WO2017065261A1 - ヒトパルボウイルスｂ１９抗原および抗体の同時検出方法及びキット - Google Patents

ヒトパルボウイルスｂ１９抗原および抗体の同時検出方法及びキット Download PDF

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antigen
antibody
probe
surfactant
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然 顧
金子　敦
克己 青柳
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富士レビオ株式会社
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    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • the present invention relates to a method for simultaneously detecting human parvovirus B19 antigen and antibody contained in a specimen, and a simultaneous detection kit for human parvovirus B19 antigen and antibody.
  • Human parvovirus B19 is a linear single-stranded DNA virus classified into the genus Parvoviridae parvovirus.
  • the virus particle has an icosahedral structure, and the capsid proteins VP1 (83 kDa) and VP2 (58 kDa) constitute a capsid at a ratio of 1: 9. It does not have an envelope.
  • Known diseases / symptoms caused by parvovirus B19 infection include infectious erythema (apple disease), arthritis, fetal edema and miscarriage.
  • human parvovirus B19 acquires lifelong immunity once infected, it is not possible to evaluate new infections even by measuring IgG type antibodies. Thus, human parvovirus B19 generally measures IgM type antibodies to assess new infections.
  • parvovirus B19 In the early stage of infection with parvovirus B19, there is a period (window period) in which anti-parvovirus B19 antibody (IgM) is not detected in blood. During this window period, parvovirus B19 can be detected early by detecting parvovirus B19 antigen. On the other hand, when the parvovirus B19 antigen in the blood has a low titer, it is possible to detect parvovirus B19 with higher sensitivity by detecting the IgM type antibody. Therefore, parvovirus B19 antigen and IgM type anti-antigen are detected. It is desirable to detect both parvovirus B19 antibodies.
  • Patent Document 3 describes that an immunological measurement result of an antigen of parvovirus B19 and an immunological measurement result of an IgM antibody are used in combination. In this method, an antigen and an antibody are used. It is necessary to measure separately, and a large amount of specimen is required. In addition, two different immunological measurements need to be performed, which is laborious.
  • Patent Documents 4 and 5 describe HCV and HIV antigen-antibody simultaneous measurement methods.
  • HCV and HIV have an envelope.
  • an envelope membrane protein is used to detect an antigen in the envelope. It needs to be destroyed to expose the antigen inside the envelope.
  • the antibody to be measured is IgG type, and generally, IgM antibodies tend to be less stable than IgG antibodies.
  • the immunoassay conditions described in the methods of these patent documents are for the simultaneous measurement of the antigen inside the envelope and the IgG type antibody that are exposed by destroying the envelope membrane protein, and have an envelope. It cannot be applied to a simultaneous detection system of an antigen of parvovirus B19 and an IgM type antibody.
  • An object of the present invention is to provide means for simultaneously detecting human parvovirus B19 antigen and IgM anti-human parvovirus B19 antibody.
  • the present inventors have intensively studied an immunoassay system for simultaneously detecting human parvovirus B19 antigen and IgM anti-human parvovirus B19 antibody, and added a specific surfactant to the antigen-antibody reaction solution.
  • the present inventors have found that parvovirus B19 antigen and IgM anti-parvovirus B19 antibody can be detected simultaneously with high sensitivity, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a method for simultaneously detecting at least one parvovirus B19 antigen and at least one IgM anti-parvovirus B19 antibody present in a specimen, wherein the same reaction is carried out in the presence of a surfactant.
  • the specimen is (1) a first probe for detecting a parvovirus B19 antigen, and (2) providing a method comprising contacting a second probe for detecting an IgM-type anti-parvovirus B19 antibody.
  • the present invention also provides a kit for use in the above-described method of the present invention, the first probe for detecting the parvovirus B19 antigen and the second probe for detecting the IgM anti-parvovirus B19 antibody.
  • a surfactant, a parvovirus B19 antigen and IgM type anti-parvovirus B19 antibody simultaneous detection kit is provided.
  • the present invention it is possible to simultaneously detect at least one parvovirus B19 antigen and at least one IgM anti-parvovirus B19 antibody present in a sample, so whether or not the sample is positive for parvovirus B19. Can be detected with high sensitivity by a simple operation.
  • the parvovirus B19 antigen-antibody simultaneous detection method of the present invention is a method for simultaneously detecting at least one parvovirus B19 antigen and at least one IgM-type anti-parvovirus B19 antibody present in a specimen.
  • a first probe for detecting a parvovirus B19 antigen and (2) comprising contacting with a second probe for detecting human IgM type anti-parvovirus B19 antibody.
  • “In the same reaction system” means that the specimen, the first probe, and the second probe are reacted in the same reaction solution (for example, in the same well, the same reaction cell, etc.).
  • the surfactant is present at least in the reaction system for reacting the specimen, the first probe, and the second probe.
  • a surfactant may or may not be present.
  • the type of surfactant is not particularly limited as long as it improves the sensitivity of the parvovirus B19 antigen-antibody simultaneous detection system.
  • at least one surfactant selected from an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, and a cationic surfactant can be preferably used.
  • One type of surfactant may be used, or a plurality of types may be used in combination.
  • the surfactant that improves the sensitivity of the parvovirus B19 antigen-antibody simultaneous detection system may be at least one selected from an anionic surfactant and an amphoteric surfactant.
  • nonionic surfactants such as Tween surfactants and Triton (registered trademark) surfactants are not used alone, the effect of improving the sensitivity in the antigen-antibody simultaneous detection system of parvovirus B19 is not recognized ( As other additives, for example, for different purposes, it may be used in combination with a surfactant that improves the sensitivity in a parvovirus B19 antigen-antibody simultaneous detection system.
  • anionic surfactant examples include an anionic surfactant having an alkyl group having 9 or more carbon atoms, more preferably 11 or more carbon atoms in the molecule.
  • the alkyl group is preferably a linear alkyl group.
  • anionic surfactants having an alkyl group having 9 or more carbon atoms include alkyl sulfate salts such as sodium dodecyl sulfate (SDS), N-decanoyl sarcosine sodium (NDS), and N-lauroyl sarcosine sodium (NLS).
  • N-acyl sarcosine salts such as sodium N-myristoyl sarcosine
  • alkylbenzene sulfonates such as dodecylbenzene sulfonic acid (SBDS).
  • amphoteric surfactant examples include amphoteric surfactants having an alkyl group having 10 or more carbon atoms, more preferably 12 or more carbon atoms, and quaternary ammonium in the molecule.
  • the alkyl group is preferably a linear alkyl group.
  • amphoteric surfactant having an alkyl group having 10 or more carbon atoms and a quaternary ammonium include CH 3- (CH 2 ) n -N + (CH 3 ) 2 -[(CH 2 ) 3- SO 3 ⁇ ] (n is an integer of 9 or more), and an example is N-decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate.
  • C10APS N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate
  • C12APS N-tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate
  • C14APS N- And hexadecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate
  • the cationic surfactant include a cationic surfactant having an alkyl group having 10 or more carbon atoms, more preferably 12 or more carbon atoms, and quaternary ammonium in the molecule.
  • the alkyl group is preferably a linear alkyl group.
  • cationic surfactant having an alkyl group having 10 or more carbon atoms and quaternary ammonium include CH 3 — (CH 2 ) n —N + (CH 3 ) 3 .Br—, and CH 3
  • a cationic surfactant having a structure represented by — (CH 2 ) n —N + (CH 3 ) 3 .Cl— (both of which n is an integer of 9 or more) can be given.
  • decyltrimethyl Ammonium bromide C10TAB
  • dodecyltrimethylammonium bromide C12TAB
  • tetradecyltrimethylammonium bromide C14TAB
  • hexadecyltrimethylammonium bromide C16TAB
  • decyltrimethylammonium chloride C10TAC
  • dodecyltrimethylammonium chloride C12TAC
  • tetradecyl Such as trimethylammonium chloride (C14TAC) and hexadecyltrimethylammonium chloride (C16TAC). And the like.
  • the concentration of the surfactant in the reaction system is not particularly limited as long as the antigen and antibody of parvovirus B19 can be detected simultaneously. For example, 0.01 to 10%, 0.03 to 7%, 0.05 to 5%, 0.1 to It can be carried out in the range of 3% or 0.5% to 2%. Here,% is% by weight. When a plurality of surfactants having an effect of improving the sensitivity in the parvovirus B19 antigen-antibody simultaneous detection system are used in combination, the total concentration may be in the above range.
  • the simultaneous detection of the antigen and antibody of parvovirus B19 according to the present invention is typically performed by an immunoassay.
  • an immunoassay method a sandwich method and a competitive method can be used, but the sandwich method is preferably used.
  • the sandwich immunoassay is a well-known conventional method. Specific examples include chemiluminescent enzyme immunoassay (chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA), enzyme-linked immunosorbent assay (Enzyme-Linked SImmunoSorbent Assay; ELISA), radioimmunoassay, and electrochemiluminescence immunoassay. In the present invention, any method may be used.
  • the term “detection” includes qualitative detection, quantitative detection, and semi-quantitative detection.
  • the term “measurement” includes qualitative detection, quantification and semi-quantification.
  • a molecule that specifically binds to the parvovirus B19 antigen can be used.
  • a typical example of such a specific binding molecule is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a parvovirus B19 antigen.
  • the first probe may use only one type of such molecule, or may use a combination of a plurality of types of such molecules.
  • an antibody is used as the first probe, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, but a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of the reproducibility of the immunoassay.
  • the second probe may be a molecule to which the anti-parvovirus B19 antibody specifically binds (2-1 probe).
  • a typical example of such a molecule is a polypeptide containing the full length or partial region of parvovirus B19 antigen, preferably a polypeptide containing a partial region of parvovirus B19 antigen. Since the probe 2-1 also captures anti-parvovirus B19 antibodies other than IgM type antibodies, for example, when an IgG type anti-parvovirus B19 antibody is also present in the sample, the IgG type parvovirus B19 antibody is also detected. Captured by 2-1 probe.
  • a molecule that specifically binds to the human IgM-type antibody and A step of reacting the antibody to be detected is also required.
  • a typical example of a molecule that specifically binds to a human IgM type antibody is an anti-human IgM antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the anti-human IgM antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a molecule that specifically binds to a human IgM antibody may be used as the second probe.
  • Typical examples of such molecules include anti-human IgM antibodies or antigen-binding fragments thereof as described above.
  • a molecule that specifically binds to the anti-parvovirus B19 antibody which can be used as the 2-1 probe, and A step of reacting the detection target antibody is further performed.
  • the anti-human IgM antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the second probe at least one of the above-described 2-1 probe and 2-2 probe may be used. Similarly to the first probe, the second probe may use only one type of molecule or a combination of a plurality of types of molecules.
