KR20240009996A

KR20240009996A - 항노로바이러스 항체

Info

Publication number: KR20240009996A
Application number: KR1020237043426A
Authority: KR
Inventors: 유지 사이토; 고지 히라오카; 신야 오가사와라
Original assignee: 덴카 주식회사
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2022-05-20
Publication date: 2024-01-23
Also published as: TW202313673A; WO2022244861A1; JPWO2022244861A1; EP4342909A1

Abstract

많은 유전자형의 노로바이러스에 반응하여, 노로바이러스를 일괄하여 검출하는 것이 가능한 항노로바이러스 항체가 개시되어 있다. 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 각각 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드와 항원 항체 반응한다. 노로바이러스에 대하여 폭넓게 결합하여, 인간 노로바이러스를 폭넓게 특이적이면서 고감도로 검출할 수 있는 신규의 항노로바이러스 항체, 그리고 그것을 사용한 노로바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구가 제공되었다.

Description

항노로바이러스 항체

본 발명은, 항노로바이러스 항체, 그리고 그것을 사용한 노로바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구에 관한 것이다.

노로바이러스는, 인간에게 경구 감염되어, 십이지장으로부터 소장 상부에서 증식하여, 감염성 위장염을 일으킨다. 십이지장 부근의 소장 상피 세포를 탈락시켜, 구토, 설사, 복통 등의 증상을 야기한다. 감염으로부터 발증까지의 잠복 기간은 12시간 내지 72시간(평균 1 내지 2일)이고, 증상이 수렴된 후에도 변으로의 바이러스의 배출은 1 내지 3주일 정도 계속되고, 7주일을 초과하는 배출도 보고되어 있다. 식중독 보고 환자 중 약 7할이 노로바이러스 감염증이다.

노로바이러스는, 약 7,500 염기의 플러스 단일쇄 RNA를 게놈으로 갖는 엔벨로프를 갖지 않는 바이러스이다. 노로바이러스의 게놈에는 3개의 단백질 코드 영역(ORF)이 존재하고 있고, ORF1은 바이러스의 복제에 관여하는 비구조 단백질, ORF2는 캡시드 구조 단백질(VP1), ORF3은 소규모의 구조 단백질(VP2)을 코드하고 있는 것이 보고되어 있다. 또한, 노로바이러스는, 캡시드 유전자 서열의 유사성을 바탕으로, 게노 그룹 I 내지 V(GI 내지 GV)의 5개의 그룹으로 분류되고, 이 중, GI, GII, GIV가 인간 감염의 주류가 된다. 그 중에서도 게노 그룹 I(GI)과 게노 그룹 II(GII)는 유전적 다양성이 많고, 인간 유래 시료로부터는, 진화 계통이 다른 다양한 바이러스가 검출되고, 게노 그룹 I은 9종 혹은 그 이상 게노 타입(유전자형), 게노 그룹 II는 22종 혹은 그 이상의 게노 타입으로 분류할 수 있는 것으로 되어 있다.

노로바이러스의 검출은, 캡시드 구조 단백질을, 항체를 사용하여 효소 면역검정(EIA)법(비특허문헌 1 참조)이나 면역 크로마토그래피법(비특허문헌 2 참조)에 의해 검출하는 것이 행해지고 있다. 따라서, 노로바이러스 항원을 적확하게 검출하기 위해서는, 모든 유전자형에 반응하는 항체가 필요해진다.

그러나, 항원의 공통 영역을 인식하여 반응하는 항체는 용이하게 입수할 수 없고, 지금까지는, 특정한 아미노산 서열을 갖는 노로바이러스 항원 펩티드 또는 그것의 프래그먼트에 대한 항체(예를 들어, 특허문헌 1 참조)를 복수 조합한 시약을 제작하여, 다른 유전자형의 노로바이러스를 각각 검출하는 것이 행해지고 있다.

예를 들어, 게노 그룹 GII의 노로바이러스에 공통적으로 반응하는 항체를 얻기 위해 검토한바, GII에 속하는 노로바이러스의 캡시드의 돌출 영역의 특정 부위에 결합하는 항체가, GII의 노로바이러스에 대하여 폭넓게 결합하여, 당해 GII에 속하는 유전자형(GII/1 내지 GII/17)의 노로바이러스의 대략 모두를 특이적으로 검출하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 2 참조).

