KR101364130B1

KR101364130B1 - 일본뇌염바이러스에 대한 단일클론항체, 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 항원 검출 방법

Info

Publication number: KR101364130B1
Application number: KR1020110031073A
Authority: KR
Inventors: 남재환; 김혜연; 박기범; 김재옥; 김도근; 한의리
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-05
Filing date: 2011-04-05
Publication date: 2014-02-21
Also published as: KR20120114451A

Abstract

본 발명에서는 일본뇌염바이러스(JEV)의 구조 단백질의 특정 영역을 에피토프(epitope)로 인식하는 단일클론항체, 이 단일클론항체를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주 및 이 단일클론항체를 이용하여 JEV 백신 등의 중화 항체가 및/또는 역가 등을 효율적으로 분석하기 위한 생체외(in vitro) 시스템을 제안한다. JEV 백신의 효능을 검정하기 위해 수많은 동물을 희생시켰던 종래의 생체내(in vivo) 검정을 대신하여 본 발명에서 확인된 단일클론항체를 이용한 생체외 검정이 가능하게 되었다.

Description

일본뇌염바이러스에 대한 단일클론항체, 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 항원 검출 방법{Monoclonal Antibodies to Japanese Encephalitis Virus, Hybridoma Cell-lines of Producing the Antibodies and JEV-Antigen Detecting Method Using Thereof}

본 발명은 일본뇌염바이러스를 인식하는 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 일본뇌염바이러스의 특정 에피토프를 인식하는 단일클론항체, 이 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이 단일클론항체를 이용하여 일본뇌염바이러스의 항원, 예를 들면 일본뇌염바이러스 백신과의 항원-항체 결합체의 형성 여부를 통하여 이를 정량적으로 분석하는 것과 같은 응용 방법에 관한 것이다.

우리나라를 비롯한 극동지방과 동남아시아 전역에서 일본뇌염(Japanese Encephalitis)의 위험성이 존재한다. 보고된 바에 따르면, 매년 35,000 ~ 50,000 명이 일본뇌염에 감염되는데, 이들 중 10,000 명은 사망하며, 15,000명은 회복 후, 신경계 합병증을 남길 정도로 일본뇌염은 공중 보건에 심각한 위협을 가하는 질환이다. 일본뇌염은 모기가 매개하는 일본뇌염바이러스(Japanese Encephalitis virus, JEV)에 의해 유발되는데, JEV는 플라비바이러스과(Flaviviridae), 플라비바이러스(Flavivirus)속에 속하는 양성 2중 RNA((+) ssRNA) 게놈을 가지는 Group Ⅳ의 바이러스이다. 잘 알려져 있는 것처럼, 플라비바이러스속에는 일본뇌염바이러스 외에도 황열 바이러스(yellow fever virus), 웨스트 나일바이러스(West Nile virus), 뎅기열바이러스(dengue virus)와 같은 인체 병원성 바이러스가 속해 있다.

JEV는 돼지, 소와 같은 가금류에서 증폭되며, 이 바이러스에 감염된 매개모기인 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus)에 의해 사람에게 전달되는데, 일본뇌염이 인간에게 전염되면 열, 두통과 같은 비-특징적인 증상이 1 ~ 6일 동안 지속된 뒤, 급성 뇌염 단계에서는 악액질(cachexia), 경련(convulsions) 등을 유발할 뿐만 아니라, 이 바이러스가 중추신경계로 침투한 경우에는 일생 동안에 걸쳐 귀머거리 또는 반부전마비(hemiparesis)로 발전될 수 있고, 최악의 경우에는 사망에 이를 수도 있는 질병이다.

중추신경계로 침투한 JEV에 의한 면역학적 분석에 따르면, JEV의 침투로 인해 중추신경계에 존재하는 면역 세포인 미세아교세포(microglial cell)가 활성화되어 인터류킨-1(interleukin-1, IL-1) 및 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)와 같은 사이토카인과, 신경독(neurtoxin), 흥분성 신경전달물질(excitatory neutrotransmitter), 프로스타글란딘(prostaglandin), 반응 산소(reactive oxygen) 등이 분비됨으로써 뇌에서 독성 효과를 야기한다. 주로 극동 지방과 동남아 지역에서 발병하는 것으로 알려졌으나, 최근에는 호주를 비롯한 환태평양 지역과 인도에서도 일본 뇌염 사례가 보고되고 있어 JEV에 의한 질병의 치료와 예방이 더욱 중요해지고 있다. 특히 전 세계적인 지구 온난화 현상에 의한 바이러스의 중간 숙주인 모기의 급속한 증가와 아울러, 대륙 사이의 빈번한 교류 및 여행으로 인하여 JEV 바이러스가 극동 지역이나 동남아 지역을 넘어 다른 지역으로 전파될 가능성이 점차 증가하고 있다는 점을 고려해 볼 때, JEV에 대한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.

