CN109444428A - 一种定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,包括磁微粒混悬液、酶结合物、样品稀释液、校准品、发光底物及浓缩洗液;其中磁微粒混悬液中的固相载体为羧基化粒径为0.05‑1um磁微粒,包被抗原为基因重组抗原;酶结合物的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体。本发明试剂盒可利用全自动化学发光免疫分析仪对样本进行定量检测分析,具有操作简便、检测时间短、检测更加准确、检测线性范围宽的优点。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断免疫检测技术,尤其是涉及一种定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒。
背景技术
人类细小病毒B19(HPVB19)是线性单链DNA病毒,基因组大小为 5.6kb,归类为细小病毒亚科红病毒属。血液制品、2-7岁的儿童是HPV B19 病毒的主要传染源,呼吸道、血制品及母婴垂直传播是其常见的传播途径。HPV B19感染遍布全球,根据年龄和地域分布,感染率并不相同。大约有15%的学前儿童,50%成年人和85%老年人血清学阳性。HPV B19一般引起自限性疾病,感染症状因宿主的免疫功能及血液学体质的不同而异。感染儿童最典型的症状是传染性红斑(第五病);成人B19感染最常见的症状是关节炎和关节痛;孕妇感染 B19会导致胎儿水肿及胎儿贫血,严重时可导致流产,HPV B19被认为是仅次于HCMV的宫内感染最主要的病原之体一;对于免疫缺陷病人,如艾滋病患者、接受化疗或器官移植手术的癌症病人,因感染B19后不能产生中和抗体而导致慢性贫血,短暂的再生障碍性危象以及急性淋巴白血病等严重疾病,严重时可导致死亡。
抗体检测是目前临床诊断及流行病学调查B19感染的主要方法,检测方法主要有ELISA和胶体金,其不足之处有以下几点:1、手工操作,加样不精确;操作时间长、过程繁琐,易发生操作差错;这些误差和差错均会影响检测结果的准确度和精密度。2、检测过程处于开放的空间,容易引起各种试剂之间的交叉污染,进而影响检测结果的准确性。3、方法学上胶体金分析灵敏度低,肉眼判读结果也存在人为误差。4、基本上皆为定性产品,线性范围窄;定性产品用一个简单的颜色反应点来判定结果,容易产生假阳性或假阴性结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用化学发光法来定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,该试剂盒具有灵敏度高、线性检测范围广、重现性高等优点,且能自动化操作。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,包括B19-IgG磁微粒混悬液、磁微粒B19-IgG酶结合物、磁微粒B19-IgG样品稀释液、磁微粒B19-IgG校准品、发光底物及浓缩洗液;其中B19-IgG磁微粒混悬液中的固相载体为羧基化粒径为0.05-1um磁微粒,包被抗原为基因重组抗原;所述磁微粒B19-IgG酶结合物的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体。
所述B19-IgG磁微粒混悬液中的封保液为PH7~8的PBS缓冲液,其中包含防腐剂、蛋白质类稳定剂和表面活性剂。
所述磁微粒B19-IgG样品稀释液为PH7~8的PBS缓冲液,其中包含防腐剂、蛋白质类稳定剂及表面活性剂。
所述磁微粒B19-IgG校准品由B19-IgG高值阳性稀释配制的在0~100IU/mL之间的6个不同浓度点;其中校准品稀释液为PH7~8的PBS缓冲液,其中包含防腐剂,蛋白质类稳定剂和表面活性剂。
所述PH7~8的PBS缓冲液中的防腐剂为防腐剂Proclin300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上混合物;所述蛋白质类稳定剂为酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物;所述表面活性剂包括Triton X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。
所述发光底物包括发光底物A液和B液;其中发光底物A液由0.2M Tris-Hcl、0.15mM Luminol、0.59mM羟基香豆素、0.59mM没食子酸配制而成;发光底物B 液由0.2M乙酸-乙酸盐缓冲、0.85mM氨基酸氧化酶、0.008 Tween20、0.5mM二乙烯三胺五乙酸、0.12mM维生素C 配制而成。
所述浓缩洗液为10倍浓缩洗液,由NaH2PO4·2H2O 4.6g、Na2HPO4·12H2O 62.32g、NaCl 175.6g、Tween 20 2-10ml、蒸馏水1000ml配制而成。
