支
持体を標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触させ、（ｅ）未結
合の標識抗１４１Ｖｐ２４抗体を除き、（ｆ）標識を検
出して固相支持体に結合した標識抗ＨＩＶｐ２４抗体の
存在を決定する 工程からなり、他方の検出系は下記工程（ｇ）固相支持
体を抗ＨＩＶｇｐ４１抗体てコーティングし、 （ｈ）該抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １抗体をコーティング
した固相支持体を生物学的試料および組換えＩ−１ １
Ｖ ｇｐ４１タンパク質と接触させ、 （ｉ）未結合の試料および未結合の組換えＨＩＶｇｐ４
１タンパク質を除き、 （ｊ）該抗ＨＩＶｇｐ４１抗体をコーティングした固相
支持体を標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、（ｋ）
未結合の標識抗Ｈ Ｉ Ｖ ｇｐ４． １抗体を除き、
（Ｑ）標識を検出して固相支持体に結合した標識抗ＨＩ
Ｖｇｐ４１抗体の存在を決定する 工程からなる。
抗１−１ １ Ｖ抗体を含む生物学的試料は、組換え抗
原の結合に関して固相支持体と競合し、第二の工程にお
いてビーズに結合する標識抗体の量を減少ざせ、固相支
持体上で検出される標識の量を減少させる。抗Ｈ Ｉ
Ｖ抗体を含まないコントロールに比べて、検出される標
識の量が減少している試料は反応性とされる。
原の結合に関して固相支持体と競合し、第二の工程にお
いてビーズに結合する標識抗体の量を減少ざせ、固相支
持体上で検出される標識の量を減少させる。抗Ｈ Ｉ
Ｖ抗体を含まないコントロールに比べて、検出される標
識の量が減少している試料は反応性とされる。
本発明の方法により容易に試験することのできる生物学
的試料としては、全血、血清、血漿、尿、唾肢、大便、
リンパ球または細胞培養調製物および純粋なおよび部分
的に純粋な免疫グロブリンなどのヒトおよび動物の体液
が挙げられる。本発明のイムノアッセイに用いることの
できる固相支持体としては、反応トレイのウエル、試験
管、ビーズ、ストリップ、膜、フィルター、微細粒子、
または当業者に知られた他の固相支持体が挙げられる。
的試料としては、全血、血清、血漿、尿、唾肢、大便、
リンパ球または細胞培養調製物および純粋なおよび部分
的に純粋な免疫グロブリンなどのヒトおよび動物の体液
が挙げられる。本発明のイムノアッセイに用いることの
できる固相支持体としては、反応トレイのウエル、試験
管、ビーズ、ストリップ、膜、フィルター、微細粒子、
または当業者に知られた他の固相支持体が挙げられる。
−１二記アソセイにおいて、酵素標識、放射性同位体標
識、蛍光標識および化学発光標識を用いることができる
。さらに、ヒオチン／標識抗ピオチン抗体系などのハプ
テン／標識抗ハプテン抗体系も本発明のアッセイに用い
ることができる。ポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体の両方とも試薬として有用であり、ＩｇＧおよ
びＩｇＭクラスのＨ Ｉ Ｖ抗体を固相支持体まｉ？は
標識試薬に用いることができる。
識、蛍光標識および化学発光標識を用いることができる
。さらに、ヒオチン／標識抗ピオチン抗体系などのハプ
テン／標識抗ハプテン抗体系も本発明のアッセイに用い
ることができる。ポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体の両方とも試薬として有用であり、ＩｇＧおよ
びＩｇＭクラスのＨ Ｉ Ｖ抗体を固相支持体まｉ？は
標識試薬に用いることができる。
本発明は、細菌により製造されたエンベロープおよびコ
アの両タンパク質をアソセイ試薬として用いた二重イム
ノアッセイ法である。
アの両タンパク質をアソセイ試薬として用いた二重イム
ノアッセイ法である。
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。Ｈ Ｉ
Ｖに感染したＨ Ｔ − ９細胞を集め、全細胞ＤＮ
Ａを単離し消化した。得られたＤＮＡ断片をモレキュラ
ークローニングし、ＨＩＶゲノム配列のために選択した
。コアタンパク質をコードするＤＮＡ断片およびエンベ
ロープ糖タンパク質をコートするＤＮＡ断片を、よく知
られた組換え法を用いてさらに細菌発現ｌ＼クター中に
ザックローニングした。細菌で発、現されたタンパク質
を、Ｈ Ｉ Ｖに特異的に反応する抗体の存在についで
彬者血清をアソセイするための抗原試薬として用いＸ夜
剋工− Ｈ Ｉ Ｖゲノムのクローニングおよび大腸菌中でのコ
アタンパク質およびエンヘロープタンパク質の発現 密度勾配濃度を用い、フエデリック・キャンザー・リザ
ーヂ・ファノリティ−（Ｆｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、フエデリ
ック、メリーラントから提供されたＨＩＶ感染ＨＴ−９
細胞の培養肢からｌ｛ Ｉ Ｖウイルスを精製した。バ
ンド（ｂａｎｄｅｄ）ウイルスから抽出した精製ウイル
スＲＮＡを用い、ウイルスｃＤＮＡライブラリーを構築
した［オカヤマ（Ｏ ｋａｙａｍａ）ら、Ｍｏｌ． ａ
ｎｄ ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，３、２８０−２８９（１
９８３）］。
るが、本発明はこれらに限られるものではない。Ｈ Ｉ
Ｖに感染したＨ Ｔ − ９細胞を集め、全細胞ＤＮ
Ａを単離し消化した。得られたＤＮＡ断片をモレキュラ
ークローニングし、ＨＩＶゲノム配列のために選択した
。コアタンパク質をコードするＤＮＡ断片およびエンベ
ロープ糖タンパク質をコートするＤＮＡ断片を、よく知
られた組換え法を用いてさらに細菌発現ｌ＼クター中に
ザックローニングした。細菌で発、現されたタンパク質
を、Ｈ Ｉ Ｖに特異的に反応する抗体の存在についで
彬者血清をアソセイするための抗原試薬として用いＸ夜
剋工− Ｈ Ｉ Ｖゲノムのクローニングおよび大腸菌中でのコ
アタンパク質およびエンヘロープタンパク質の発現 密度勾配濃度を用い、フエデリック・キャンザー・リザ
ーヂ・ファノリティ−（Ｆｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、フエデリ
ック、メリーラントから提供されたＨＩＶ感染ＨＴ−９
細胞の培養肢からｌ｛ Ｉ Ｖウイルスを精製した。バ
ンド（ｂａｎｄｅｄ）ウイルスから抽出した精製ウイル
スＲＮＡを用い、ウイルスｃＤＮＡライブラリーを構築
した［オカヤマ（Ｏ ｋａｙａｍａ）ら、Ｍｏｌ． ａ
ｎｄ ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，３、２８０−２８９（１
９８３）］。
ボリＡ選択ウイルスＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするために、標識ウイルスｃＤ
ＮＡ断片をブローブとして用いた。
ラリーをスクリーニングするために、標識ウイルスｃＤ
ＮＡ断片をブローブとして用いた。
−つのクローンであるｐｃＷｌｌ（全ウイルス３゜Ｌ
Ｔ Ｒと３゛オーブンリーディングフレームを含む）を
プ口ーブどして用いてゲノムライブラリーのスクリーニ
ングを行い、部分的または全ウイルスゲノムを含む幾つ
かのクローンが単離された。
Ｔ Ｒと３゛オーブンリーディングフレームを含む）を
プ口ーブどして用いてゲノムライブラリーのスクリーニ
ングを行い、部分的または全ウイルスゲノムを含む幾つ
かのクローンが単離された。
これらのクローンを用い、大腸菌中でのｐ２．４および
ｇｐ４ １の製造のための発現ヘクターを構築した。
ｇｐ４ １の製造のための発現ヘクターを構築した。
一つのクローンであるｐＣ２３（全ウイルスｇａｇ遺伝
子を含む）は、約１７ＫＤ（ｐｌ７）、２ ４． Ｋ
Ｉ）（ｐ２４）およびＩ ５ＫＤ（ｐｌ ５）の３つの
コアタンパク質をコードしていた。これらのうちで最も
抗原性の高いｐ２４を大腸菌中での発現のために選択し
た。Ｉａｃプロモーターの制御下で翻訳できる位置にて
、ｐ２４遺伝子断片をプラスミドｐＵＣ９（ファルマシ
ア、ビス力夕ウエー、ニュージャージー）中に挿入した
。得られたブラスミド（ｐＢｌと称する）は、ｐ１７タ
ンパク質のカルボキンル末端の１３個のアミノ酸、全ｐ
２４タンパク質およびｐｌ５タンパク質の５９個のをコ
ードするＤＮＡを含んでいた。大腸菌で発現されたタン
パク質は、期待される分子量とよく一致し、ウエスタン
ブロツティング分析により容易に検出することができた
。
子を含む）は、約１７ＫＤ（ｐｌ７）、２ ４． Ｋ
Ｉ）（ｐ２４）およびＩ ５ＫＤ（ｐｌ ５）の３つの
コアタンパク質をコードしていた。これらのうちで最も
抗原性の高いｐ２４を大腸菌中での発現のために選択し
た。Ｉａｃプロモーターの制御下で翻訳できる位置にて
、ｐ２４遺伝子断片をプラスミドｐＵＣ９（ファルマシ
ア、ビス力夕ウエー、ニュージャージー）中に挿入した
。得られたブラスミド（ｐＢｌと称する）は、ｐ１７タ
ンパク質のカルボキンル末端の１３個のアミノ酸、全ｐ
２４タンパク質およびｐｌ５タンパク質の５９個のをコ
ードするＤＮＡを含んでいた。大腸菌で発現されたタン
パク質は、期待される分子量とよく一致し、ウエスタン
ブロツティング分析により容易に検出することができた
。
他のクローンであるｐ４．ＩＣ（エンベローブ遺伝子の
８４５ｂｐ断片からなり、ＢｇｌｌＩおよびＫｐｎｌ制
限部位を側面に有する）は、ｇｐ＋２０のカルボキンル
末端（４５アミノ酸）および全ｇｐ４ ｔタンパク質を
コードしていた。この遺伝子断片をｐＵｃ９中に挿入し
、」二記ｐ２４の場合と同様にして発現を行った。ウエ
スタンブロソティング分析により、期待された分子量お
よび抗原性が確認された。
８４５ｂｐ断片からなり、ＢｇｌｌＩおよびＫｐｎｌ制
限部位を側面に有する）は、ｇｐ＋２０のカルボキンル
末端（４５アミノ酸）および全ｇｐ４ ｔタンパク質を
コードしていた。この遺伝子断片をｐＵｃ９中に挿入し
、」二記ｐ２４の場合と同様にして発現を行った。ウエ
スタンブロソティング分析により、期待された分子量お
よび抗原性が確認された。
ｇｐｉ ＋およびｐ２４の増殖に用いた宿主細胞は、４
／Ｐ’ｔｒａ Ｄ３ ６、ｐｒｏ ＡＢ， ｌａｃ Ｉ
ｑ Ｚ Ｍ １５）であったしメンソング（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ）ら、Ｍ ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．． Ｉ
Ｏ Ｉ、２ ０ 〜７ ８（１ ９ ８ ３）］。１
ａｃＺ遺伝子を含むベクターは、市販されている（ファ
ルマノア、ピスカタウエー、ニュージーランド）。
／Ｐ’ｔｒａ Ｄ３ ６、ｐｒｏ ＡＢ， ｌａｃ Ｉ
ｑ Ｚ Ｍ １５）であったしメンソング（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ）ら、Ｍ ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．． Ｉ
Ｏ Ｉ、２ ０ 〜７ ８（１ ９ ８ ３）］。１
ａｃＺ遺伝子を含むベクターは、市販されている（ファ
ルマノア、ピスカタウエー、ニュージーランド）。
核酸に関するすべての操作は、マニアナイスらの〃）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、３
〜１７（１９８２）に記載されている。
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、３
〜１７（１９８２）に記載されている。
実施例２
ｇｐ４１およびｐ２４の精製および特徴イｔ ＋Ｊ大腸
菌中で製造したＨＩＶｇｐ４１組換えタンパク質（クロ
ーンｐ４１ｃ）をアフィニティー力ラムおよびイオン交
換クロマトグラフィーにｊこり精製した。細菌溶解肢の
上清を、モノクローナル抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を結合し
たセファロース４Ｂビーズからなるアフィニティー力ラ
ムに通した。
菌中で製造したＨＩＶｇｐ４１組換えタンパク質（クロ
ーンｐ４１ｃ）をアフィニティー力ラムおよびイオン交
換クロマトグラフィーにｊこり精製した。細菌溶解肢の
上清を、モノクローナル抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を結合し
たセファロース４Ｂビーズからなるアフィニティー力ラ
ムに通した。
このカラムを０．５％トリトンＸ−１００のバッファー
で洗浄し、結合したトｒ Ｔ Ｖ ｇｐ４ １を５ＭＮ
