KR100916992B1

KR100916992B1 - Ｂ형 간염 바이러스 ｓ 항원의 검출법

Info

Publication number: KR100916992B1
Application number: KR1020077006465A
Authority: KR
Inventors: 노보루 마키; 야스유키 후쿠다; 타츠지 키무라; 요코 오다; 치하루 오우에; 오사무 쿠사노
Original assignee: 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠
Priority date: 2004-09-22
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2009-09-14
Also published as: US8679762B2; CA2580620C; WO2006033368A1; EP1806363B1; JP4430677B2; EP1806363A4; CA2580620A1; CN101023098B; US20080193916A1; JPWO2006033368A1; EP1806363A1; KR20070056107A; ES2428630T3; CN101023098A

Abstract

[과제] 검체 중에 존재하는 가능성 있는 B형 간염 바이러스(HBV)의 이스케이프 변이체도 검출할 수 있는, HBV 또는 HBs 항원의 검출에 유용한 프로브와 그의 이용법을 제공한다.

[해결수단] 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상에 존재하는 에피토프를 인식하는 프로브, 및 이 프로브를 이용하는 B형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스 s 항원의 검출법.

B형 간염 바이러스, 이스케이프 변이체, 프로브, 검출법

Description

Ｂ형 간염 바이러스 ｓ 항원의 검출법{Method of Detecting Hepatitis B Virus s Antigen}

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 s 항원(HBs 항원)의 신규 에피토프(epitope)를 인식하는 프로브 및 이 프로브를 사용한 HBV 또는 HBs 항원의 검출법에 관한 것이다.

바이러스 감염의 진단은 주로 바이러스나 바이러스 관련 성분(단백질이나 핵산)을 검출하는 방법과 바이러스 감염에 의해 생체가 생산하는 특이항체를 검출하는 방법에 의해 실시된다.

통상 HBV 감염의 유무는 HBs 항원이나 HBc 항체의 존재를 확인하는 것에 의해 알 수 있다. 또한 HBV의 감염성뿐만 아니라 HBV 캐리어의 병태나 예후, 치료 효과 판정의 지표로서 B형 간염 바이러스 e 항원(HBe 항원), 상기 항원에 대한 항체, HBV의 DNA (HBV-DNA) 양의 측정이 이용될 수 있다.

HBV의 바이러스 입자(HBV 입자)를 구성하고 있는 항원 중, HBs 항원은 감염성을 갖는 HBV 입자 표면의 주요 구성 외피 단백질로서, HBV-DNA를 포함하는 코어 입자를 둘러싸고 있는 간세포 유래의 지질 이중막에 포함되어 있다. 또한 HBV 감염자의 혈액 중에는 HBs 항원으로 이루어지는 감염성이 없는 소형 구형 입자나 관상 입자도 존재한다. 소형 구형입자는 혈중에 가장 다량으로 존재하고 있고, 1~ 수개의 HBV 입자에 대하여 약 1000개의 비율로 구형입자가 관찰된다. 현재 시판되고 있는 HBs 항원 검사약은 주로 이 소형 구형 입자의 형태에 있는 HBs 항원을 검출하는 것이다.

HBs 항원은 전장 226 아미노산 잔기(아미노산 번호: 1~226)으로 이루어지는 지질 이중막을 4회 관통하는 막 단백질이다. HBs 항원의 막 관통 구조 모델은 완전히 해명되어 있지 않지만, Howard 등 (비특허문헌 1 Howard et al. Viral Hepatitis and Liver Disease (ed by Zuckerman AJ, Alan R), p1094-1101, Liss Inc, New York, 1988.)은 HBs 항원의 N 말단측의 1번부터 11번까지 이루어지는 지질 이중층의 외측(ER 루멘측) 영역, 12번부터 28번까지 이루어지는 지질 이중막을 관통하는 소수성의 막 관통영역, 29번부터 80번까지 이루어지는 지질 이중층의 내측 영역, 81번부터 97번까지 이루어지는 소수성의 막 관통영역, 98번부터 156번까지 이루어지는 친수성의 ER 루멘 영역, 그리고 157번 이후의 2개의 소수성의 막 관통영역으로 이루어지는 것으로 제창하고 있다(도 1).

종래법에 있어서 HBs 항원의 검출에 사용되는 주요한 공통 항원결정기 a는 ER 루멘 측, 즉 바이러스 입자 표면에 국소적으로 존재하고 있는 98번부터 156번 까지의 아미노산에 포함되는 아미노산 번호 110~156 상에 위치하고 있다. 이 공통항원결정기 a는 복잡한 고차 구조로 이루어지고, 적어도 4개의 에피토프가 존재하는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 2).

한편, HBV는 DNA 바이러스이지만, 바이러스의 증식시에 DNA로부터 RNA를 복 제하고, 또한 RNA로부터 역전사효소에 의해 DNA를 합성하기 때문에, RNA형의 바이러스에 필적할 정도의 변이를 유발하는 것이 알려져 있다. 이 때문에, HBV가 감염되어 있는 개체 중에는 다종다양의 변이를 가진 변이주가 혼재되어 있는 것으로 생각되고 있다. 이와 같은 상태에서 외부로부터 중화 항체 등의 선택적인 압력이 가해지면, 그 압력에 감수성인 HBV 주(strains)가 감소되고, 반대로 이것에 저항성 또는 비감수성인 변이주가 증식하게 되는 현상이 생긴다. 근년 문제로 되는 소위 "이스케이프 변이주(escpae mutant)"는 상술한 주요 공통항원결정기 a에서 아미노산으로 치환이나 결실, 삽입이 생기는 것에 의해 변이 전의 항원결정기 a를 인식하는 항체로부터 피하여서 감염을 유지할 수 있도록 된 변이주이다.

이 이스케이프 변이주의 발생에 관한 문제점의 하나는 변이 전의 항원결정기 a를 이용한 백신 접종에 의해 유도된 항체로부터 피할 수 있기 때문에 지속 감염을 유발할 수 있는 점이다.

또 하나의 문제점은 종래의 HBs 항원검사법으로는 이 이스케이프 변이주가 검출될 수 없는 점이다. 일반적으로, 공통항원결정기 a의 이스케이프 변이주로는 야생형 공통항원결정기 a에 대한 모노클로날 항체와의 반응성이 저하되기 때문에 종래의 HBs 항원 검사법에 사용되는 야생형의 공통항원결정기 a에 대한 모노클로날 항체는 이스케이프 변이형의 HBs 항원을 인식할 수 없어, HBV 감염을 찾을 수 없게 되어 버린다. 예컨대 145번째의 아미노산이 야생주의 Gly로부터 Arg으로 변이된 145Arg 변이주는 공통항원결정기 a에 대한 모노클로날 항체와의 반응성이 현저히 저하되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 또한 실제로 이 종래의 HBs 항원측정 시약을 사용한 HBV의 스크리닝 검사에서 HBs 항원이 음성을 나타낸 혈액을 수혈하는 것에 의해 B형 간염 감염이 생긴 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3).

또하 HBV의 급성 감염에 있어서 감염 초기에 HBs 항원이 양성이고, 그 후 HBs 항원이 음성화되지만, HBs 항체는 양성으로 되는 현상이 보고되어 있다. HBs 항체가 양성으로 되는 것은 HBs 항원의 공통항원결정기 a에 대한 항체가, 감염자의 체내에서 생산되기 때문이다. 이 환자의 공통항원결정기 a에 대한 환자 자신의 항체는 HBs 항원검사약에 사용되고 있는 모노클로날 항체가 인식하는 공통항원결정기 a와 동일한 영역에 결합되기 때문에 양 항체 간의 경합에 의해 HBs 항원검사약의 감도 저하를 유발하여 검사약에 의한 검출을 방해하는 것으로 추정된다.