本发明的优点在于提供了一种能定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒。由于妊娠期发生初次感染或复发感染,体内产生IgG 或IgM 是一个急剧变化的过程,只有通过定量分析浓度变化才能检测到,定量分析也有助于发现假阳性或假阴性结果,所以定量分析是TORCH筛查的最佳选择。
同时本发明试剂盒可利用全自动化学发光免疫分析仪对样本进行检测分析,具有操作简便、检测时间短、检测更加准确、检测线性范围宽的优点。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明,以方便本领域技术人员的理解。如无特殊说明,本实施例中所用的试剂和检测仪器均为市售产品,方法为本行业常规方法。
实施例1 制备定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒
1、配制B19-IgG磁微粒混悬液
1.1 取30ul混匀后的羧基表面磁珠原液用300ul的PBS缓冲液洗涤5次。
1.2 用20mg/ml的EDC和20mg/ml的NHS对磁微粒活化1小时。
1.3 用PH7~8 PBS缓冲液将活化后的磁微粒洗涤3次。
1.4 按照0.03ug/测试的量加入重组抗原,包被1小时。
1.5 用封保液封闭4次。
1.6 加入3ml封保液保存。
其中所用的封保液是由0.01M的PH7~8的PBS缓冲液配制,其中含有1‰(v/v)的防腐剂Proclin 300、0.2‰(w/v)的防腐剂NaN3,3%(w/v)稳定剂牛血清白蛋白,1‰(v/v)的表面活性剂Triton X-100,5%(v/v)的甘油。
2、配制磁微粒B19-IgG酶结合物
将辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体按照体积比1:2000~1:4000的比例稀释到酶结合物缓冲液中,得到酶结合物溶液;
所用的酶结合物缓冲液由0.05M的PH7~8的Tris缓冲液配制,其中含有1‰(v/v)的防腐剂Proclin 300、0.2‰(w/v)的防腐剂Bro,20%(v /v)稳定剂牛血清,1‰(v/v)的表面活性剂Triton X-100,0.2‰的胭脂红色素。
3、配制磁微粒B19-IgG样品稀释液
样品稀释液由0.01M的PH7~8的PBS缓冲液配制,其中含有1‰(v/v)的防腐剂Proclin300、0.2‰(w/v)的防腐剂NaN3,2%(w/v)稳定剂牛血清白蛋白,1%(v/v)的表面活性剂Triton X-100,0.2‰的柠檬黄色素,0.2‰的日落黄色素。
4、配制磁微粒B19-IgG校准品
校准品由B19-IgG高值阳性稀释配制的在0~100IU/mL之间的6个(0IU/ml、3IU/ml、10IU/ml、25IU/ml、50IU/ml、100IU/ml)浓度点;
所用的稀释液由0.01M的PH7~8的PBS缓冲液配制而成,其中含有1‰(v/v)的防腐剂Proclin 300、0.2‰(w/v)的防腐剂NaN3,2%(w/v)稳定剂牛血清白蛋白,0.2‰的柠檬黄色素,0.2‰的日落黄色素。
5、配制发光底物
发光底物A 液由0.2M Tris-Hcl、0.15mM Luminol、0.59mM 羟基香豆素、0.59mM 没食子酸配制而成;
发光底物B 液由0.2M 乙酸- 乙酸盐缓冲、0.85mM 氨基酸氧化酶、0.008 Tween20、0.5mM 二乙烯三胺五乙酸、0.12mM 维生素C 配制而成。
6、配制浓缩洗液
浓缩洗液为10倍浓缩洗液,由NaH2PO4·2H2O 4.6g、Na2HPO4·12H2O 62.32g、NaCl175.6g、Tween 20 2-10ml、蒸馏水1000ml配制而成。
实施例2 本发明试剂盒的使用方法
1.样本要求
1.1 采用正确医用技术收集全血样本,待血细胞在室温下凝聚后离心分离,提取血清用于检测。也可使用EDTA(1.5g/L全血)、柠檬酸钠(10.9mmol/L全血)或肝素钠(0.1-0.2mg/mL全血)作抗凝剂的血浆用于检测。
1.2 血清收集后在室温放置不可超过8小时。如果不在8小时内检测,需将样本放置在2-8℃的冰箱中;若需长时间保存或运输,则应冻存于-20℃以下,避免反复冻融。使用前恢复到室温,轻轻摇动混匀。
2.检验方法
2.1 消耗品检查:根据仪器说明装载或检查消耗品是否充足,参考相应的仪器系统操作说明。
2.2 试剂包装载:试剂包首次上机前,轻轻地倒转试剂包多次以混合新试剂包内的成分,避免产生气泡;不要倒转已经打开的试剂包;仪器通过扫描试剂包条码自动获取测试所需的参数。如果特殊情况下仪器无法识别条码,可以手工输入,参考相应的仪器系统操作说明。
2.3 测试:将样本容器放置在仪器配套样本架中;装载样本架,在仪器软件界面中输入样本信息;选择“运行”开始测试,系统自动进行试验操作。参考相应的仪器系统操作说明。
3.结果计算
选择适当的曲线拟合方式,本试剂盒推荐采用四参数拟合方式,以校准品浓度值为x轴,以校准品发光强度log值为y轴建立定标曲线。根据待测样本的发光强度值回算相应的浓度值。仪器自动操作系统可通过存储的定标曲线以及样本测试得到的信号值自动计算样本测试结果。
4.参考值
