JPH09182599A - ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７抗原に対するモノクローナル抗体及びこれを用いるｐ１７抗原の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７中、９〜
１８位の１０アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列のＮ
末端から始まる３以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列
を特異的に認識するモノクローナル抗体、該抗体を用い
るｐ１７抗原の検出法、並びに該抗体を生産するための
ペプチド、免疫原及びハイブリドーマ。 【効果】 ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７抗原を特異的
に検出又は測定することができる。ｐ１７ＥＬＩＳＡ法
により、ｐ２４抗原ＥＩＡで検出されないＨＩＶをも検
出することもできるので、両者を組み合わせることによ
り、ＨＩＶの検出をより確実にすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ−１ｇａｇ
蛋白質ｐ１７抗原を特異的に認識するモノクローナル抗
体、該抗体を用いるｐ１７抗原の検出法、並びに該抗体
を生産するためのペプチド、免疫原及びハイブリドーマ
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＩＶの感染を診断するには、一般にＨ
ＩＶの構造蛋白質に対する抗体を検出することによって
感染経験を確認する方法が用いられている。感染後に抗
体が産生されるまでのタイムラグの間には検出できない
というデメリットもあるが、容易に高い感度を達成でき
るのでスクリーニング技術として最も広く用いられてい
る。

【０００３】しかし、抗体検出においては、ウイルス粒
子が高い濃度で血中に存在する時には検出すべき抗体が
このウイルス粒子に中和されてしまって検出することが
できなくなる場合がある。また、抗体は持っているもの
の感染の原因となる活性なウイルス粒子を持たないキャ
リア、あるいはワクチン等によって人為的に抗体陽性と
なった健常者と、実際の患者を区別することもできな
い。更に、ＨＩＶの場合には免疫システムそのものをウ
イルスが破壊するため、免疫不全症状が進んだ状態では
抗体を検出することが困難となる。

【０００４】このような抗体検出の限界を乗り越えるた
めに、あるいはＨＩＶ抗体陽性等ＨＩＶの感染が疑われ
た時には、ＨＩＶ感染の確定診断が行われる。確定診断
にはウイルスの分離やウイルス抗原の検出が必要であ
る。ウイルスの分離は、感染が疑われる患者リンパ球を
培養し、培養物中のＨＩＶ抗原を検出することによって
行われている。

【０００５】特に、ウイルスの複製に必須とされている
ｇａｇ蛋白質の検出は診断的な意義が大きいとされてい
る。これまでにもｇａｇ蛋白質の前駆体であるｐ５５、
そのプロテアーゼ分解生成物であるｐ２４やｐ１７等に
ついて免疫学的な分析が試みられた（特表平５−５０７
４０９号公報、特表平４−５０３１１０号公報）。ま
た、ｐ２４については既にモノクローナル抗体を使った
抗原検出用キットが市販されている。