플라비바이러스속에 속하는 일본뇌염바이러스는 크기가 40 ~ 50 ㎚로 외막을 가지는 구형 바이러스이다. 게놈 분석에 따르면 일본뇌염바이러스는 단일가닥의 양성-극성 RNA 바이러스로서 지질 외막이 바이러스의 캡시드 코어를 둘러싸고 있다. 게놈 분석에 따르면 일본뇌염바이러스는 약 11kb 크기의 RNA 게놈을 가지며 하나의 긴 열린해독틀(Open reading frame, ORF)을 암호화하고 있으며, 게놈의 양쪽 끝에 바이러스의 복제, 전사 및 해독에 관여하는 95개의 뉴클레오티드로 구성되는 5'-NTR(non-translated region)과 574개의 뉴클레오티드로 구성되는 3'-NTR 2개의 시스-작용 인자(cis-acting factor)가 위치하고 있다. 특히 일본뇌염바이러스의 RNA 게놈 중 5' 말단에 I 캡 구조를 가지고 있는 반면, 3' 말단에는 폴리 A 꼬리(poly (A) tail)가 없는 것이 특징이다.

일본뇌염바이러스의 ORF는 하나의 긴 다-단백질(poly-protein)로 발현되며 번역과 동시에 또는 번역 후 프로세싱에 의해 최소한 3개의 구조 단백질(structural protein)과 7개의 비구조단백질(nonstructural protein, NS)이 합성된다. 구조 단백질은 5' 말단에서부터 보면 캡시드(capsid, C), 전-멤브레인(premembrane, pM) 및 외피(envelope, E) 순으로 암호화되어 있는데, 특히 외피 단백질은 바이러스 표면의 당단백질로서, 바이러스의 어셈블리(assembly) 과정에서 당화(glycosylation) 및 이합체화(dimerization)가 일어나서, 숙주 세포 수용체로의 바이러스의 부착, 특이적 막-융합, 적혈구 응고 억제, 항-융합(anti-fusion) 항체의 유도 및 바이러스에 대한 중화 항체의 생성 등에 관여한다.

또한, 바이러스의 자기복제에 필수적인 자기복제 효소 (replicase)로 구성된 7개의 비구조적 단백질들은 NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5순으로 암호화되어 있는데, 그 중에서 NS3는 헬리카아제(helicase)/세린 프로테아제(serine protease)/NTPase 등 다양한 기능을 가지고 있으며, NS5는 RNA polymerase의 기능을 갖는 것으로 알려져 있다.

일본 뇌염의 치료 및 예방과 관련하여, 일본뇌염바이러스는 하나의 혈청형(stereotype)이 알려져 있으나 strain에 따라 다른 antigenic determination을 가지고 있다. 아직까지 일본 뇌염에 대한 효과적인 치료제가 개발되어 있지 않기 때문에 백신을 통한 예방 접종이 가장 효율적인 일본뇌염에 대한 방어 수단이다. 현재 세계적으로 사용되고 있는 일본뇌염 백신으로는 ⅰ) 마우스의 뇌-배양에서 유래하거나 햄스터의 초대 신장 세포(primary hamster kidney, PHK) 배양에서 유래한 불활화 사백신(inactivated vaccine)과, 1종류의 약독화 생-바이러스 백신이 개발되어 사용되고 있다. 불활성화 사백신으로는 나카야마-주(Nakayama strain) 또는 베이징-1 주(Beijing-1 strain)를 마우스의 뇌에서 배양시킨 것이나 P3 주를 PHK 세포에서 배양시킨 것이 사용되고 있으며, 약독화 생백신으로는 SA-14-14-2 주를 PHK 세포에서 배양시킨 것이 널리 사용되고 있다. 그 중에서 우리나라의 경우에는 Nakayama-NIH 주를 특정 병원균 제거(specific pathogen free) 마우스의 뇌에서 증식하여 포르말린 처리한 불활성화 백신과 약독화 생-바이러스 백신(JEV SA14-4-2)이 시판되어 사용되고 있으며, 국가 예방접종에는 불활화 일본뇌염 백신이 권장되고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면 천연 폴리페놀 항산화 카르복실산인 로즈마린산(rosmarinic acid), 국화과에 속하는 식물에서 발견되는 아크티제닌(arctigenin) 또는 카레 성분인 강황(tumeric)의 주요 성분의 하나인 커큐민(curcumin) 등이 마우스 모델이나 신경 세포에서의 JEV의 복제를 억제하는 등의 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Vivek Swarup et al. (2007). Antiviral and Anti-Inflammatory Effects of Rosmarinic Acid in an Experimental Murine Model of Japanese Encephalitis, Antimicrob. Agents Chemother. 51(9): 3367-70; Vivek Swapu et al. (2009). Novel strategy for treatment of Japanese encephalitis using arctigenin, a plant lignan, J. Antimirob. Chemother. 61(3): 679-88; Kallol Dutta et al. (2009). Curcumin Protects Neuronal Cells from Japanese Encephalitis Virus-Mediated Cell Death and also Inhibits Infective Viral Particle Formation by Dysregulation of Ubiquitin??Proteasome System, J. Neuroimmune Pharmoacol. 4(3): 328-37).