ａｌを含有する同バッファーで溶出した。溶出タンパク
質溶液を充分に透析してＮａ［を除き、Ｏ Ｉ％ツイー
ン２０および７Ｍ尿素を含有するバッファ一（バッファ
一Ａ）とｌ：１に混合し、ＤＥＡＥアニオン交換カラム
に加えた。このカラムをバッファ一Ａで充分に洗浄し、
ついでバノファ一Ａ中のＩ Ｏ Ｏ 〜５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ勾配を用いて結合タンパク質を溶出した。ｇｐ４
１活性のピークのフラクションをプールし、透析して尿
素を除いた。
で洗浄し、結合したトｒ Ｔ Ｖ ｇｐ４ １を５ＭＮ
ａｌを含有する同バッファーで溶出した。溶出タンパク
質溶液を充分に透析してＮａ［を除き、Ｏ Ｉ％ツイー
ン２０および７Ｍ尿素を含有するバッファ一（バッファ
一Ａ）とｌ：１に混合し、ＤＥＡＥアニオン交換カラム
に加えた。このカラムをバッファ一Ａで充分に洗浄し、
ついでバノファ一Ａ中のＩ Ｏ Ｏ 〜５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ勾配を用いて結合タンパク質を溶出した。ｇｐ４
１活性のピークのフラクションをプールし、透析して尿
素を除いた。
大腸菌中組換え製造したｐ２４（クローンｐＢＩ）を、
細菌溶解岐の上清をモノクローナル抗Ｈ Ｉ ＶＩ）２
４抗体を結合したセファロース４Ｂビーズからなるアフ
ィニティー力ラムに通ずことにより精製した。このカラ
ムを０．１％トリトンＸ−１００を含有ずるバッファー
で洗浄し、４Ｍ塩酸グアニジン（Ｇ ｕｌ−Ｉ Ｃ Ｉ
）を含有する同バッファーで結合ｐ２４を溶出した。溶
出タンパク質溶肢を充分に透析し、ついで第二のアフィ
ニティーカラムに再び加え、」−記のようにして溶出し
た。ｐ２４のピークのフラクションをプールし、透析し
てＧｕＨＣｌを除いた。
細菌溶解岐の上清をモノクローナル抗Ｈ Ｉ ＶＩ）２
４抗体を結合したセファロース４Ｂビーズからなるアフ
ィニティー力ラムに通ずことにより精製した。このカラ
ムを０．１％トリトンＸ−１００を含有ずるバッファー
で洗浄し、４Ｍ塩酸グアニジン（Ｇ ｕｌ−Ｉ Ｃ Ｉ
）を含有する同バッファーで結合ｐ２４を溶出した。溶
出タンパク質溶肢を充分に透析し、ついで第二のアフィ
ニティーカラムに再び加え、」−記のようにして溶出し
た。ｐ２４のピークのフラクションをプールし、透析し
てＧｕＨＣｌを除いた。
これら組換えタンパク質をさらに特徴付けるため、ソユ
プバッハ（ Ｓ ｃｈｕｐｂａｃｈ）らのＳ ｃｉｅｎ
ｃｅ． ２２４、５０３〜５０５（＋９８４）に記載の
方法に従い、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロ
ッティングに供した。精製エンベロープタンパク質を電
気泳動にかけゲルを染色した後、約３８ＫＤおよび３
６ Ｋ． Ｄの特定のバンドを幾つかの低分子量のバン
ドとともに検出した。これら２つのバンドはｇｐ４ １
に対するヒトボリクローナル抗体おｊ；びマウスモノク
ローナル抗体と非常によく反応した。これら２つのバン
ドのアミノ末端シークエンシングにより、両バンドがｇ
ｐ！２０のカルボキノル末端部分および完全なｇｐ４１
遺伝子産物を含んでいることが示された。
プバッハ（ Ｓ ｃｈｕｐｂａｃｈ）らのＳ ｃｉｅｎ
ｃｅ． ２２４、５０３〜５０５（＋９８４）に記載の
方法に従い、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロ
ッティングに供した。精製エンベロープタンパク質を電
気泳動にかけゲルを染色した後、約３８ＫＤおよび３
６ Ｋ． Ｄの特定のバンドを幾つかの低分子量のバン
ドとともに検出した。これら２つのバンドはｇｐ４ １
に対するヒトボリクローナル抗体おｊ；びマウスモノク
ローナル抗体と非常によく反応した。これら２つのバン
ドのアミノ末端シークエンシングにより、両バンドがｇ
ｐ！２０のカルボキノル末端部分および完全なｇｐ４１
遺伝子産物を含んでいることが示された。
精製コア抗原は、電気泳動しゲル染色した後に主として
約２ ８ Ｋ １）のタンパク質として幾つかの低分子
量のバンドとともに移動した。このバンドは、ｐ２４に
対するヒトボリクローナル抗体およびマウスモノクロー
ナル抗体と非常によく反応した。アミノ末端シークエン
ソングにより、このバンドはｐｌ７タンパク質の一部、
全ｐ２４タンパク質およびｐｌ５タンパク質の一部を含
んでいることが示された。
約２ ８ Ｋ １）のタンパク質として幾つかの低分子
量のバンドとともに移動した。このバンドは、ｐ２４に
対するヒトボリクローナル抗体およびマウスモノクロー
ナル抗体と非常によく反応した。アミノ末端シークエン
ソングにより、このバンドはｐｌ７タンパク質の一部、
全ｐ２４タンパク質およびｐｌ５タンパク質の一部を含
んでいることが示された。
実施例３
ヒト血清中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体および抗１４１Ｖｐ
２４抗体の競合イムノアッセイ 本実施例は、ヒト生物学的試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の
ための２固相検出系からなるイムノアッセイを示す。第
一の固相系は、以下手順に従って構築した。
２４抗体の競合イムノアッセイ 本実施例は、ヒト生物学的試料中の抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体の
ための２固相検出系からなるイムノアッセイを示す。第
一の固相系は、以下手順に従って構築した。
１／４インチポリスチレンヒーズを、よく知られた方法
によりＡＩＤＳ徹者の血清から精製したＨＩＶ抗体で前
以てコーティングした。
によりＡＩＤＳ徹者の血清から精製したＨＩＶ抗体で前
以てコーティングした。
低スピード（約＋０．ＯＯｏｘｇ）遠心分離により清澄
化し１％ＢＳΔ中に希釈したＰ２４細菌溶解液の約１：
ＩＯ００希釈を含む溶肢に上記前以てコーティングした
ビーズをさらすことにより、実施例１に記載したｐ２４
タンパク質を該ビーズに結合させた。ついで、このビー
ズを室温にて２時間インキユベートし、溶液を除き、ビ
ーズを洗浄し、乾燥させた。このｐ２４コーティングビ
ーズをＨ Ｒ Ｐ Ｏ標識抗ＨＩＶｐ２４抗体（ｌ）．
２〜０２ ｕ ９／ｗＱ： ２ ｏ ｏμＱ）、ＡＩＤ
Ｓ患者、ＬＳＡ患者または正常コントロールのいずれか
からの血清試料（５０μの、および０．５Ｍクエン酸ナ
トリウム（ｐｌｉ ７ ． ５ Ｘ２ ０μＱ）と接触
させた。この混合物を１５〜４５℃の温度範囲にて１〜
２４時間、好ましくは１６〜２２時間インキュベ−１−
１，た。
化し１％ＢＳΔ中に希釈したＰ２４細菌溶解液の約１：
ＩＯ００希釈を含む溶肢に上記前以てコーティングした
ビーズをさらすことにより、実施例１に記載したｐ２４
タンパク質を該ビーズに結合させた。ついで、このビー
ズを室温にて２時間インキユベートし、溶液を除き、ビ
ーズを洗浄し、乾燥させた。このｐ２４コーティングビ
ーズをＨ Ｒ Ｐ Ｏ標識抗ＨＩＶｐ２４抗体（ｌ）．
２〜０２ ｕ ９／ｗＱ： ２ ｏ ｏμＱ）、ＡＩＤ
Ｓ患者、ＬＳＡ患者または正常コントロールのいずれか
からの血清試料（５０μの、および０．５Ｍクエン酸ナ
トリウム（ｐｌｉ ７ ． ５ Ｘ２ ０μＱ）と接触
させた。この混合物を１５〜４５℃の温度範囲にて１〜
２４時間、好ましくは１６〜２２時間インキュベ−１−
１，た。
このビーズを蒸留水（５ ｘｆｆ）で３回洗浄して未結
合の試料および未結合の標識抗体を除いた。この洗浄ビ
ーズを０−フェニレンジアミンの過酸化水素溶液（３０
０μのと接触させると、西洋ワザビペルオキシダーゼの
存在下で黄色の生成物を生成する。室温にて約３０分間
インキユベートした後、Ｉ Ｎ Ｈｉｓ ０４（ＩＪ’
ｌ１２）を加えて色生成をストップさせた。コントロー
ル（抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を含まない）に比べて約５０％の
色（４９２ｎｍにおける吸光度）の減少を示した試料は
陽性の結果とした。
合の試料および未結合の標識抗体を除いた。この洗浄ビ
ーズを０−フェニレンジアミンの過酸化水素溶液（３０
０μのと接触させると、西洋ワザビペルオキシダーゼの
存在下で黄色の生成物を生成する。室温にて約３０分間
インキユベートした後、Ｉ Ｎ Ｈｉｓ ０４（ＩＪ’
ｌ１２）を加えて色生成をストップさせた。コントロー
ル（抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を含まない）に比べて約５０％の
色（４９２ｎｍにおける吸光度）の減少を示した試料は
陽性の結果とした。
ビーズを抗ＨＩＶｇｐ４１で前以てコーティングし、つ
いでｇｐ４ １を含む（１％ＢＳＡ中に約１５０希釈）
細菌溶解液をオーバーコーディングすることに上り、上
記手順に従って第二の固相系を構築した。ｇｐ４１をコ
ーティングしたビーズを、ＨＲＰＯ標識抗Ｈ Ｔ Ｖ
ｇｐ４ １（ｌ）．２〜１ ５μ２／叶：２００μＱ）
、ＡＩＤＳ患者、ＬＡＳ患者または正常コントロールの
いずれかからの血清試料（５０μＱ）および０．５Ｍク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７．５；２０７ｌｆ！）と接触
させた。インキュベーンヨン、色生成、および吸光度の
計算を上記と同様に行っ ノこ。
いでｇｐ４ １を含む（１％ＢＳＡ中に約１５０希釈）
細菌溶解液をオーバーコーディングすることに上り、上
記手順に従って第二の固相系を構築した。ｇｐ４１をコ
ーティングしたビーズを、ＨＲＰＯ標識抗Ｈ Ｔ Ｖ
ｇｐ４ １（ｌ）．２〜１ ５μ２／叶：２００μＱ）
、ＡＩＤＳ患者、ＬＡＳ患者または正常コントロールの
いずれかからの血清試料（５０μＱ）および０．５Ｍク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７．５；２０７ｌｆ！）と接触
させた。インキュベーンヨン、色生成、および吸光度の
計算を上記と同様に行っ ノこ。
各検出系において、目的の抗体（ＨＩＶｐ２４に対する
血清抗体および｝Ｉ Ｉ Ｖ ｇｐ４１に対する血清抗
体）は、コーティングピーズ上の多数の結合部位につい
で対応ずる標識抗体（Ｉ｛ＲＰＯ標識抗ＨＩＶｐ２４抗
体およびＨＲＰＯ標識抗Ｈ Ｔ Ｖｇｐ’ｌ Ｉ抗体）
と競合した。それゆえ、各検出系において発色した色の
強度は、試料中の抗ＨＩＶ ｇｐａｌ抗体および抗１−
ＩＴＶｐ２４抗体の量と逆の相関関係を有していた。い
ずれかの検出系、または両検出系における陽性の反応は
、血清試料中の抗１−１ １ Ｖ抗体の試験が陽性であ
ることを示していた。
血清抗体および｝Ｉ Ｉ Ｖ ｇｐ４１に対する血清抗
体）は、コーティングピーズ上の多数の結合部位につい
で対応ずる標識抗体（Ｉ｛ＲＰＯ標識抗ＨＩＶｐ２４抗
体およびＨＲＰＯ標識抗Ｈ Ｔ Ｖｇｐ’ｌ Ｉ抗体）
と競合した。それゆえ、各検出系において発色した色の
強度は、試料中の抗ＨＩＶ ｇｐａｌ抗体および抗１−
ＩＴＶｐ２４抗体の量と逆の相関関係を有していた。い
ずれかの検出系、または両検出系における陽性の反応は
、血清試料中の抗１−１ １ Ｖ抗体の試験が陽性であ
ることを示していた。
組換えｇｐ４１アッセイで試験したときは、３０のＡ
ｔ Ｄ Ｓ 叡者の血清のうち３０が陽性とされ、一方
、正常なコントロール群からの３０の血清からは陽性が
みられなかった。組換えｐ２４ア・ノセＨＩＶｐ２４に
対する抗体を検出する本発明の第一の検出系ではＡＩＤ
Ｓ患者の４１の試料のうち１０の試料が陽性であったが
、ＨＩＶｇｐ４１に対する抗体を検出する本発明の第二
の検出系を用いると９１のすべての試料が陽性であった
。いずれかの検出系または両検出系における陽性反応は
陽性の結果を示すので、すべての試料は本発明のアッセ
イ法により陽性とされた。ＬＡＳ患者からの６２のすべ
ての試料は、アッセイＡ，ＢおよびＣを用いた試験に上
り陽性であった。
ｔ Ｄ Ｓ 叡者の血清のうち３０が陽性とされ、一方
、正常なコントロール群からの３０の血清からは陽性が
みられなかった。組換えｐ２４ア・ノセＨＩＶｐ２４に
対する抗体を検出する本発明の第一の検出系ではＡＩＤ
Ｓ患者の４１の試料のうち１０の試料が陽性であったが
、ＨＩＶｇｐ４１に対する抗体を検出する本発明の第二
の検出系を用いると９１のすべての試料が陽性であった
。いずれかの検出系または両検出系における陽性反応は
陽性の結果を示すので、すべての試料は本発明のアッセ
イ法により陽性とされた。ＬＡＳ患者からの６２のすべ