비특허문헌 1: Howard et al. Viral Hepatitis and Liver Disease (ed by Zuckerman AJ, Alan R), p1094-1101, Liss Inc, New York, 1988.

비특허문헌 2: 오카모토 히로아키에 의한 "Japanese Clinic, Molecular Hepatitis Virology, Fundamental-Clinic-Prophylaxis, Lower Volume, Hepatitis A, B, D, E Viruses, pp. 212-222, 1995년 10월 26일 발행.

비특허문헌 3: Thiers et al. Lancet, ii, 1273-1276, 1988.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

야생형의 공통항원결정기 a에 대한 모노클로날 항체를 사용한 종래의 HBs 항원검사약은 공통항원결정기 a 상의 이스케이프 변이주를 검출할 수 없기 때문에, 이 검사약의 사용에 의해 음성으로 판정된 혈액이 수혈에 사용되는 것에 의해 B형 간염의 감염을 유발할 가능성이 있다. 본원발명의 과제는 이러한 HBV 이스케이프 변이주도 검출할 수 있는 프로브 및 이 프로브를 사용한 HBs 항원측정법을 개발하는 것이다.

또한 본원발명은 HBs 항체 양성인 감염자 검체에서도 공통항원결정기 a에 대한 환자 자신의 항체에 의해 방해됨없이 HBs 항원을 측정할 수 있는 것과 같은 프로브 및 이 프로브를 사용한 HBs 항원측정법을 개발하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 서열번호 1에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상에 존재하는 에피토프(epitope)를 인식하는 항체를 프로브로 사용하는 것에 의해 상기 과제를 해결하는데 성공하였다.

즉 본 발명은 B형 간염 바이러스 s 항원의 26번부터 80번까지에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상에 존재하는 에피토프를 인식하는 프로브에 관한 것이고, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상에 존재하는 에피토프를 인식하는 프로브에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 프로브를 사용하는, B형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스 s 항원의 검출법에 관한 것이다.

본 명세서에서는 226개의 아미노산 잔기로 이루어지는 HBs 항원의 N 말단의 아미노산 잔기를 1번으로 하여 동일 항원 중의 부분 아미노산 서열의 위치를 나타내고 있다. 여기서 HBV 유전자의 S 영역에는 Pre-S1, Pre-S2 및 S 유전자가 존재하고 있고, 이들은 Pre-S1 + Pre-S2 + S 유전자에 지배되고 있는 389~400개의 아미노산 잔기로 이루어지는 Large S 단백질, pre-S2 + S 유전자에 지배되고 있는 281개의 아미노산 잔기로 이루어지는 Middle 단백질, 및 S 유전자에 지배되는 226개 아미노산 잔기로 이루어지는 Small S 단백질을 코드하고 있다(미타무라 케이지, "Japanese Clinic, Molecular Hepatitis Virology, Fundamental-Clinic- Prophylaxis", Lower Volume, pp.13-27, 1995년 10월 26일 발행). 일반적으로 HBs 항원으로 기재한 경우는 Small S 단백질을 의미하고, 본 명세서에서도 특별한 한정이 없는 한 그대로 표시하는 것으로 한다. 단 본 발명의 검출법은 Large S 단백질, Middle 단백질, Small S 단백질중 어떤 단백질이어도 검출할 수 있기 때문에 검출되는 B형 간염 바이러스 s 항원(HBs 항원)은 상기 3종의 단백질을 포함한다.

본 발명의 프로브는 서열번호 1에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상의 에피토프를 인식할 수 있는 프로브이고, 전형적으로는 상기 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이다. 보다 구체적으로는, 2004년 9월 9일에 국제미생물 기탁기관인 도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고우 켄큐쇼 특허생물기탁 센터 (일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 추오우 6)에 수령번호 FERM ABP-10115, ABP-10116 및 ABP-10117로서 기탁되어 있는 하이브리도마 세포주인 1C10, 4A3 또는 6G6 중 어느 하나에 의해 생산되는 모노클로날 항체이다.

서열번호 1에 표시되는 아미노산 서열은 HBs 항원의 26번부터 80번까지의 아미노산 서열, 즉 HBs 항원의 지질 이중막의 내측에 존재하는 친수성 영역에 상당한다. 상기 에피토프는 HBV 바이러스 입자, 소형 구형 입자 또는 관상 입자의 내측에 위치하기 때문에, HBs 항원의 공통항원결정기 a를 포함하는 ER 루멘 측에 위치하는 영역과는 달리, 상술한 이스케이프 변이주를 유도할 수 있는 외부로부터의 중화항체 등의 선택 압력을 받지 않는다. 따라서 종래법에서 공통항원결정기 a와 비교하면, 동일 에피토프 상의 변이는 선택 압력을 받기 어려워지므로 특정의 변이주만이 우세하게되어 HBs 항원측정시약에 반응하지 않는 변이주만이 증가하는 현상은 본 발명에서 에피토프에 관하여 말하면 전혀 생기지 않는 것으로 생각된다.

또한 본 발명의 프로브는 이것을 사용하여 HBs 항원을 검출하는 경우에 환자 자신의 HBs 항원에 대한 항체의 방해를 거의 받지 않는다. 이것은 본 발명의 프로브가 인식하는 에피토프가 HBV 입자, 소형 구형 입자 및 관상 입자에서 모두 그들 내측에 위치하고 있기 때문에 HBs 항원의 공통항원결정기 a와 비교하면 감염자의 체내에서 면역원으로서 작용할 가능성이 낮고, 환자 자신의 동일 에피토프에 대한 항체의 생산이 억제되기 때문으로 추정된다.

이와 같이, 본 발명의 프로브를 사용하는 것에 의해 공통항원잔기 a에 관하여 이스케이프 변이가 생긴 HBs 항원도 확실하게 검출할 수 있다.

또한 검체 중의 HBV 입자, 소형 구형 입자 또는 관상 입자에 존재하는 HBs 항원을 본 발명의 프로브를 사용하여 검출하기 위해서는 지질 이중층이나 구형 또는 관상 입자의 내측에 국소적으로 존재하고 있는 HBs 항원의 26번부터 80번까지의 아미노산 서열 상의 에피토프를 프로브와 접촉가능한 상태로 만드는 것이 필요로 하게된다.

본 발명의 다른 양태는 이 검체 중의 HBs 항원을 본 발명의 프로브를 사용하여 검출할 때에 지질이중층 또는 단백질의 응집체를 변성시킬 수 있는 변성제, 전형적으로는 계면활성제, 카오트로픽 이온 등의 단백질 변성제, 특히 계면활성제를 검체에 가하는 것을 포함하는, 검체 중의 HBV 또는 HBs 항원의 검출법이다.

본 발명은 변성제를 사용하는 것에 의해 HBV 입자, 소형구형 입자 및 관상 입자를 변성시키고, 이들의 내측에 존재하는 HBs 항원의 26번부터 80번 까지의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, 즉 HBs 항원의 지질이중막의 내측에 존재하는 친수성 영역을 노출시키는 것이다. 여기서 사용될 수 있는 변성제는 HBV 바이러스 입자의 지질이중막을 파괴하고 또 소형 구형 입자 및 관상 입자에 있는 HBs 항원간의 결합(응집)을 분리시키는 한편, 프로브 자체를 불활성화시키지 않는 변성제이고, 전형적으로는 도데실 황산 나트륨 등의 계면활성제를 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 프로브, 변성제, HBs 항원 이외의 HBV 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 프로브를 이용하는, HBV 바이러스의 검출법, 및 이러한 구성을 구비한, 즉 본 발명의 프로브, 변성제 및 HBs 항원 이외의 HBV 항원에 대한 프로브를 포함하는 HBV 검출용 시약도 제공한다.