하지만, 임상적으로 JEV에 대한 효율적인 치료법이 아직 개발되지 못하였기 때문에 주로 백신을 이용하여 일본뇌염을 예방하고자 하는 노력이 지속되고 있다. 일례로, 포르말린을 사용하여 마우스의 뇌에서 유래한 불활성화 생백신이 최초로 제조된 이래로 JEV가 야기하는 질환을 예방하기 위한 다양한 백신이 개발되거나 제안되었다. 하지만 마우스의 뇌에서 유래한 생백신과 관련해서 현재 상업적으로 사용되는 백신이 JE-VAX™ 백신인데, 보통 2-3회의 접종이 요구되기 때문에 번거로울 뿐만 아니라, 매우 드물기는 하지만 자가면역 반응에 의한 신경 합병증의 위험이 존재하며 중화 항체는 통상적으로 3년이 경과하면 사라지기 때문에 일정 주기마다 다시 예방 주사를 접종하여야 한다.

이를 대신하기 위해서 세포 배양액(cell-culture)에서 유래하거나 또는 생명공학 기술을 접목한 새로운 형태의 백신이 개발되거나 제안되었다. JEV와 관련된 약독화된 생백신(live attenuated vaccine)으로서 JEV strain SA14-14-2를 이용한 백신이 중국에서 개발되어 1회의 접종만으로 효율적인 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 대한민국등록특허 제10-0490980호(특허문헌 1)에서는 JEV의 유전자 prME, NS1 영역과 돼지의 인터류킨-2 유전자가 각각 삽입된 재조합 플라스미드가 조합된 DNA 백신을 제안하고 있고, 이와 함께 대한민국등록특허 제10-0942388호(특허문헌 2)에서는 역전사 중합효소연쇄반응을 이용하여 JEV를 검출하기 위하여 JEV의 캡시드(C) 영역에 인접한 5'-NTR 부위와 M 단백질 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트를 개시하고 있다.

한편, JEV 백신과 관련해서 현재 국내를 포함하여 전 세계적으로 일본뇌염백신의 역가를 시험하기 위한 방법으로 해당 백신을 실험 동물에 면역한 후에 생성된 항체 중 JEV를 중화시키는 항체량(중화항체가)을 측정하는 생체내(in vivo) 역가 시험법을 사용하고 있다. 구체적으로 현재 국내에서는 일본뇌염 백신의 중화 능력을 검사하기 위해서 제조된 백신을 검정 프로토콜에 따라 예를 들어 기니아 피그에 면역 후 채혈하여 혈청 내에 존재하는 JEV에 대한 중화항체 역가를 검사하고 있다.

우리나라에서 불활화 일본뇌염 백신의 국가 검정에 연간 2천여 마리의 마우스가 사용되고 있는데, 백신 제조사의 품질 관리시험에 사용되는 것을 고려한다면 일본뇌염 백신의 역가 시험에 연간 1만 마리 이상의 마우스가 사용되는 것으로 추정되고 있다. 하지만 세계보건기구(WHO), 유럽(EU) 및 미국 등은 의약품의 품질 관리에 동물시험을 대체하는 시험법을 개발하여 실험 동물의 사용을 최소화하고자 노력하고 있다. 뿐만 아니라, 기본적으로 이러한 생체내(in vivo) 방법은 동물을 사용하는 관계로 긴 면역 시간이 요구되고, 중화항체가 확인을 하는 세포의 상태라든가 실험자의 숙달도 등에 따라 정확한 중화항체 역가를 확인하는 것이 어렵다.

또 하나의 방법으로 플라크 감소 중화항체 검사법(plaque reduction neutralization test, PRNT)이 주로 사용되고 있는데, 이 검사법은 감염 위험성이 존재하는 바이러스를 직접 사용하여 계태아 세포에 감염시켜 일정한 배양 기간 동안 세포의 병변 효과를 통해 관찰하는 방법이다. 일본뇌염 백신의 중화항체가를 검정하는 것과 관련해서는 일반적으로 해당 백신을 32배 희석하여 마우스에 1주일 간격으로 2회 면역하여 채혈한 뒤, 계태아 배양 1차 세포를 이용하여 측정하고 있다. 그런데 PRNT 검사법에서는 BL3 조건의 실험실에서의 작업이 요구될 뿐만 아니라 중화항체를 확인하는데 최소한 3주간의 검정 기간이 필요하고 숙주 세포를 준비하는데 어려움이 존재한다. 아울러 동물을 사용하는 in vivo 실험이기 때문에 실험 동물의 이상으로 인한 검정 차질이 발생할 수 있다.