그러나, 노로바이러스는 이변이성의 바이러스이고 캡시드의 표면에 노출되어 있는 돌출 영역은 변이가 많고, 돌출 영역에 항원 항체 반응을 함으로써 폭넓은 유전자형과 반응하는 항체를 일시적으로 제작할 수 있었다고 해도, 변이주가 발생하면 반응할 수 없게 된다는 문제가 있었다.

따라서, 유전자형이 다른 다수의 노로바이러스를 일괄하여 검출할 수 있는 항체의 창생이 요망되고 있었다.

한편, 비특허문헌 3에는, 노로바이러스의 캡시드의 셸 영역과 항원 항체 반응하는 모노클로날 항체가 기재되어 있다.

일본 특허 공표 제2009-542715호 공보 국제 공보 WO13/039165

「개량 노로바이러스 항원 검출 EIA 키트의 평가」, 월간 의학과 약학 Vol.61 No.1 Page. 93-98(2009. 01. 25) 「노로바이러스 항원 신속 진단약 퀵나비-노로의 평가」, 월간 의학과 약학 Vol.61 No.5 Page. 779-785(2009. 05. 25) Gabriel I. Parra et al., PLOS ONE, June 2013, Volume 8, Issue 6, e67592

본 발명은, 많은 유전자형의 노로바이러스에 반응하여, 노로바이러스를 일괄하여 검출하는 것이 가능한 항노로바이러스 항체를 제공하는 것이다.

본 발명은, 상기 과제를 감안하여, 노로바이러스에 공통적으로 반응하는 항체를 얻기 위해 검토한바, 노로바이러스의 캡시드의 표면에 노출되어 있는 돌출 영역이 아니라, 내부 구조인 셸 영역에 착안하여, 노로바이러스의 캡시드의 셸 영역의 특정 부위에 결합하는 항체가, 노로바이러스에 대하여 폭넓게 결합하여, 인간 노로바이러스를 폭넓게 특이적으로 검출할 수 있는 것을 알아냈다.

즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.

(1) 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 각각 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드와 항원 항체 반응하는, 항노로바이러스 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.

(2) 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열의 전체 또는 일부 영역을 에피토프로 하는, (1)에 기재된 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.

(3) 상기 항노로바이러스 항체가 모노클로날 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.

(4) 검체 중의 노로바이러스와, (1) 내지 (3)의 어느 것에 기재된 항노로바이러스 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 항원 항체 반응을 이용한, 노로바이러스의 면역 측정 방법.

(5) (1) 내지 (3)의 어느 것에 기재된 항노로바이러스 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는, 노로바이러스의 면역 측정 기구.

본 발명에 의해, 노로바이러스에 대하여 폭넓게 결합하여, 인간 노로바이러스를 폭넓게 특이적이면서 고감도로 검출할 수 있는 신규의 항노로바이러스 모노클로날 항체, 그리고 그것을 사용한 노로바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구가 제공되었다.

본 발명의 항노로바이러스 항체는, MLYTPLRTGGGSGGTDPFVVAGR(서열 번호 1) 및 RLVAMLYTPLRANGSGDDVFTVS(서열 번호 2)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드와 항원 항체 반응하는 항체이고, 노로바이러스의 캡시드 구조 단백의 셸 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 것이다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 각각 나타나는 아미노산 서열의 공통성으로부터, MLYTPLR(서열 번호 3)의 전체 또는 일부 영역이 에피토프라고 생각된다. 또한, 이 영역은, 비특허문헌 3에 기재되어 있는 모노클로날 항체의 에피토프와는 다른 영역이다.

노로바이러스의 캡시드 구조 단백(VP1)은, 셸 영역(S 도메인)과 돌출 영역(P 도메인)을 포함하는 것이 알려져 있다. S 도메인은, VP1의 어셈블리를 담당한다고 생각되고 있다. 한편, P 도메인은, 다시 P1과 P2 서브 도메인으로 나뉘고, P1 서브 도메인은, S 도메인과 상호 작용하여, 캡시드의 물리적 안정성을 증강하는 것, P2 서브 도메인은, 바이러스 입자의 최외곽에 위치하여, 마우스 노로바이러스에서는 중화 항체의 표적이 되는 것이 보고되어 있다.