본 발명의 프로브에 더하여, HBs 항원 이외의 HBV 바이러스 항원, 예컨대 HBcr 항원(국제공개특허 WO 02/14871호 팜플렛)을 측정하는 것에 의해 HBs 항원 만의 검출로는 잘못하면 HBV 음성으로 판정될 수 있는 HBV 감염자의 검체도 확실하게 HBV 양성으로 포착할 수 있다.

HBs 항원은 전술한 바와 같이 RNA 바이러스에 필적할 정도로 고빈도의 변이를 유발하는 것이 알려져 있다. 그 때문에 HBs 항원의 26번부터 80번까지의 아미노산 서열에서, 서열번호 1의 아미노산 서열과는 상이한 서열로 이루어지는 변이 HBs 항원도 존재한다.

그러나, 이러한 변이를 갖는 HBs 항원에서도 그의 아미노산 서열이 특정되면 본 명세서에 개시된 내용을 따라 이들을 대장균에서 발현시키고, 정제하는 것은 가능하다. 또 그의 정제된 변이 HBs 항원에 대한 프로브를 취득하고, 이것에 의해 HBs 항원을 검출하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명에서 HBs 항원의 26 내지 80번째의 아미노산 잔기에 상당하는 서열은 서열번호 1에 표시되는 것에 한정되는 것이 아니고, 본 발명은 서열번호 1에 표시한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상의 에피토프를 인식하는 프로브에 한정되는 것도 아니고, 상기 프로브를 사용한 검출법에 한정되는 것도 아니다.

발명의 효과

본 발명의 프로브 및 이것을 사용한 HBV 바이러스 또는 HBs 항원의 검출법은 종래의 HBs 항원 검출법으로는 검출될 수 없었던 HBs 항원의 공통항원결정기 a에서 이스케이프 변이주 등을 감도 좋게 검출하고, HBV 감염을 확실하게 판정할 수 있다. 또한 HBs 항원의 공통항원결정기 a에 대한 환자 자신의 항체가 HBs 항원의 검출을 저해하고 있는 경우에도 본 발명의 검출법에 의해 HBV 감염을 확실하게 판정할 수 있다.

본 발명의 프로브와 경합하는 환자 자신의 항체가 존재하고, HBs 항원의 검출을 저해하고 있는 경우에도 산성화제 또는 알칼리제와 변성제를 조합한 전처리를 실시하는 것에 의해 HBV 감염을 확실하게 판정할 수 있다.

또한 HBV의 다른 항원을 인식하는 프로브와 조합하여 HBs 항원과 HBV의 다른 항원을 동시에 측정하는 것에 의해 보다 확실하게 HBV 감염을 검출할 수 있게 된다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 프로브는 HBs 항원의 26번부터 80번까지에 상당하는 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 1에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 것이라면 어떤 것이라도 이용될 수 있지만, 전형적으로는 각 펩티드 또는 HBs 항원을 항원으로서 얻을 수 있는 항체, 특히 모노클로날 항체가 유용하다.

서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는 상기 펩티드를 코드하는 유전자를 사용한 재조합 유전자 수법 또는 화학합성법 등에 의해 제조할 수 있고, 이러한 제조 조작은 자체 공지의 각종 방법 또는 기기 등을 이용하여 얻을 수 있다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 유전자 단편은 HBV 환자 혈청으로부터 바이러스 유전자를 분리하고, PCR에 의해 목적 유전자를 증폭하는 것에 의해 제조할 수 있다. 또한 PCR 제조시에 부가된 링커 유래 제한효소부위 또는 그의 유전자 단편이 삽입된 플라스미드 유래의 제한효소 부위 등을 이용하여 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.

이 발현 벡터를 대장균 등의 숙주에 형질전환으로 도입하고, 이 대장균을 배양하여 지질이중막의 내측에 위치하는 HBs(26~80)의 항원을 얻을 수 있다. 배양에 의해 얻어진 균체로부터 목적하는 단백질을 취득 정제하는 방법은 관용의 기술, 예컨대 세포의 초음파 파괴, 원심분리, 각종 크로마토그래피 등의 조작에 의해 달성할 수 있다. 즉, 상기와 같은 방법으로 목적하는 단백질을 효율 좋게 발현시킨 경우, 다수의 단백질은 균체내에에서 불용성 과립을 형성한다. 이 특징을 이용하여 균체를 생리식염수 등으로 생리적 조건의 완충액에 현탁시킨 후, 초음파 처리에 의해 세포를 파쇄하고, 균체 파쇄물을 원심분리하여 불용성 분획을 회수한다. 회수된 불용성 분획을 6M 요소로 추출하고, 겔 여과에 의해 고순도의 trpE-HBs(26~80) 항원으로 한 후, 면역원으로서 이용할 수 있다.

본 발명의 프로브, 예컨대 폴리클로날 항체는 예컨대 랫트, 토끼, 염소 또는 양 등의 동물에 상기 HBs(26~80) 항원 또는 폴리펩티드(이하, 본 항원)을 단독 또는 BSA, KLH 등과 결합시킨 항원으로 하고, 프로인트 완전 보조제 등의 보조제와 혼합하여 정기적으로 면역시키고, 혈청을 채취하는 것으로 제조할 수 있다. 특정의 인식부위를 가진 폴리클로날 항체를 얻기 위해서는, 목적으로 하는 영역의 부분 펩티드를 면역원으로 사용하는 방법이 있다.

하이브리도마에 의한 모노클로날 항체의 제조는 잘 알려져 있다. 예컨대 BALB/c 마우스 등의 복강내 또는 피하에 본 항원을 단독 또는 BSA, KLH 등과 결합시킨 항원으로서 프로인트 완전 보조제 등의 보조제와 혼합하여 정기적으로 면역시킨다. 혈중의 항체가가 상승한 시점에서 최종 면역으로서 본 항원을 꼬리 정맥내에 투여하고 무균적으로 비장을 적출한 후 적당한 마우스 골수종 세포주와 세포 융합하여 하이브리도마를 얻는다. 본 방법은 Kohler와 Milstein의 방법(Nature 256: 495-497, 1975)을 따라서 실시할 수 있다.

상기 방법으로 얻은 하이브리도마를 적당한 배양액 중에서 배양하고, 그 후 본 항원에 대하여 특이적인 반응을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선택하여 클론화한다. 항체 생산 하이브리도마의 클로닝에는 한계희석법 외에 연한천법(Eur J Immunol. 6: 511-519, 1976) 등을 이용할 수 있다. 이 하이브리도마를 배지 중 또는 마우스 복강에서 배양하여 배지 중 또는 복강 중에 모노클로날 항체를 생산시킬 수 있다.

이렇게하여 혈청 중의 폴리클로날 항체, 배지 중 또는 복수 중에 생산된 모노클로날 항체는 프로테인 A 칼럼 크로마토그래피 등의 방법에 의해 정제할 수 있다. 폴리클로날 항체는 담체 고정화 항원을 사용한 친화성 크로마토그래피 등의 방법에 의해 특정의 항원에 반응하는 항체만을 정제할 수 있고, 동일하게하여 특정의 항원에 반응하지 않는 항체를 얻을 수 있다.

상기 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 이외에도 프로브로서 이용되는 분자를 제조할 수 있다. 예컨대 재조합 항체에 관해서는 Hoogenboon의 총설 등에 상세하게 기재되어 있다(Trends in Biotechnology, 15: 62-70, 1997).