ての試料は、アッセイＡ，ＢおよびＣを用いた試験に上
り陽性であった。
Ｘ夜鯉ｉ
実施例３のアッセイとウエスタンブロッティング法との
比較： 抗Ｔ｛ Ｉ Ｖ抗体のための市販の酵素イムノアッセイ
（アボット・ラボラトリーズ、アボット・パーイで試験
したときは、ＡＩＤＳ患者血清のうち９が陽性であり、
２９のＡＲＣ患者の血清のうち２１が陽性とされた。
比較： 抗Ｔ｛ Ｉ Ｖ抗体のための市販の酵素イムノアッセイ
（アボット・ラボラトリーズ、アボット・パーイで試験
したときは、ＡＩＤＳ患者血清のうち９が陽性であり、
２９のＡＲＣ患者の血清のうち２１が陽性とされた。
実施例４
実施例３のアッセイと従来の抗１−Ｔ Ｉ Ｖ抗体スク
リニングアッセイとの比較 ＡＩＤＳ患者、リンパ節障害症候群（ＬＡＳ）患者およ
び正常物からの血清試料を、実施例３のアッセイ（第１
表におけるアッセイＡ）、細胞培養から得られたＨＩＶ
抗原を用いた抗１−１ １ Ｖ抗体のための市販の酵素
イムノアッセイ（アボット・ラホラトリーズ、アボソト
・パーク、イリノイ：第１表におけるアッセイＢ）、お
よびウエスタンブロツティング法（第１表にお１′３る
アッセイＣ）による試験に供した。第１表に示した結果
によれば、アッセイＡおよびアッセイＢ法を用いた試験
では９１のすべてのＡＩＤＳ患者の血清が陽性反応を示
したのに対し、ウエスタンブロッティング法を用いた試
験では９１の試料のうち９０が陽性反応を示した。
リニングアッセイとの比較 ＡＩＤＳ患者、リンパ節障害症候群（ＬＡＳ）患者およ
び正常物からの血清試料を、実施例３のアッセイ（第１
表におけるアッセイＡ）、細胞培養から得られたＨＩＶ
抗原を用いた抗１−１ １ Ｖ抗体のための市販の酵素
イムノアッセイ（アボット・ラホラトリーズ、アボソト
・パーク、イリノイ：第１表におけるアッセイＢ）、お
よびウエスタンブロツティング法（第１表にお１′３る
アッセイＣ）による試験に供した。第１表に示した結果
によれば、アッセイＡおよびアッセイＢ法を用いた試験
では９１のすべてのＡＩＤＳ患者の血清が陽性反応を示
したのに対し、ウエスタンブロッティング法を用いた試
験では９１の試料のうち９０が陽性反応を示した。
ク、イリノイ）において繰り返し反応性であった血肢提
供者からの血清または血漿試料を、本発明のアッセイ法
およびウエスタンブロツティング法により試験した。そ
の結果を第２表に示す。全部で３５１の繰り返し反応性
の試料のうち、２３２がウエスタンブロッティング法を
用いて陰性であり、２３２が実施例３の二重検出系を用
いて陰性であった。ウエスタンブロッティング分析にお
いては不確定の反応を示した１つの試料は、実施例３の
アッセイでは陽性であり、両検出系において反応性であ
った。ウエスタンブロッティング法において陽性である
ことが確認された１１８の試料についでは、抗ｇｐ４１
検出系において陰性であった３つの試料は抗ｐ２４抗体
検出系において陽性であったので、１１８のすべての試
料もまた実施例３のアッセイを用いて陽性であった。
供者からの血清または血漿試料を、本発明のアッセイ法
およびウエスタンブロツティング法により試験した。そ
の結果を第２表に示す。全部で３５１の繰り返し反応性
の試料のうち、２３２がウエスタンブロッティング法を
用いて陰性であり、２３２が実施例３の二重検出系を用
いて陰性であった。ウエスタンブロッティング分析にお
いては不確定の反応を示した１つの試料は、実施例３の
アッセイでは陽性であり、両検出系において反応性であ
った。ウエスタンブロッティング法において陽性である
ことが確認された１１８の試料についでは、抗ｇｐ４１
検出系において陰性であった３つの試料は抗ｐ２４抗体
検出系において陽性であったので、１１８のすべての試
料もまた実施例３のアッセイを用いて陽性であった。
？尖■（ウエスタンブロッティング法と実施例３のアソ
（注）＊Ｉ．検出アッセイのいずれかまたは両方で陽性 ＊２：アッセイｌで陽性（抗ｐ２４抗体）＊３・アッセ
イ２で陽性（抗ｇｐ４１抗体）抗Ｈ ｒ Ｖ抗体につい
で陽性の生物学的試料を同定ずることは、ヒトの血液提
供を保護する上で重要である。上記結果は、現在用いら
れているスクリーニングアッセイを用いたときに得られ
る有為数の偽陽性を、本発明のアッセイ法を用いること
により防ぐことができることを示している。本発明のア
ッセイにより、操作の厄介さや主観的解釈といったウエ
スタノブロツティング法に付随する問題点を回避しなが
ら、真の陽性試料を検出するためにウエスタンブロッテ
ィング法と同じ性能て一層特異的なスクリーニング広が
可能となる。
（注）＊Ｉ．検出アッセイのいずれかまたは両方で陽性 ＊２：アッセイｌで陽性（抗ｐ２４抗体）＊３・アッセ
イ２で陽性（抗ｇｐ４１抗体）抗Ｈ ｒ Ｖ抗体につい
で陽性の生物学的試料を同定ずることは、ヒトの血液提
供を保護する上で重要である。上記結果は、現在用いら
れているスクリーニングアッセイを用いたときに得られ
る有為数の偽陽性を、本発明のアッセイ法を用いること
により防ぐことができることを示している。本発明のア
ッセイにより、操作の厄介さや主観的解釈といったウエ
スタノブロツティング法に付随する問題点を回避しなが
ら、真の陽性試料を検出するためにウエスタンブロッテ
ィング法と同じ性能て一層特異的なスクリーニング広が
可能となる。
実施例６
初期Ｈ Ｉ Ｖ感染の血清学的マーカーを検出するため
の実施例３のアッセイの使用 この研究には、Ｈ Ｉ Ｖ感染の初期段階における２群
の血友病患者集団が含まれていた。第一の１ｉ′丁は、
Ｈ Ｉ Ｖ感染についで血清陰性と試験された２４人の
患者からなっており、第二の群は、以前は血清陰性と試
験されたが抗１−１ １ Ｖ抗体の検出のための標準Ｅ
Ｌ Ｔ ＳＡスクリーニングアッセイ（アボット・ラボ
ラトリーズ、アボット・パーク、イリノイ）を用いた最
後の所定のアッセイでは＋ｆ＋ｔ Ｍ？陽性と変更され
た１６人の患者からなっていノこ。
の実施例３のアッセイの使用 この研究には、Ｈ Ｉ Ｖ感染の初期段階における２群
の血友病患者集団が含まれていた。第一の１ｉ′丁は、
Ｈ Ｉ Ｖ感染についで血清陰性と試験された２４人の
患者からなっており、第二の群は、以前は血清陰性と試
験されたが抗１−１ １ Ｖ抗体の検出のための標準Ｅ
Ｌ Ｔ ＳＡスクリーニングアッセイ（アボット・ラボ
ラトリーズ、アボット・パーク、イリノイ）を用いた最
後の所定のアッセイでは＋ｆ＋ｔ Ｍ？陽性と変更され
た１６人の患者からなっていノこ。
第一の検出可能なＨ Ｔ Ｖマーカーおよび該検出可能
なマーカーのその後の経時変化を評価するために、患者
を１〜６箇月の間隔で２年にわたってアソセイした。検
出可能なマーカーの特異的試験には、Ｉ｛ ｒ Ｖ抗原
の検出のためのアッセイである実施例３のアッセイ（ア
ボット・ラボラトリーズ、アボット・パーク、イリノイ
）および抗１−１ １ Ｖ抗体の検出のためのウエスタ
ンブロソティング法を用いた、Ｉ−ｒ Ｉ Ｖエンベロ
ープタンパク質であるｇｐ４１に対する特異的抗体およ
び１−１ １ Ｖコアタンパク質であるｐ２４に対する
特異的抗体のためのアッセイが含まれていた。
なマーカーのその後の経時変化を評価するために、患者
を１〜６箇月の間隔で２年にわたってアソセイした。検
出可能なマーカーの特異的試験には、Ｉ｛ ｒ Ｖ抗原
の検出のためのアッセイである実施例３のアッセイ（ア
ボット・ラボラトリーズ、アボット・パーク、イリノイ
）および抗１−１ １ Ｖ抗体の検出のためのウエスタ
ンブロソティング法を用いた、Ｉ−ｒ Ｉ Ｖエンベロ
ープタンパク質であるｇｐ４１に対する特異的抗体およ
び１−１ １ Ｖコアタンパク質であるｐ２４に対する
特異的抗体のためのアッセイが含まれていた。
その結果は、血清変換の前に４０人の患者のうち１４人
（３５％）がＨ Ｔ Ｖ抗原についで陽性であることを
示していた。６例においてはＨＩＶ抗原が唯一の検出可
能なマーカーであり、標準ＥＬＩＳＡ法により抗１−１
Ｔ Ｖ抗体についで陰性であった１−Ｉ Ｉ Ｖ抗原
陽性の別の３例においては、実施例３のアッセイ法（抗
ｇｐ４１抗体）およびウエスタンプロツティング法によ
り抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を検出することができた。このデー
タは、実施例３のアッセイが初期段階のＨ Ｔ Ｖ感染
における抗１−１ １ Ｖ抗体を検出するのに用いるこ
とができることを示している。
（３５％）がＨ Ｔ Ｖ抗原についで陽性であることを
示していた。６例においてはＨＩＶ抗原が唯一の検出可
能なマーカーであり、標準ＥＬＩＳＡ法により抗１−１
Ｔ Ｖ抗体についで陰性であった１−Ｉ Ｉ Ｖ抗原
陽性の別の３例においては、実施例３のアッセイ法（抗
ｇｐ４１抗体）およびウエスタンプロツティング法によ
り抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体を検出することができた。このデー
タは、実施例３のアッセイが初期段階のＨ Ｔ Ｖ感染
における抗１−１ １ Ｖ抗体を検出するのに用いるこ
とができることを示している。
実施例７
標識抗ヒト抗体を用いた抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗Ｉ
１ １ Ｖ ｇｐ４１抗体の検出のためのイムノアｙセ
イ 本実施例では、ヒト生物学的試料中の抗１−Ｉ Ｔ Ｖ
抗体のための２固相検出系からなるイムノアッセイを記
載する。第一の固相系を以下の手順で構築した。
１ １ Ｖ ｇｐ４１抗体の検出のためのイムノアｙセ
イ 本実施例では、ヒト生物学的試料中の抗１−Ｉ Ｔ Ｖ
抗体のための２固相検出系からなるイムノアッセイを記
載する。第一の固相系を以下の手順で構築した。
実施例２に記載した精製ｐ２４タンパク質（約０１〜０
．５μｇ／ｍ（１）を含有ずる溶液にＩ／４インヂのポ
リスチレンビーズをさらすことにより、該精製ｐ２４タ
ンパク質を該ビーズ−１二に直接コーティングした。こ
のビーズを４０℃で２時間インキコベートし、溶液を除
いた。このビーズを１％１３ＳＡ溶液中でさらにインキ
ユベートし、溶液を除き、ビーズを洗浄し、乾燥させた
。このｐ２４をコーティングしたビーズを、ヤギ血清、
仔ウノ血清および大腸菌（．ＩＭ＋０３）溶解物を含有
し希釈液中で１：４０に希釈した患者試料（２００μｇ
）と接触た。この混合物を４０°Ｃにて３０分〜１時間
インキユベートした。このビーズを蒸留水（５ｍので３
回洗浄し、ついでＩ−Ｉ Ｒ Ｐ Ｏに結合したアフィ
ニティー精製ヤギ抗ヒト抗体（２００μ１２）とともに
４０℃にて１／２時間〜２時間インキユベートした。
．５μｇ／ｍ（１）を含有ずる溶液にＩ／４インヂのポ
リスチレンビーズをさらすことにより、該精製ｐ２４タ
ンパク質を該ビーズ−１二に直接コーティングした。こ
のビーズを４０℃で２時間インキコベートし、溶液を除
いた。このビーズを１％１３ＳＡ溶液中でさらにインキ
ユベートし、溶液を除き、ビーズを洗浄し、乾燥させた
。このｐ２４をコーティングしたビーズを、ヤギ血清、
仔ウノ血清および大腸菌（．ＩＭ＋０３）溶解物を含有
し希釈液中で１：４０に希釈した患者試料（２００μｇ
）と接触た。この混合物を４０°Ｃにて３０分〜１時間
インキユベートした。このビーズを蒸留水（５ｍので３
回洗浄し、ついでＩ−Ｉ Ｒ Ｐ Ｏに結合したアフィ
ニティー精製ヤギ抗ヒト抗体（２００μ１２）とともに
４０℃にて１／２時間〜２時間インキユベートした。
このビーズを再び洗浄し、実施例３に記載のようにＯ
Ｐ Ｄ基質溶肢（３００ｌ１０．）と接触させた。
Ｐ Ｄ基質溶肢（３００ｌ１０．）と接触させた。
第二の固相系についでも、精製ｇｐ４ １を０．０５〜
０ ３μ９／ｒｓＱのタンパク質濃度でビーズに直接コ
ーティングした他は上記手順に従って構築した。抗ｇｐ
４１抗体アッセイプロトコールは、抗ｐ２４抗体アッセ
イについでの上記に従った。
０ ３μ９／ｒｓＱのタンパク質濃度でビーズに直接コ
ーティングした他は上記手順に従って構築した。抗ｇｐ
４１抗体アッセイプロトコールは、抗ｐ２４抗体アッセ
イについでの上記に従った。
各検出系において、目的の抗体（ＨＩＶｐ２４に対する
血清抗体およびＨＩＶｇｐ４１に対する血清抗体）は、
対応ずる抗原コーティングビーズに結合する。これらの
結合抗体は、ヤギ抗ヒト抗体結合体を用いて検出される
。それゆえ、各検出系で発色した色の強度は、試籾中の
抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４１抗体および抗ＨＩＶｐ２４
抗体の量に直接相関する範囲内のものであった。いずれ
かの検出系または両検出系における陽性反応は、血清試
料中の抗１−１ １ Ｖ抗体についで陽性であることを