본 발명의 항노로바이러스 항체는, IgG, IgA, IgY, IgD, IgM, IgE 또는 그것들의 하나 이상의 일부, 예를 들어 중쇄, 경쇄, Fc 또는 F(ab) 일부와 같은 임의의 요구된 유형일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항노로바이러스 항체는, 공지의 수단을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 포유 동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 산생되는 것 및 유전자 공학적 방법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주에 의해 산생되는 것이 포함된다.

항노로바이러스 모노클로날 항체 산생 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, 유전자 재조합 노로바이러스 유사 중공 입자(VLP)를 감작 항원으로서 사용하여, 이것을 통상의 면역 방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해, 모노클로날 항체 산생 세포를 스크리닝하여, 얻어진 모노클로날 항체 중으로부터, 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 각각 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드와 항원 항체 반응하는 모노클로날 항체를 선택함으로써 제작할 수 있다. 또한, 폴리클로날 항체는, 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 각각 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드의 적어도 어느 것을, 그대로, 또는 상용되는 담체에 고정화하여, 마우스, 래트, 햄스터 등의 동물에 면역하고, 그 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 회수함으로써 제작할 수 있다.

유전자 재조합 노로바이러스 VLP는, 노로바이러스의 캡시드의 유전자 서열을 트랜스퍼 벡터에 삽입하고, 바큘로바이러스 DNA와, 전술한 플라스미드를 Sf9 세포에 동시에 형질 감염시키고, 상동 재조합을 이용하여, 재조합 바이러스를 제작하여 증식시켜 시드 바이러스를 얻고, 그 후, Tn5 세포로 단백질의 발현을 행함으로써 세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적의 재조합 바이러스 VLP를 공지의 방법으로 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한, 유전자 재조합 노로바이러스 VLP 자체는 주지이고, 항노로바이러스 항체의 창제 등을 위해 널리 사용되고 있는 것이다.

감작 항원으로 면역되는 포유 동물로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터 등이 사용된다.

감작 항원을 동물에 면역하기 위해서는, 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들어, 감작 항원을 포유 동물의 복강내, 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는, 감작 항원을 PBS(인산염 완충 식염수(Phosphate-Buffered Saline))나 생리 식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것을 소망에 따라 통상의 아쥬반트, 예를 들어 프로인트 완전 아쥬반트를 적량 혼합하고, 유화 후, 동물의 피하, 피내, 복강 등에 투여하여 일시 자극 후, 필요에 따라 마찬가지의 조작을 반복해서 행한다. 항원의 투여량은 투여 경로, 동물종에 따라 적절히 결정되지만, 통상의 투여량은 1회당 10㎍ 내지 1㎎ 정도가 바람직하다. 이렇게 면역하여, 혈청 중에 원하는 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유 동물로부터 채혈하고, 혈청 성분을 정제함으로써 폴리클로날 항체를 얻을 수 있다. 혈청 성분을 정제할 때는, 감작 항원을 고정화한 어피니티 칼럼 등을 사용할 수 있다.

또한, 모노클로날 항체를 제작할 때는, 항체 레벨이 상승한 포유 동물로부터 면역 세포를 취출하여, 세포 융합을 행한다. 세포 융합을 행할 때의 바람직한 면역 세포로서는, 특히 비세포를 들 수 있다.

상기 면역 세포와 융합되는 다른 쪽의 친세포로서의 포유 동물의 미엘로마 세포는, 이미, 공지의 다양한의 세포주, 예를 들어 P3X63, NS-1, MPC-11, SP2/0 등이 적절히 사용된다.

상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합은 공지의 방법, 예를 들어 켈러 등의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)) 등에 준하여 행할 수 있다. 즉, 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 1000 내지 6000의 PEG, 30 내지 60％ 농도), 센다이 바이러스(HVJ) 등의 세포 융합 촉진제의 존재 하에, 소망에 따라 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가하여, RPMI1640 배양액, MEM 배양액 등의 영양 배양액 중에서, 면역 세포와 미엘로마 세포를 혼합함으로써, 융합 세포(하이브리도마)의 형성이 행해진다.