본 발명에서 사용되는 변성제는 HBV 입자의 지질 이중막의 구조를 파괴할 수 있는 또는 HBs 항원으로 이루어지는 소형 구형 입자 및 관상 입자에서 HBs 항원 간의 결합(응집)을 분리할 수 있는 변성제이라면 전부 이용될 수 있다. 예컨대 요소나 산성화제, 알칼리제 등이 이용될 수 있지만, 특히 계면활성제가 유효하다. 계면활성제에는 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽 이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 등이 있지만, 지질 이중막의 구조를 파괴할 수 있는 계면활성제는 전부 이용할 수 있다. 예컨대 Tween 20이나 Nonidet P-40 등의 비이온성 계면활성제는 계면활성 작용은 그리 강하지 않지만, 지질 이중막의 구조를 충분히 파괴하므로 본 발명에서 에피토프를 노출시킬 수 있다.

또한 SDS 나 Sarcosyl과 같은 음이온성 계면활성제는 계면활성작용이 강한 것으로 생각되지만, 이와 같은 계면활성제도 본 발명에서 에피토프를 노출시킬 수 있다. 강한 계면활성제에 의한 처리를 실시하면, 단백질의 구조 에피토프를 파괴하여, 구조 에피토프를 인식하는 항체와 항원이 결합될 수 없게 되는 경우도 있지만, 이 경우는 HBs 항원의 연속 에피토프를 인식하는 프로브를 이용하는 것으로 항원의 측정은 가능하다.

또한 변성제에는 검체 중에 존재하는 HBs 항원을 효율 좋게 유리시키는 것 뿐만 아니라 HBs 항원에 모노클로날 항체가 용이하게 결합될 수 있게 하는 역할이 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 계면활성제로 변성된 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 프로브로서 항체를 이용하는 경우에는 이와 같은 변성 처리에 의해 노출되고 변성된 본 발명에 따른 에피토프에 결합될 수 있는 프로브인 것이 필요하다.

예컨대 특정의 계면활성 작용이 강한 계면활성제를 사용하는 경우에는 그 계면활성제에 의해 노출, 변성되는 에피토프에 대한 모노클로날 항체를 선택하는 것이 필요하다. 이 때문에, 미리 계면활성제에 의해 변성처리를 실시한 HBs 항원의 26~80번째에 상당하는 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 1에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 사용하여 동물을 면역시키고, 또한 항체의 선택에도 상기 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

항체의 스크리닝 시에는 변성 처리시킨 펩티드 항원을 고정화하고, 계면활성제를 포함하는 용액 중에서 반응하는 모노클로날 항체를 스크리닝하는 것에 의해 본 발명의 이뮤노에세이(immunoassay)에 적합한 항체를 얻을 수 있다. 이와 같은 항체는 스크리닝 용액 중에 계면활성제를 포함하기 때문에 모노클로날 항체 자체는 계면활성제의 변성 작용에 대하여 내성인 항체를 취득할 수 있다.

변성제로 처리된 시료중의 HBs 항원은 효소 결합된 이뮤노소르벤트 에세이(ELISA), 효소 이뮤노도트 에세이, 라디오이뮤노에세이 및 응집을 기초로한 에세이 또는 다른 잘 알려져 있는 이뮤노에세이법으로 검출할 수 있다. 또한 검출에 표식항체가 사용되는 경우는 표식으로서 예컨대 형광물질, 화학발광물질, 방사성 물질, 효소 등이 사용된다.

예컨대 검체 중의 HBs 항원을 검출하기 위하여 ELISA의 샌드위치 반응계를 원리로 한 방법을 이용하는 경우, 다음과 같은 공정으로 실시한다. 먼저 고체 지지체(예컨대 마이크로티터 웰의 내벽)에 지질 이중막의 내측에 위치하는 에피토프를 인식하는 항체 등을 결합시킨다. 이어 비특이적 반응을 제외하기 위하여, 우혈청 알부민 등으로 블로킹을 실시한다. 이 지지체에 계면활성제 등으로 처리된 검체를 첨가하고, 고상화된 항체에 의해 HBs 항원이 포착된다. 이 포착된 HBs 항원에 대한 표식항체 등을 반응시키는 것에 의해 HBs 항원을 검출할 수 있다. 고체 지지체에 결합시키는 항체는 지질 이중막의 내측에 위치하는 에피토프에 결합되는 항체이면 전부 이용할 수 있다. 또한 표식항체는 HBs 항원에 결합되는 것이라면 전부 이용될 수 있다. 이 조합은 자유이며 고감도, 고특이성을 얻을 수 있는 조합을 선택할 수 있다.

상기에서 사용될 수 있는 고체 지지체로서는 폴리스티렌이나 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리비닐제의 마이크로티터 플레이트, 시험관, 모세관, 비즈(라텍스 입자나 적혈구, 금속화합물 등), 막(리포좀 등), 필터 등을 들 수 있다. 본 발명에서 HBs 항원을 측정할 수 있는 검체로는 전혈, 혈장, 혈청, 요, 타액, 뇌척수액 등의 생물학적 체액 및 간조직 등의 조직을 포함할 수 있다.

본 발명에서 검체 중의 HBs 항원을 번잡한 조작을 수반하지 않고, 프로브 예컨대 모노클로날 항체와 결합반응시키는 것에 적합한 상태로 처리하는 방법이 중요하다. 요컨대 검체 중에 포함되는 HBs 항원의 지질 이중막을 가용화시키는 것에 의해 본래 바이러스 입자 표면에 노출되어 있지 않은 에피토프를 노출시키는 것이 중요하다.

도 1은 HBs 항원의 이차 구조를 모식적으로 도시한 것이다.

이하의 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

trpE-HBs(26~80) 항원의 발현 및 정제

(A) TrpE-HBs(26~80) 항원 발현 플라스미드의 구축

HBs(26~80) 영역에 상당하는 발현 플라스미드는 이하의 방법으로 구축하였다. HBV 환자 혈청 100μl를 DNA 추출액 100μl [1M Tris-HCl (pH 8.4)가 10 μl, 250 mM EDTA가 8μl, 10% SDS가 40 μl, 5M NaCl이 8 μl, 20 mg/ml Proteinase K가 10 μl, tRNA (5 ㎍/μl)가 1 μl, 멸균수가 23 μl]와 혼합시키고, 54℃에서 30분간 보온시켰다. 200μl의 페놀/클로로포름 (1:1) 용액을 가하여 혼합하고, 15 Krpm 으로 5분간 원심분리한 후, 상청액을 취출하여 150μl의 이소프로판올과 7 μl의 5M NaCl을 가하여 -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 15 Krpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 침전물을 70% 에탄올로 헹구고, 15 Krpm, 4℃에서 다시 한번 5분간 원심분리하였다. 침전물을 자연 건조시켜 20 μl의 멸균수에 용해시켜서 HBV DNA 용액으로 하였다.

이 HBV DNA 용액의 5 μl를 2개의 프라이머 (5'-GAATTCCTCACAATACCACAGAGTCTA-3' (서열번호:2), 5'-GGATCCTTAAAAACGCCGCAGACACATCCAGCG-3' (서열번호: 3)을 이용한 PCR을 실시하였다. PCR은 GeneAmpTM (DNA Amplication Reagent Kit, Perkin Elmer Cetus 제조)의 키트를 이용하여 DNA 변성 95℃ 1분, 어닐링 55℃ 1분, DNA 합성 72℃ 1분의 조건으로 실시하여 얻어진 DNA 단편을 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하여 글래스파우더법(GeneClean)으로 정제하였다. 이 증폭된 HBs(26~80) 유전자 단편 0.5 ㎍을 제한효소반응액 20 μl[50 mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, 100 mM NaCl, 15 단위의 EcoRI 및 15 단위의 BamHI 효소)중에서 37℃ 1시간 동안 소화시키고, 그후 0.8% 아가로오스 겔 전기영동을 실시하여 약 180 bp의 EcoRI-Bam HI 단편을 정제시켰다.