  • Parvovirus B19 has VP2 which is a major capsid antigen and VP1 which is a minor capsid antigen as structural proteins.
  • VP1 is a protein in which the N-terminus of VP2 is extended.
  • the amino acid sequence of the major capsid antigen VP2 of parvovirus B19 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of VP2 is registered in GenBank with accession number CBI63309.1.
  • the base sequence of parvovirus B19 is registered in GenBank with accession number FN598217.1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the full-length base sequence of parvovirus B19.
  • the base sequence encoding the VP2 antigen (SEQ ID NO: 1) is the 3304th to 4968th base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the “parvovirus B19 antigen” in the present invention includes both VP2 and VP1, but is preferably VP2. That is, in the simultaneous detection method of the present invention, at least one of VP1 antigen and VP2 antigen in a sample and at least one of IgM type anti-VP1 antibody and IgM type anti-VP2 antibody in the sample may be simultaneously detected. It is preferable to simultaneously detect VP2 antigen and IgM type anti-VP2 antibody.
  • the first probe that can bind to VP2 include an anti-VP2 antibody that specifically binds to VP2 or an antigen-binding fragment thereof.
  • Examples of the second probe capable of binding to the IgM-type anti-VP2 antibody include a polypeptide containing the full length or partial region of VP2, preferably a polypeptide containing the partial region of VP2.
  • a detection reaction may be performed by reacting a labeled VP2 polypeptide in which a labeling substance is bound to a polypeptide containing a partial region.
  • the production method of the antibody and its antigen-binding fragment itself is a well-known conventional method.
  • the anti-parvovirus B19 antibody is prepared by, for example, immunizing an animal (except human) with a parvovirus major antigen VP2 or a partial fragment thereof together with an appropriate adjuvant, obtaining antiserum from blood collected from the animal, By purifying the polyclonal antibody, an anti-parvovirus B19 polyclonal antibody that specifically binds to VP2 can be obtained. Immunization is usually carried out several times over several weeks in order to increase the antibody titer in the immunized animal.
  • the antibody in the antiserum can be purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, fractionation by anion chromatography, affinity column purification, or the like.
  • the anti-parvovirus B19 monoclonal antibody can be prepared, for example, by a well-known hybridoma method. Specifically, parvovirus B19 main antigen VP2 or a partial fragment thereof is immunized to an animal (excluding humans) together with an appropriate adjuvant, and antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes are collected from the animal, Antiparvovirus that specifically binds to VP2 by preparing hybridomas by fusing with myeloma cells, selecting hybridomas that produce antibodies that bind to VP2, and proliferating them to recover antibodies from the culture supernatant B19 monoclonal antibody can be obtained.
  • Anti-human IgM polyclonal antibody and monoclonal antibody can also be prepared in the same manner as described above using human IgM or a partial fragment thereof as an immunogen.
  • anti-parvovirus B19 antibody and anti-human IgM antibody can be used as the anti-parvovirus B19 antibody and anti-human IgM antibody.
  • the “antigen-binding fragment” may be any antibody fragment as long as the binding property of the original antibody to the corresponding antigen (antigen-antibody reactivity) is maintained.
  • Specific examples include, but are not limited to, Fab, F (ab ′) 2 , scFv, and the like.
  • Fab and F (ab ′) 2 can be obtained by treating a monoclonal antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin.
  • a method for producing scFv single chain fragment of variable region is also well known.
  • mRNA of a hybridoma produced as described above is extracted, single-stranded cDNA is prepared, and immunoglobulin H chain and L PCR is carried out using primers specific to the chain to amplify the immunoglobulin H chain gene and L chain gene, and these are ligated with a linker, added with an appropriate restriction enzyme site, and introduced into a plasmid vector.
  • ScFv can be obtained by transforming E. coli to express scFv and recovering it from E. coli.
  • a polypeptide containing the full-length or partial region of parvovirus B19 antigen can be prepared by conventional methods such as chemical synthesis and genetic engineering techniques.
  • the chemical synthesis method examples include Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. Moreover, it can also synthesize
  • a method for producing a polypeptide by a genetic engineering technique is also well known.
  • a polypeptide containing the full length or partial region of VP2 is produced by a genetic engineering technique, for example, the following may be carried out.
  • PCR is performed using a previously cloned full-length VP2 DNA as a template and primers designed based on VP2 gene sequence information to prepare a polynucleotide encoding the full-length or desired part of VP2.
  • Primers used for PCR can be appropriately designed based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and VP2 sequence information registered in databases such as GenBank.
  • a polynucleotide encoding a desired polypeptide can be prepared by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer. Since the codon encoding each amino acid is known, as long as the amino acid sequence can be specified, the base sequence of the polynucleotide encoding the amino acid sequence can be determined.
  • the desired polynucleotide can be obtained by incorporating the prepared polynucleotide into an appropriate vector, expressing the polypeptide in an appropriate expression system, and recovering the polypeptide.
  • the vectors used and various expression systems are also well known.
  • Various vectors, host cells, reagents, kits Can be appropriately selected and used by those skilled in the art. Human-derived cultured cells are also commercially available and distributed and are easy to obtain.
  • the “partial region” of the parvovirus B19 antigen may be a region long enough for the antibody to be captured to bind by the antigen-antibody reaction.
  • the partial region may be a region having 7 residues or more, preferably 10 residues or more.
  • the partial region has, for example, 30 residues, 40 residues or more, 50 residues or more, or 100 It may be a residue or more.
  • the 2-1 probe is used as the second probe
  • the anti-VP2 antibody used as the first probe or its antigen binding property A polypeptide that does not contain the region recognized by the fragment is used as the 2-1 probe. That is, a polypeptide that includes a partial region of VP2 but does not include a region recognized by the first probe is used as the 2-1 probe.
  • a preferred specific example of the first probe can include an antibody that recognizes an epitope contained in the 279th to 388th VP2 antigen or an antigen-binding fragment thereof.
  • Preferable specific examples of the 2-1 probe used in combination with the first probe include a polypeptide containing a partial region of VP2 and not containing a region of amino acids 279 to 388 of VP2. More specifically, there may be mentioned a polypeptide comprising a region of amino acids 1 to 278 of SEQ ID NO: 1, a region of amino acids 389 to 554, and a region selected from partial regions of these regions.
  • a labeled antigen polypeptide can be used in addition to the labeled antibody, depending on the type of the second probe employed. It is necessary to have a configuration in which a binding reaction does not occur between the first probe and the second probe.
  • the human parvovirus B19 antigen / antibody simultaneous detection method of the present invention is performed by sandwich immunoassay using the first probe and the second probe immobilized on a solid phase as a solid phase probe, for example, This will be specifically described.
  • the embodiment in which the 2-1 probe is used as the second probe and the embodiment in which the 2-2 probe is used will be described separately.
  • an anti-parvovirus B19 antibody that specifically binds to a parvovirus B19 antigen (test antigen) in a specimen is used as a second probe.
  • a parvovirus B19 antigen polypeptide (2-1 probe) containing a partial region of the parvovirus B19 antigen, to which an IgM anti-parvovirus B19 antibody (test antibody) in the sample specifically binds is used.
  • these probes are immobilized on a solid phase.
  • the first probe and the 2-1 probe are immobilized on the same solid phase carrier (same well).
  • particles such as magnetic particles are used as the solid phase
  • the first probe and the 2-1 probe may be immobilized on the same solid phase carrier (the same particle) or different solid phase carriers. After immobilizing each probe on (different particles), the particles may be mixed and used.
  • the solid phase probe and the specimen are contacted in the presence of a surfactant (primary reaction step).
  • a sample which may be appropriately diluted with a sample diluent
  • a surfactant may be added to a well containing two solid phase probes.
  • particles When particles are used as the solid phase, particles containing two solid phase probes, a specimen, and a surfactant may be mixed.
  • the parvovirus B19 antigen protein in the sample passes through the first probe, and the anti-parvovirus B19 antibody in the sample (if the sample also contains an IgG-type anti-parvovirus B19 antibody, the IgM type In addition to the anti-parvovirus B19 antibody, an IgG-type anti-parvovirus B19 antibody may also be included), each of which is captured on the solid phase via the 2-1 probe.
  • an appropriate probe labeled with a labeling substance is brought into contact with the solid phase, The test antigen and test antibody captured on the solid phase are respectively bound to the labeled probe (secondary reaction step).
  • the labeled probe used in combination with the first probe for detection of the test antigen is referred to as a third probe for convenience.
  • a molecule that specifically binds to a test antigen at a site different from that of the first probe typically, an anti-parvovirus that binds to a test antigen at a site different from that of the first probe).
  • B19 antibody bound to a labeling substance can be used.
  • the labeled probe used in combination with the 2-1 probe for detection of the test antibody is referred to as the 4-1 probe for convenience.
  • the 4-1 probe a probe in which a labeling substance is bound to a molecule that specifically binds to a human IgM antibody (typically, an anti-human IgM antibody) can be used.
  • the secondary reaction step may be performed in the presence or absence of a surfactant.
  • the same labeling substance may be bound to the third and 4-1 probes, or different labeling substances may be bound. In the present invention, it is not essential to distinguish and detect the parvovirus B19 antigen and the IgM anti-parvovirus B19 antibody, so the same labeling substance may be bound to the third and 4-1 probes. For example, ALP may be bound to either. When different labeling substances are bound, the signals from the respective labeling substances can be distinguished, so that it is possible to distinguish and detect the parvovirus B19 antigen and the IgM anti-parvovirus B19 antibody.
  • the first probe and the labeled third probe are anti-parvovirus B19 antibodies that bind to the parvovirus B19 antigen at different sites, that is, have different epitopes from each other. It has no reactivity.
  • the polypeptide used as the 2-1 probe does not include a region recognized by the first probe and does not include a region recognized by the labeled third probe. Since the epitope of an antibody can be narrowed down by conventional epitope mapping using a short peptide, it is only necessary to examine the epitope of a known antibody or a newly prepared antibody and select an appropriate combination in which recognition regions do not overlap.
  • the solid phase is washed with an appropriate buffer solution to remove unreacted components from the reaction system.
  • the signal from the labeling substance is detected by an appropriate method. Thereby, parvovirus B19 antigen and IgM anti-parvovirus B19 antibody contained in the sample can be measured simultaneously.
  • the secondary reaction step is performed after the primary reaction step.
  • the secondary reaction step may be performed before the primary reaction step (that is, the reaction between the labeled probe and the sample is performed first).
  • the primary reaction step and the secondary reaction step may be performed simultaneously.
  • an anti-human IgM antibody (2-2 probe) is used as the second probe.
  • An anti-human IgM antibody and an anti-parvovirus B19 antibody as a first probe are immobilized on a solid phase to form a solid phase probe, and the solid phase probe and the specimen are contacted in the presence of a surfactant (primary reaction step).