【０００６】しかし、ｐ１７については、モノクローナ
ル抗体を使ったサンドイッチ法による高い感度を持った
検出系は未だに知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｐ１７をよ
り確実に検出することのできる新しいモノクローナル抗
体を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から
始まる３以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を特異的
に認識するモノクローナル抗体。 （２）配列番号１で示されるアミノ酸配列を特異的に認
識するモノクローナル抗体。 （３）ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７由来の蛋白質又は
ペプチドで、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から始まる３以上のアミノ酸からなるアミノ酸配
列を含む免疫原で免疫された哺乳動物の免疫細胞と哺乳
動物のミエローマ細胞とを融合して得られ、前記（１）
又は（２）に記載のモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマ。 （４）前記（３）に記載のハイブリドーマを培養し、前
記（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体を採取
することを特徴とするモノクローナル抗体の製造法。 （５）前記（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗
体を用いることを特徴とするＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ
１７抗原の検出法。 （６）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から
始まる３以上のアミノ酸からなるペプチド。 （７）配列番号１で示されるペプチド。 （８）配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から
始まる３以上のアミノ酸からなる免疫原。 （９）配列番号１で示されるペプチドからなる免疫原。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−
１ｇａｇ蛋白質ｐ１７由来の蛋白質又はペプチドで、か
つ配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から始ま
る３以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む免疫原
で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ
細胞とを融合して得られるハイブリドーマを培養して該
モノクローナル抗体を産生せしめ、該モノクローナル抗
体を採取することにより得られる。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体は、配列番号
１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から始まる３以上の
アミノ酸からなるアミノ酸配列を特異的に認識するもの
である。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番
号２で示されるＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７中、９〜
１８位の１０アミノ酸残基に相当する。抗体は、３個の
アミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるといわれて
おり(F. Hudecz et al., J. Immunol. Methods, 147, 2
01-210(1992)) 、本発明のモノクローナル抗体も、配列
番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端から始まる３以
上のアミノ酸を含むアミノ酸配列であれば認識すること
ができる。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体を得るための
免疫原としては、ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７由来の
蛋白質又はペプチドで、かつ配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列のＮ末端から始まる３以上のアミノ酸からなる
アミノ酸配列を含むものであれば、特に制限はなく、実
施例に示した文献(Microbiol. Immunol., 39/7, 473-48
3,1995) に記載の方法の他にも公知の方法によって得る
ことができる。例えば、特開昭６２−１６４６９６号公
報や特開平１−９８４９０号公報にはＨＩＶのｇａｇ遺
伝子を各種ベクターに組み込んで発現させ、ｐ１７を組
換え体として得る方法が開示されている。このような方
法によって得られたｐ１７組換え体は、本発明のモノク
ローナル抗体を得るための免疫原として有用である。ま
た、組換え体に限らず、ＨＩＶ感染細胞株の培養物から
精製したｐ１７を免疫原としてもよい。このような細胞
株としては、特公平５−５１６００号公報や特公平５−
６８２３２号公報に記載されたものを例示することがで
きる。

【００１２】更に、これらの生物材料に由来するｐ１７
のみならず、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末
端から始まる３以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を
含むペプチドを化学的に合成し、これを免疫原としても
よい。前記ペプチドは、液相法及び固相法等のペプチド
合成の方法により合成することができ、またペプチド自
動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実
験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１
９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸
善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２
タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年
等に記載された方法に従い合成することができる。

【００１３】そして、これらのペプチドは対応する配列
を持つＤＮＡより組換えＤＮＡ技術を用いて調製しても
よく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研
究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編
「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法II」，東京化学同
人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法III 」，東京化学同人，１９８７年等を
参照して調製を行えばよい。

【００１４】免疫原としてペプチドを用いる場合、該ペ
プチドそのものを抗体産生用免疫原として動物に免疫し
てもよいし、該ペプチドと担体（キャリア）を結合させ
たものを抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよ
い。なお、免疫原が低分子物質の場合には、担体と結合
したものを免疫するのが一般的であるものの、アミノ酸
数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を
産生させたとの報告（木山ら「日本薬学会第１１２年会
講演要旨集３」，１９９２年、１２２頁）もあるので、
担体を使用することは必須ではない。

【００１５】担体を使用する場合には、スカシガイのヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ヒト血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、
ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチル
リジン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公
知なものを用いることができる。そして、前記ペプチド
と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミ
ドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジジン法又
はジパルミチルリジン法等の公知の結合法を用いること
ができる。

【００１６】また、ニトロセルロース粒子、ポリビニル
ピロリドン又はリポソーム等の担体に前記のペプチドを
吸着させたものを抗体産生用免疫原とすることもでき
る。モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法(G.
Koehler et al., Nature,256, 495-497(1975)) による
ハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウ
イルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得るこ
とができる。

【００１７】細胞融合法によるモノクローナル抗体の調
製は、以下の操作により行うことができる。まず、前記
抗体産生用免疫原を哺乳動物（マウス、ヌードマウス、
ラット等、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥
類（ニワトリ等）に免疫する。抗体産生用免疫原の免疫
量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決め
られるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当
たり一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記抗体産生用免
疫原を免疫注射するのが好ましい。

【００１８】なお、抗体産生用免疫原はアジュバントを
添加混合して免疫注射をすることが好ましい。アジュバ
ントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フ
ロイントアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバン
ト又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いるこ
とができる。免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背
部等の部位に行えばよい。