이어 발현 벡터인 pATtrpE의 DNA 0.5 ㎍을 제한효소반응액 20 μl[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, 100 mM NaCl, 15 단위의 EcoRI 및 15 단위의 BamHI 효소] 중, 37℃에서 1시간 동안 소화시키고, 그 반응액에 물 39μl를 가하고, 70℃에서 5분간 열처리한 후에 박테리아 알칼리성 포스파타제(BAP) 1μl (250 단위/μl)를 가하여 37℃에서 1시간 보온시켰다.

이 반응액에 페놀을 가하여 페놀 추출을 실시하고, 수득한 수층을 에탄올 침전시키고, 침전물을 건조시켰다. 수득한 EcoRI-BamHI 처리 벡터-DNA 0.5㎍과 상술한 HBs(26~80) 180 bp 단편을 10 x 리가제용 완충액 [660 mM Tris-HCl (pH 7.5), 66 mM MgCl2, 100mM 디티오트레이톨, 1mM ATP] 5 μl, T4 리가제 1μl (350 단위/μl)에 물을 가하여 50μl로 하고, 16℃에서 하룻밤 보온하고, 연결(ligation) 반응을 실시하였다. 발현 플라스미드 pATtrpE-HBs(26~80)을 얻기 위하여 이 연결반응액을 이용하여 대장균 HB101을 형질전환시켰다.

형질전환에 사용되는 감수성 대장균은 염화 칼슘법[Mandel, M.과 Higa, A., J. Mol.Biol., 53, 159-162 (1970)]에 의해 만들 수 있다. 형질전환 대장균을 25 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트(1% 트립톤, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)상에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 동안 보온시켰다. 플레트 상에 생긴 균의 콜로니를 1 백금 루프(loop) 취하고, 25 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 LB 배지로 전달하여 하룻밤 37℃에서 배양하였다.

1.5 ml의 균배양액을 원심분리로 집균하고, 플라스미드 DNA의 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 알칼리법[Manniatis 등, Molecular Cloning: A Lboratory Manual, (1982)]에 의해 실시하였다. 수득한 플라스미드 DNA 1㎍를 제한효소 반응액 20 μl [ 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨 , 100 mM NaCl, 1 단위의 EcooRI 및 15 단위의 BamHI 효소] 중에서 37℃ 1시간 동안 소화시키고, 아가로오스 겔 전기영동을 실시하여 약 180 bp의 EcoRI-BamHI 단편이 생기는 pATtrpE-HBs(26~80) 발현 플라스미드를 선별하였다.

(B) TrpE-HBs(26~80) 항원의 발현 및 정제

발현 플라스미드 pATtrpE-HBs(26~80)을 가진 대장균 HB101주를 50 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 3 ml의 2YT 배지(1.6% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% NaCl)에 접종하고, 37℃에서 9시간 배양한다. 이 배양액 1 ml를 50 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 100 ml의 M9-CA 배지(0.5% NA2 HPO4, 0.5% KH2 PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 2mM MgSO4, 0.5% 카자미노산, 0.2% 글루코오스)에 계속 접종하고, 37℃에서 배양하였다. OD600=0.3일 때 최종 농도 40 mg/l로 되도록 인돌아크릴산을 가하고 또한 16시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 5 Krpm, 10분간 원심분리하여 균체를 모았다.

균체에 20 ml의 완충액 A [50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA, 30mM NaCl]을 가하여 현탁시키고, 다시 원심분리를 실시하여 발현균체 2.6 g을 얻었다. 수득한 균체를 완충액 A 10 ml 중에 현탁시키고, 초음파 파쇄에 의해 대장균 막을 파쇄시킨 후에 원심분리를 실시하여 trpE-HBs(26~80) 융합 항원을 포함하는 불용성 분획을 얻었다.

이 불용성 분획을 8M 요소, 10mM 디티오트레이톨, 1mM EDTA를 포함하는 PBS 3ml에 용해시키고 6M 요소 존재하에 세파크릴 S300HR 칼럼에 걸어 여과를 실시하여 trpE-HBs(26~80) 융합 항원을 거의 단일하게 정제하였다.

실시예 2

하이브리도마의 제조

상기 방법에 의해 제조한 폴리펩티드 [trpE-HBs(26~80)]를 6M 요소 용해후, 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 7.3)(PBS)에 최종 농도가 0.2~1.0 mg/ml로 되도록 희석시키고, 등량의 프로인트 보조제와 혼합하고, 4내지 6주령의 BALB/c 마우스에 10-20㎍ 복강내 투여하였다. 2-4 주간 마다 동일한 추가 면역을 실시하고 PBS에 용해시킨 HBs 10 ㎍을 최종 면역으로하여 꼬리 정맥내에 투여하였다.

최종 면역 후 3일째에 이 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하고, 가위와 금속 메쉬를 이용하여 비장을 개별 세포로 파쇄시키고, RPMI-1640 배지로 3회 세정하였다. 대수(log) 증식기의 마우스 골수종 세포주 Sp2/0Ag14를 RPMI-1640 배지로 3회 세정한 후 이 세포와 비장세포를 1:5의 세포수 비로 혼합하였다. 200 x g, 5분간 원심분리후, 상청액을 제거하고, 세포 덩어리를 부드럽게 혼합하면서 50% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 4000 (머크사 제조)을 포함하는 RPMI-1640 배지 1 ml를 천천히 가하고, 또 RPMI-1640 배지 10ml를 가하여 세포 융합시켰다.

융합 세포는 원심분리 (200 x g, 5분간)에 의해 PEG를 제거한 후 10% 소 태아 혈청 및 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)을 포함하는 RPMI-1640 배지에 현탁시키고, 96웰 세포 배양 플레이트에 파종하였다. 약 10일간 배양하여 하이브리도마만을 증식시킨 후, 목적하는 항체를 생산하는 클론을 ELISA법에 의해 검색하고 소망하는 반응 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다.

수득한 하이브리도마에 관하여 한계희석법에 의해 단일 클론화를 실시하고, 항체 생산 하이브리도마를 수립하였다. 수득한 하이브리도마를 6G6, 4A3, 1C10으로 명명하였다. 이들 하이브리도마 세포는 2004년 9월 9일에 도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고우 켄큐쇼 특허생물기탁 센터에 기탁되었다.

실시예 3

모노클로날 항체의 제조 및 해석

실시예 2에 기재된 방법에 의해 얻은 하이브리도마를, 미리 프리스타틴을 복강 투여한 BALB/c 마우스 복강에 이식하여, 복수 중에 생산되어 나오는 모노클로날 항체를 취득하였다. 이 모노클로날 항체는 프로테인 A 세파로오스 칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 IgG 분획을 분리 정제하였다.

수득한 모노클로날 항체에 관하여 TrpE-HBs(26~80) 항원 및 HBs 영역 유래의 서열에 의해 합성한 20 아미노산으로 이루어진 합성 펩티드를 사용하여 에피토프 해석을 실시한 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 HBs 항원 중 지질 이중막의 내측에 위치하는 에피토프(아미노산 번호: 26~80)를 인식하는 모노클로날 항체인 것을 알았다.

항마우스 Ig 각 아이소타입 항체를 사용한 아이소타입 타이핑 키트(Zymed사 제조)에 의해 각각 모노크로날 항체의 (서브)클래스를 확인하였다. 그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 6G6, 4A3은 IgG1,κ 이고, IC10은 G2a,κ 이었다.