결국, 일본뇌염 백신의 중화항체가를 검정하기 위한 종래의 방법은 기본적으로 적지 않은 시간이 필요하기 때문에 백신의 검정 기간을 준수하는 것이 어려울 뿐만 아니라 동물 실험에 의한 불확실성의 문제를 완전히 제거할 수 없다. 따라서 일본뇌염바이러스에 의해 야기되는 질환에 대한 효율적인 방어 시스템을 구축하는 동시에, 현재 또는 추후에 개발되는 일본뇌염바이러스 백신의 효율적인 접종 농도 등을 검정하는데 있어서 동물을 사용하지 않고 효율적으로 검정하기 위한 방법을 모색할 필요성이 존재한다.

1. 대한민국등록특허 제10-0490980호 2. 대한민국등록특허 제10-0942388호

본 발명은 전술한 문제를 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 일본뇌염바이러스(JEV)의 구조 단백질의 특정 영역을 에피토프로 인식하고/인식하거나 JEV의 해당 단백질을 중화시키는 단일클론항체를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 JEV 특이적인 단일클론항체를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 humanized JEV 특이적 단일클론항체를 유효 성분으로 포함하는 약리학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 JEV 특이적 단일클론항체를 이용하여 항원-항체 복합체의 검출 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 JEV 특이적 단일클론항체를 이용하는 면역분석법을 통해서 JEV 백신의 유효량 등을 평가, 검정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부하는 도면을 통해서 더욱 분명해질 것이다.

전술한 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 일본뇌염바이러스(JEV)의 외피 단백질을 에피토프(epitope)로 인식하며, 기탁번호 KCLRF-BP-00258 또는 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체를 제공한다.

이때, 기탁번호 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체는 JEV의 외피 단백질 중 C-말단의 서열번호 3을 에피토프로 인식한다.

또한 본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00258 또는 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포를 제공한다.

아울러, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 일본뇌염바이러스(JEV)의 외피 단백질을 에피토프(epitope)로 인식하며, 기탁번호 KCLRF-BP-00258 또는 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체를 포함하는 일본뇌염바이러스의 외피 단백질 검출을 위한 조성물을 제공한다.

더욱이, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 일본뇌염바이러스(JEV)의 외피 단백질을 에피토프(epitope)로 인식하며, 기탁번호 KCLRF-BP-00258 또는 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 사기 생물학적 시료에 JEV 항원 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 항원-항체 복합체 형성은 효소면역흡착법(ELISA)에 의하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 샌드위치 ELISA에 의할 수 있다.

특히 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는 일본뇌염백신이며, 기탁번호 KCLRF-BP-00258에 의해 생성되는 단일클론항체가 상기 일본뇌염백신과 항원-항체 복합체를 형성하며, 기탁번호 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체가 이 항원-항체 복합체를 인식한다.

본 발명에서는 일본뇌염바이러스의 특정 에피토프를 인식하는 단일클론항체를 제작하였으며, 이 단일클론항체를 이용한 약학적 응용을 제안하였다. 본 발명에 따른 단일클론항체 및 이를 함유하는 조성물을 인체에 투여하는 방법을 통하여 일본뇌염에 감염된 환자를 치료하거나, 일본뇌염을 예방하거나 또는 환자가 일본뇌염에 감염되었는지의 여부를 진단할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 JEV 특이적인 단일클론항체를 이용한 면역학적 분석을 통해서 샘플 내의 JEV 항원-단일클론항체 복합체의 검출을 통해서 이들 샘플이 일본뇌염에 감염되었는지의 여부를 확인할 수 있다.

뿐만 아니라, JEV 특이적 단일클론항체를 이용한 면역분석법, 예를 들어 ELISA 분석에 의해, 개발된 JEV 백신의 유효량 등을 검정할 수 있다. 이에 따라 기존에 많은 수의 실험 동물을 희생시켜 일본뇌염 백신의 역가 시험을 대체하는 in vitro 역가 시험을 가능하게 하였다.