융합에 의해 형성된 하이브리도마를 히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 포함하는 배지(HAT 배지) 등의 선택 배지에서 1일 내지 7일간 배양하고, 미융합 세포와 분리한다. 얻어진 하이브리도마를 그 산생하는 항체에 의해 또한 선택한다. 선택한 하이브리도마를 공지의 한계 희석법에 따라 단일 클론화하여, 단일 클론성 항체 산생 하이브리도마로서 수립한다.

하이브리도마의 산생하는 항체의 활성을 검출하는 방법은, 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 ELISA법, 응집 반응법, 방사선 면역검정법을 들 수 있다.

얻어진 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 취득하기 위해서는, 당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양 상청으로서 얻는 방법, 혹은 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유 동물에 투여하여 증식시켜, 그 복수로서 얻는 방법 등이 채용된다.

항체의 정제는, 염석법, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법 또는 어피니티 크로마토그래피법 등의 공지의 정제 수단을 사용하여 행할 수 있다.

본 발명의 항노로바이러스 항체를 임의의 면역 측정 방법에 적용함으로써, 검체 중의 노로바이러스를 특이적으로 측정·검출할 수 있다.

면역 측정 방법 자체는 주지이고, 본 발명의 면역 측정은, 항체 또는 그의 항원 결합성 단편으로서 상기한 본 발명의 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 사용하는 것 이외는, 주지의 면역 측정 방법의 어느 것이든 채용할 수 있다. 따라서, 면역 측정 방법은, 특별히 제한되지 않고, 샌드위치법, 면역 응집법, 경합법 등, 주지의 면역 측정 방법의 어느 것이든 채용할 수 있다. 이것들 중에서도 항노로바이러스 항체와 표지 항노로바이러스 항체를 사용한 샌드위치법이 바람직하고, 고정화 항노로바이러스 항체와 표지 항노로바이러스 항체를 사용하는 방법이 더욱 바람직하다.

항노로바이러스 항체를 고정화하는 지지체로서는, 폴리스티렌 플레이트, 라텍스 입자, 자성 입자, 유리 섬유막, 나일론막, 니트로셀룰로오스막, 아세트산셀룰로오스막 등의 불용성 지지체가 바람직하다. 항체의 고정화 방법은 주지이다.

또한, 표지 항노로바이러스 항체로서는, 공지의 표지체, 예를 들어 방사성 동위체(예를 들어, ³²P, ³⁵S, ³H), 효소(예를 들어, 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, 루시페라아제), 단백(예를 들어, 아비딘), 저분자 화합물(예를 들어, 비오틴), 형광 물질(예를 들어, FITC), 화학 발광 물질(예를 들어, 아크리디늄), 라텍스 입자(예를 들어, 착색 라텍스 입자, 형광 라텍스 입자), 금속(예를 들어, 금, 은, 백금 등의 귀금속) 콜로이드 입자, 탄소 원자 등을 사용할 수 있다.

검체 중의 노로바이러스의 검출은, 검체 중의 노로바이러스를 고정화 항노로바이러스 항체와 반응시킴으로써 행해지지만, 샌드위치법에 의한 경우에는, 검체 함유액과 고정화 항노로바이러스 항체를 반응시키고, 이어서 상기 표지 항체를 반응시키는 것, 혹은 고정화 항노로바이러스 항체와 표지 항체를 동시에 반응시킴으로써 행할 수 있다. 반응 종료 후, 검체 중의 노로바이러스와 고정화 항노로바이러스 항체와 표지 항체로 형성된 복합체 중의 표지량을 측정하면, 검체 중의 노로바이러스양을 측정할 수 있다. 표지량의 측정은, 표지체의 종류에 따른 수단으로 행할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 효소, 아비딘을 사용한 경우에는, 반응 후, 기질을 더하여, 효소 활성을 측정한다. 또한, 표지로서 형광(형광 라텍스 입자를 포함함) 또는 화학 발광 물질을 사용한 경우에는, 소광이 일어나지 않는 조건에서 신호를 측정한다. 착색 라텍스 입자, 금속 콜로이드 입자 및 탄소 입자 등은 목시 혹은 반사광 등으로 신호를 측정한다.