  • the labeled probe (4-2 probe) used in combination with the 2-2 probe for detection of the test antibody is a probe in which a labeling substance is bound to a molecule to which the anti-parvovirus B19 antibody specifically binds.
  • a probe in which a labeling substance is bound to a polypeptide containing a partial region of the parvovirus B19 antigen can be preferably used.
  • the first probe and the labeled third probe have no reactivity with the 4-2 probe. In other words, the polypeptide used as the 4-2 probe does not include a region recognized by the first probe and does not include a region recognized by the labeled third probe.
  • the solid phase used for the immunoassay is not particularly limited, and may be the same as the solid phase used in a known immunoassay system.
  • Specific examples of the solid phase material include, but are not limited to, polystyrene, polyethylene, sepharose, and the like.
  • the physical shape of the solid phase is not essentially important, and various shapes such as a plate shape, a particle shape, and a film shape can be adopted.
  • the solid phase to be used is preferably one in which the antibody can be easily immobilized on the surface and the immune complex formed during the measurement and unreacted components can be easily separated. For example, plates, magnetic particles, latex particles, beads, chromatographic carriers, membranes and the like can be used.
  • plastic plates and magnetic particles used in ordinary immunoassays are preferred. From the viewpoints of handling, storage, and ease of separation, it is most preferable to use magnetic particles made of the materials described above.
  • the binding of the probe to these solid phases can be carried out by a conventional method well known to those skilled in the art, and may be carried out by physical adsorption or a covalent bond. For example, a glutaraldehyde method, a periodic acid method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, and the like can be used.
  • an appropriate amount of a probe is added to a particle suspension in which magnetic particles are added to a buffer solution and dispersed, and the mixture is stirred at 20 to 37 ° C. for about 1 hour.
  • the particles can be washed with an appropriate buffer to obtain probe (antibody, antigen) -bound particles.
  • the composition of the buffer to be used may be a general one used for immobilization of antibodies and antigens, and the pH may be in a range where the antibody exists stably and does not inhibit immobilization on the solid phase.
  • the labeling substance is not particularly limited, and the same labeling substance used in known immunoassay systems can be used. Specific examples include enzymes, fluorescent materials, chemiluminescent materials, staining materials, radioactive materials, and the like.
  • the enzyme known ones such as alkaline phosphatase (ALP), peroxidase, ⁇ -galactosidase can be used, but the enzyme is not limited thereto.
  • ALP alkaline phosphatase
  • peroxidase peroxidase
  • ⁇ -galactosidase the enzyme is not limited thereto.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the same labeling substance may be bound to the third probe and the fourth probe (the 4-1 probe or the 4-2 probe). Binding of these labeling substances to antibodies or antigens can be performed by conventional methods well known to those skilled in the art.
  • Coupling of the labeling substance is preferably a covalent bond, and a glutaraldehyde method, a periodic acid method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, or the like can be used.
  • a labeling substance is bound to an antibody, for example, an antibody fragment obtained by pepsin treatment and reduction treatment of an antibody and maleimidated ALP are mixed to prepare an antibody labeled with the labeling substance. it can.
  • a substrate such as a chromogenic substrate, a fluorescent substrate or a luminescent substrate corresponding to the enzyme is reacted with the enzyme, and a signal generated as a result is measured to obtain an enzyme activity to determine a measurement object.
  • a signal generated as a result is measured to obtain an enzyme activity to determine a measurement object.
  • a luminescent substrate such as disodium (for example, trade name AMPPD) can be used.
  • biotin or hapten When biotin or hapten is used as the labeling substance, it can be detected using a streptavidin or hapten antibody to which an enzyme, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, a staining substance or a radioactive substance is bound.
  • Signal detection is appropriately selected according to the type of labeling substance. For example, a colorimeter or absorptiometer is used if the signal is colored, a fluorometer is used if it is fluorescent, a photon counter is used if it is luminescent, and a radiation measuring device is used if it is radiation.
  • a colorimeter or absorptiometer is used if the signal is colored
  • a fluorometer is used if it is fluorescent
  • a photon counter is used if it is luminescent
  • a radiation measuring device is used if it is radiation.
  • a sample derived from a healthy person who has not been infected with parvovirus B19 may be subjected to the simultaneous detection method of the present invention.
  • the signal value obtained from the healthy subject sample is compared with the signal value obtained from the subject sample, and the signal value of the subject sample is high, parvovirus B19 antigen and It can be determined that at least one of IgM type anti-parvovirus B19 antibodies is present (positive for parvovirus B19).
  • a plurality of healthy human samples may be measured in advance, and a cut-off value for determining whether or not parvovirus B19 is positive may be calculated from the obtained signal value.
  • the cut-off value an average value of the signal values of the negative control, or an average value + 2SD (SD is a standard deviation) can be used.
  • SD is a standard deviation
  • the cut-off value may be compared with the signal value obtained from the subject specimen, and the discriminant value may be obtained by an appropriate calculation formula. In this case, when the discriminant value is equal to or greater than a preset value, it can be determined that the parvovirus B19 is positive.
  • a positive control may be applied to the simultaneous detection method of the present invention.
  • Positive controls include parvovirus B19 antigen positive specimen, recombinant parvovirus B19 antigen, IgM anti-parvovirus B19 antibody positive specimen, purified IgM anti-parvovirus B19 antibody, IgM obtained by immunization with other animal species A solution containing the anti-parvovirus B19 antibody, a mixture thereof, and the like at an appropriate concentration can be used.
  • Cut-off value can be set from signal values obtained from positive control and negative control. Also in this case, when the signal value obtained from the subject specimen is equal to or higher than the cutoff value, it can be determined that the parvovirus B19 is positive. Further, a discriminant value is obtained, and when the discriminant value is equal to or larger than a preset value, it can be determined that parvovirus B19 is positive. Alternatively, a signal value may be obtained for each of a plurality of positive controls and a plurality of negative controls, and a positive reference value and a negative reference value may be set from an average value of the signal values.
  • Parvovirus B19 negative if the signal value of the subject sample is less than the negative reference value (both the parvovirus B19 antigen and IgM anti-parvovirus B19 antibody are not present in the subject sample), above the positive reference value If there is parvovirus B19 positive, it is possible to determine that infection is suspected if it is above the negative reference value and below the positive reference value.
  • the sample to which the antigen-antibody simultaneous detection method of the present invention is applied is a sample separated from a subject.
  • the sample is expected to contain antigens and antibodies of the virus when the subject is infected with parvovirus B19, and specific examples include whole blood, plasma, and serum. Can do.
  • the sample may be used after appropriately diluted as necessary.
  • the subject is not particularly limited as long as it is a mammal, but is generally a human, for example, a parvovirus B19 infected person or a patient suspected of being infected.
  • the parvovirus B19 antigen / antibody simultaneous detection kit comprises a first probe capable of binding to a parvovirus B19 antigen, a second probe capable of binding to an IgM anti-parvovirus B19 antibody, and a surfactant.
  • the kit may be a simultaneous detection by immunoassay, preferably a simultaneous detection kit by sandwich immunoassay.
  • the kit may further include a plate-like solid phase carrier, and the first probe and the second probe may be included in the form of being immobilized in the same well of the plate.
  • the kit further includes a particulate carrier such as a magnetic particle, latex particle, or bead as the solid phase carrier, and the first probe and the second probe are immobilized on the same or different carrier particles. These probes can be included. When immobilized on different carrier particles, the particles are mixed and used in the first reaction step.
  • a particulate carrier such as a magnetic particle, latex particle, or bead as the solid phase carrier
  • VP2 Antigen VP2 which is a main constituent protein of parvovirus
  • pAcYM1 Baculovirus Transfer Vector
  • This plasmid was introduced into insect cells Sf9 together with Baculo Gold Liniarized Baculovirus DNA (Pharmagen) by the lipofectin method. After the introduced cells were cultured for several days, the virus in the culture supernatant was collected. Furthermore, in order to purify this virus, the virus was cloned using the limiting dilution method. Insect cells Sf21 were infected with this purified recombinant virus, and the recombinant protein (VP2) was collected and purified from the cultured insect cells.
  • pAcYM1 Baculovirus Transfer Vector
  • VP2 was collected and purified from insect cells as follows. That is, insect cells were collected by centrifugation, then sonicated and centrifuged to collect precipitates. The precipitate was washed, and the crude fraction containing the recombinant VP2 antigen was collected.
  • the separation gel concentration of SDS-PAGE-Model-491-Prep-Cell (manufactured by BIO-RAD) for purification was determined to be 10% by preliminary plate SDS-PAGE, and a cylindrical separation gel was prepared.
  • the crude recombinant VP2 crude fraction was dissolved in 2 mL of sample buffer with an SDS concentration of 2%, followed by electrophoresis, and VP2 eluted from the columnar gel tip was collected. The collected VP2 was concentrated using Centriprep (Amicon) to obtain a recombinant VP2 antigen.
  • Recombinant VP2 partial polypeptide having a partial sequence of parvovirus VP2 antigen was expressed as follows. Using the cloned full-length VP2 DNA as a template, PCR amplification was performed to include the desired partial sequence (the 3304th to 4137th nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 2 and the 4468th to 4968th nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 2), Each DNA fragment was cloned into the expression vector pETBA (biodynamics). The obtained expression plasmid was introduced into Escherichia coli to induce and express the VP2 partial polypeptide.
  • pETBA biodynamics
  • Escherichia coli was recovered by centrifugation, subjected to ultrasonic disruption and centrifuged, and then the precipitate was recovered. The precipitate was washed, and a crude fraction containing the recombinant VP2 partial polypeptide was collected. The crude fraction was purified by a gel filtration column, and recombinant VP2 partial polypeptide 1 containing amino acid sequences 1 to 278 of SEQ ID NO: 2 and recombinant VP2 partial polypeptide containing amino acids 389 to 554 of SEQ ID NO: 2 2 was obtained.
  • the anti-VP2 monoclonal antibody was prepared by immunizing BALB / c mice with the recombinant VP2 antigen obtained in (1) above and fusing the spleen lymphocytes with myeloma cells. Specifically, the recombinant VP2 antigen emulsified with Freund's complete adjuvant was first immunized with 25-100 ⁇ g / mouse, and two weeks later, booster immunization was performed with the same antigen emulsified with Freund's incomplete adjuvant. Further, about 2 weeks later, recombinant VP2 antigen dissolved in physiological saline was intravenously administered.
  • Mouse myeloma cells P3U1 previously cultured in RPMI-1640 medium and spleen cells were mixed at a ratio of 1: 2 to 1: 5, and cell fusion was performed using polyethylene glycol.