따라서 종래 일본뇌염 백신의 중화항체가 등의 검정을 위해 실험 동물을 사용하였던 것과 비교할 때, 시험의 불확실성과 오류를 최소화할 수 있고, 시험 기간을 단축할 수 있으며 간단히 중화항체의 역가를 검정할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 일본뇌염바이러스의 외피 단백질의 클로닝을 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터에 의하여 발현된 일본뇌염바이러스 외피 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 재조합 바이러스 벡터에 의하여 발현된 일본뇌염바이러스 외피 단백질을 비중에 따라 분리, 정제한 뒤 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 것이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 일본뇌염바이러스에 대한 단일클론항체를 제조하기 위하여 표적 항원을 사용하여 마우스를 면역시키기 위한 과정(면역 스케줄)을 개략적으로 도시한 것이고, 도 4b는 이러한 절차에 따라 JEV 항원으로 면역된 마우스의 혈청을 이용하여 ELISA를 수행한 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체를 선별하기 위하여 웨스턴 블롯팅 결과를 도시한 사진이다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체를 선별하기 위하여 96-웰 플레이트에서 IFA 측정 결과를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체를 선별하기 위하여 1차 선별된 20개의 클론을 대상으로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과를 도시한 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 항체의 최적량을 알아보기 위해서 최종적으로 선별된 단일클론항체를 사용하여 더블 샌드위치 ELISA를 수행하고 그 결과를 측정한 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 단일클론항체를 사용하여 식품의약품안전청의 표준품을 대상으로 더블 샌드위치 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 표이고, 도 9b는 음성 대조군인 Vero cell을 대상으로 더블 샌드위치 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 표이다.
도 10은 제조사 A에서 판매하고 있는 JEV 백신을 대상으로 본 발명의 단일클론항체를 사용하여 더블 샌드위치 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 표이다.
도 11은 제조사 B에서 판매하고 있는 JEV 백신을 대상으로 본 발명의 단일클론항체를 사용하여 더블 샌드위치 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 표이다.
도 12는 시판되고 있는 JEV 제조 백신에 대한 역가를 측정한 것으로, 왼쪽이 제조사 A 백신에 대한 역가를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 오른쪽이 제조사 B 백신에 대한 역가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 일본뇌염바이러스 표준품을 일정 농도로 희석하여 생체내에서 중화항체가를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 14는 일본뇌염바이러스의 외피 단백질 중 에피토프를 찾아내기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따라 JEV 외피 항원을 이루는 아미노산을 10개씩 중복하여 15-mer의 단위로 합성한 펩타이드를 보여주는 표이다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명에 따라 최종적으로 선별된 단일클론항체(JEV_1 하이브리도마 클론에서 생산)의 에피토프를 확인하기 위하여, 표적 항원을 15개 중첩되는 아미노산으로 구성되는 펩타이드와 반응시킨 뒤, 각각의 펩타이드에 대한 반응성을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 16a 및 도 16b는 본 발명에 따라 최종적으로 선별된 다른 단일클론항체(JEV_2 하이브리도마 클론에서 생산)의 에피토프를 확인하기 위하여, 표적 항원을 15개 중첩되는 아미노산으로 구성되는 펩타이드와 반응시킨 뒤, 각각의 펩타이드에 대한 반응성을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

국내를 비롯하여 아시아 전역을 중심으로 세계적으로 만연하고 있는 일본뇌염바이러스(JEV)가 야기하는 질병을 효율적으로 치료하기 위한 물질이 현재까지 개발되지 못하고 있는 현실을 고려해 볼 때, JEV의 단백질 중 특정 영역을 에피토프(epitope)로 인식하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 확인하여 이를 임상적으로 활용할 필요성이 있다. 아울러, 현재 개발, 시판되고 있는 백신의 중화 항체 생산 능력이나 1회 복용 수준과 같은 백신의 효능을 검정하기 위해서도 종래 사용된 동물 모델을 대신하여 이들 백신 중 항원결정부위와 반응하는 단일클론항체를 활용하는 방안을 검토할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 일본뇌염의 예방, 진단은 물론이고 백신의 효능을 검출하기 위한 방안으로서 일본뇌염바이러스(JEV)의 특정 에피토프를 인식하여 결합하는 단일클론항체를 통해서 전술한 문제점을 해소할 수 있다는 점에 착안하였다. 이하, 본 발명을 첨부하는 도면을 참조해서 설명한다.

본 발명자들은 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV)에 대한 단일클론항체를 제조하기 위해서, 일본뇌염바이러스의 구조 단백질 중에서 외피 당단백질(envelope protein, E)을 표적으로 하였다. JEV의 게놈을 구성하는 구조 단백질 중에서 외피 단백질은 JEV가 숙주 세포의 수용체로 부착하여 특이적 막-융합 등에 의한 중화항체의 생성 등에 관여하는데, 중화 항체는 바이러스의 외피 complex에 직접 결합하여 JEV에 대한 감염 예방 및 치료에 중요한 역할을 하기 때문에, JEV 백신의 효능 평가에 중요하다. JEV의 외피 당단백질에 대한 단일클론항체를 제작하기에 앞서 본 발명자들은 JEV의 외피 당단백질을 암호화하는 유전자의 클로닝을 확인하였다. 본 발명에 따른 JEV로는 Nakayama 주는 물론이고, Beijing 주 역시 사용될 수 있으며 현재까지 알려져 있는 임의의 JEV strain이 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 JEV 중에서 Nakayama strain의 외피 당단백질을 암호화하는 1500 bp의 유전자(서열번호 1) 전체를 클로닝하고, 이 유전자에 의해 발현되는 500 bp의 아미노산(서열번호 2)의 단백질에 주목하였다.