본 발명에 따른 아미노산 번호 31-70의 영역에 존재하는 항원 에피토프를 인식하는 항체는 지금까지 보고되어 있지 않고, 6G6, 4A3, 1C10 모노클로날 항체는 각각 신규한 에피토프를 인식하고 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 4

계면활성제를 사용한 검출법의 검토

항HBs 항원 모노클로날 항체 6G6을 최종 농도가 6 ㎍/ml로 되도록 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 희석시키고, 96웰 마이크로플레이트(누크사 제조) 1웰 당 80 μl씩 분주(플레이팅)하였다. 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 0.35 ml를 사용하여 2회 세정하여 0.5% 카제인-Na을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)(이하, 블로킹액) 0.35 ml를 첨가하고, 또 실온에서 2시간 정치시켰다.

블로킹액 제거후, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.5% 카제인-Na를 포함하는 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)에 각 계면활성제를 4% 또는 8%로 되도록 첨가한 것 40 μl와 측정시료 40 μl를 각각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시키고 세정액 0.35 ml로 5회 세정하며, 이어 퍼옥시다아제(POD) 표식한 모노클로날 항체(5C3) 80 μl를 부가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 상기 세정액 0.35 ml로 6회 세정하고, 기질(오르토페닐렌디아민, 이하 OPD) 용액 80 μl를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 2N 황산용액 80μl를 첨가하고 파장 630 nm의 흡광도를 대조용으로 하여, 파장 492 nm에서 흡광도(OD492)를 측정하였다.

HBs 양성 혈청을 다양한 계면활성제를 사용하여 측정한 결과를 표 3에 나타내었다. HBs 항원 양성 혈청을 계면활성제가 들어가지 않은 완충액을 사용하여 측정해보면 HBs 항원을 검출할 수 없었지만, 다양한 종류의 계면활성제(음이온성, 양이온성, 양쪽 이온성, 비이온성)을 가하여 완충액을 사용하여 측정해보니 충분한 시그널을 얻을 수 있으며, HBs 항원을 명확하게 검출할 수 있었다. 이것에 의해 각종 계면활성제에 의해 HBs 항원의 지질 이중막의 내측에 존재하는 신규 에피토프가 노출되어 검출될 수 있는 것이 명확하게 되었다.

퍼옥시다아제 표식한 모노클로날 항체인 5C3은 HBs 항원의 전장인 1~226번째의 아미노산 서열로 이루어지는 항원을 실시예 1에 준한 방법으로 발현, 정제하고, 그 재조합 항원을 마우스에 면역시켜 얻은 모노클로날 항체이다. 이 항체가 상기 재조합 HBs 항원에 결합하는 것이 확인되었다. 그러나, 이 항체와 실시예 3과 동일한 방법으로 HBs 항원의 1~226번째 아미노산 서열을 기준하여, 10 아미노산씩 오버래핑하는 20개 아미노산으로 이루어지는 합성 펩티드의 결합을 조사한 결과, 상기 항체는 어떤 합성 펩티드와도 반응하지 않았다. 이 때문에 5C3은 HBs 항원의 아미노산 서열의 연속 에피토프가 아니라 구조 에피토프를 인식하고 있는 것으로 생각할 수 있다.

실시예 5

HBs 항원 음성 검체의 측정

HBs 항원 음성이지만, HBV에 감염되어 있는 것으로 생각되는 검체를 실시예 4의 방법을 개량한 방법으로 측정하였다.

항 HBs 항원 모노클로날 항체 6G6을, 최종 농도가 6㎍/ml로 되도록, 0.15M의 NaCl을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 희석시키고, 96웰 마이크로플레이트(누크사 제조) 1웰당 100μl씩 분주하였다. 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 0.15M의 NaCl을 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)의 0.3 ml를 사용하여 2회 세정하고, 0.5% 카제인나트륨, 3% 수크로오스를 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)(블로킹액) 0.35 ml를 첨가하고, 또 실온에서 2시간 정치시켰다.

블로킹액을 제거한 후 완충액(0.15M의 NaCl, 10mM의 EDTA-2Na, 0.2%의 프로클린, 1% BSA, 0.1% 카제인나트륨, 3% 말 혈청, 2% 마우스 혈청, 10% Brij35를 포함하는 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)의 50μl와 측정시료 50μl를 각각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후, 0.35 ml의 세정액으로 5회 세정하며 또 퍼옥시다제 표식된 모노클로날 항체(5C3) 100μl를 부가하여 실온에서 30분간 반응시켰다.

반응 후, 상기 세정액 0.35 ml로 6회 세정하고, 기질(오르토페닐렌디아민, 이하 OPD라 칭함)용액 100μl를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 2N 황산 용액을 첨가하여, 파장 630 nm의 흡광도를 대조용으로 하여, 파장 492 nm에 따른 흡광도(OD 492)를 측정하였다.

검체는 IICJapan으로부터 구입한 검체를 이용하며, HBs 항원 및 항HBs 항체는 ABBOTT사의 CLIA법으로, HBN-DNA는 Gen-Probe사의 TMA법에 의해 측정하였다.

표 4에 나타낸 5개의 검체는 TMA법으로 HBV-DNA에 대하여 양성이다. 또한 ABBOTT사의 CLIA법으로는 HBs 항체도 양성이어서, HBV 감염 환자의 혈청인 것으로 생각된다. 그러나 종래의 HBs 항원측정법인 ABBOTT사의 HBsAgCLIA법으로는 No.2, 3, 5에 관하여는 음성으로 판정되었다.

이들 HBs 항원 음성의 3개 검체에 대하여 본 발명의 방법에 의해 판정을 실시해보니, No.2와 5 검체에서 HBs 항원을 검출할 수 있었다. 또한 본 발명의 측정법과 ABBOTT사의 HBsAgCLIA 측정법 모두 항원 음성으로 판정된 No. 3의 검체는 HBcrAg 측정법으로 검출이 가능하며, HBs 항원과 HBcr 항원의 동시측정은 보다 확실한 HBV 항원의 검출에 유용하다.

실시예 6

1) 산성화제 농도:

HBV 항원 음성 검체 또는 항 HBs 항체를 포함하는 HBV 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 50 μL에 각종 농도의 염산 수용액 50 μL를 첨가하고, 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 이하에 기재한 측정법을 실시하여 검토하였다.

항 HBs 항원 모노클로날 항체 6G6을, 최종 농도 6㎍/ml로 되도록 0.15 M의 NaCl을 포함하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 희석시키고, 96웰 마이크로플레이트(누크사 제조) 1개 웰당 100μl씩 분주하였다. 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다.

0.15M의 NaCl을 포함하는 10mM 인산완충액(pH 7.3)으로 2회 세정한 후 0.5% 카제인 나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.1을 350μL 첨가하여 2시간 인큐베이트하였다. 블로킹액 제거후, 중화제를 포함하는 반응완충액 100 μL와 각각의 검체처리법으로 얻은 측정시료를 각 웰에 가하고 교반하면서 실온에서 2시간 반응시켜 0.05% Tween20을 포함하는 10 mM 인산완충액 pH 7.3 (세정액) 350μL으로 6회 세정하고, 또 퍼옥시다제 (POD) 표식한 모노클로날 항체 (5C3) 100μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 6회 세정한 후, 기질(오르토페닐렌디아민, 이하 OPD) 용액 100μl를 첨가하고 30분간 인큐베이트한 후, 2N 황산용액 100μl을 첨가하고, 파장 630 nm의 흡광도를 대조용으로 하여, 파장 492 nm에서 흡광도(OD492)를 측정하였다. 표에 나타낸 염산 농도는 검체(Sample)과 처리제를 혼합후의 처리시 농도로 표시하였다.