  • the fused cells were suspended in a HAT medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, dispensed into a 96-well culture plate, and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • monoclonal antibody VP2-1 is an antibody that recognizes an epitope contained in the amino acid sequence of 279th to 298th of SEQ ID NO: 1
  • monoclonal antibody VP2-2 is the 329th to 358th of SEQ ID NO: 1. It was an antibody that recognizes an epitope contained in the amino acid sequence, and it was confirmed that the monoclonal antibody VP2-3 is an antibody that recognizes an epitope contained in the amino acid sequence from the 359th to the 388th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • mouse anti-human IgM monoclonal antibody final concentration 3 mg / mL
  • pepsin final concentration 6 ⁇ g / mL
  • 0.1 M citrate buffer pH 3.5
  • Pepsin digestion was performed after standing for 1 hour.
  • gel filtration purification was performed to obtain an antibody from which the Fc region was removed.
  • 2-mercaptoethanol final concentration 10 mM
  • desalting was performed to obtain a mouse anti-human IgM monoclonal antibody Fab '.
  • Fab ′ and maleimidated alkaline phosphatase were mixed at a molar ratio of 1: 1 and allowed to stand at 25 ° C. for 30 minutes for coupling.
  • 2-Mercaptoethanol final concentration: 10 mM was added to the coupling solution and allowed to stand overnight at 4 ° C. to stop the reaction.
  • 100 mM MES (pH 6.8) containing 1% BSA, 1 mM NaCl, 0.1 mM ZnCl 2 was added to prepare 200 ⁇ g / mL, and an ALP-labeled anti-human IgM monoclonal antibody solution was prepared.
  • the anti-VP2 monoclonal antibody VP2-1 was treated in the same manner to obtain an ALP-labeled anti-VP2 monoclonal antibody VP2-1.
  • each well was washed 3 times with 350 ⁇ L of PBS, 300 ⁇ L / well of blocking solution (PBS containing 0.5% casein, 3% sucrose, 0.05% procrine) was added, and incubated at room temperature for 2 hours.
  • blocking solution PBS containing 0.5% casein, 3% sucrose, 0.05% procrine
  • primary reaction solution containing each surfactant shown in Table 1 and Table 2 below add each surfactant to PBS containing 1% BSA, 0.05% casein, 0.05% procrine at a final concentration of 0.5%) 100 ⁇ L of the sample diluted 20 times by the above was added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • a secondary reaction solution (1 ⁇ g / mL ALP-labeled anti-VP2 monoclonal antibody VP2-1 and 0.5 ⁇ g / mL ALP-labeled anti-IgM monoclonal antibody (1 100 ⁇ L of PBS containing% BSA, 0.05% casein, 0.05% procrine) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed with 300 ⁇ L of a cleaning solution, and 100 ⁇ L of a substrate solution obtained by diluting 1 tablet of PNPP Substrate Tablets (manufactured by Thermo Fisher Scientific) with 5 mL of diluent (0.1 M carbonate buffer, 2.0 mM MgCl 2 , pH 9.8) was added. After 30 minutes of incubation at 50 ° C., 50 ⁇ L of 1N NaOH was added to stop the reaction. The absorbance (A415 / 630 nm) of each well was measured with a spectrophotometer.
  • Tables 1 and 2 show the IgM and IgG titers of the anti-parvovirus B19 antibody of each positive specimen and the DNA level (IU / mL) of parvovirus B19.
  • a plurality of negative samples were similarly measured for each surfactant, and the average count value and SD of the negative samples were calculated for each surfactant.
  • the cut-off value for determining whether or not a sample is positive was set to the value of the average count value of negative samples + 2SD. Since the cut-off value varies depending on the type of surfactant to be added, it was set for each surfactant. Further, for each positive sample, a value obtained by dividing the count value by the cut-off value was obtained and used as a discriminant value. When this discriminant value is 1 or more, it can be discriminated that at least one of parvovirus B19 antigen and anti-parvovirus B19 antibody is present in the sample (positive for parvovirus B19).
  • Tables 1 and 2 show the discriminant values under the conditions where each surfactant was added. The effect when the surfactant was added was judged as a percentage of the discriminant value when the surfactant was added divided by the discriminant value when no surfactant was added.
  • an amphoteric surfactant or an anionic surfactant to the reaction solution, an increase in detection sensitivity was observed in a plurality of samples with respect to the non-addition condition.
  • C12APS and C14APS were added, a significant increase in detection sensitivity was observed.
  • the addition of SDS and NLS greatly increased the detection sensitivity.

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Abstract

ヒトパルボウイルスB19抗原とIgM型抗ヒトパルボウイルスB19抗体とを同時に検出するための新規な手段が開示されている。本発明による検体中のヒトパルボウイルスB19抗原及びIgM型抗ヒトパルボウイルスB19抗体の同時検出法は、界面活性剤の存在下、同一の反応系内で、前記検体を、 (１)　パルボウイルスB19抗原を検出するための第１のプローブ、及び (２)　IgM型抗パルボウイルスB19抗体を検出するための第２のプローブ に接触させることを含む。

Description

ヒトパルボウイルスＢ１９抗原および抗体の同時検出方法及びキット
　本発明は、検体中に含まれるヒトパルボウイルスB19抗原および抗体を同時に検出する方法、及びヒトパルボウイルスB19抗原および抗体の同時検出キットに関する。
　ヒトパルボウイルスB19は、パルボウイルスルス科パルボウイルス属に分類される直鎖一本鎖DNAウイルスである。ウイルス粒子は正２０面体構造であり、カプシドタンパク質のVP1（83kDa）及びVP2（58kDa）が1:9の比率でカプシドを構成している。エンベロープは有していない。パルボウイルスB19感染による疾患・症状として、伝染性紅斑（りんご病）、関節炎、胎児水腫や流産等が知られている。
　ヒトパルボウイルスB19は、一度感染すると終生免疫を獲得するため、IgG型抗体を測定しても新規感染を評価することができない。従って、ヒトパルボウイルスB19では、新規感染を評価するため、IgM型抗体が一般的に測定される。
　検体中のヒトパルボウイルスB19を免疫学的に測定する方法として、IgM型抗ヒトパルボウイルスB19抗体を免疫測定する方法のほかに、検体をpH4.0以下の条件で前処理した後に抗パルボウイルスB19抗体を用いて免疫測定する方法（特許文献１）、検体をpH4.5～6.5のグアニジンで前処理した後に、抗パルボウイルスB19抗体を用いて免疫測定する方法（特許文献２）が知られている。これらの方法では、検体中に含まれる抗体を不活性化する。
　また、パルボウイルスB19抗原の免疫学的測定の結果と、パルボウイルスB19のIgM抗体の免疫学的測定の結果とを併せて使用することによって、パルボウイルスB19を高感度に検出する方法が知られている（特許文献３）。
　他方、検体中のヒトC型肝炎ウイルス（HCV）抗原とIgG型の抗HCV抗体とを同時に検出する方法（特許文献４）、やヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原とIgG型の抗HIV抗体とを同時に検出する方法（特許文献５）が知られている。
特開２００１－３４３３８８ 特開２００７－２７８９０２ 特開２００８－１４５１８１ 国際公開ＷＯ００／００７０２３ 特表２００１－５０４５７２
　パルボウイルスB19の感染初期において、血中の抗パルボウイルスB19抗体（IgM）が検出されない期間（ウインドウ期間）が存在する。このウインドウ期間は、パルボウイルスB19抗原を検出することによって早期にパルボウイルスB19を検出することが可能である。一方、血液中のパルボウイルスB19抗原が低力価の場合は、IgM型抗体の検出を行うことにより、より高感度にパルボウイルスB19を検出することができるため、パルボウイルスB19抗原とIgM型抗パルボウイルスB19抗体の両者を検出することが望ましい。
　特許文献３には、パルボウイルスB19の抗原の免疫学的測定結果と、IgM型抗体の免疫学的測定結果とを併せて使用することが記載されているが、この方法では、抗原と抗体を別々に測定する必要があり、多くの検体量が必要となる。また２つの異なる免疫学的測定を実施する必要があり、手間を要する。