JEV의 외피 당단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝하기 위한 바람직한 벡터로는 곤충 세포를 매개로 하여 목적 단백질을 증폭할 수 있으며 포유동물에서 일어나는 번역-후 변형(post-transcriptional modification)을 진행할 수 있는 바큘로바이러스(Baculovirus) 유래의 벡터를 사용할 수 있다. 그 중에서도 JEV의 외피 단백질을 암호화하는 유전자(서열번호 1)의 크기(1,500 bp)를 고려하여 lethal 부분이 제거(deletion)되고 viable virus가 암호화되어 있지 않게 변형된 BaculoGold DNA를 가지는 pACGP67-A, -B 또는 -C 타입의 벡터를 사용할 수 있는데, 본 발명의 실시예에서는 pAcGP67-A 벡터를 사용하였다. 이러한 형태의 바큘로바이러스 벡터는 바큘로바이러스가 곤충 세포에 감염되어 증폭되는 원리를 이용하는데, 곤충 세포가 대부분의 포유동물 표적 서열을 인식하기 때문에 다양한 단백질을 발현시킬 수 있고, 번역-후 변형이 일어날 뿐만 아니라 표적 단백질을 높은 효율로 발현시킨다는 점에서 바람직하다.

물론, 본 발명에 따라 JEV의 외피 단백질을 클로닝하기 위해서 전술한 벡터 외에도 이미 공지된 다양한 벡터, 예를 들어 바이러스 유래의 벡터를 사용하여 재조합 할 수 있다. 이러한 클로닝 방법을 통하여 정제된 JEV 외피 단백질을 사용하여 마우스를 면역시키고 면역된 마우스에서 적출한 비장 세포를 마우스 기원의 골수종 세포인 Sp2/0 cell과 융합하여 생성된 하이브리도마 중에서 JEV 외피 항원 단백질에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다.

JEV 외피 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 선별하기 위해서 1차적으로 선별된 20개의 단일클론항체에 대한 항원 반응성을 IFA와 같은 면역조직화학 방법 및 웨스턴 블롯팅 방법을 사용하여 JEV 외피 단백질과의 친화적 반응 정도를 확인하였다. 이러한 방법에 의하여 2차적으로 14개의 단일클론항체를 선별하였고, 2차적으로 선별된 단일클론항체를 대상으로 샌드위치 ELISA 방법에서 JEV 항원을 가지고 있는 백신에 대한 중화항체가 생산 정도를 확인하여, 최종적으로 1쌍의 단일클론항체(JEV_1, JEV_2)를 확인하였다. 후술하는 것과 같이 본 발명에서 최종적으로 선별된 단일클론항체는 JEV 백신에 대한 효율적인 중화항체가 생산을 생체외(in vitro)에서 검정하는데 이용될 수 있다. 이들 최종적으로 선별된 하이브리도마 세포주 JEV_1 및 JEV_2는 2011년 2월 15일자로 국제기탁기관인 서울시 종로구 연건동 소재 한국세포주 은행(KCLB)에 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00258, KCLRF-BP-00259로 기탁하였다.

본 발명에 따른 JEV의 표적 항원을 대상으로 하는 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al. European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로서 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝(sub cloning)을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, V653, S194, 랫트(rat) 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예 사용된 세포주는 마우스 유래의 골수종 세포 SP-2/0이다. 상기의 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 고-순도로 정제하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 JEV 표적 항원 단백질을 선택적, 특이적으로 인식하는 단일 클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 다양한 방법, 예를 들면, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(enzyme immunoassay, EIA)라고도 알려져 있는 효소면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역형광법(Immunofluorescence assay, IFA), 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및 유세포 분석법 등을 사용할 수 있는데 꼭 이들로만 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 예시된 방법은 웨스턴 블롯팅 또는 면역흡광법이다.

본 발명에 따른 단일클론항체는 항원과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화 (neutralization)시키며, JEV에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, 표적 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의하여 항원이 제거되도록 할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의하여 더욱 잘 잡아먹히게 만들 수도 있다. 또한, 단일클론항체가 결합되어 있는 항원 세포는 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)에 의해 보다 쉽게 제거됨으로써, 상기 단일클론항체를 면역반응을 통한 항원의 제거에 이용할 수 있다. 따라서 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원의 제거 및 항원 감소의 결과를 기대할 수 있어 본 발명의 단일클론항체는 JEV에 의한 감염에 대한 효율적인 방어 시스템으로 사용될 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 단일클론항체가 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 키메릭(chimeric) 항체, 인간화 항체(humanized antibody) 및 인간 단일클론항체로 전환될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 키메릭 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 재조합시킨 것이고, 인간화 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역에서 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions : CDRs) 또는 상보성 결정 영역 중에서도 항원 결합 특이성에 관여하는 아미노산 잔기들(specificity determining residues : SDRs)만을 인간 항체에 이식시킨 것이다.