항 HBs 항체를 포함하는 HBs 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650)는 염산을 포함하지 않는 용액으로 실온에서 10분간 인큐베이트를 실시하여도 거의 HBs 항원활성을 검출할 수 없었지만, 처리시의 염산농도 0.05N 보다 HBs 항원 활성이 확인되어 0.25 ~1.0N에서 피크로 되었다(표 5).

실시예 7

2) 산성화제 공존하에서 각종 계면활성제:

HBV 항원 음성 검체 또는 HBs 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 30 μL에 각종 계면활성제를 1.0N 염산 농도의 수용액에 용해시킨 그의 30 μL를 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 1)에서 전술한 방법으로 검토하였다(표 6~표 9). 또한 표에 나타낸 염산 농도 및 계면활성제 농도는 검체(Sample)과 처리제를 혼합한 후의 처리시 농도로 표시하였다.

표 6 ~ 표 9에 나타낸 바와 같이, 3예의 검체중 적어도 1예가 각각의 검체의 판정기준보다 높은 반응성을 나타낸 계면활성제를 첨가효과가 있는 것으로 판단하였다. 그 결과, 염산 또는 염산과 같은 산성화제와 함께 각종 계면활성제를 첨가하면, HBs 항원 양성 검체 중의 코어 항원 면역활성이 크게 상승한 계면활성제가 확인되었다. 첨가 효과가 확인된 것은 1쇄 알킬기와 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 동일 분자중에 갖고 있는 양쪽 이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제이었다.

또한 Triton X100이나 Bridj35와 같은 비이온성 계면활성제에 의해서도 첨가 효과가 확인되었다. CHAPS와 같은 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제는 반응성의 향상을 나타내지 않았다. 그외에 SDS, N-라우로일 사르코신 Na 등의 음이온성 계면활성제나 데옥시콜산 등도 검토하였지만, 산성화제와의 공존하에서는 용해성이 나빠서 검토할 수 없었다.

산성화제에 1쇄 알킬기와 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 동일 분자 중에 갖고 있는 양쪽 이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제를 첨가하는 것에 의해 측정 감도의 상승이 확인되었다. 이 산성화제와 계면활성제의 처리제로부터 산성화제를 제거하고, 효과가 있었던 계면활성제만으로 처리를 행하였지만 측정감도는 크게 저하되었다. 이점으로부터 측정감도의 상승은 산성화제에 의해 HBs 항원을 검출할 때의 저해물질인 항 HBs 항체를 불활성화시키고 또 계면활성제의 첨가에 의해 검체 중의 HBs 항원의 지질 이중막의 내측에 존재하는 에피토프가 제시되어 6G6과의 반응성이 크게 향상되는 것으로 생각된다.

실시예 8

3) 산성화제 공존하에서 단백질변성제:

HBV 항원 음성 검체 또는 HBs 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 30 μL에, 단백질변성제인 요소 또는 구아니딘 염산염을 1.0N 염산농도의 수용액에 용해시키고, 그의 30 μL를 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 1)에서 전술한 방법으로 검토하였다. 각각의 HBs 항원 양성 검체의 면역활성을 표 10에 나타내었다. 표 10에 나타낸 염산 농도 및 단백질변성제 농도는 검체(Sample)와 처리제를 혼합한 후의 처리시 농도로 표시하였다.

단백질변성제인 요소를 첨가하면, 산성화제만과 비교하여 약 1.5 내지 3배, 구아니딘 염산염을 첨가한 경우는 약 2 내지 3배 상승하는 검체가 확인되었다. 또한 산성화제만의 처리시에 혈청 단백질 등이 변성하여 침전이나 백탁을 생기게 할 수 있고, 피페팅 조작의 저해, 침전물이 큰 유사 양성의 원인으로 될 수도 있다. 또한 이들 침전물 중에 목적으로 하는 항원이 들어있는 것에 의한 감도의 저하도 생각된다. 요소나 구아니딘 염산염을 처리시 0.5M 이상 첨가하는 것에 의해 이와 같은 침전물 형성을 크게 감소시킬 수 있는 것이 판명되며, 특히 요소는 처리시 1.5M 이상 4M 이하, 구아니딘 염산염은 처리시 2M 이상 3.5M 이하의 첨가에 의해 효과가 확인되었다.

실시예 9

4) 산성화제 공존하에서 환원제의 검토:

HBV 항원 음성 검체(Normal plasma) 또는 3예의 HBs 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 30 μL에, 1.0N 염산을 포함하는 용액에 환원제인 디티오트레이톨, 2-머캅토에틸아민 클로라이드, 2-디에틸아미노에탄티올 클로라이드를 혼합한 용액의 30μL를 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 1)에서 전술한 방법으로 검토하였다(표 11).

여기서 이용된 환원제 농도는 검체의 처리시의 농도로 나타내었다. HBV 항원 음성 검체에서는 환원제를 첨가하여도 전혀 그의 시그널의 변화는 확인되지 않았지만, HBs 항원 양성 검체에서는 디티오트레이톨 농도가 1~5 mM에서 1예(#990640) 검체에서 30% 이상의 상승이 확인되었다.

실시예 10

5) 알칼리제 농도:

HBV 항원 음성 검체 또는 항HBs 항체를 포함하는 HBV 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 50 μL에, 각종 농도의 수산화나트륨 수용액 50 μL을 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고, 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 이하에 기재하는 측정법을 이용하여 검토하였다.

항 HBs 항원 모노클로날 항체 6G6을, 최종 농도가 6㎍/ml로 되도록 0.15M의 NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 희석시키고, 96웰 마이크로플레이트(누크사 제조) 1개 웰당 100μl씩 분주하였다. 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다.

0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3으로 2회 세정한 후, 0.5% 카제인 나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.1을 350 μL 첨가하고 2시간 동안 인큐베이트하였다. 블로킹액 제거한 후 중화제를 포함하는 반응완충액 100 μL과 각각의 검체 처리법으로 얻은 측정시료를 각 웰에 첨가하고 교반하면서 실온에서 2시간 동안 반응시켜 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 인산완충액 pH 7.3(세정액) 350 μL으로 6회 세정하고, 이어 비오틴 표식된 모노클로날 항체(HBs124) 100μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 6회 세정하고, POD 표식한 아비딘 D 100 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 6회 세정하고, 기질(오르토페닐렌디아민, 이하 OPD) 용액 100μl를 첨가하고 30분간 인큐베이트한 후 2N 황산 용액 100μl를 첨가하고 파장 630 nm의 흡광도를 대조용으로하여, 파장 492 nm에서 흡광도(OD492)를 측정하였다. 표에 나타낸 수산화나트륨의 농도는 검체와 처리제를 혼합한 후의 처리시 농도로 표시하였다.

비오틴 표식된 모노클로날 항체인 HBs 124는 HBs 항원의 전장인 1~226번째 아미노산 서열로 이루어지는 항원을 실시예 1에 준한 방법으로 발현시키고, 정제하며 그 재조합 항원을 마우스에 면역시켜 얻은 모노클로날 항체이다. 이 항체가 상기 재조합 HBs 항원에 결합하는 것은 확인되었다. 그러나, 상기 항체와 실시예 3과 동일한 방법으로 HBs 항원의 1~226번째 아미노산 서열을 기본으로 10 아미노산씩 오버래핑하는 20개 아미노산으로 이루어지는 합성 펩티드와의 결합을 조사한 결과, 상기 항체는 어떤 합성 펩티드와도 반응하지 않았다. 이 때문에 HBs124는 HBs 항원의 아미노산 서열의 연속 에피토프가 아니라 구조 에피토프를 인식하고 있는 것으로 간주되었다.