示していた。
血清抗体およびＨＩＶｇｐ４１に対する血清抗体）は、
対応ずる抗原コーティングビーズに結合する。これらの
結合抗体は、ヤギ抗ヒト抗体結合体を用いて検出される
。それゆえ、各検出系で発色した色の強度は、試籾中の
抗１−１ １ Ｖ ｇｐ４１抗体および抗ＨＩＶｐ２４
抗体の量に直接相関する範囲内のものであった。いずれ
かの検出系または両検出系における陽性反応は、血清試
料中の抗１−１ １ Ｖ抗体についで陽性であることを
示していた。
上記アッセイ態様は、ｐ２４およびｇｐ４１タンパク質
を同じ固相支持体上にコーティングずることにより変更
することができる。この変更アッセイにおいては、精製
ｐ２４（ｌ）．１−０．５μＬ’＊（２）および精製ｇ
ｐ４１（ｌ）．０５〜０ ３μｇ／１１（！）を含む溶
液にビーズをさらすことにより、ｐ２４およびｇｐ４１
の両情製タンパク質てビーズを同１１４ｊに＝！ーティ
ングした。ビーズのコーティングおよびアッセイ手順に
ついでは、他の点に関し」二記と同様であった。これら
のビーズを用いることにより、」二記Ｈ Ｔ − ９細
胞中で増殖させた全ウイルス溶解物を用いたＥＬｌ．Ｓ
Ａ抗Ｈ Ｉ Ｖスクリーニング試験などの従来の抗Ｈ
Ｉ Ｖ抗体試験に比べて、感度が有為に向」ニした抗ｇ
ｐ４ １抗体および抗ｐ２４抗体の検出が可能となった
（第３表参照）。なお第３表中の数値は、抗Ｈ Ｔ Ｖ
抗体陽性血清の終点希釈の逆数を示ず。
を同じ固相支持体上にコーティングずることにより変更
することができる。この変更アッセイにおいては、精製
ｐ２４（ｌ）．１−０．５μＬ’＊（２）および精製ｇ
ｐ４１（ｌ）．０５〜０ ３μｇ／１１（！）を含む溶
液にビーズをさらすことにより、ｐ２４およびｇｐ４１
の両情製タンパク質てビーズを同１１４ｊに＝！ーティ
ングした。ビーズのコーティングおよびアッセイ手順に
ついでは、他の点に関し」二記と同様であった。これら
のビーズを用いることにより、」二記Ｈ Ｔ − ９細
胞中で増殖させた全ウイルス溶解物を用いたＥＬｌ．Ｓ
Ａ抗Ｈ Ｉ Ｖスクリーニング試験などの従来の抗Ｈ
Ｉ Ｖ抗体試験に比べて、感度が有為に向」ニした抗ｇ
ｐ４ １抗体および抗ｐ２４抗体の検出が可能となった
（第３表参照）。なお第３表中の数値は、抗Ｈ Ｔ Ｖ
抗体陽性血清の終点希釈の逆数を示ず。
実施例８
標識組換えｇｐ４．Ｉおよびｐ２４を用いた抗Ｈ Ｉ
Ｖｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の検出のため
のザンドイッヂイムノアソセイ： 実施例７に記載したように精製組換えｇｐ４１またはｐ
２４または両者をコーティングしたビーズを固相として
用いた。これらのビーズを、血清試料（２００μＱ）、
および非イオン性界面活性剤および犬腸菌ＪＭ］０３溶
解物を含む試料添加溶肢（２０μｇ）と１５〜４０℃に
て３０分間接触させた。ビーズを蒸留水で洗浄し、つい
でビオヂンおよびヒオヂン化精製ｐ２４に対するＨ Ｒ
Ｐ Ｏ標識抗体（抗ｐ２４抗体アッセイのため）、ビ
オチンおよびビオヂン化精製ｇｐ４１に対するＨ Ｒ
Ｐ Ｏ標識抗体（抗ｇＰ４ １抗体アソセイのため）ま
たは抗Ｈ １■抗体アソセイのためにビオヂンおよびビ
オヂン化精製ｇｐ４１およびｐ２４に対するＨ Ｒ Ｐ
Ｏ標識抗体を含む溶液（２００７ｌＱ）と接触させた
。適当なビーズを対応する結合溶液とともに４０℃にて
３０分〜２時間インキユヘートし、ついで蒸留水で洗浄
し、実施例３に記載のように基質と反応させた。別のや
り方として、試料および結合溶液をビーズに同時に加え
ることにより１つのインキュヘーノヨン工程および１つ
の洗洋工程を省略することができる。各検出系において
、目的の抗体（ＨＩＶｐ２４に対する血清抗体、Ｉ−Ｉ
Ｉ Ｖ ｇｐ４ １に対する血清抗体、またはｇｐ４
１またはｐ２４のいずれかまたは両方に対する血清抗
体）は、ビーズ上にコーティングされた抗原を結合溶液
中の対応標識抗原を架橋する。ｐ２４検出系またはｇｐ
７Ｉ＋検出系のいずれかまたは両検出系における陽性反
応、または同じ固相支持体」−のｐ２４およびｇｐ４１
を用いたアッセイにおける陽性反応は、血清試料中の抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体についで陽性であることを示す。後者の
抗ＨＩＶアッセイの感度は第３表に示してあり、従来の
抗Ｈ Ｉ Ｖ試験に比べて有為に良好であることがわか
る。
Ｖｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の検出のため
のザンドイッヂイムノアソセイ： 実施例７に記載したように精製組換えｇｐ４１またはｐ
２４または両者をコーティングしたビーズを固相として
用いた。これらのビーズを、血清試料（２００μＱ）、
および非イオン性界面活性剤および犬腸菌ＪＭ］０３溶
解物を含む試料添加溶肢（２０μｇ）と１５〜４０℃に
て３０分間接触させた。ビーズを蒸留水で洗浄し、つい
でビオヂンおよびヒオヂン化精製ｐ２４に対するＨ Ｒ
Ｐ Ｏ標識抗体（抗ｐ２４抗体アッセイのため）、ビ
オチンおよびビオヂン化精製ｇｐ４１に対するＨ Ｒ
Ｐ Ｏ標識抗体（抗ｇＰ４ １抗体アソセイのため）ま
たは抗Ｈ １■抗体アソセイのためにビオヂンおよびビ
オヂン化精製ｇｐ４１およびｐ２４に対するＨ Ｒ Ｐ
Ｏ標識抗体を含む溶液（２００７ｌＱ）と接触させた
。適当なビーズを対応する結合溶液とともに４０℃にて
３０分〜２時間インキユヘートし、ついで蒸留水で洗浄
し、実施例３に記載のように基質と反応させた。別のや
り方として、試料および結合溶液をビーズに同時に加え
ることにより１つのインキュヘーノヨン工程および１つ
の洗洋工程を省略することができる。各検出系において
、目的の抗体（ＨＩＶｐ２４に対する血清抗体、Ｉ−Ｉ
Ｉ Ｖ ｇｐ４ １に対する血清抗体、またはｇｐ４
１またはｐ２４のいずれかまたは両方に対する血清抗
体）は、ビーズ上にコーティングされた抗原を結合溶液
中の対応標識抗原を架橋する。ｐ２４検出系またはｇｐ
７Ｉ＋検出系のいずれかまたは両検出系における陽性反
応、または同じ固相支持体」−のｐ２４およびｇｐ４１
を用いたアッセイにおける陽性反応は、血清試料中の抗
Ｈ Ｉ Ｖ抗体についで陽性であることを示す。後者の
抗ＨＩＶアッセイの感度は第３表に示してあり、従来の
抗Ｈ Ｉ Ｖ試験に比べて有為に良好であることがわか
る。
（以下余白）
（注’）＊ Ｉ ：ＥＬ Ｉ ＳＡ抗Ｈ ｒ Ｖ抗体ア
ッセイ＊２実施例７の組換え法に基づく抗ＨＩＶ抗体ア
ッセイ ＊３：実施例８の紹換え法に基づく抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体ザ
ンドイッチアッセイ 実施例９ ＨＩＶｐ２４およびｇｐ４１に対する抗体のイムノアッ
セイ 本発明の他の態様において、２つの検出系を異なる態様
で用いた。第一の検出系において、固相を抗ＨＩＶｐ２
４抗体でコーティングし、ついであった。第二の検出系
（すなわち抗ｇｐ４１抗体の検出系）においても、すべ
ての試料は抗ｇｐ４ １抗体についで陰性であった。
ッセイ＊２実施例７の組換え法に基づく抗ＨＩＶ抗体ア
ッセイ ＊３：実施例８の紹換え法に基づく抗Ｈ Ｉ Ｖ抗体ザ
ンドイッチアッセイ 実施例９ ＨＩＶｐ２４およびｇｐ４１に対する抗体のイムノアッ
セイ 本発明の他の態様において、２つの検出系を異なる態様
で用いた。第一の検出系において、固相を抗ＨＩＶｐ２
４抗体でコーティングし、ついであった。第二の検出系
（すなわち抗ｇｐ４１抗体の検出系）においても、すべ
ての試料は抗ｇｐ４ １抗体についで陰性であった。
寒上衆（実施例３のアッセイおよび実施例９の感度を決
定するために、臨床病歴、ウェスタンブロツティング法
および他のスクリーニングアッセイによりＨ Ｉ Ｖに
対する抗体を有していることがわかっている患者からの
Ｉ１の試料のパネルを、試料の一連の希釈肢を用いて試
験した。第５表および第６表に示した結果は、第一の検
出系においてはわずかに何人かの患者のみが抗ｐ２４抗
体を有していることを示していた。しかしながら、実施
例９のアッセイにより抗ｐ２４抗体についで有為に高い
終点希釈が得られ、感度が優れていることを示していた
。第二の検出系においては、ｌ１生物学的試料および組
換えｐ２４にさらした。沈浄工程の後、固相を標識抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体と接触させて結合したｐ２４の量を検出
した。結合したｐ２４が存在しないことは、試料中に抗
ＨＩＶｐ２４抗体が存在することを示していた。
定するために、臨床病歴、ウェスタンブロツティング法
および他のスクリーニングアッセイによりＨ Ｉ Ｖに
対する抗体を有していることがわかっている患者からの
Ｉ１の試料のパネルを、試料の一連の希釈肢を用いて試
験した。第５表および第６表に示した結果は、第一の検
出系においてはわずかに何人かの患者のみが抗ｐ２４抗
体を有していることを示していた。しかしながら、実施
例９のアッセイにより抗ｐ２４抗体についで有為に高い
終点希釈が得られ、感度が優れていることを示していた
。第二の検出系においては、ｌ１生物学的試料および組
換えｐ２４にさらした。沈浄工程の後、固相を標識抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体と接触させて結合したｐ２４の量を検出
した。結合したｐ２４が存在しないことは、試料中に抗
ＨＩＶｐ２４抗体が存在することを示していた。
第二の検出系においては、固相を抗ＨＩＶｇｐ４１抗体
でコーティングし、ついで生物学的試料および組換えｇ
ｐ４１にさらした。洗浄工程の後、固相を標識抗ＨＩＶ
ｇｐ４１抗体と接触させて結合したｇＰ４１の量を検出
した。結合したｇｐ’Ｉ １が存在しないことは、試料
中に抗Ｔ−［ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １抗体が存在ずること
を示していた。
でコーティングし、ついで生物学的試料および組換えｇ
ｐ４１にさらした。洗浄工程の後、固相を標識抗ＨＩＶ
ｇｐ４１抗体と接触させて結合したｇＰ４１の量を検出
した。結合したｇｐ’Ｉ １が存在しないことは、試料
中に抗Ｔ−［ Ｉ Ｖ ｇｐ４ １抗体が存在ずること
を示していた。
実施例３のアッセイおよび実施例９のアッセイについで
特異性および感度を試験した。特異性を決定するために
、Ｈ Ｉ Ｖへの暴露についでの知られた危険因子を有
しない血液提イ』（者の集団を両アッセイを用いて試験
した。その結果を第４表に示す。
特異性および感度を試験した。特異性を決定するために
、Ｈ Ｉ Ｖへの暴露についでの知られた危険因子を有
しない血液提イ』（者の集団を両アッセイを用いて試験
した。その結果を第４表に示す。
実施例３および実施例９の両実施例の第一の検出系（す
なわち抗ｐ２４抗体の検出系）において、ケベての試料
はｐ２４に対する抗体についで陰虹てのずべての試料が
実施例３のアッセイおよび実施例９のアッセイの両方に
おいて陽性であると検出された。しかしながら、実施例
９のアッセイにより抗ｇｐ４１抗体についで有為に高い
終点希釈が得られ、感度が優れていることを示していた
。なお第５表および第６表において、数値は実ｊ血例３
のアッセイおよび実施例９のアッセイにより試験した患
者の終点希釈の逆数を示ず。
なわち抗ｐ２４抗体の検出系）において、ケベての試料
はｐ２４に対する抗体についで陰虹てのずべての試料が
実施例３のアッセイおよび実施例９のアッセイの両方に
おいて陽性であると検出された。しかしながら、実施例
９のアッセイにより抗ｇｐ４１抗体についで有為に高い
終点希釈が得られ、感度が優れていることを示していた
。なお第５表および第６表において、数値は実ｊ血例３
のアッセイおよび実施例９のアッセイにより試験した患
者の終点希釈の逆数を示ず。
（注）Ｎ ：陰性
ＮＤ：決定せず
実施例１０（酵素イムノアッセイ）
本実施例では、１０価免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に対
する増大した感度により抗ＨＩＶ抗体の初期検出が可能
になった酵素イムノアッセイ法を記載ずる。
する増大した感度により抗ＨＩＶ抗体の初期検出が可能
になった酵素イムノアッセイ法を記載ずる。
Ｈ Ｉ Ｖ − １感染後、徹者により異なる期間の間
、患者血漿中でウイルス抗原を検出することができる。
、患者血漿中でウイルス抗原を検出することができる。
感染後の期間にわたって、抗原の力価は、ＨＩＶ−１に
対する抗体が産生されるにつれて同時に減少していく。
対する抗体が産生されるにつれて同時に減少していく。