　特許文献４および５には、HCVおよびHIVの抗原抗体同時測定方法が記載されているが、HCVやHIVはエンベロープを有し、これらの方法ではエンベロープ内の抗原を検出するため、エンベロープ膜蛋白質を破壊して、エンベロープ内部の抗原を露出させる必要がある。さらに、特許文献の方法では、測定する抗体がIgG型であり、一般的にIgG抗体に比べてIgM抗体は安定性が低い傾向がある。つまり、これら特許文献の方法に記載された免疫測定条件は、エンベロープ膜蛋白質を破壊して露出させた、エンベロープ内部の抗原と、IgG型抗体とを同時に測定するためのものであり、エンベロープを有さないパルボウイルスB19の抗原と、IgM型抗体との同時検出系に適用することはできない。
　本発明は、ヒトパルボウイルスB19抗原とIgM型抗ヒトパルボウイルスB19抗体とを同時に検出するための手段を提供することを目的とする。
　本願発明者らはヒトパルボウイルスB19抗原とIgM型抗ヒトパルボウイルスB19抗体とを同時に検出するための免疫測定系について鋭意に検討したところ、特定の界面活性剤を抗原抗体反応液中に添加することによって、感度よくパルボウイルスB19抗原とIgM型抗パルボウイルスB19抗体とを同時に検出することができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、検体中に存在する少なくとも１種のパルボウイルスB19抗原及び少なくとも１種のIgM型抗パルボウイルスB19抗体を同時に検出する方法であって、界面活性剤の存在下、同一の反応系内で、前記検体を、
(１)　パルボウイルスB19抗原を検出するための第１のプローブ、及び
(２)　IgM型抗パルボウイルスB19抗体を検出するための第２のプローブ
に接触させることを含む、方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法に用いられるキットであって、パルボウイルスB19抗原を検出するための第１のプローブと、IgM型抗パルボウイルスB19抗体を検出するための第２のプローブと、界面活性剤とを含む、パルボウイルスB19抗原及びIgM型抗パルボウイルスB19抗体の同時検出キットを提供する。
　本発明によれば、検体中に存在する少なくとも１種のパルボウイルスB19抗原及び少なくとも１種のIgM型抗パルボウイルスB19抗体を同時に検出することができるので、検体がパルボウイルスB19陽性であるか否かを簡便な操作で感度良く検出することができる。
　本発明のパルボウイルスB19の抗原抗体の同時検出方法は、検体中に存在する少なくとも１種のパルボウイルスB19抗原及び少なくとも１種のIgM型抗パルボウイルスB19抗体を同時に検出する方法であり、界面活性剤の存在下、同一の反応系内で、前記検体を、
(１)　パルボウイルスB19抗原を検出するための第１のプローブ、及び
(２)　ヒトIgM型抗パルボウイルスB19抗体を検出するための第２のプローブ
に接触させることを含む。「同一の反応系内で」とは、同一の反応液中（例えば、同一のウェル内、同一の反応セル内、など）で検体と第１のプローブと第２のプローブとを反応させることをいう。
　界面活性剤は、少なくとも、検体と、第１のプローブと、第２のプローブとを反応させる反応系内に存在させる。それ以外の反応工程（例えば、サンドイッチ免疫測定法における二次反応工程）には、界面活性剤が存在してもよいし、存在しなくてもよい。
　界面活性剤の種類は特に限定されず、パルボウイルスB19の抗原抗体同時検出系における感度を向上させるものであればよい。例えば、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種の界面活性剤を好ましく使用することができる。１種類の界面活性剤を用いてもよいし、複数種類を組み合わせて用いてもよい。また、他の添加剤等と組み合わせて用いてもよい。あるいは、パルボウイルスB19の抗原抗体同時検出系における感度を向上させる界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選択される少なくとも１種であってもよい。Tween系界面活性剤、Triton(登録商標)系界面活性剤などの非イオン性界面活性剤には、単独使用ではパルボウイルスB19の抗原抗体同時検出系における感度を向上させる効果は認められないが（下記実施例の(１２)参照）、他の添加剤として、例えば異なる目的で、パルボウイルスB19の抗原抗体同時検出系における感度を向上させる界面活性剤と組み合わせて使用することは差し支えない。
　陰イオン性界面活性剤の好ましい例としては、分子内に炭素原子９個以上、より好ましくは炭素原子１１個以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤が挙げられる。アルキル基は、好ましくは直鎖アルキル基である。炭素原子９個以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などのアルキル硫酸エステル塩、N-デカノイルサルコシンナトリウム（NDS）、N-ラウロイルサルコシンナトリウム（NLS）、N-ミリストイルサルコシンナトリウム等のＮ－アシルサルコシン塩、ドデシルベンゼンスルホン酸（SBDS）などのアルキルベンゼンスルホン酸塩などが挙げられる。
　両性界面活性剤の好ましい例としては、分子内に炭素原子１０個以上、より好ましくは炭素原子１２個以上のアルキル基と、第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤が挙げられる。アルキル基は、好ましくは直鎖アルキル基である。炭素原子１０個以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤の好ましい例としては、CH3-(CH2)n-N+(CH3)2-[(CH2)3-SO3 -]（nは９以上の整数）で表される構造の両性界面活性剤を挙げることができ、具体例として、N-デシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C10APS）、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C12APS）、N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C14APS）、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C16APS）などが挙げられる。
　陽イオン性界面活性剤の好ましい例としては、分子内に炭素原子１０個以上、より好ましくは炭素原子１２個以上のアルキル基と、第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤が挙げられる。アルキル基は、好ましくは直鎖アルキル基である。炭素原子１０個以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤の好ましい例としては、CH3-(CH2)n-N+(CH3)3・Br-、及びCH3-(CH2)n-N+(CH3)3・Cl-（いずれもnは９以上の整数）で表される構造の陽イオン性界面活性剤を挙げることができ、具体例として、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（C10TAB）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（C12TAB）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（C14TAB）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（C16TAB）、デシルトリメチルアンモニウムクロライド（C10TAC）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（C12TAC）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド（C14TAC）、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（C16TAC）などが挙げられる。
　上記の中でも特に、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C12APS）、N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C14APS）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、N-ラウロイルサルコシンナトリウム（NLS）、ドデシルベンゼンスルホン酸（SBDS）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（C12TAB）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（C14TAB）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（C12TAC）、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド（C14TAC）からなる群より選択される少なくとも１種、又は、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C12APS）、N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート（C14APS）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、及びN-ラウロイルサルコシンナトリウム（NLS）からなる群より選択される少なくとも１種を好ましく用いることができる。
　反応系内における界面活性剤の濃度は、パルボウイルスB19の抗原及び抗体を同時に検出できる濃度であれば特に限定されないが、例えば、0.01～10 %、0.03～7 %、0.05～5 %、0.1～3 %、または0.5～2 %の範囲で行うことができる。ここで％は重量％である。パルボウイルスB19の抗原抗体同時検出系における感度を向上させる効果を有する複数の界面活性剤を組み合わせて用いる場合は、合計の濃度が上記の範囲であればよい。
　本発明によるパルボウイルスB19の抗原・抗体の同時検出は、典型的には免疫測定法により行われる。免疫測定法としては、サンドイッチ法および競合法を用いることができるが、サンドイッチ法を用いることが好ましい。サンドイッチ免疫測定自体は周知の常法である。具体例を挙げると、化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA）、酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光免疫測定法等の各種の手法があり、本発明においてはいずれの手法を用いてもよい。
　なお、本発明において、「検出」という語には、定性的検出、定量的検出、及び半定量的検出が包含される。また、「測定」という語には、定性的検出、定量及び半定量が包含される。
　第１のプローブとしては、パルボウイルスB19抗原に特異的に結合する分子を用いることができる。そのような特異結合分子の典型例として、パルボウイルスB19抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を挙げることができる。第１のプローブは、そのような分子を１種類だけ使用してもよいし、複数種類のそのような分子を組み合わせて使用してもよい。第１のプローブとして抗体を用いる場合、ポリクロ―ナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定の再現性等の観点からはモノクローナル抗体が好ましい。
　第２のプローブは、抗パルボウイルスB19抗体が特異的に結合する分子であり得る（第２－１のプローブ）。そのような分子の典型例として、パルボウイルスB19抗原の全長又は部分領域を含むポリペプチド、好ましくはパルボウイルスB19抗原の部分領域を含むポリペプチドを挙げることができる。第２－１のプローブは、IgM型抗体以外の抗パルボウイルスB19抗体も捕捉するので、例えば検体中にIgG型抗パルボウイルスB19抗体も存在する場合には、当該IgG型パルボウイルスB19抗体も第２－１のプローブによって捕捉される。従って、IgM型の抗パルボウイルスB19抗体を特異的に検出するためには、第２－１のプローブと検出対象抗体を反応させる工程に加えて、ヒトIgM型抗体に特異的に結合する分子と検出対象抗体を反応させる工程も必要となる。ヒトIgM型抗体に特異的に結合する分子の典型例として、抗ヒトIgM抗体又はその抗原結合性断片を挙げることができる。抗ヒトIgM抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
　あるいは、第２のプローブとして、ヒトIgM型抗体に特異的に結合する分子（第２－２のプローブ）を使用してもよい。そのような分子の典型例としては、上述した通り、抗ヒトIgM抗体又はその抗原結合性断片を挙げることができる。この場合には、当該第２－２のプローブと検出対象抗体を反応させる工程に加えて、第２－１のプローブとして使用され得る、上記した抗パルボウイルスB19抗体が特異的に結合する分子と検出対象抗体を反応させる工程をさらに実施する。第２－２のプローブとして用いる場合も、抗ヒトIgM抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
　本発明では、第２のプローブとして、上記した第２－１のプローブ及び第２－２のプローブの少なくともいずれかを用いればよい。また第１のプローブと同様に、第２のプローブも、１種類の分子のみを用いてもよいし、複数種類の分子を組み合わせて用いてもよい。
　パルボウイルスB19は、構造タンパク質として、主要カプシド抗原であるVP2と、マイナーカプシド抗原であるVP1とを有する。VP1は、VP2のＮ末端が伸長されたタンパク質である。パルボウイルスB19の主要カプシド抗原VP2のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。VP2のアミノ酸配列は、GenBankにアクセッション番号CBI63309.1で登録されている。パルボウイルスB19の塩基配列は、GenBankにアクセッション番号FN598217.1で登録されている。配列番号２に示す塩基配列は、パルボウイルスB19の全長塩基配列である。VP2抗原（配列番号１）をコードする塩基配列は、配列番号２の3304～4968番目の塩基配列である。