항 HBs 항체를 포함하는 HBV 양성 검체(#990493, #990640, #990650)는 수산화나트륨을 포함하지 않는 용액에서 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하여도 전혀 HBs 항원 활성은 검출되지 않았지만, 처리시의 수산화나트륨 농도 0.25N~1N에서 HBs 항원에 대한 시그널의 상승이 확인되었다(표 12).

실시예 11

6) 알칼리제 공존하에서 각종 계면활성제 농도:

HBV 항원 음성 검체 또는 HBV 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 30 μL에, 각종 계면활성제를 1.0N 수산화나트륨 농도의 수용액에 용해된 그의 30 μL을 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고, 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 5)에서 기재한 방법으로 검토하였다(표 13 ~ 표 17). 또한 표에 나타낸 수산화나트륨 농도 및 계면활성제 농도는 검체(Sample)와 처리제를 혼합한 후의 처리시 농도로 나타내었다.

표 13 ~ 표 17에 나타낸 바와 같이, 3예의 검체 중 적어도 1예가 각각의 검체의 판정 기준보다 높은 반응성을 나타낸 계면활성제를 첨가효과 있음으로 판단하였다. 그 결과, 수산화나트륨과 같은 알칼리제와 함께 각종 계면활성제를 첨가하면, HBs 항원 양성 검체 중의 코어 항원 면역 활성이 크게 상승한 계면활성제가 확인되었다. 첨가 효과가 확인된 것은 도데실 황산 나트륨, N-라우로일 사르코신 Na 등의 음이온성 계면활성제, 1쇄 알킬기와 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 동일 분자 중에 갖고 있는 양쪽 이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제이었다.

또한 TritonX100, Tween20, Bridj35와 같은 비이온성 계면활성제, CHAPS와 같은 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제에 의해서도 첨가 효과가 확인되었다.

알칼리제에 음이온성 계면활성제 또는 1쇄 알킬기와 제3급 아민 또는 제4급 암모늄 염을 동일 분자 중에 갖고 있는 양쪽 이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제를 첨가하는 것에 의해 측정감도의 상승이 확인되었다. 이 알칼리제와 계면활성제의 처리제로부터 알칼리제를 제거하고, 효과가 있었던 계면활성제만으로 처리하였지만, 측정감도의 상승은 확인되지 않았다. 알칼리제와 계면활성제의 조합에 의해 HBs 항원 측정의 저해물질인 항 HBs 항체를 불활성화시키고, 검체 중의 HBs 항원의 지질 이중막의 내측에 존재하는 에피토프가 제시되어 6G6과의 반응성이 크게 향상되는 것으로 생각되었다.

실시예 12

7) 알칼리제 공존하에서 단백질 변성제:

HBs 항원 음성 검체 또는 HBs 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 30 μL에, 단백질 변성제인 요소 또는 구아니딘 염산염을 1.0N 수산화나트륨 농도의 수용액에 용해시키고, 그의 30 μL을 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고, 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 5)에서 기재한 방법으로 검토하였다. 각각의 HBs 항원 양성 검체의 면역활성을 표 18에 나타내었다. 표 18에 나타낸 수산화 나트트륨 농도 및 단백질 변성제 농도는 검체(Sample)와 처리제를 혼합한 후의 처리시 농도로 나타내었다.

HBs 항원 양성 검체 3예에서 단백질 변성제인 요소를 첨가한 경우는 알칼리성화제만과 비교하여 약 8배 이상, 구아니딘 염산염을 첨가한 경우는 약 4.5배 이상으로 상승한 것이 확인되었다. 또한 알칼리성화제만의 처리인 경우, 중화시에 혈청단백질 등이 변성되어 침전이나 백탁을 생기게 할 수 있고, 피페팅 조작의 장해나 침전물이 큰 유사 양성의 원인으로 되는 수가 많다. 또한 이들의 침전물의 중에 목적으로 하는 항원이 들어있는 것에 의한 감도의 저하도 생각할 수 있다. 요소나 구아니딘 염산염을 처리시 1M 이상 첨가하는 것에 의해 이와 같은 침전물 형성을 크게 감소시킬 수 있는 것이 판명되었고, 특히 요소는 처리시 2M 이상 4M 이하, 구아니딘 염산염은 처리시 2M 이상 3M 이하의 첨가에 의해 효과가 확인되었다.

실시예 13

8) 알칼리제 공존하에서 환원제의 검토:

HBV 항원 음성 검체 또는 3예의 HBs 항원 양성 검체(#990493, #990640, #990650) 30 μL에, 1.0N 수산화나트륨을 포함하는 용액에 환원제인 디티오트레이톨, 2-머캅토에틸아민 클로라이드, 디에틸 아미노에탄티올 클로라이드, 2-머캅토에탄올, 트리(2-카르복시에틸)포스핀 클로라이드를 혼합한 용액의 30 μL를 첨가하여 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하고, 그의 50 μL를 측정 시료로 하여 5)에서 기재한 방법으로 검토하였다(표 19).

여기서 사용되는 환원제는 검체의 처리시의 농도로 나타내었다. HBV 항원 음성 검체에서는 환원제를 첨가하여도 거의 그 시그널의 변화는 확인되지 않았지만, HBs 항원 양성 검체에서는 3예 모두 2-머캅토에틸아민 클로라이드, 디에틸아미노에탄티올 클로라이드, 2-머캅토에탄올의 농도가 20 mM에서 2 내지 3배의 시그널 상승이 확인되었다. 보다 효과적이었던 것은 트리(2-카르복시에틸)포스핀 클로라이드이고, 농도가 2 mM에서는 1.5배, 10mM에서는 15배 이상의 시그널 상승이 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Advanced Life Science Institute, INC. <120> A partial sequence of Hepatitis B virus s-antigen <130> SAP-729-PCT <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 55 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 20 25 30 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 35 40 45 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 50 55 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 2 gaattcctca caataccaca gagtcta 27 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 3 ggatccttaa aaacgccgca gacacatcca gcg 33

Claims

B형 간염 바이러스 s 항원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 상에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체.
삭제
제 1항에 있어서, 변성제에 의해 변성된 B형 간염 바이러스 s 항원의 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 얻을 수 있는, B형 간염 바이러스 s 항원을 인식할 수 있는 항체.
제 1항에 기재된 항체를 이용하는, B형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스 s 항원의 검출법.
제 4항에 있어서, 변성제의 공존하에서 실시하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 계면활성제인 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 산성화제, 및 (2) 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 알칼리제, 및 (2) 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 알칼리제, 및 (2) 계면활성제 또는 단백질 변성제 또는 환원제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 4항에 있어서, B형 간염 바이러스 s 항원 이외 추가적으로 B형 간염 바이러스 항원에 대한 항체를 이용하는 검출법.
제 1항에 기재된 항체 및 변성제를 포함하는 B형 간염 바이러스 s 항원 검출용 시약.
제 1항에 기재된 항체, B형 간염 바이러스 s 항원 이외의 B형 간염 바이러스 항원에 대한 항체 및 변성제를 포함하는 B형 간염 바이러스 s 항원 검출용 시약.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 산성화제, 및 (2) 계면활성제 및 단백질 변성제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 알칼리제, 및 (2) 계면활성제 및 단백질 변성제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 알칼리제, 및 (2) 계면활성제 또는 단백질 변성제 및 환원제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 알칼리제, 및 (2) 계면활성제 및 단백질 변성제 또는 환원제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.
제 5항에 있어서, 변성제가 (1) 알칼리제, 및 (2) 계면활성제 및 단백질 변성제 및 환원제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해 B형 간염 바이러스 s 항원의 해리와 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합되는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 검출법.