상기한 면역 측정 방법 중에서도, ELISA 및 면역 크로마토그래피법이 보다 바람직하다.

본 발명의 항노로바이러스 항체를 사용한 면역 측정 기구는, 고정화된 본 발명의 항노로바이러스 항체를 포함한다. 고정화 항노로바이러스 항체 외에, 예를 들어 검체용 희석액, 표지 항노로바이러스 항체, 반응 기질 등에 의해 구성되는 키트의 형태여도 된다.

실시예

실시예 1 항노로바이러스 모노클로날 항체의 취득

통상의 방법에 의해 제작된 노로바이러스 유사 중공 입자(VLPs)를 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하여, 켈러 등의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해, 마우스 미엘로마 세포와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마)를, 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, 그 배양 상청을 사용하여, 노로바이러스에 대한 산생 항체의 반응성을 조사했다. VLPs를 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄, pH7.3(이하, PBS라고 약칭함)에서 0.1㎍/mL로 희석했다. 희석한 VLPs를 플라스틱제 마이크로타이터 플레이트(Nunc-Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, 상품명, Nalgen Nunc International사제)의 웰에, 1웰당 100μL의 VLPs/PBS, pH7.3 용액을 더하여, 4℃, 12시간의 조건 하에서 VLPs를 마이크로타이터 플레이트 상에 고상화했다. 12시간 후, 웰에 더해 둔 VLPs/PBS 용액을 디캔테이션에 의해 제거하고, 그 마이크로타이터 플레이트의 웰에 PBS, 0.05％(v/v) Tween20(이하 PBS-T라고 약칭하며, Tween은 상품명)을 200μL/웰에 더하고, 디캔테이션에 의한 PBS-T의 제거를 행하였다. 이 세정 공정을 총 3회 행하였다.

그 후, 1％ Perfect Block(상품명, 후나코시사제 블로킹제)/PBS pH7.3을 200μL/웰에 첨가하여, 4℃, 12시간의 조건 하에서 VLPs 고상화 마이크로타이터 플레이트의 웰 내 블로킹을 행하였다. 12시간 경과 후, 4℃인채로 보존 상태로 했다. 배양 상청 중의 항노로바이러스 모노클로날 항체의 반응성을 확인하기 위해, VLPs 고상화 마이크로타이터 플레이트에, 배양 상청 100μL/웰에 더하여, 37℃, 1시간 가온했다. 그 후, 웰에 더해 둔, 배양 상청을 디캔테이션에 의해 제거하고, PBS-T를 200μL/웰에 첨가하여, 디캔테이션에 의한 PBS-T의 제거를 행하여, 웰 내의 세정을 했다. 이 세정 공정을 총 3회 행하였다.

그 후, 웰에 퍼옥시다아제-콘쥬게이티드 염소 항 마우스 면역 글로불린(Agilent Technologies사제)(이하, 효소 표지 항체라고 칭함)을 100μl/웰(1만배 희석)에 더하여, 37℃, 1시간 가온했다. 그 후, 웰에 더한 효소 표지 항체를 디캔테이션에 의해 제거하고, PBS-T를 200μL/웰에 첨가하여, 디캔테이션에 의한 PBS-T의 제거를 행하여, 웰 내의 세정을 했다. 이 세정 공정을 총 3회 행하였다. 그 후, 웰에 3,3',5,5'-T-테트라메틸벤지딘(이하, TMB라고 약칭함) 용액을 퍼옥시다아제 효소 반응 기질 용액으로서, 100μL/웰에 더하여, 25℃, 30분, 차광으로 정치했다. 그 후, 즉시 313mM H₂SO₄ 용액을 100μL/웰에 첨가하여, 효소 반응을 정지시켰다.

그 후, 본 웰의 흡광도를 측정하여, 450㎚의 흡광도로부터 630㎚의 흡광도를 차감한 수치를 반응성 평가의 지표로 했다(Josephy P.D., Mason R.P. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3669-3675). 상청의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(단 클론화)를 행하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 항노로바이러스 모노클로날 항체를 산생하는 세포주를 얻을 수 있었다.