従来の抗Ｈ ｒ Ｖ − １抗体アッセイの感度は、感
染と抗体の検出との間に期間（血清変換）があるもので
ある。循環しているＨ Ｉ ＶＩ抗原レベルを測定して
も、この期間を短くすることができても完全になくずこ
とはできない、それゆえ、ＨＩＶ−１に感染した患者が
、感染後の危険な期間にＨＩＶ抗原および抗ＨＩＶ−１
抗体の両方とも検出されないことがあり得る。
染と抗体の検出との間に期間（血清変換）があるもので
ある。循環しているＨ Ｉ ＶＩ抗原レベルを測定して
も、この期間を短くすることができても完全になくずこ
とはできない、それゆえ、ＨＩＶ−１に感染した患者が
、感染後の危険な期間にＨＩＶ抗原および抗ＨＩＶ−１
抗体の両方とも検出されないことがあり得る。
本実施例のアッセイ態様は、従来の抗Ｈ Ｉ Ｖｌ抗体
アッセイに比べて抗Ｈ Ｉ Ｖ − １抗体の早期の検
出を可能にするものである。ボリマー１８Ｍの場合には
、本実施例のアッセイ態様は、単一結合Ｉ．ｇＭ分子に
より複数の抗原結合分子を捕捉することができ、その結
果、結合する酵素が増大し、ＩｇＭに対する感度が向上
ずる（第１図）。ＩｇＭは、感染への初期応答の主要戊
分であることが観察されている。加えて、アッセイにお
ける反応性のために二重の特異性が必要であることから
、従来の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡｓ）に比べて特異
性を損なうことなく大量の使用が可能となる。
アッセイに比べて抗Ｈ Ｉ Ｖ − １抗体の早期の検
出を可能にするものである。ボリマー１８Ｍの場合には
、本実施例のアッセイ態様は、単一結合Ｉ．ｇＭ分子に
より複数の抗原結合分子を捕捉することができ、その結
果、結合する酵素が増大し、ＩｇＭに対する感度が向上
ずる（第１図）。ＩｇＭは、感染への初期応答の主要戊
分であることが観察されている。加えて、アッセイにお
ける反応性のために二重の特異性が必要であることから
、従来の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡｓ）に比べて特異
性を損なうことなく大量の使用が可能となる。
本アッセイの基−本原理によれば、固相上にコーティン
グした抗原を用い、患者血−清中に存在する抗体を特異
的に結合させる。これらの抗体を、ついで酵素に結合し
た抗原に特異的に結合させる。
グした抗原を用い、患者血−清中に存在する抗体を特異
的に結合させる。これらの抗体を、ついで酵素に結合し
た抗原に特異的に結合させる。
抗原抗体相互反応の特異性は、従来のＥｒＡとは違って
全反応を通じた両段階において必要である。
全反応を通じた両段階において必要である。
従来のＥＩＡでは、特異的に結合した抗体は酵素標識し
た抗１ｇＧ抗体により検出されるが、該抗体は結合した
あらゆるＩｇＧを認識する。
た抗１ｇＧ抗体により検出されるが、該抗体は結合した
あらゆるＩｇＧを認識する。
患者血漿試料を、組換えｇａｇタンパク質（ｆｐ２４）
および組換えｅｎｖタンパク質（ｆｐ４１）をコーティ
ングしたポリスチレンビーズと接触さぜた。４０゜Ｃで
３０分間インキユヘートした後、蒸留水で充分に洗浄す
ることにより過剰の試料を除いた。この抗１−＋ Ｉ
Ｖ−１抗体の結合した洗浄ビーズを、ついで西洋ワザビ
ペルオキシダーゼ（Ｈ’Ｒ Ｐ Ｏ ）に結合させたｒ
ｐ２４、ビオヂン化ｒｐ４１およびＨＲＰＯに結合させ
た精製ウザギ抗ビオチンＩｇＧを含むバソファ一溶肢と
接触させた。４０℃にて３０分間インキコベートした後
、充分に洗ａ卜することにより過剰の結合体を除いた。
および組換えｅｎｖタンパク質（ｆｐ４１）をコーティ
ングしたポリスチレンビーズと接触さぜた。４０゜Ｃで
３０分間インキユヘートした後、蒸留水で充分に洗浄す
ることにより過剰の試料を除いた。この抗１−＋ Ｉ
Ｖ−１抗体の結合した洗浄ビーズを、ついで西洋ワザビ
ペルオキシダーゼ（Ｈ’Ｒ Ｐ Ｏ ）に結合させたｒ
ｐ２４、ビオヂン化ｒｐ４１およびＨＲＰＯに結合させ
た精製ウザギ抗ビオチンＩｇＧを含むバソファ一溶肢と
接触させた。４０℃にて３０分間インキコベートした後
、充分に洗ａ卜することにより過剰の結合体を除いた。
発色源基質である０−フェニレンジアミンおよび過酸化
水素とともに室温にて３０分間インキコベートすること
により、結合したＨ Ｒ Ｐ Ｏを検出した。３０分後
、ｌＭ硫酸を加えて発色反応を停止させた。得られた黄
−オレンジ色を４． ９ ２ ｎｍでの比色分折により
定量し、アッセイにおいて患者試料を正常なヒト血漿で
置き換えることにより得られた陰性コントロール光学密
度と比較した。陰性コントロールに比べてＯＤ４９２が
＋０．１大きい試料は、抗Ｈ ＩＶ−１抗体についで陽
性と考えられた。
水素とともに室温にて３０分間インキコベートすること
により、結合したＨ Ｒ Ｐ Ｏを検出した。３０分後
、ｌＭ硫酸を加えて発色反応を停止させた。得られた黄
−オレンジ色を４． ９ ２ ｎｍでの比色分折により
定量し、アッセイにおいて患者試料を正常なヒト血漿で
置き換えることにより得られた陰性コントロール光学密
度と比較した。陰性コントロールに比べてＯＤ４９２が
＋０．１大きい試料は、抗Ｈ ＩＶ−１抗体についで陽
性と考えられた。
血清変換を受けている幾人かの患者からの一連の試料血
液を本アッセイ態様に従ってアッセイした。これらのデ
ータを、上記全ウイルス溶解物を用いたＥＬＩＳＡ抗Ｈ
Ｉ Ｖ抗体スクリーニング試験および実施例７のアッ
セイと比較して第７表に示す。ゲインズ（Ｈ ． Ｇ
ａｉｎｅｓ）により記載された方法［ゲインズら、「デ
テクション・オブ・イムノグ口プリン・Ｍ・アンヂボデ
ィ・イン・プライマリー・ヒューマン・イムノデフィシ
ェンンー・バイラス・インフェクション（ｊ）ｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｒ ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ
ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｉ ｍｍ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ ｉｒｕｓ Ｉ ｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ）Ｊ、Ｌａｎｃｅｔ ｉ ｌ ２ ４
９〜ｌ２５３、＋９８７］により測定した抗Ｈ Ｉ
Ｖ１１ｇＭおよびＩｇＧレベルもまた第７表に示す。な
お、第７表において、アッセイ結果は、ノグナルとカッ
トオフとの比（Ｓ／Ｃｏ）で示してある。またＩｇＭお
よびＩｇＧレベルは、陰性コントロールに対するシグナ
ルの比（Ｓ／Ｎ）で示してある。最初の陽性の結果（Ｓ
／Ｃｏ＞Ｉ ．０）を＊で示してある。
液を本アッセイ態様に従ってアッセイした。これらのデ
ータを、上記全ウイルス溶解物を用いたＥＬＩＳＡ抗Ｈ
Ｉ Ｖ抗体スクリーニング試験および実施例７のアッ
セイと比較して第７表に示す。ゲインズ（Ｈ ． Ｇ
ａｉｎｅｓ）により記載された方法［ゲインズら、「デ
テクション・オブ・イムノグ口プリン・Ｍ・アンヂボデ
ィ・イン・プライマリー・ヒューマン・イムノデフィシ
ェンンー・バイラス・インフェクション（ｊ）ｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｒ ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ
ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｉ ｍｍ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ ｉｒｕｓ Ｉ ｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ）Ｊ、Ｌａｎｃｅｔ ｉ ｌ ２ ４
９〜ｌ２５３、＋９８７］により測定した抗Ｈ Ｉ
Ｖ１１ｇＭおよびＩｇＧレベルもまた第７表に示す。な
お、第７表において、アッセイ結果は、ノグナルとカッ
トオフとの比（Ｓ／Ｃｏ）で示してある。またＩｇＭお
よびＩｇＧレベルは、陰性コントロールに対するシグナ
ルの比（Ｓ／Ｎ）で示してある。最初の陽性の結果（Ｓ
／Ｃｏ＞Ｉ ．０）を＊で示してある。
３６の血清変換試料のうち３４の試料において、実施例
ｌＯのアッセイは、従来の抗１｛ Ｉ Ｖ試験に比へて
高いシグナルとカットオフ（Ｓ／Ｃｏ）で抗Ｈ Ｉ Ｖ
− １抗体を検出した。実施例１０のアッセイは、従
来のウイルス溶解物アッセイよりも早期に３６のすべて
の血清変換試料を検出した。さらに、従来の抗ＨＩＶア
ッセイの一つまたは両方では陰性と試験された幾つかの
試料が、実施例１０のアッセイにより陽性と検出された
。たとえば、パネル２の場合には、実施例ＩＯのアッセ
イは試料を６日目に陽性と検出したのに対し、実施例７
のアッセイは試料を８日目に陽性と検出したに過ぎなか
った。ウイルス溶解物を用いたアッセイで（ま１４日目
にはボータ゛−ラインにあり、２１１ヨ目には陽性であ
った。
ｌＯのアッセイは、従来の抗１｛ Ｉ Ｖ試験に比へて
高いシグナルとカットオフ（Ｓ／Ｃｏ）で抗Ｈ Ｉ Ｖ
− １抗体を検出した。実施例１０のアッセイは、従
来のウイルス溶解物アッセイよりも早期に３６のすべて
の血清変換試料を検出した。さらに、従来の抗ＨＩＶア
ッセイの一つまたは両方では陰性と試験された幾つかの
試料が、実施例１０のアッセイにより陽性と検出された
。たとえば、パネル２の場合には、実施例ＩＯのアッセ
イは試料を６日目に陽性と検出したのに対し、実施例７
のアッセイは試料を８日目に陽性と検出したに過ぎなか
った。ウイルス溶解物を用いたアッセイで（ま１４日目
にはボータ゛−ラインにあり、２１１ヨ目には陽性であ
った。
バネル２においては、比較的高レベルのＩｇＭが早期に
観察され、ＩｇＧは後に産生された。実施例１０のアッ
セイから得られたシグナルのパターンは急速に上昇した
後にプラ１・一に落ちるものであり、従来の抗Ｈ Ｉ
Ｖアッセイのシグナルが時間の進行どともに着実に」一
昇ずるものであるのとは極めて対照的である。
観察され、ＩｇＧは後に産生された。実施例１０のアッ
セイから得られたシグナルのパターンは急速に上昇した
後にプラ１・一に落ちるものであり、従来の抗Ｈ Ｉ
Ｖアッセイのシグナルが時間の進行どともに着実に」一
昇ずるものであるのとは極めて対照的である。
パネル４は、ＩｇＭレベルが減少し始める血清変換の後
期を示す。実施例１０のアッセイからのシグナルはＩｇ
Ｍレベルが下がるにつれて減少していき、競合するＩｇ
Ｇレベルの方は、ＩｇＧが充分に上昇してＩｇＧシグナ
ルがＩｇＭシグナルを置き換えてしまうまで上昇してい
き、その際、本発明のシグナルはＩｇＧレベルと平行し
て上昇していく。
期を示す。実施例１０のアッセイからのシグナルはＩｇ
Ｍレベルが下がるにつれて減少していき、競合するＩｇ
Ｇレベルの方は、ＩｇＧが充分に上昇してＩｇＧシグナ
ルがＩｇＭシグナルを置き換えてしまうまで上昇してい
き、その際、本発明のシグナルはＩｇＧレベルと平行し
て上昇していく。
パネル１においては、実施例ＩＯのアッセイシグナルお
よび実施例７のアッセイシグナルは平行して上昇してい
く。このパネルは、最初のＩｇＭレベルが比較的低く、
初期１ｇＧレベルが高い。
よび実施例７のアッセイシグナルは平行して上昇してい
く。このパネルは、最初のＩｇＭレベルが比較的低く、
初期１ｇＧレベルが高い。
パネル２、５および７において実施例１０のアッセイに
独特な２相応答は、ビーズにより捕捉された５量体１ｇ
Ｍが１以上の結合体分子と結合するために、このアッセ
イがＩｇＧの場合よりも高い効率でＩｇＭを検出するこ
とを示している。血清変換の初期において競合ｒｇＧが
それほど多量に存在せず実質的にＩｇＭが存在するとき
は、本発明のアッセイ態様により高いシグナルが得られ
る。
独特な２相応答は、ビーズにより捕捉された５量体１ｇ
Ｍが１以上の結合体分子と結合するために、このアッセ
イがＩｇＧの場合よりも高い効率でＩｇＭを検出するこ
とを示している。血清変換の初期において競合ｒｇＧが
それほど多量に存在せず実質的にＩｇＭが存在するとき
は、本発明のアッセイ態様により高いシグナルが得られ
る。
ＩｇＭレベルが下がり、競合ＴｇＧレベルが上昇するに
つれて、２価のｒｇＧは１０価のＩｇＭと競合し、検出
効率は悪くなる。それゆえ、本発明のアッセイで観察さ
れる全シグナルは減少する。最後に、ＩｇＧレベルか上
昇し続けＩｇＭレベルが下がり続けるど、アソセイから
の全ノグナルは再び上昇し応答の第二相を形威する。