【００１９】初回免疫後、１〜３週間間隔で皮下、静脈
内、腹腔内又は背部等の部位に抗体産生用免疫原を追加
免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６
回が一般的である。この場合も抗体産生用免疫原はアジ
ュバントを添加混合して追加免疫注射をすることが好ま
しい。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定
をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラト
ーに達したら、抗体産生用免疫原を生理食塩水（０．９
％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は
腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜
５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リ
ンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。

【００２０】この免疫動物より得られた抗体産生能を有
する細胞と哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット
等）のミエローマ細胞とを細胞融合させるが、ミエロー
マ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボ
シル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジン
キナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好
ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ
欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究
リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３・
ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１株（ＪＣＲＢ ０００９）、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２
８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２
９）などを用いることができる。

【００２１】細胞融合は、各種分子量のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）、リポソーム又はセンダイウイルス
（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融
合法により行うことができる。ミエローマ細胞がＨＧＰ
ＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培
地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有
する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択
的に培養し、増殖させることができる。

【００２２】このようにして得られたハイブリドーマの
培養上清をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免
疫学的測定法により測定することにより、配列番号１で
示されるアミノ酸配列のＮ末端から始まる３以上のアミ
ノ酸からなるアミノ酸配列を特異的に認識する抗体を産
生するハイブリドーマを選択することができ、この方法
と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わ
せて行うことにより、本発明のモノクローナル抗体を生
産する細胞株を単離して得ることができる。

【００２３】この細胞株を適当な培地で培養して、その
培養上清から本発明のモノクローナル抗体を得ることが
できるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地
等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる
点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又
はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。ま
た、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性が
ありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔
内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本
発明のモノクローナル抗体を得ることもできる。

【００２４】このようにして得られたモノクローナル抗
体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、又は
アフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいは
これらの方法を組み合わせることにより、精製された本
発明のモノクローナル抗体を得ることができる。本発明
のモノクローナル抗体を用いることにより、ＨＩＶ−１
ｇａｇ蛋白質ｐ１７抗原を特異的に検出又は測定するこ
とができる。

【００２５】本発明の検出法は、抗体を用いる測定法、
即ち免疫学的測定法であれば、いずれの方法においても
その測定法で使用される抗体として、前記の抗体を用い
ることにより、所期の効果を奏するものであって、例え
ば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫
測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、
酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫比濁法、ラテックス凝集
反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反
応又はウエスタンブロット法等により本検出法は実施さ
れる。

【００２６】本検出法における試料としては、血液、血
清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹
水、羊水、又は細胞あるいは臓器の抽出液等、ＨＩＶ又
はその構成部分が含まれる可能性のある生体試料であれ
ば対象となる。本検出法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測
定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体
を用いた免疫測定法により実施する場合には、サンドイ
ッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイッチ
法の場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なくとも
１種が本発明のモノクローナル抗体であればよい。

【００２７】固相担体としては、ポリスチレン、ポリカ
ーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリ
レート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロー
ス、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、又は
磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試
験管、スティック、又は試験片等の形状の固相担体を用
いることができる。

【００２８】固相化抗体は、固相担体と抗体を物理的吸
着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に
従って結合させることにより調製することができる。標
識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース
オキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を、蛍
光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシア
ネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリア
ジンイソチオシアネート等を、そして放射免疫測定法の
場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１
等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、Ｎ
ＡＤＨ−ＦＭＮＨ₂ −ルシフェラーゼ系、ルミノール−
過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又は
ジオキセタン化合物系等を用いることができる。

【００２９】標識物質と抗体との結合法は、グルタルア
ルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又
は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
測定の操作法は公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床
病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノア
ッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３
年，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書
院，１９８７年,北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎ
ｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年）
により行うことができる。

【００３０】例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同
時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体
を反応させて、固相化抗体−ｐ１７抗原−標識抗体の複
合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離
して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量より試料中
のｐ１７抗原量を測定することができる。具体的には、
酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基
質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等によ
り測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識に
よる蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質
標識による放射線量を測定する。発光免疫測定法の場合
は発光反応系による発光量を測定する。