인간화 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역 중 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 인간 항체의 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역대신 치환하고, 그 결과 항원 결합능을 나타내는 하이브리드(hybrid: 생쥐 중쇄/인간 경쇄 혹은 생쥐 경쇄/인간 중쇄) 항체로부터 생쥐 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 다시 인간 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역으로 치환하여 항원 결합능을 나타내는 완전 인간 항체 가변영역을 골라낸 후 이를 인간 항체 불변영역과 연결시키는 등의 공지의 방법을 사용하여 본 발명의 단일클론항체로부터 용이하게 제조가능하며, 이러한 변이체가 본 발명의 범위에 속한다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 사실이다. 위와 같이 제조된 키메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체는 공지의 방법을 사용하여 동물세포에서 생산할 수 있다.

또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 암 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv 등을 포함할 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명에 따라 선별된 하이브리도마를 이용하여 본 발명에 따른 단일클론항체를 대량생산할 수 있다. 단일클론항체를 대량생산하기 위한 방법의 일례로서, 선별된 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액(ascites fluid)에서 배양한 후, 이에 제한되는 것은 아니나 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피 등으로 분리하는 것을 포함한다. 또한, 원하는 하이브리도마 클론이 분리되면, 이 클론을 배양하여 배양액에 존재하는 단일클론항체를 분리하여 사용할 수도 있으며, 생쥐의 복강에 하이브리도마 클론을 주사하여 얻은 복수액으로부터 단일클론항체를 얻을 수도 있다. 상기와 같이 제조된 단일클론항체는 면역진단, 면역치료, 그리고 항원 및 항체의 분자세포생물학적인 연구, 더 나아가 촉매항체와 같은 유용한 항체를 얻는 데에도 널리 이용된다.

바람직하게 본 발명의 대량생산방법은 추가적으로 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 고-순도(예컨대 95% 이상)로 정제하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전 또는 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 상기 단일클론항체를 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에서 유래된 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 단일클론항체를 포함하는 JEV의 감염에 의한 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

투여 방식에 적합한 제제는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에서 유래된 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물은 암 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여 될 수 있으며 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화 할 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에서 확인되는 것과 같이 본 발명에 따른 단일클론항체를 사용하여 생물학적 시료와 반응시켜 JEV 항원 또는 이들 항원을 함유한 백신에서의 항원의 발현 정도를 측정할 수 있다. 이러한 의미에서 본 명세서에 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 인간을 포함한 동물, 예를 들어 포유동물의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 요(尿)는 물론이고 JEV의 특정 항원을 함유하는 백신 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명에 따른 단일클론항체와 반응시켜 JEV의 표적 단백질인 외피 단백질의 발현 정도를 측정할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란, 생물학적 시료 중의 JEV의 표적 단백질인 외피 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 JEV 외피 단백질과 본 발명에 따른 단일클론항체 또는 이와 동일한 에피토프를 인식하는 단일클론항체의 결합물을 의미한다. 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 예를 들어, 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법 (fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method) 등의 방법을 통해 검출할 수 있지만, 본 발명이 이러한 방법으로만 한정되는 것은 아니고 다양한 응용이 가능하다.

이때, "검출"이란, 항원-항체 복합체를 탐지하기 위한 것으로 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소 등의 표지를 사용할 수 있지만, 다른 표지 역시 사용될 수 있다. 구체적으로, 검출 표지로 사용가능한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺ 킬레이트 또는 크립테이트(cyptate) 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼튼(Bolton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 ⅰ) 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적(direct) ELISA, ⅱ) 고체 지지체에 부착된 항원과 이 항원을 인지하는 1차 항체가 결합된 항원-1차 항체의 복합체에서 이 1차 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적(indirect) ELISA, ⅲ) 고체 지지체에 부착된 항체(즉, 포획 항체(capture antibody)와 이 항체가 인지하는 특정 영역을 가지는 항원이 결합한 항원-항체 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체(즉, 검출 항체(detection antibody)를 이용하는 직접적 샌드위치(sandwich) ELISA, ⅳ) 고체 지지체에 부착된 포획 항체와 이 항체가 인지하는 특정 영역을 가지는 항원이 결합된 포획항체-항원의 복합체에 이 항원의 다른 부위를 인지하는 또 다른 항체(1차 검출 항체)와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체(2차 검출 항체)를 이용하는 간접적 또는 중첩적(double) 샌드위치 ELISA, 또는 ⅴ) 항원을 포함하는 샘플과 항체를 인큐베이션 한 뒤, 이 항원으로 코팅된 well로 항원-항체 복합체를 첨가하고 well의 항원과 결합되지 않은 항체를 제거한 뒤에, 이 항체 또는 항원에 특이적인 2차 항체로서 효소와 conjugate된 2차 항체(또는 항체 특이적인 항원으로서 효소 등에 의해 표지된 항원)를 반응시키는 경쟁적 ELISA(competitive ELISA, 이 경우에는 샘플 내에 항원이 많을수록 well에 코팅된 항원과 결합하는 1차 항체의 수가 감소하게 된다) 등을 적용해 볼 수 있다.