つれて、２価のｒｇＧは１０価のＩｇＭと競合し、検出
効率は悪くなる。それゆえ、本発明のアッセイで観察さ
れる全シグナルは減少する。最後に、ＩｇＧレベルか上
昇し続けＩｇＭレベルが下がり続けるど、アソセイから
の全ノグナルは再び上昇し応答の第二相を形威する。
これとは対照的に、従来の抗１−１ １ Ｖ抗体アッセ
イで観察されるシグナルは＃２以外のすべてのパネルに
おいて着実に」二昇し、２相応答はみられない。これら
の両方のアッセイとも、ヤギ中で産生された抗ヒトｒｇ
Ｇ］−Ｉ鎖およびＬ鎖に結合したＩ｛ＲＰＯを利用して
捕捉抗体を検出する。この初期応答が欠如していること
は、これら従来の抗１−１ １■抗体アッセイのいずれ
もこれら血清変換パネルにおいてＩｇＭを検出しないこ
と、およびＩｇＭをＨ鎖の交差反応性により検出するが
ＩｇＧほどには効率的には検出しないことを示している
。
イで観察されるシグナルは＃２以外のすべてのパネルに
おいて着実に」二昇し、２相応答はみられない。これら
の両方のアッセイとも、ヤギ中で産生された抗ヒトｒｇ
Ｇ］−Ｉ鎖およびＬ鎖に結合したＩ｛ＲＰＯを利用して
捕捉抗体を検出する。この初期応答が欠如していること
は、これら従来の抗１−１ １■抗体アッセイのいずれ
もこれら血清変換パネルにおいてＩｇＭを検出しないこ
と、およびＩｇＭをＨ鎖の交差反応性により検出するが
ＩｇＧほどには効率的には検出しないことを示している
。
それゆえ、本実施例は、ｌｏ価免疫グロブリンＭ（ｆｇ
Ｍ）に対する上昇した感度のために抗Ｈ ＩＶ抗体の早
期検出を可能とした酵素イムノアッセイ態様を示すもの
である。
Ｍ）に対する上昇した感度のために抗Ｈ ＩＶ抗体の早
期検出を可能とした酵素イムノアッセイ態様を示すもの
である。
′Ｌ！ｉ（本発明のアッセイと抗１｛ Ｉ ＶＩ抗体の
ための 以上、本発明を説明ケるために特定の実施例を挙げたが
、本発明の範囲に含まれるべき変更は当業者により理解
されるべきである。たとえば、」二記ｐ２４およびｇｐ
”ｌ Ｉタンパク質の一部または断片、またはこれらタ
ンパク質の置換、欠失もしくはイ」加類似物を、組換え
ＤＮＡ法かまたは直接ペブチド合成法のいずれにより製
造されたかにかかわりなく本発明のアッセイ法に用いる
ことができる。
ための 以上、本発明を説明ケるために特定の実施例を挙げたが
、本発明の範囲に含まれるべき変更は当業者により理解
されるべきである。たとえば、」二記ｐ２４およびｇｐ
”ｌ Ｉタンパク質の一部または断片、またはこれらタ
ンパク質の置換、欠失もしくはイ」加類似物を、組換え
ＤＮＡ法かまたは直接ペブチド合成法のいずれにより製
造されたかにかかわりなく本発明のアッセイ法に用いる
ことができる。
第１図は、２価１ｇＧおよび多価１ｇＭにお１ノる、ビ
ーズ／抗原／試料抗体／酵素結合抗原の結合様式を示す
模式図である。
ーズ／抗原／試料抗体／酵素結合抗原の結合様式を示す
模式図である。
Claims (39)
- （１）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた抗
ＨＩＶ抗体の検出方法であって、（ａ）該第一固相支持
体にｐ２４タンパク質を、該第二固相支持体にｇｐ４１
タンパク質をそれぞれ結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体を除き、（ｄ）標識
を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在を決定し
、 （ｅ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触（ｆ）該第
二固相支持体から未結合の生物学的試料および未結合の
標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を除き、ついで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （２）ｐ２４タンパク質を第一固相支持体上にコーティ
ングすることにより該第一固相支持体に直接結合させ、
ｇｐ４１タンパク質を第二固相支持体上にコーティング
することにより該第二固相支持体に直接結合させた請求
項（１）に記載の方法。 - （３）まず抗ＨＩＶｐ２４抗体で第一固相支持体をコー
ティングしたのちｐ２４タンパク質をオーバーコーティ
ングすることによりｐ２４タンパク質を該第一固相支持
体に間接的に結合させ、まず抗ＨＩＶｇｐ４１抗体で第
二固相支持体をコーティングしたのちｇｐ４１タンパク
質をオーバーコーティングすることによりｇｐ４１タン
パク質を該第二固相支持体に間接的に結合させた請求項
（１）に記載の方法。 - （４）抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体
の標識が同じかまたは異なり、酵素標識、放射性同位体
標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる群から選ば
れたものである請求項（１）に記載の方法。 - （５）固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出方法であ
って、 （ａ）該固相支持体にｐ２４タンパク質およびｇｐ４１
タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および標識抗ＨＩＶ
ｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ
、 （ｃ）該固相支持体から未結合の生物学的試料および未
結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体を除き、ついで （ｄ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、または
両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定
する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （６）ｐ２４タンパク質およびｇｐ４１タンパク質を固
相支持体上にコーティングすることにより該固相支持体
に直接結合させた請求項（５）に記載の方法。 - （７）まず組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４
１タンパク質に対する抗体で固相支持体をコーティング
したのちｐ２４タンパク質およびｇｐ４１タンパク質を
オーバーコーティングすることによりｐ２４タンパク質
およびｇｐ４１タンパク質を該固相支持体に間接的に結
合させた請求項（５）に記載の方法。 - （８）抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体
の標識が同じかまたは異なり、酵素標識、放射性同位体
標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる群から選ば
れたものである請求項（５）に記載の方法。 - （９）生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体を検出するための
イムノアッセイキットであって、（ａ）それぞれ、組換
えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４１タンパク質を
コーティングした第一固相支持体および第二固相支持体
、および （ｂ）標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ
４１抗体 からなることを特徴とするイムノアッセイキット。 - （１０）第一固相支持体が、まず抗ＨＩＶｐ２４抗体を
コーティングしたのちに組換えｐ２４タンパク質をコー
ティングしたものであり、第二固相支持体が、まず抗Ｈ
ＩＶｇｐ４１抗体をコーティングしたのちに組換えｇｐ
４１タンパク質をコーティングしたものである請求項（
９）に記載のイムノアッセイキット。 - （１１）生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体を検出するため
のイムノアッセイキットであって、 （ａ）組換えｐ２４タンパク質および組換えｇｐ４１タ
ンパク質をコーティングした固相支持体、および（ｂ）
標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体 からなることを特徴とするイムノアッセイキット。 - （１２）抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体の標識が同じかまたは異なり、酵素標識、放射性同位
体標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる群から選
ばれたものである請求項（９）に記載のイムノアッセイ
キット。 - （１３）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）第一のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体
をコーティングしたのち組換えｐ２４タンパク質をオー
バーコーティングし、 （ｂ）該第一のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
一のアリコートおよび西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合した抗ＨＩＶｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一のポリスチレンビーズを洗浄し、 （ｄ）該洗浄した第一のポリスチレンビーズをｏ−フェ
ニレンジアミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生
成物を生成させ、 （ｅ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、（ｆ）第二のポリスチ
レンビーズに抗ＨＩＶｇｐ４１抗体をコーティングした
のち組換えｇｐ４１タンパク質をオーバーコーティング
し、 （ｇ）該第二のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
二のアリコートおよび西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合した抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｈ）該第二のポリスチレンビーズを洗浄し、（ｉ）該
洗浄した第二のポリスチレンビーズをｏ−フェニレンジ
アミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を生
成させ、ついで （ｊ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶ抗体を含有し
ないコントロールを工程（ａ）〜工程（ｊ）の方法によ
り試験したときに生成する黄色の生成物の量に比べて、
該第一の固相支持体または該第二の固相支持体のいずれ
かまたは両方で生成する黄色の生成物の量が減少するこ
とにより試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＩＨＩＶ抗体の検出方法。 - （１４）固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出方法で
あって、 （ａ）ポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体および
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体をコーティングしたのち組換えｐ
２４タンパク質および組換えｇｐ４１タンパク質をオー
バーコーティングし、 （ｂ）該ポリスチレンビーズを生物学的試料のアリコー
トおよび西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ＨＩ
Ｖｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該ポリスチレンビーズを洗浄し、 （ｄ）該洗浄したポリスチレンビーズをｏ−フェニレン
ジアミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を
生成させ、ついで （ｅ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決