　本発明における「パルボウイルスB19抗原」には、VP2とVP1の両者が包含されるが、VP2であることが好ましい。すなわち、本発明の同時検出法では、検体中のVP1抗原及びVP2抗原の少なくともいずれかと、検体中のIgM型抗VP1抗体及びIgM型抗VP2抗体の少なくともいずれかとを同時検出すればよいが、検体中のVP2抗原及びIgM型抗VP2抗体を同時検出することが好ましい。VP2と結合可能な第１のプローブとしては、例えば、VP2に特異的に結合する抗VP2抗体又はその抗原結合性断片を挙げることができる。IgM型抗VP2抗体と結合可能な第２のプローブとしては、例えば、VP2の全長又は部分領域を含むポリペプチド、好ましくはVP2の部分領域を含むポリペプチドを挙げることができる。第２－２のプローブを用いてVP2抗原及びIgM型抗VP2抗体の同時検出を実施する場合には、第２－２のプローブで検体中のIgM型抗体を捕捉した後、例えば、VP2の全長又は部分領域を含むポリペプチドに標識物質を結合させた標識VP2ポリペプチドを反応させて検出反応を行なえばよい。
　抗体及びその抗原結合性断片の作製方法自体は周知の常法である。抗パルボウイルスB19抗体は、例えば、パルボウイルスの主要抗原VP2又はその部分断片を適宜アジュバントと共に動物（ヒトを除く）に免疫し、該動物から採取した血液から抗血清を得て、該抗血清中のポリクローナル抗体を精製することで、VP2に特異的に結合する抗パルボウイルスB19ポリクローナル抗体を得ることができる。免疫は、被免疫動物中での抗体価を上昇させるため、通常数週間かけて複数回行なう。抗血清中の抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、アフィニティーカラム精製等により行なうことができる。
　抗パルボウイルスB19モノクローナル抗体は、例えば、周知のハイブリドーマ法により作製することができる。具体的には、パルボウイルスB19の主要抗原VP2又はその部分断片を適宜アジュバントと共に動物（ヒトを除く）に免疫し、該動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、VP2と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から抗体を回収することで、VP2に特異的に結合する抗パルボウイルスB19モノクローナル抗体を得ることができる。
　抗ヒトIgMポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体も、ヒトIgM又はその部分断片を免疫原として用いて、上記と同様に調製することができる。
　また、抗パルボウイルスB19抗体や抗ヒトIgM抗体は、市販の抗体を用いることができる。
　「抗原結合性断片」は、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している限り、いかなる抗体断片であってもよい。具体例としては、Fab、F(ab')2、scFv等を挙げることができるが、これらに限定されない。FabやF(ab')2は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）の作製方法も周知であり、例えば、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、該ベクターで大腸菌を形質転換してscFvを発現させ、これを大腸菌から回収することにより、scFvを得ることができる。
　パルボウイルスB19抗原の全長又は部分領域を含むポリペプチドは、化学合成、遺伝子工学的手法等の常法により作製できる。
　化学合成法の具体例としては、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等を挙げることができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。化学合成の場合は、アミノ酸配列のみに基づいて所望のポリペプチドを合成できる。
　遺伝子工学的手法によるポリペプチドの作製方法も周知である。VP2の全長又は部分領域を含むポリペプチドを遺伝子工学的手法により作製する場合には、例えば次の通りに行なえばよい。あらかじめクローニングした全長VP2のDNAを鋳型とし、VP2の遺伝子配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行ない、VP2の全長又は所望の一部をコードするポリヌクレオチドを調製する。PCRに用いるプライマーは、配列番号２に示した塩基配列やGenBank等のデータベースに登録されているVP2配列情報等に基づいて適宜設計することができる。あるいは、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いた常法により調製することもできる。各アミノ酸をコードするコドンが公知であるから、アミノ酸配列さえ特定できれば、そのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列も決定できる。次いで、調製したポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込み、適当な発現系にてポリペプチドを発現させ、このポリペプチドを回収することで、所望のポリペプチドを得ることができる。用いるベクターや各種の発現系（細菌発現系、酵母細胞発現系、哺乳動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、無細胞発現系など）も周知であり、種々のベクターや宿主細胞、試薬類、キットが市販されているため、当業者であれば適宜選択して使用することができる。ヒト由来培養細胞も市販・分譲されており、入手は容易である。
　なお、本発明において、パルボウイルスB19抗原の「部分領域」とは、捕捉対象となる抗体が抗原抗体反応により結合するのに十分な長さの領域であればよい。この分野において、約７残基のサイズのポリペプチドであれば抗原性を発揮することが知られている。従って、部分領域は、７残基以上、好ましくは１０残基以上の領域であり得る。ただし、部分領域のサイズがあまりに小さいと、目的外の抗体とも交差反応してしまう可能性が高くなるので、部分領域は、例えば３０残基上、４０残基以上、５０残基以上、又は１００残基以上としてもよい。
　パルボウイルスB19の抗原・抗体同時検出のためには、第１のプローブと第２のプローブとの間で結合反応が生じない構成にする必要がある。例えば、VP2抗原及びIgM型抗VP2抗体を同時検出する態様において、第２のプローブとして第２－１のプローブを使用する場合には、第１のプローブとして使用する抗VP2抗体又はその抗原結合性断片が認識する領域を含まないポリペプチドを第２－１のプローブとして用いる。すなわち、第２－１のプローブとして、VP2の部分領域を含み、かつ、第１のプローブが認識する領域を含まないポリペプチドを用いる。好ましい具体例を挙げると、例えば、第１のプローブの好ましい具体例として、VP2抗原の279番目～388番目に含まれるエピトープを認識する抗体又はその抗原結合性断片を挙げることができるが、この好ましい第１のプローブと組み合わせて用いる第２－１のプローブの好ましい具体例としては、VP2の部分領域を含み、かつ、VP2の279番～388番アミノ酸の領域を含まないポリペプチドを挙げることができ、より具体的には、配列番号１の1番～278番アミノ酸の領域、389番～554番アミノ酸の領域、及びこれら領域の部分領域から選択される領域を含むポリペプチドを挙げることができる。
　また、本発明の同時検出法をサンドイッチ免疫測定により実施する場合、採用する第２のプローブの種類に応じて、標識抗体の他に標識抗原ポリペプチドが使用され得るが、標識抗原及び標識抗体と第１のプローブ及び第２のプローブとの間でも結合反応が生じない構成にする必要がある。
　以下、本発明のヒトパルボウイルスB19抗原・抗体同時検出方法を、第１のプローブ及び第２のプローブを固相に固定化して固相プローブとして使用するサンドイッチ免疫測定により実施する場合を例に、具体的に説明する。第２のプローブとして第２－１のプローブを用いる態様と、第２－２のプローブを用いる態様に分けて、それぞれ説明する。
A.　第２－１のプローブを用いた同時検出
　第１のプローブとして、検体中のパルボウイルスB19抗原（被検抗原）と特異的に結合する抗パルボウイルスB19抗体を、第２のプローブとして、検体中のIgM型抗パルボウイルスB19抗体（被検抗体）が特異的に結合する、パルボウイルスB19抗原の部分領域を含むパルボウイルスB19抗原ポリペプチド（第２－１のプローブ）を用いる。まず、これらのプローブを固相に固定化する。固相としてプレートを用いる場合、第１のプローブ及び第２－１のプローブは、同一の固相担体（同一のウェル）に固定化される。磁性粒子などの粒子を固相として用いる場合、第１のプローブ及び第２－１のプローブは、同一の固相担体（同一の粒子）に固定化されてもいいし、あるいは、異なる固相担体（異なる粒子）にそれぞれのプローブを固定化した後、粒子を混合して用いてもよい。
　次いで、界面活性剤の存在下で、固相プローブと検体を接触させる（一次反応工程）。固相としてプレートを用いる場合は、２つの固相プローブを含むウェルに検体（検体希釈液により適宜希釈してもよい）と界面活性剤を添加すればよい。固相として粒子を用いる場合は、２つの固相プローブを含む粒子と検体と界面活性剤を混合すればよい。これにより、検体中のパルボウイルスB19抗原タンパク質が第１のプローブを介して、また検体中の抗パルボウイルスB19抗体（検体中にIgG型の抗パルボウイルスB19抗体も存在する場合には、IgM型抗パルボウイルスB19抗体の他にIgG型抗パルボウイルスB19抗体も含まれ得る）が第２－１のプローブを介して、それぞれ固相上に捕捉される。
　次に、固相上に捕捉されなかった検体中の成分を、例えば適当な緩衝液で固相を洗浄することによって除いた後、標識物質で標識された適当なプローブを固相と接触させ、固相上に捕捉された被検抗原及び被検抗体と標識プローブとをそれぞれ結合させる（二次反応工程）。被検抗原の検出のために第１のプローブと組み合わせて使用される標識プローブを便宜的に第３のプローブと呼ぶ。第３のプローブとしては、第１のプローブとは異なる部位で被検抗原に特異的に結合する分子（典型的には、第１のプローブとは異なる部位で被検抗原と結合する抗パルボウイルスB19抗体）に標識物質を結合させたものを用いることができる。また、被検抗体の検出のために第２－１のプローブと組み合わせて使用される標識プローブを便宜的に第４－１のプローブという。第４－１のプローブとしては、ヒトIgM型抗体と特異的に結合する分子（典型的には抗ヒトIgM抗体）に標識物質を結合させたものを用いることができる。二次反応工程は、界面活性剤の存在下で行なってよいし、非存在下で行なってもよい。
　第３及び第４－１のプローブには、同じ標識物質を結合させてもよいし、異なる標識物質を結合させてもよい。本発明においては、パルボウイルスB19抗原とIgM型抗パルボウイルスB19抗体とを区別して検出することは必須的ではないので、第３及び第４－１のプローブには同じ標識物質を結合してよく、例えば、どちらにもALPを結合してよい。異なる標識物質を結合した場合には、各標識物質からのシグナルを区別できるので、パルボウイルスB19抗原とIgM型抗パルボウイルスB19抗体とを区別して検出することが可能である。
　第１のプローブと標識された第３のプローブは、互いに異なる部位でパルボウイルスB19抗原に結合する、すなわちエピトープが互いに異なる抗パルボウイルスB19抗体であるが、いずれも、第２－１のプローブとの反応性を有しない。言い換えると、第２－１のプローブとして用いるポリペプチドは、第１のプローブが認識する領域を含まず、かつ、標識された第３のプローブが認識する領域を含まない。抗体のエピトープは、短いペプチドを用いた常法のエピトープマッピングにより絞り込むことができるので、公知の抗体や新たに調製した抗体についてエピトープを調べ、認識領域が重複しない適当な組み合わせを選択すればよい。
　二次反応の終了後、例えば適当な緩衝液で固相を洗浄し、未反応の成分を反応系内から除去する。次いで、標識物質からのシグナルを適当な方法で検出する。これにより、検体中に含まれるパルボウイルスB19抗原及びIgM型抗パルボウイルスB19抗体を同時に測定することが可能となる。
　上記では、一次反応工程の後に二次反応工程を行う場合について説明したが、一次反応工程の前に二次反応工程を行ってもよいし（すなわち、標識プローブと検体との反応を先に行なってもよい）、一次反応工程と二次反応工程を同時に行ってもよい。
B.　第２－２のプローブを用いた同時検出
　この態様では、第２のプローブとして抗ヒトIgM抗体（第２－２のプローブ）を使用する。抗ヒトIgM抗体及び第１のプローブである抗パルボウイルスB19抗体を固相に固定化して固相プローブとし、界面活性剤の存在下で固相プローブと検体を接触させる（一次反応工程）。
　二次反応工程において用いる標識された第３のプローブは、上記Aの態様と同様のものを用いればよい。被検抗体の検出のために第２－２のプローブと組み合わせて用いる標識プローブ（第４－２のプローブ）は、抗パルボウイルスB19抗体が特異的に結合する分子に標識物質を結合させたプローブであり、例えば、パルボウイルスB19抗原の部分領域を含むポリペプチドに標識物質を結合させたプローブを好ましく用いることができる。
　第１のプローブ及び標識された第３のプローブは、第４－２のプローブとの反応性を有しない。言い換えると、第４－２のプローブとして用いるポリペプチドは、第１のプローブが認識する領域を含まず、かつ、標識された第３のプローブが認識する領域を含まない。
　その他の条件、手順等は、上述の「A.　第２－１のプローブを用いた同時検出」と同様である。