【００３１】本検出法を免疫比濁法、ラテックス凝集反
応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反
応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光
を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により
実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン
緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いること
ができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や
非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。

【００３２】抗体を固相担体に感作させて用いる場合に
は、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマ
ー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプ
セル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、
金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よ
りなる粒子を使用することができる。

【００３３】この感作の方法としては、物理的吸着法、
化学的結合法又はこれらの方法の併用等の公知の方法を
使うことができる。測定の操作法は公知の方法により行
うことができるが、例えば、光学的方法により測定する
場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させ
た抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法によ
り、透過光や散乱光を測定する。

【００３４】また、目視的に測定する場合には、プレー
トやマイクロタイタープレート等の容器中で、試料と固
相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視
的に判定する。なお、目視的に測定する代わりにマイク
ロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよ
い。

【００３５】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施形態の好ま
しい一例を示す。配列番号１で示されるペプチド又は大
腸菌組換えリコンビナントｐ１７抗原を完全フロイント
アジュバントと混合してエマルジョンとして、マウスの
皮下、静脈内、腹腔内又は背部等に注射する。初回免疫
後、３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等に前
記免疫原を追加免疫注射する。初回免疫の後、免疫動物
の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返
し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記免疫原を生
理食塩水に溶解したものを静脈内に注射し、最終免疫と
する。この最終免疫の３〜５日後に脾細胞を取得する。
この脾細胞とマウスミエローマ細胞とを電気融合装置に
より細胞融合させ、培養する。抗原、例えば配列番号１
で示されるペプチド又は大腸菌組換えリコンビナントｐ
１７抗原をマイクロプレートに固相化し、培養上清を反
応させた後、パーオキシターゼ（ＰＯＤ）標識抗マウス
ＩｇＧ抗体によるＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを行
う。限界希釈を２回行ってＥＬＩＳＡ法で陽性の細胞を
クローニングし、前記ｐ１７抗原を特異的に認識する抗
体を産生するハイブリドーマを選択した。

【００３６】このハイブリドーマを適当な培地で培養し
て、その培養上清から本発明のモノクローナル抗体を得
ることができる。本発明のモノクローナル抗体を用いる
ことにより、ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７抗原を特異
的に検出又は測定することができ、ＨＩＶ感染症の診断
をより確実に行うことができる。

【００３７】

【実施例】以下、調製例及び実施例により、本発明を更
に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定さ
れるものではない。 （調製例１）リコンビナントｐ１７抗原の調製 （１）ｐ１７発現ベクターｐＴＧ１７２の構築 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写を開始するＴ７ファージ
プロモーターを持つベクターｐＴ７−７をもとに、ＨＩ
Ｖのｐ１７を発現するベクターを構築した(Microbiol.
Immunol., 39/7, 473-483, 1995)。ＨＩＶ−１プロウイ
ルスクローンｐＮＬ４−３（J. Virol. 59:284-291, 19
86、GenBank データファイル HIVNL43、ＮＩＨより入手
可能）のBglII/HindIII 断片（1.03kb) を切り出した。
この断片をBamHI とHindIII で開裂したＭ１３ｍｐ１９
に挿入してＧａｇ１９（Ｂｇ−Ｈ）とした。

【００３８】Ｇａｇ１９（Ｂｇ−Ｈ）におけるｇａｇ遺
伝子のイニシエーションコドンであるＡＴＧ上流の配列
ＧＡＧをin vitroミュータジェネシスによってＣＡＴと
し、７８７ヌクレオチドの位置にNdeIサイトを持つＧａ
ｇ１９（Ｎｄｅ）を得た。Ｇａｇ１９（Ｎｄｅ）のNdeI
/PstI 断片（７８７−１４１５、0.６３kb) を切り出
し、ｐＴ７−７のNdeI/PstI サイトに挿入してｐＴＧ５
４１とした。更に、ｐ２４をコードするｃＤＮＡを含む
ｐＴＧ９２２（Microbiol. Immunol. 36:823-831,1992)
からPstIとBalIで切り出した断片（１４１５−２６１
９、1.２kb) を、このｐＴＧ５４１のPstIサイトに挿入
してｐＴＧ５９２とした。ｐＴＧ５９２のＴ７ＲＮＡプ
ロモーターの支配下には、ｇａｇ遺伝子のイニシエーシ
ョンコドンから、ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ領域まで
を完全に含むＤＮＡ断片が連結されていることになる。