취득한 세포주를 브리스턴 처리한 BALB/c 마우스에 복강 투여하여, 약 2주일 후, 항체 함유 복수를 채취했다. 얻어진 복수로부터, 프로테인 A칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피법에 의해 IgG를 정제하여, 정제 항노로바이러스 셸 영역 항체(SMoAb)를 얻었다.

실시예 2 항노로바이러스 항체 에피토프의 확인

실시예 1에서 제작한 항노로바이러스 셸 영역 항체(SMoAb)에 대하여, 노로바이러스 유전자군에 공통되는 아미노산 서열을 동정하고, 동정된 아미노산 서열을 바탕으로, 펩티드 합성을 행하여, 동정된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 제작했다. 제작한 펩티드를 PBS로 0.3㎍/mL로 희석했다. 희석한 펩티드를 플라스틱제 마이크로타이터 플레이트(Nunc-Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, 상품명, Nalgen Nunc International사제)의 웰에, 1웰당 100μL의 노로바이러스 펩티드/PBS, pH7.3 용액을 더하여, 4℃, 12시간의 조건 하에서 노로바이러스 펩티드를 마이크로타이터 플레이트 상에 고상화했다. 12시간 후, 웰에 더해 둔 노로바이러스 펩티드/PBS 용액을 디캔테이션에 의해 제거하고, 그 마이크로타이터 플레이트의 웰에 PBS-T를 200μL/웰에 첨가하여, 디캔테이션에 의한 PBS-T의 제거를 행하였다. 이 세정 공정을 총 3회 행하였다.

그 후, 1％ Perfect Block(상품명, 후나코시사제 블로킹제)/PBS pH7.3을 200μL/웰에 첨가하여, 4℃, 12시간의 조건 하에서 펩티드 고상화 마이크로타이터 플레이트의 웰 내 블로킹을 행하였다. 12시간 경과 후, 4℃인채로 보존 상태로 했다. 항노로바이러스 모노클로날 항체의 반응성을 확인하기 위해, 노로바이러스 펩티드 고상화 마이크로타이터 플레이트에, 1㎍/mL의 항노로바이러스 모노클로날 항체 100μL/웰에 더하여, 37℃, 1시간 가온했다. 그 후, 웰에 더해 둔, 항체액을 디캔테이션에 의해 제거하고, PBS-T를 200μL/웰에 첨가하여, 디캔테이션에 의한 PBS-T의 제거를 행하여, 웰 내의 세정을 했다. 이 세정 공정을 총 3회 행하였다.

그 후, 웰에 효소 표지 항체를 100μl/웰(1만배 희석)에 더하여, 37℃, 1시간 가온했다. 그 후, 웰에 첨가한 효소 표지 항체를 디캔테이션에 의해 제거하고, PBS-T를 200μL/웰에 첨가하여, 디캔테이션에 의한 PBS-T의 제거를 행하여, 웰 내의 세정을 했다. 이 세정 공정을 총 3회 행하였다. 그 후, 웰에 TMB 용액을 퍼옥시다아제 효소 반응 기질 용액으로 하고, 100μL/웰에 더하여, 25℃, 30분, 차광으로 정치했다. 그 후, 즉시 313mM H₂SO₄ 용액을 100μL/웰에 첨가하여, 효소 반응을 정지시켰다.

그 후, 본 웰의 흡광도를 측정하여, 450㎚의 흡광도로부터 630㎚의 흡광도를 차감한 수치를 반응성 평가의 지표로 했다(Josephy P.D., Mason R. P. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3669-3675). 실시예 1에서 얻어진 SMoAb2 클론과 항노로바이러스 폴리클로날 항체(PoAb)를 마이크로타이터 플레이트 상의 펩티드와 반응시켜, 효소 표지 항체, 퍼옥시다아제 효소 반응 기질 용액을 사용하여 반응을 확인했다. 반응을 확인할 수 있었던 펩티드의 아미노산 서열은, 표 1에 나타냈다.

[표 1]

본 발명의 SoMb 항체는, GI과 GII의 공통된 서열을 많이 포함하는 MLYTPLR(서열 번호 3)을 인식하고 있다고 생각된다.