　免疫測定に用いる固相は特に限定されず、公知の免疫測定系で使用されている固相と同様でよい。固相の材質の具体例としては、ポリスチレン、ポリエチレン、セファロース等が挙げられるが、これらに限定されない。固相の物理的形状は本質的に重要ではなく、プレート状、粒子状、膜状など種々の形状を採用できる。使用する固相は、その表面への抗体の固定化が容易で、測定中に形成される免疫複合体と未反応の成分を容易に分離できるものであることが好ましい。例えば、プレート、磁性粒子、ラテックス粒子、ビーズ、クロマトグラフィ用担体、メンブレン等を用いることができる。特に、通常の免疫測定法に使用されるプラスチックプレートや磁性粒子が好ましい。取り扱い、保存、および分離の容易性等の観点から、前述のような材質の磁性粒子を使用することが最も好ましい。これらの固相へのプローブの結合は、当業者に周知の常法によって行なうことができ、物理的吸着により行ってもよいし、共有結合を用いてもよい。例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、およびピリジル・ジスルフィド法などを使用することができる。或いは、緩衝液に磁性粒子を添加して分散した粒子懸濁液に、プローブ（抗体、抗原）を適当量加え、２０～３７℃にて１時間程度撹拌し、その後、磁性粒子を磁力で集め、粒子を適当な緩衝液により洗浄してプローブ（抗体、抗原）結合粒子を得ることができる。使用する緩衝液の組成は抗体や抗原の固定化に使用される一般的なものでよく、ｐＨは抗体が安定に存在し、固相への固定化を阻害しない範囲であればよい。
　標識物質も特に限定されず、公知の免疫測定系で使用されている標識物質と同様のものを用いることができる。具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、染色物質、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができるが、これに限定されるものではない。高い検出感度の測定系を提供するためには、ＡＬＰを用いることが望ましい。上述した通り、第３のプローブ及び第４のプローブ（第４－１のプローブ、又は第４－２のプローブ）には、同じ標識物質を結合してよい。これらの標識物質の抗体又は抗原への結合は、当業者に周知の常法によって行なうことができる。標識物質の結合は、共有結合が好ましく、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、およびピリジル・ジスルフィド法などを使用することができる。抗体に標識物質を結合させる場合には、例えば、抗体をペプシン処理および還元処理して得られた抗体断片と、マレイミド化したＡＬＰを混合して、標識物質で標識された抗体を調製することができる。
　標識物質として酵素を用いる場合、該酵素に対応した発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を該酵素と反応させ、その結果発生するシグナルを測定することにより、酵素活性を求め測定対象物を測定することができる。例えば、標識物質としてＡＬＰを用いる場合、３－（４－メトキシスピロ（１，２－ジオキセタン－３，２’－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン）－４－イル）フェニルホスフェート２ナトリウム（例えば商品名ＡＭＰＰＤ）などの発光基質を用いることができる。
　標識物質としてビオチン又はハプテンが用いられる場合には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、染色物質又は放射性物質などを結合したストレプトアビジン又はハプテン抗体などを用いて検出することができる。
　シグナルの検出は、標識物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、シグナルが発色であれば比色計や吸光光度計を、蛍光であれば蛍光光度計を、発光であればフォトンカウンターを、放射線であれば放射線測定装置をそれぞれ用いればよい。
　陰性コントロールとして、パルボウイルスB19に感染歴のない健常人由来の検体を本発明の同時検出法に付してもよい。健常人検体から得られたシグナル値と、被検者検体から得られたシグナル値を比較し、被検者検体のシグナル値が高かった場合には、被検者検体中にパルボウイルスB19抗原及びIgM型抗パルボウイルスB19抗体の少なくともいずれかが存在する（パルボウイルスB19陽性）、と判定することができる。予め複数の健常人検体について測定を行ない、得られたシグナル値から、パルボウイルスB19陽性か否かを判定するためのカットオフ値を算出してもよい。カットオフ値としては、陰性コントロールのシグナル値の平均値、あるいは平均値＋2SD（SDは標準偏差）などを用いることができる。被検者検体から得られたシグナル値がカットオフ値以上の場合、パルボウイルスB19陽性と判定することができる。さらにカットオフ値と被検者検体から得られたシグナル値を比較し、適当な計算式によって判別値を求めてもよい。この場合、判別値が、予め設定した値以上になる場合には、パルボウイルスB19陽性と判定することができる。
　さらに陽性コントロールを本発明の同時検出法に付してもよい。陽性コントロールとしては、パルボウイルスB19抗原陽性検体、リコンビナントパルボウイルスB19抗原、IgM型抗パルボウイルスB19抗体陽性の検体、精製IgM型抗パルボウイルスB19抗体、他の動物種で免疫して得られたIgM型抗パルボウイルスB19抗体、およびこれらの混合物などを適切な濃度で含む溶液を用いることができる。
　カットオフ値は、陽性コントロールと陰性コントロールから得られたシグナル値から設定することもできる。この場合も、被検者検体から得られたシグナル値がカットオフ値以上となる場合には、パルボウイルスB19陽性と判定することができる。さらに判別値を求め、該判別値が予め設定した値以上となる場合には、パルボウイルスB19陽性と判定することができる。あるいはまた、複数の陽性コントロール及び複数の陰性コントロールについてそれぞれシグナル値を求めて、それらシグナル値の平均値等から陽性基準値及び陰性基準値を設定してもよい。被検者検体のシグナル値が陰性基準値未満であればパルボウイルスB19陰性（被検者検体中にパルボウイルスB19抗原及びIgM型抗パルボウイルスB19抗体のいずれも存在しない）、陽性基準値以上であればパルボウイルスB19陽性、陰性基準値以上～陽性基準値未満であれば感染の疑いあり、のように判定することも可能である。
　本発明の抗原抗体同時検出法が適用される検体は、被検者から分離された検体である。被検者がパルボウイルスB19に感染していた場合に該ウイルスの抗原及び抗体を含むと予想される試料であれば特に限定されず、好ましい具体例としては、全血、血漿及び血清を挙げることができる。検体は、必要に応じ適宜希釈して使用してよい。
　被検者は、哺乳動物であれば特に限定されないが、一般的にはヒトであり、例えば、パルボウイルスB19感染者又は感染の疑いのある患者であり得る。
　本発明によるパルボウイルスB19抗原・抗体の同時検出キットは、パルボウイルスB19抗原と結合可能な第１のプローブと、IgM型抗パルボウイルスB19抗体と結合可能な第２のプローブと、界面活性剤とを含む。該キットは、免疫測定による同時検出、好ましくはサンドイッチ免疫測定による同時検出キットであり得る。例えば、該キットは、プレート状の固相担体をさらに含み、第１のプローブ及び第２のプローブがプレートの同一のウェル内に固定化された形態でこれらプローブを含み得る。あるいは、該キットは、固相担体として、磁性粒子やラテックス粒子、ビーズ等の粒子状担体をさらに含み、第１のプローブ及び第２のプローブが同一の又は異なる担体粒子に固定化された形態でこれらプローブを含み得る。異なる担体粒子に固定化されている場合、粒子を混合して第一反応工程に用いる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（１）　リコンビナントVP2抗原の調製
　パルボウイルスの主要構成タンパク質であるVP2の発現は以下のようにして行った。即ち、クローニングしておいたVP2全長DNAを、制限酵素で切断し、対応する制限酵素で切断したBaculovirus Transfer Vector（pAcYM1）に組み込んだ。このプラスミドをリポフェクチン法により、Baculo Gold Liniarized Baculovirus DNA（Pharmagen社製）と共に、昆虫細胞Sf9細胞に導入した。導入細胞を数日培養後、培養上清のウイルスを回収した。さらにこのウイルスを純化するために、限外希釈法を用いてウイルスのクローニングを行った。この純化した組換えウイルスを昆虫細胞Sf21細胞に感染させ、培養後の昆虫細胞から組換えタンパク（VP2）を回収・精製した。
　昆虫細胞からのVP2の回収・精製は、以下のように行った。即ち、昆虫細胞を遠心回収後、超音波破砕を行い遠心分離後、沈殿を回収した。沈殿物を洗浄し、リコンビナントVP2抗原を含む粗画分を回収した。事前の平板SDS-PAGEにより精製用SDS-PAGE Model 491 Prep Cell（BIO-RAD社製）の分離ゲル濃度を10 %と決め、円柱状分離ゲルの作製を行った。リコンビナントVP2粗画分をSDS濃度２％としたサンプルバッファー2 mLに溶解後、泳動を行い、円柱状のゲル先端より溶出するVP2を回収した。回収したVP2を、セントリプレップ（アミコン社製）を用いて濃縮し、リコンビナントVP2抗原を得た。
（２）　リコンビナントVP2部分ポリペプチドの調製
　パルボウイルスVP2抗原の部分配列を有するリコンビナントVP2部分ポリペプチドの発現は以下のようにして行った。クローニングしておいたVP2全長DNAを鋳型に、目的の部分配列（配列番号２の3304～4137番目の核酸配列、および配列番号２の4468～4968番目の核酸配列）を含むようにPCR増幅し、DNA断片をそれぞれ発現用ベクターpETBA (biodynamics)にクローニングした。得られた発現用プラスミドを大腸菌に導入し、VP2部分ポリペプチドを誘導発現させた。その後、大腸菌を遠心分離にて回収し、超音波破砕を行い遠心分離後、沈殿を回収した。沈殿物を洗浄し、リコンビナントVP2部分ポリペプチドを含む粗画分を回収した。粗画分をゲルろ過カラムにより精製し、配列番号２の1～278番目のアミノ酸配列を含むリコンビナントVP2部分ポリペプチド１と、配列番号２の389～554番目のアミノ酸配列を含むリコンビナントVP2部分ポリペプチド２を得た。
（３）　抗VP2モノクローナル抗体の確立
　抗VP2モノクローナル抗体は、上記（１）で得たリコンビナントVP2抗原をBALB/cマウスに免疫し、その脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより作製した。すなわち、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したリコンビナントVP2抗原を25～100μg/マウスで初回免疫を行い、２週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同抗原で追加免疫を行った。さらに、約２週間後、生理食塩水に溶解したリコンビナントVP2抗原を静脈内投与し、その３～４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調製した。前もってRPMI-1640培地で培養していたマウスミエローマ細胞(P3U1)と脾細胞を１：２～１：５の比率で混合し、ポリエチレングリコールを用い細胞融合を行った。融合した細胞はヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＨＡＴ培地に浮遊した後、96ウェル培養プレートに分注し37℃、CO2インキュベーターで培養した。
　その後、培養上清の一部をとり、上記（１）で調製したリコンビナントVP2抗原を固相化した96ウェルELISAプレートを用いたELISA法により、抗VP2抗体を産生するウェルをスクリーニングし、VP2に対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマについて、常法の限界希釈法に従い、単一クローン化を行い、3種類の抗VP2抗体（VP2-1、VP2-2、VP2-3）産生ハイブリドーマを得た。
（４）　モノクローナル抗体の作製
　上記(３)で得たハイブリドーマを、あらかじめプリスタン0.5mLを腹腔に投与したマウス腹腔に1匹当たり約1×107個移植し、腹水中に産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノクローナル抗体の精製は、プロテインAを結合させたセファロースカラム（バイオラッド社製）によりIgGフラクションを分離することにより行った。
　次に、得られたモノクローナル抗体それぞれについて、２０～３０アミノ酸からなるペプチドマッピングにより、各ポリペプチドに対する反応性を調べた。その結果、モノクローナル抗体VP2-1は、配列番号１の279番目～298番目のアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体であり、モノクローナル抗体VP2-2は、配列番号１の329番目～358番目のアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体であり、モノクローナル抗体VP2-3は、配列番号１の359番目～388番目のアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する抗体であることが確認された。
（５）　標識モノクローナル抗体の調製
　マウス抗ヒトIgMモノクローナル抗体とウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタケらの方法（Yoshitakeet al., J. Biochem. 1982, 92(5), p.1413-1424）により結合させ、ALP酵素標識抗ヒトIgMモノクローナル抗体を調製した。
　具体的には、脱塩処理したマウス抗ヒトIgMモノクローナル抗体（終濃度3mg/mL）とペプシン（終濃度6μg/mL）を0.1M クエン酸バッファー（pH3.5）中で混合し、37℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Ｆｃ領域を除去した抗体を得た。次に、２－メルカプトエタノール（終濃度10mM）を添加して37℃にて３時間静置し、チオール化を行った。更に脱塩処理し、マウス抗ヒトIgMモノクローナル抗体のFab’を得た。
　一方、脱塩したアルカリホスファターゼとＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（GMBS）（終濃度0.3mg/mL）を混合し、30℃で１時間静置してマレイミド化を行った。