【００３９】得られたｐＴＧ５９２をSphI/ApaI で消化
後、平滑末端処理して閉環させｐＴＧ１７２を得た。ｐ
ＴＧ１７２は、ｇａｇ領域のｐ１７に加えｐ２４の一部
とｐｏｌ領域のＰＲをコードする配列を含んでいる。こ
のベクターを発現させると、ｐｏｌ領域の発現によって
生じるウイルスプロテアーゼの作用によってｐ１７とｐ
２４の間が切断され、ｐ１７を発現生成物として回収す
ることができる。

【００４０】（２）ｐＴＧ１７２によるｐ１７の発現と
生成 ｐＴＧ１７２で常法によって形質転換した大腸菌（Esch
erichia coli) ＢＬ２１を５０μｇ／mlアンピシリン加
ＬＢ培地に接種した。細胞密度が上がったところで１mM
のイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加
してｇａｇ蛋白質の発現を誘導し、更に５時間培養を続
けた。

【００４１】培養後の細胞を回収し、１５mMのリン酸緩
衝液（ｐＨ６．７、以下単に「リン酸緩衝液」とい
う。）に懸濁させて超音波処理で細胞を破壊した。処理
後の遠心上清から４０〜８０％硫安で沈殿画分を回収
し、リン酸緩衝液に対して透析した。透析後の画分をＳ
セファロース（ファルマシア製）にロードし、０〜８０
０mMのＮａＣｌでリニアグラディエントに溶出した。ｐ
１７の溶出ピークは３００〜４５０mMにあるのでこの画
分を集め、リン酸緩衝液で２倍に希釈してモノＳカラム
（ファルマシア製）にロードした。同じ条件でリニアグ
ラディエントに溶出するとｐ１７は３５０〜４００mMで
溶出される。この画分を集め、１０mMのメルカプトエタ
ノールを含むリン酸緩衝液で４倍に希釈してヒドロキシ
ルアパタイトカラム（高研製）にロードした。１５〜７
００mMのリン酸でリニアグラディエントに溶出して、３
５０〜４２０mMで溶出される画分を集めて濃縮し、ｐ１
７を純粋な蛋白質として得た。

【００４２】（実施例１）ペプチドの合成 市販の合成ペプチド合成キット＜通称 Geysen らの方法
＞（カイロンマルチピンペプチド合成キット）を用い
て、GenBank データファイル HIVNL43のＨＩＶのｐ１７
抗原のアミノ酸配列に基づき各種ペプチドを合成した。
Ｎ末端から１０個ずつピン上に合成し、更にＮ末端から
２個ずつずらしたオリゴペプチドライブラリー計６２個
を合成した（図１）。

【００４３】本発明のモノクローナル抗体は、配列番号
２で示されるＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７中、９〜１
８位の１０アミノ酸残基に相当するペプチド、即ち、配
列番号１で示されるペプチドを特異的に認識し、このペ
プチドは本発明のモノクローナル抗体を製造するための
免疫原として利用できる。配列番号１で示されるペプチ
ドを６Ｎ塩酸中、１１０℃、２２時間の条件下で加水分
解し、アミノ酸分析した結果を表１に示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】（実施例２）抗ｐ１７モノクローナル抗体
の調製 （１）抗ｐ１７モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の作製 大腸菌組換えリコンビナントｐ１７抗原１０μg を生理
食塩水０．５ｍｌで希釈し、これを完全フロイントアジ
ュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとしてＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に
３週間おきに３回免疫後、更に１カ月おいて前記ｐ１７
抗原１０μg を生理食塩水０．３ｍｌで希釈して静脈内
に注射した。３日後に免疫したマウスから脾臓を取り出
し、脾細胞を分離した。この脾細胞とマウスミエローマ
細胞株（Ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１株）を電気融
合装置により細胞融合させ、ミエローマ細胞換算で１×
１０⁴ ／wellずつ９６穴マイクロプレート１０枚にまい
て培養した。前記ｐ１７抗原を別の９６穴マイクロプレ
ートに固相化し、培養上清を反応させた後、ホースラデ
ィッシュパーオキシターゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体によるＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを行った。
限界希釈（０．５個／well）を２回行ってＥＬＩＳＡ法
で陽性の細胞をクローニングし、前記ｐ１７抗原を特異
的に認識する抗体を産生するハイブリドーマＡ１４４
（Mouse-Mouse hybridoma A144）及びＣ４１５を得た。