定し、 抗ＨＩＶ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）〜
工程（ｅ）の方法により試験したときに生成する黄色の
生成物の量に比べて、生成する黄色の生成物の量が減少
することにより試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （１５）２つの固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出
方法であって、 （ａ）第一固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体を結合させ
、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび組換えＨＩＶｐ２４タンパク質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識抗ＨＩＶｐ２４抗体と接
触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ＨＩＶｐ２４抗体を除き、 （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｇ）第二固相支持体に抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を結合さ
せ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質と接触させ
、 （ｉ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｇｐ４１を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と
接触させ、 （ｋ）未結合の標識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を除き、つい
で （ｌ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （１６）固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出方法で
あって、 （ａ）固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶ
ｇｐ４１抗体を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および組換えＨＩＶ
ｐ２４タンパク質および組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク
質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の組換えＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質および組換えＨＩＶｇｐ４１タンパ
ク質を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識抗ＨＩＶｐ２４抗体および標
識抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、ついで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在、または両
抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定す
る ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （１７）抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体の標識が同じかまたは異なり、酵素標識、放射性同位
体標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる群から選
ばれたものである請求項（１５）または（１６）に記載
の方法。 - （１８）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、 （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｇ）該第二固相支持体にＨＩＶｇｐ４１を結合させ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートと接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｋ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、ついで （ｌ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （１９）固相支持体を用いた生物学的試料中の抗ＨＩＶ
抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４
１を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識抗ヒト抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の標識抗ヒト抗体を除き、ついで （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、または
両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定
する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （２０）抗ヒト抗体の標識が、酵素標識、放射性同位体
標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる群から選ば
れたものである請求項（１８）または（１９）に記載の
方法。 - （２１）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を標識ＨＩＶｐ２４と接触させ
、 （ｅ）未結合の標識ＨＩＶｐ２４を除き、 （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｇ）該第二固相支持体にＨＩＶｇｐ４１を結合させ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートと接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を標識ＨＩＶｇｐ４１と接触さ
せ、 （ｋ）未結合の標識ＨＩＶｇｐ４１を除き、ついで （ｌ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （２２）固相支持体を用いた生物学的試料中の抗ＨＩＶ
抗体の検出方法であって、 （ａ）該固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４
１を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を標識ＨＩＶｐ２４および標識ＨＩ
Ｖｇｐ４１と接触させ、 （ｅ）未結合の標識ＨＩＶｐ２４および標識ＨＩＶｇｐ
４１を除き、ついで （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、または
両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定
する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （２３）抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗
体の標識が同じかまたは異なり、酵素標識、放射性同位
体標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる群から選
ばれたものである請求項（２１）または（２２）に記載
の方法。 - （２４）標識ｐ２４および標識ｇｐ４１が同じ反応混合
物中に存在する請求項（２２）に記載の方法。 - （２５）工程（ｂ）および（ｄ）を同時に行い、工程（
ｈ）および（ｊ）を同時に行う請求項（２１）に記載の
方法。 - （２６）工程（ｂ）および（ｄ）を同時に行う請求項（
２２）に記載の方法。 - （２７）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）該第一固相支持体にｐ２４タンパク質を、該第二
固相支持体にｇｐ４１タンパク質をそれぞれ結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗
体と接触させ、 （ｃ）該第一固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗
体を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｆ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび第二ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｇｐ４１
抗体と接触させ、 （ｇ）該第二固相支持体から未結合の生物学的試料およ
び未結合の第二ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｇｐ４１
抗体を除き、 （ｈ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、ついで （ｉ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいず
れか、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体
の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （２８）固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出方法で
あって、 （ａ）該固相支持体にｐ２４タンパク質およびｇｐ４１
タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および第一ハプテン
に結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗体および第二ハプテンに
結合させた抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該固相支持体から未結合の生物学的試料および未
結合の第一ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｐ２４抗体お
よび未結合の第二ハプテンに結合させた抗ＨＩＶｇｐ４
１抗体を除き、 （ｄ）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体
および該第二ハプテンに対する標識抗体と接触させ、つ
いで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体または抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか、または
両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定
する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （２９）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）第一のポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体
をコーティングしたのち組換えｐ２４タンパク質をオー
バーコーティングし、 （ｂ）該第一のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
一のアリコートおよび第一ハプテンに結合した抗ＨＩＶ
ｐ２４抗体と接触させ、 （ｃ）該第一のポリスチレンビーズを西洋ワサビペルオ