　脱塩した後、Fab’とマレイミド化アルカリホスファターゼをモル比1:1の割合で混合し、25℃にて30分静置してカップリングを行った。カップリング液に２－メルカプトエタノール（終濃度10mM）を添加して4℃にて一晩静置し、反応を停止させた。濃縮および脱塩後、1% BSA、1mM NaCl、0.1mM ZnCl2を含有する100mM MES (pH6.8)を加えて200μg/mLに調製し、ALP標識抗ヒトIgMモノクローナル抗体溶液とした。
　抗VP2モノクローナル抗体VP2-1についても、同様にして処理し、ALP標識抗VP2モノクローナル抗体VP2-1を得た。
（６）　パルボウイルスB19抗原および抗パルボウイルスB19抗体の同時測定用サンドイッチELISAの確立、ならびに両性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤の添加の評価
　NUNC社製ELISAプレートに、１ウェルあたり、2 μg/mLのリコンビナントVP2部分ポリペプチド１および２と、1μg/mLのVP2-2抗体及びVP2-3抗体を含む100μL PBS（pH7.4）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを350μLのPBSで３回洗浄し、ブロッキング溶液（0.5% カゼイン、3% スクロース、0.05% プロクリンを含むPBS）300μL/ウェルを添加して、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、下記表１及び表２に示す各界面活性剤をそれぞれ含む１次反応溶液（1% BSA、0.05% カゼイン、0.05% プロクリンを含むPBSに各界面活性剤を終濃度0.5％で添加）により２０倍希釈した検体100μLをウェルにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液（0.1% Tween20を含むPBS）300μLで洗浄後、1μg/mLのALP標識抗VP2モノクローナル抗体VP2-1と0.5μg/mLのALP標識抗IgMモノクローナル抗体とを含む２次反応溶液（1% BSA、0.05% カゼイン、0.05% プロクリンを含むPBS）100μLをウェルにそれぞれ添加し、37℃で１時間インキュベートした。その後、洗浄液300μLで洗浄し、PNPP Substrate Tablets (Thermo Fisher Scientific社製)１タブレットを5mLの希釈液(0.1 M 炭酸バッファー, 2.0 mM MgCl2, pH 9.8)で希釈した基質液100μLを添加し、37℃で３０分間インキュベートしたのちに、1N NaOHを50μL添加して反応を止めた。分光光度計により、各ウェルの吸光度（A415/630nm）を測定した。
　陽性検体としては購入検体を使用した。各陽性検体の抗パルボウイルスB19抗体のIgM価とIgG価、及びパルボウイルスB19のDNAレベル（IU/mL）を表１及び表２に示す。
　複数の陰性検体も各界面活性剤について同様に測定し、各界面活性剤について陰性検体の平均カウント値とＳＤを算出した。検体が陽性か否かを判定するためのカットオフ値を、陰性検体の平均カウント値＋２ＳＤの値に設定した。なお、カットオフ値は添加する界面活性剤の種類によって異なるため、界面活性剤毎に設定した。さらに、各陽性検体について、カウント値をカットオフ値で除した値を求めて判別値とした。この判別値が１以上の場合には、検体中にパルボウイルスB19抗原及び抗パルボウイルスB19抗体の少なくともいずれかが存在する（パルボウイルスB19陽性）と判別することができる。
　結果を表１及び表２に示す。表１及び表２には、各界面活性剤を添加した条件における判別値を示す。界面活性剤を添加した際の効果は、界面活性剤添加した時の判別値を非添加の時の判別値で除したものの百分率で判断した。両性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤を反応液中に添加することによって、非添加条件に対し、複数の検体において、検出感度の上昇が認められた。特に、C12APS、C14APSの添加では、検出感度の顕著な上昇が認められた。また、SDS、NLSの添加でも、検出感度が大幅に上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（７）　両性界面活性剤（C12APS）の添加濃度の評価
　次いでC12APSの添加濃度について評価した。測定は、上記（６）と同様に行った。結果を表３に示す。表中、「対非添加」は、界面活性剤添加時の判別値／非添加時の判別値（％）である（表４～表１０でも同様）。検討したC12APSの添加濃度0.05%～5.0%の全ての範囲で、非添加条件に対し、検出感度の上昇が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（８）　陰イオン性界面活性剤（NLS）の添加濃度の評価
　NLSの添加濃度について評価した。測定は、ブロッキング溶液（2.0% BSA、3% スクロース、0.05% プロクリンを含むPBS）、１次反応液（2% BSA、0.1% プロクリンを含むPBS)及び２次反応液（2% BSA、0.1% プロクリンを含むPBS）を用いた点を除いて上記（６）と同様に行った。結果を表４に示す。検討したNLSの添加濃度0.05%～5.0%のほぼ全ての範囲で、非添加条件に対し、検出感度の上昇が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（９）　両性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤の添加の評価
　分子内にアルキル基と第四級アンモニウムを含む両性界面活性剤について、アルキル基の鎖長を更に評価した。測定は、上記（６）と同様に行った。結果を表５および表６に示す。C10APSおよびC16APSを反応液に添加することによって、界面活性剤非添加条件に対し、検出感度の上昇が認められ、C10以上のアルキル基を有する両性界面活性剤では検出感度の上昇効果があることが示された。
　さらにC12のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤SDBS、及びC9のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤NDSの添加効果を評価した。測定は、上記（６）と同様に行った。結果を表６および表７に示す。SDBSおよびNDSを反応液に添加することによって、界面活性剤非添加条件に対し、検出感度の上昇が認められ、C9以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤では検出感度の上昇効果があることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（１０）　陽イオン性界面活性剤の添加の評価
　陽イオン性界面活性剤の添加効果を評価した。上記（８）と同様の方法で行った。結果を表８に示す。陽イオン性界面活性剤を反応液中に添加することによって、非添加条件に対し、複数の検体において、検出感度の上昇が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（１１）　陽イオン性界面活性剤（C12TAB）の添加濃度の評価
　C12TABの添加濃度について評価した。測定は、上記（１０）と同様に行った。結果を表９に示す。陽イオン性界面活性剤は、ＤＮＡ価の高い検体（PVP201-16）における改善効果が大きいことから、検体PVP201-16を用いて評価したところ、検討した界面活性剤の添加濃度0.05%～5.0%の全ての範囲で、非添加条件に対し、検出感度の上昇が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（１２）　非イオン性界面活性剤（Triton(登録商標)、Tween）の添加の評価
　非イオン性界面活性剤の添加効果を評価した。測定は、上記（６）と同様に行った。結果を表１０に示す。非イオン性界面活性剤を添加した場合は、非添加条件と同等の検出感度を示し、検出感度の上昇は認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010

Claims (16)

  1. 　検体中に存在する少なくとも１種のパルボウイルスB19抗原及び少なくとも１種のIgM型抗パルボウイルスB19抗体を同時に検出する方法であって、界面活性剤の存在下、同一の反応系内で、前記検体を、
    (１)　パルボウイルスB19抗原を検出するための第１のプローブ、及び
    (２)　IgM型抗パルボウイルスB19抗体を検出するための第２のプローブ
    に接触させることを含む、方法。
  2. 　前記界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記陰イオン性界面活性剤が、分子内に炭素原子９個以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤であり、前記両性界面活性剤が、分子内に炭素原子１０個以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤であり、前記陽イオン性界面活性剤が、分子内に炭素原子１０個以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤である、請求項２記載の方法。
  4. 　前記陰イオン性界面活性剤が、分子内に炭素原子１１個以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤であり、前記両性界面活性剤が、分子内に炭素原子１２個以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両性界面活性剤であり、前記陽イオン性界面活性剤が、分子内に炭素原子１２個以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する陽イオン性界面活性剤である、請求項３記載の方法。
  5. 　前記界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎ－デカノイルサルコシンナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ－ミリストイルサルコシンナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸、Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、Ｎ－テトラデシルーＮ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、Ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３記載の方法。
  6. 　免疫測定により行われ、前記第１のプローブは、パルボウイルスB19抗原に特異的に結合する少なくとも１種の抗体又はその抗原結合性断片を含み、前記第２のプローブは、パルボウイルスB19抗原の全長又は部分領域を含むポリペプチドであって、第１のプローブが認識する領域を含まないポリペプチド、及びヒトIgM型抗体に特異的に結合する抗ヒトIgM抗体又はその抗原結合性断片から選択される少なくとも１種を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記免疫測定がサンドイッチ免疫測定である、請求項６記載の方法。
  8. 　前記第２のプローブは、パルボウイルスB19抗原の全長又は部分領域を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む、請求項６又は７記載の方法。
  9. 　前記パルボウイルスB19抗原がVP2である、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが、同一の又は異なる固相担体に固定化された固相プローブとして用いられる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　第２のプローブがパルボウイルスB19抗原の部分領域を含む少なくとも１種のポリペプチドであり、検体を前記固相プローブと接触させた後、第１のプローブと異なる部位でパルボウイルスB19抗原と結合する標識された抗パルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片、及びヒトIgM型抗体に特異的に結合する標識された抗ヒトIgM抗体又はその抗原結合性断片を固相と接触させることを含む、請求項１０記載の方法。
  12. 　前記第２のプローブは、第１のプローブが認識する領域を含まず、かつ、前記標識された抗パルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片が認識する領域を含まない、請求項１１記載の方法。
  13. 　第２のプローブが抗ヒトIgM抗体又はその抗原結合性断片であり、検体を前記固相プローブと接触させた後、第１のプローブと異なる部位でパルボウイルスB19抗原と結合する標識された抗パルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片、及びパルボウイルスB19抗原の部分領域を含む標識されたポリペプチドと固相を接触させることを含む、請求項１０記載の方法。
  14. 　前記標識されたポリペプチドは、第１のプローブが認識する領域を含まず、かつ、前記標識された抗パルボウイルスB19抗体又はその抗原結合性断片が認識する領域を含まない、請求項１３記載の方法。
  15. 　前記検体が血液、血清、または血漿である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法に用いられるキットであって、パルボウイルスB19抗原を検出するための第１のプローブと、IgM型抗パルボウイルスB19抗体を検出するための第２のプローブと、界面活性剤とを含む、パルボウイルスB19抗原及びIgM型抗パルボウイルスB19抗体の同時検出キット。
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