【００４６】ハイブリドーマＡ１４４及びＣ４１５が産
生する抗ｐ１７モノクローナル抗体をＰＢＳで１０μｇ
／mlに希釈し、反応後、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体
によるＥＬＩＳＡ法によりエピトープ（実施例１で合成
したオリゴペプチドライブラリー計６２個を使用）を解
析した。結果を図２及び３に示す。図２から、ハイブリ
ドーマＡ１４４が産生する抗ｐ１７モノクローナル抗体
は、配列番号２で示されるＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１
７中、９〜１８位の１０アミノ酸残基に相当するペプチ
ド、即ち配列番号１で示されるペプチドを特異的に認識
することがわかる。

【００４７】図３から、ハイブリドーマＣ４１５が産生
する抗ｐ１７モノクローナル抗体は、配列番号２で示さ
れるＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７中、９９〜１０８位
の１０アミノ酸残基に相当するペプチド等を特異的に認
識することがわかる。ハイブリドーマＡ１４４（Mouse-
Mouse hybridoma A144）は、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５２５４として
平成７年１０月２６日付けにて寄託されている。

【００４８】（２）モノクローナル抗体の産生 （腹水化）ＢＡＬＢ／ｃマウス８週齢メスの腹腔内に
０．５ｍｌのプリスタンを２週間前に接種した。マウス
ハイブリドーマを予め１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地で
培養し、マウス１匹につき１×１０⁶ 細胞を腹腔内に接
種した。１〜２週後に腹水を採取し、１２００rpm の遠
心分離により細胞を除去しモノクローナル抗体を得た。 （培養法）マウスハイブリドーマを１０％ＦＣＳ添加Ｒ
ＰＭＩ培地で培養し、細胞数が５×１０⁵ 細胞／ｍｌに
達した後に、ＰＭ−１０００培地（栄研化学社製）で１
２００rpm の遠心分離にて細胞を１回洗浄した。洗浄後
フレッシュなＰＭ−１０００培地に細胞を５×１０⁵ 細
胞／ｍｌに懸濁し、スピナーフラスコで１週間培養を続
け、抗体培養液を作製した。

【００４９】（３）モノクローナル抗体の精製 前記（２）の腹水については、プロテインＡセファロー
ス（ファルマシア社製）、ＭＡＰＳキット（バイオラッ
ド社製）によりアフィニティー精製した。前記（２）の
培養抗体については、陽イオン交換カラム及び陰イオン
交換カラムにより精製した。