실시예 3 면역 크로마토그래피(IC)법에 있어서의 항노로바이러스 모노클로날 항체의 반응성

1. 항노로바이러스 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화

노로바이러스 GI의 캡시드의 돌출 영역에 반응하는 모노클로날 항체(GIPMoAb) 및 노로바이러스 GII의 캡시드의 돌출 영역에 반응하는 모노클로날 항체(GIIPMoAb)를 1.0㎎/mL가 되도록 정제수로 희석한 액 및 항 마우스 IgG 항체를 준비하여, PET 필름으로 뒷받침된 니트로셀룰로오스 멤브레인에 1μL/㎝의 양으로 선 형상으로 도포하여, 테스트 라인으로 했다. 컨트롤 라인은, 항 마우스 글로불린 항체를 상기와 마찬가지로 도포했다. 본 실시예에 있어서, 항체 고정화 멤브레인이라고 칭한다.

2. 항노로바이러스 항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화

실시예 1에서 제작한 항노로바이러스 셸 영역 항체(SMoAb)를 0.5㎎/ml가 되도록 정제수로 희석하고, 이것에 착색 폴리스티렌 입자를 0.1％가 되도록 더하고, 교반 후, 카르보디이미드를 1％가 되도록 더하고, 다시 교반했다. 원심 조작에 의해 상청을 제외하고, 50mM Tris(pH9.0), 3.0％ BSA로 재부유하여, 항노로바이러스 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다. 본 실시예에 있어서, 항체 고정화 입자라고 칭한다.

3. 시험편의 제작

항체 고정화 멤브레인과 다른 부재(백킹 시트, 흡수대, 샘플 패드)를 접합하고 5㎜ 폭으로 절단하여, 노로바이러스 시험편으로 했다. 이것들을 본 실시예에 있어서, 시험편이라고 칭한다.

4. 면역 측정

각 시험편에, 임의로 희석한 노로바이러스 VLPs와 항체 고정화 입자를 포함하는 검체 부유액을 100μL 적가하고, 15분간 정치했다.

항 마우스 IgG 항체 및 항노로바이러스 항체의 양쪽의 도포 위치에서 발색을 목시로 확인할 수 있었던 경우에 +라고 판정했다. 항 마우스 IgG 항체의 도포 위치에서만 발색을 목시로 확인할 수 있고, 항노로바이러스 항체의 도포 위치에서 발색을 목시로 확인할 수 없는 경우는 -라고 판정했다. 또한, 항 마우스 IgG 항체의 도포 위치에서 발색을 목시로 확인할 수 없는 경우는 무효라고 판정했다. 또한, 라인의 발색 강도에 따라, +++>++>+라고 기재한다.

본 발명의 시험편과 종래품인 노로바이러스의 캡시드의 돌출 영역에 반응하는 모노클로날 항체를 사용한 시험편과 판정 결과를 비교했다.

[표 2-1]

[표 2-2]

표 2-1, 2-2로부터, 본 발명의 시험편은 종래품과 비교하여, 시험한 GI 유전자군, GII 유전자군의 모두에 반응했다. 또한, 종래품보다도 강하게 반응하고 있고, 노로바이러스 항원에 대한 항체의 결합 친화성이 높아, 노로바이러스를 더 고감도로 검출 가능한 것이 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> DENKA COMPANY LIMITED <120> Anti-norovirus antibody <130> PF727-PCT <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequence of shell domain of capsid of norovirus <400> 1 Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 10 15 Pro Phe Val Val Ala Gly Arg 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequence of shell domain of capsid of norovirus <400> 2 Arg Leu Val Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Gly Ser Gly 1 5 10 15 Asp Asp Val Phe Thr Val Ser 20 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequence of shell domain of capsid of norovirus <400> 3 Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg 1 5

Claims

서열 번호 1 및 서열 번호 2에 각각 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드와 항원 항체 반응하는, 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
제1항에 있어서, 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열의 전체 또는 일부 영역을 에피토프로 하는, 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항노로바이러스 항체가 모노클로날 항체인, 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
검체 중의 노로바이러스와, 제1항 또는 제2항에 기재된 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 항원 항체 반응을 이용한, 노로바이러스의 면역 측정 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 항노로바이러스 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는, 노로바이러스의 면역 측정 기구.