采用ROC曲线法确定参考值:样本浓度值<3IU/ml判为阴性;3IU/ml≤浓度值<5IU/ml判为可疑;浓度值≥5IU/ml判为阳性。正式产品上市后,参考值或许设定为样本浓度值<3IU/ml判为阴性,浓度值≥3IU/ml判为阳性,不设可疑区间。建议各实验室根据自身实际条件及接触人群建立正常参考值。
实施例3 人细小病毒IgG化学发光免疫检测试剂盒性能评价。
(1)线性的检测:
将3份接近100IU/ml的高值样本按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32稀释为6种浓度,其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限(3IU/ml)。将每一浓度的样本重复检测2次,计算平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数R,要求R≧0.99。
结果显示:在3~100IU/ml线性范围内,3份样本的相关系数r分别为0.9999、0.9998、0.9998,均符合要求。
(2)准确度的检测:
检测依据WHO国际参考品NIBSC(01/602)配制的2份企业准确度参考品,计算实测浓度与标示浓度偏差,要求偏差在15%以内。
结果显示:2份企业准确度参考品检测偏差均小于15%,均符合要求。
(3)精密度测定:
对重复性参考品Q1、Q2进行检测,每个样本每个浓度各做10个平行,用三批试剂盒进行检测,计算试剂盒批内及批间差。
结果显示:试剂盒批内及批间变异均小于8%。
(4)干扰性实验:
准备高低值样本各一份,血红蛋白分别用高值和低值样本配制(1000、500、250)mg/dL三个浓度梯度;甘油三脂(使用有机溶剂溶解的脂肪乳剂)分别用高值和低值样本配制(3000、1500、750)mg/dL三个浓度梯度;胆红素需先溶到二甲基甲砜(DMSO)中,分别用高值和低值样本配制(20、10、5)mg/dL三个浓度梯度,并做DMSO对照实验,每个浓度分别重复三次一天内完成。计算干扰率,干扰率计算公式:[(干扰样本浓度-对照样本浓度)-(溶剂样本浓度-对照样本浓度)]/对照样本浓度×100%,以±10%为可接受范围。
结果显示:1000mg/dL的血红蛋白、3000mg/dL的甘油三酯、20mg/dL的胆红素对检测结果无明显干扰。
Claims (7)
1.一种定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:包括B19-IgG磁微粒混悬液、磁微粒B19-IgG酶结合物、磁微粒B19-IgG样品稀释液、磁微粒B19-IgG校准品、发光底物及浓缩洗液;其中B19-IgG磁微粒混悬液中的固相载体为羧基化粒径为0.05-1um磁微粒,包被抗原为基因重组抗原;所述磁微粒B19-IgG酶结合物的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:所述B19-IgG磁微粒混悬液中的封保液为PH7~8的PBS缓冲液,其中包含防腐剂、蛋白质类稳定剂、表面活性剂和甘油。
3.根据权利要求1所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:所述磁微粒B19-IgG样品稀释液为PH7~8的PBS缓冲液,其中包含防腐剂、蛋白质类稳定剂及表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:所述磁微粒B19-IgG校准品由B19-IgG高值阳性稀释配制的在0~100IU/mL之间的6个不同浓度点;其中校准品稀释液为PH7~8的PBS缓冲液,其中包含防腐剂,蛋白质类稳定剂和表面活性剂。
5.根据权利要求2、3或4所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:所述防腐剂为防腐剂Proclin300、MIT、Bro、IPBC或NaN3中的一种或两种以上混合物;所述蛋白质类稳定剂为酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物;所述表面活性剂包括Triton X-100、Tween20、Tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。
6.根据权利要求1所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:所述发光底物包括发光底物A液和B液;其中发光底物A 液由0.2M Tris-Hcl、0.15mM Luminol、0.59mM 羟基香豆素、0.59mM 没食子酸配制而成;发光底物B 液由0.2M乙酸-乙酸盐缓冲、0.85mM氨基酸氧化酶、0.008 Tween20、0.5mM 二乙烯三胺五乙酸、0.12mM 维生素C 配制而成。
7.根据权利要求1所述的定量检测人细小病毒IgG抗体的试剂盒,其特征在于:所述浓缩洗液为10倍浓缩洗液,由NaH2PO4·2H2O 4.6g、Na2HPO4·12H2O 62.32g、NaCl 175.6g、Tween 20 2-10ml、蒸馏水1000ml配制而成。
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