【００５０】（実施例３）ＥＬＩＳＡ法による測定 （１）ハイブリドーマＡ１４４が産生するモノクローナ
ル抗体を９６穴マイクロプレートの固相抗体に、ハイブ
リドーマＣ４１５が産生するモノクローナル抗体をＰＯ
Ｄ標識抗体とし、３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジンを基質とした２ステップサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ法を確立した。測定時間は、第一反応１６〜２０時
間、第二反応１時間、酵素反応３０分で、反応温度は２
５℃に設定した。 （２）大腸菌組換えリコンビナントｐ１７抗原及びウィ
ルス抗原により、測定系の基礎的検討を行った。その結
果、測定範囲は大腸菌組換えリコンビナントｐ１７抗原
標準量で１０〜６４０ｐｇ／ｍｌであった（図４）。再
現性、希釈試験、添加回収試験ともに良好な結果が得ら
れた。交叉反応性ついて、ＨＩＶのｇａｇ蛋白質ｐ２
４、ｅｎｖ蛋白質ｇｐ４１との交叉性は認められなかっ
た。 （３）日本人ＨＩＶ感染者の末梢血単核細胞培養上清を
測定し、市販のアボットｐ２４抗原ＥＩＡIIと比較した
結果、２０４例中１９３例で判定が一致し、一致率は９
４．６％であった。不一致例の１１例は２例がｐ１７
（＋）、ｐ２４（−）、９例がｐ１７（−）、ｐ２４
（＋）の検体であった（図５）。 （４）日本人ＨＩＶ感染者の血漿をｐ１７ＥＬＩＳＡ法
で測定し、同時に市販のアボットｐ２４抗原ＥＩＡIIと
比較した。その結果、ｐ１７ＥＬＩＳＡ法陽性、ｐ２４
ＥＩＡII陰性例が２例見つかり、ｐ１７ＥＬＩＳＡ法陰
性、ｐ２４ＥＩＡII陽性例が２例あった。この２例の検
体はそれぞれ異なる検体であった（表２）。

【００５１】

【表２】

【００５２】

【発明の効果】本発明によれば、配列番号１で示される
アミノ酸配列のＮ末端から始まる３以上のアミノ酸から
なるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗
体を提供することができ、該モノクローナル抗体を用い
ることにより、ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７抗原を特
異的に検出又は測定することができる。また、ｐ１７Ｅ
ＬＩＳＡ法により、ｐ２４抗原ＥＩＡで検出されないＨ
ＩＶをも検出することもできるので、両者を組み合わせ
ることにより、ＨＩＶの検出をより確実にすることがで
きる。

【００５３】

【配列表】

【００５４】配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency
virus) 他の情報：ｇａｇ蛋白質のｐ１７中、９〜１８位の１０
アミノ酸残基

【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：１３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency
virus) 他の情報：ｇａｇ蛋白質のｐ１７全配列 配列 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Gln Tyr Lys 20 25 30 Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala 35 40 45 Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 65 70 75 Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Ala Val Leu Tyr Cys Val His Gln 80 85 90 Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu 95 100 105 Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala 110 115 120 Asp Thr Gly Asn Asn Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr 125 130

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で合成したペプチドとＨＩＶ−１ｇａ
ｇ蛋白質ｐ１７のアミノ酸配列との関係を示す図であ
る。

【図２】ハイブリドーマＡ１４４が産生する抗ｐ１７モ
ノクローナル抗体のエピトープの解析結果を示す図であ
る。

【図３】ハイブリドーマＣ４１５が産生する抗ｐ１７モ
ノクローナル抗体のエピトープの解析結果を示す図であ
る。

【図４】ｐ１７ＥＬＩＳＡ法の標準曲線を示す図であ
る。

【図５】ｐ１７ＥＬＩＳＡ法とｐ２４抗原ＥＩＡIIとの
相関を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 品川 日出男 大阪府吹田市佐竹台１丁目２番Ｄ17−201 号 (72)発明者 石橋 嘉一郎 栃木県大田原市下石上1381−３栄研化学株 式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ
   末端から始まる３以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列
   を特異的に認識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列を特
   異的に認識するモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ１７由来の蛋
   白質又はペプチドで、かつ配列番号１で示されるアミノ
   酸配列のＮ末端から始まる３以上のアミノ酸からなるア
   ミノ酸配列を含む免疫原で免疫された哺乳動物の免疫細
   胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合して得られ、請
   求項１又は２記載のモノクローナル抗体を生産するハイ
   ブリドーマ。
4. 【請求項４】 請求項３記載のハイブリドーマを培養
   し、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体を採取す
   ることを特徴とするモノクローナル抗体の製造法。
5. 【請求項５】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
   体を用いることを特徴とするＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質ｐ
   １７抗原の検出法。
6. 【請求項６】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ
   末端から始まる３以上のアミノ酸からなるペプチド。
7. 【請求項７】 配列番号１で示されるペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ
   末端から始まる３以上のアミノ酸からなる免疫原。
9. 【請求項９】 配列番号１で示されるペプチドからなる
   免疫原。