キシダーゼに結合した抗第一ハプテン抗体と接触させ、 （ｄ）該第一のポリスチレンビーズを洗浄し、 （ｅ）該洗浄した第一のポリスチレンビーズをｏ−フェ
ニレンジアミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生
成物を生成させ、 （ｆ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体の存在を決定し、（ｇ）第二のポリスチ
レンビーズに抗ＨＩＶｇｐ４１抗体をコーティングした
のち組換えｇｐ４１タンパク質をオーバーコーティング
し、 （ｈ）該第二のポリスチレンビーズを生物学的試料の第
二のアリコートおよび第二ハプテンに結合した抗ＨＩＶ
ｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｉ）該第二のポリスチレンビーズを西洋ワサビペルオ
キシダーゼに結合した抗第二ハプテン抗体と接触させ、 （ｊ）該第二のポリスチレンビーズを洗浄し、 （ｋ）該洗浄した第二のポリスチレンビーズをｏ−フェ
ニレンジアミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生
成物を生成させ、ついで （ｌ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、 抗ＨＩＶ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）〜
工程（ｌ）の方法により試験したときに生成する黄色の
生成物の量に比べて、該第一の固相支持体または該第二
の固相支持体のいずれかまたは両方で生成する黄色の生
成物の量が減少することにより試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３０）固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出方法で
あって、 （ａ）ポリスチレンビーズに抗ＨＩＶｐ２４抗体および
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体をコーティングしたのち組換えｐ
２４タンパク質および組換えｇｐ４１タンパク質をオー
バーコーティングし、 （ｂ）該ポリスチレンビーズを生物学的試料およびハプ
テンに結合した抗ＨＩＶｐ２４抗体およびハプテンに結
合した抗ＨＩＶｇｐ４１抗体と接触させ、 （ｃ）該ポリスチレンビーズを西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合した抗ハプテン抗体と接触させ、 （ｄ）該ポリスチレンビーズを洗浄し、 （ｅ）該洗浄したポリスチレンビーズをｏ−フェニレン
ジアミンの過酸化水素溶液と接触させて黄色の生成物を
生成させ、ついで （ｆ）該黄色の生成物の吸光度を検出して試料中の抗Ｈ
ＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決
定し、 抗ＨＩＶ抗体を含有しないコントロールを工程（ａ）〜
工程（ｆ）の方法により試験したときに生成する黄色の
生成物の量に比べて、生成する黄色の生成物の量が減少
することにより試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３１）２つの固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出
方法であって、 （ａ）第一固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体を結合させ
、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートおよび第一ハプテンに結合した組換えＨＩＶｐ２４
タンパク質と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の第一ハプテ
ンに結合した組換えＨＩＶｐ２４タンパク質を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｅ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｆ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｇ）第二固相支持体に抗ＨＩＶｇｐ４１抗体を結合さ
せ、 （ｈ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートおよび第二ハプテンに結合した組換えＨＩＶｇｐ４
１タンパク質と接触させ、 （ｉ）未結合の生物学的試料および未結合の第二ハプテ
ンに結合した組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質を除き、 （ｊ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｋ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｌ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３２）固相支持体を用いた抗ＨＩＶ抗体の検出方法で
あって、 （ａ）該固相支持体に抗ＨＩＶｐ２４抗体および抗ＨＩ
Ｖｇｐ４１抗体を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料および第一ハプテン
に結合した組換えＨＩＶｐ２４タンパク質および第二ハ
プテンに結合した組換えＨＩＶｇｐ４１タンパク質と接
触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料および未結合の第一ハプテ
ンに結合した組換えＨＩＶｐ２４タンパク質および未結
合の第二ハプテンに結合した組換えＨＩＶｇｐ４１タン
パク質を除き、 （ｄ）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体
および該第二ハプテンに対する標識抗体と接触させ、つ
いで （ｅ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を決定し、抗ＨＩＶｐ２
４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在、または両
抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在を決定す
る ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３３）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）第一固相支持体にＨＩＶｐ２４を結合させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を第一ハプテンに結合した抗ヒ
ト抗体と接触させ、 （ｅ）該第一固相支持体を該第一ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｈ）第二固相支持体にＨＩＶｇｐ４１を結合させ、 （ｉ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートと接触させ、 （ｊ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｋ）該第二固相支持体を第二ハプテンに結合した抗ヒ
ト抗体と接触させ、 （ｌ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｍ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｎ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３４）固相支持体を用いた生物学的試料中の抗ＨＩＶ
抗体の検出方法であって、 （ａ）固相支持体にＨＩＶｐ２４およびＨＩＶｇｐ４１
を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体をハプテンに結合した抗ヒト抗体と
接触させ、 （ｅ）該固相支持体を該ハプテンに対する標識抗体と接
触させ、 （ｆ）未結合の該ハプテンに対する標識抗体を除き、つ
いで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１の存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３５）第一固相支持体および第二固相支持体を用いた
生物学的試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法であって、 （ａ）第一固相支持体にＨＩＶｐ２４タンパク質を結合
させ、 （ｂ）該第一固相支持体を生物学的試料の第一のアリコ
ートと接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該第一固相支持体を第一ハプテンに結合したＨＩ
Ｖｐ２４タンパク質と接触させ、（ｅ）該第一固相支持
体を該第一ハプテンに対する標識抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体を除き
、 （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体の存
在を決定し、 （ｈ）第二固相支持体にＨＩＶｇｐ４１タンパク質を結
合させ、 （ｉ）該第二固相支持体を生物学的試料の第二のアリコ
ートと接触させ、 （ｊ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｋ）該第二固相支持体を第二ハプテンに結合したＨＩ
Ｖｇｐ４１タンパク質と接触させ、 （ｌ）該第二固相支持体を該第二ハプテンに対する標識
抗体と接触させ、 （ｍ）未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き
、ついで （ｎ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の
存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３６）固相支持体を用いた生物学的試料中の抗ＨＩＶ
抗体の検出方法であって、 （ａ）固相支持体にＨＩＶｐ２４タンパク質およびＨＩ
Ｖｇｐ４１タンパク質を結合させ、 （ｂ）該固相支持体を生物学的試料と接触させ、 （ｃ）未結合の生物学的試料を除き、 （ｄ）該固相支持体を第一ハプテンに結合したＨＩＶｐ
２４タンパク質および第二ハプテンに結合したＨＩＶｇ
ｐ４１タンパク質と接触させ、 （ｅ）該固相支持体を該第一ハプテンに対する標識抗体
および該第二ハプテンに対する標識抗体と接触させ、 （ｆ）未結合の該第一ハプテンに対する標識抗体および
未結合の該第二ハプテンに対する標識抗体を除き、つい
で （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶｐ２４抗体およ
び抗ＨＩＶｇｐ４１の存在を決定し、 抗ＨＩＶｐ２４抗体の存在、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の存
在、または両抗体の存在により試料中の抗ＨＩＶ抗体の
存在を決定する ことを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の検出方法。 - （３７）第一ハプテンに対する抗体および第二ハプテン
に対する抗体の標識が同じかまたは異なり、酵素標識、
放射性同位体標識、化学発光標識および蛍光標識よりな
る群から選ばれたものである請求項（２７）、（２８）
、（３１）、（３２）、（３３）、（３５）または（３
６）に記載の方法。 - （３８）第一ハプテンおよび第二ハプテンが同じかまた
は異なる請求項（２７）、（２８）、（２９）、（３０
）、（３１）、（３２）、（３３）、（３５）または（
３６）に記載の方法。 - （３９）ハプテンに対する抗体の標識が、酵素標識、放
射性同位体標識、化学発光標識および蛍光標識よりなる
群から選ばれたものである請求項（３４）に記載の方法
。
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|---|---|---|---|---|
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