일례로, 본 발명에 따른 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다. 특히 바람직하게는, 항원-항체 복합체를 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출할 수 있다. 직접적 또는 중첩적 샌드위치 ELISA를 사용하는 경우에 포획항체와 검출항체는 항원의 다른 부분을 epitope로 인식하는 것이 바람직하다. ELISA 검출 방법에 따라, 생물학적 시료는 고체 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단일클론항체(포획항체)와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단일클론항체(포획항체)로 코팅하고, 단일클론항체에 의해 코팅되지 않은 결합 부위를 차단하기 위해서 비-반응성 단백질인 BSA(bovine serum albumin) 또는 casein과 같은 단백질을 첨가한 후, 코팅된 플레이트의 웰(well)을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체(검출항체), 예를 들어 JEV의 외피 단백질에 특이적으로 결합하는 검출 항체 또는 임의의 다클론항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 단일클론항체 또는 다클론항체는 검출표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우 이들 단일클론항체 또는 다클론항체를 검출할 수 있는 또 다른 항체로 처리하여 확인할 수 있다.

바람직하게는 항원 또는 백신의 특이성을 고려해 볼 때, 본 발명에 따른 단일클론항체 중 선택되는 어느 하나의 항체를 포획항체로 사용하여 웰의 플레이트에 먼저 부착한 뒤에 표적 항원을 포함하는 생물학적 시료, 예를 들어 JEV 백신을 여기에 첨가한 뒤, 본 발명에 따른 단일클론항체 중 선택되는 다른 항체를 1차 검출 항체로 사용하고 이 검출 항체를 인식하는 표지된 2차 검출 항체를 사용하는 중첩적 샌드위치(double sandwich) ELISA이다.

본 발명의 샌드위치 ELISA 검출 방법에서, JEV의 표적 항원을 인지하는 단일클론항체(포획 항체)에 결합된 항원을 인지하는 항체는 바람직하게는 단일클론항체(검출항체)이며, 이는 JEV 표적 항원을 선별적으로 인지하지만 항원과 복합체를 형성하는데 사용된 포획 단일클론항체와는 다른 에피토프를 인지하는 단일클론항체를 사용한다. 본 발명에 따라 확인된 바에 따르면, 포획항체로서 기탁된 하이브리도마(JEV_1)에서 생산되는 단일클론항체를, 검출항체로서 기탁된 하이브리도마(JEV_2)에서 생산되는 단일클론항체를 사용하였으나, 반대로 JEV_1에서 생산되는 단일클론항체를 검출항체로, JEV_2에서 생산되는 단일클론항체를 포획항체로 사용할 수 있음은 물론이다.

이때, 예를 들어 JEV 백신을 포함하는 생물학적 시료는 1/10 ~ 1/160 범위, 바람직하게는 1/20 ~ 1/160 범위, 더욱 바람직하게는 1/20 ~ 1/80 범위로 희석될 수 있고, 포획 항체는 0.1 ~ 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 1 ~ 10 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있으며, 검출 항체는 10 ~ 500 ng/㎖, 바람직하게는 50 ~ 300 ng/㎖, 더욱 바람직하게는 100 ~ 200 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 JEV의 항원을 검출하기 위한 진단키트에 사용되는 단일클론항체는, 이 항체가 JEV의 표적 항원을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

이때 JEV의 항원을 검출하기 위한 진단키트에는 JEV의 표적 항원을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

표지에 사용되는 효소는 일반적으로 서양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 주로 사용되고 있는데, 이는 많은 기질과 반응할 수 있고, 과옥소산법에 의해 용이하게 항체에 결합시킬 수 있기 때문이다. 표지된 효소를 확인하기 위해 서양고추냉이퍼옥시다아제는 기질용액으로서 과산화수소(H₂O₂)를 사용하고, 발색제로서 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린설폰산] 암모늄염(ABTS), 5-아미노살리실산, 오르토페닐렌디아민, 4-아미노안 티피린, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 등을 사용하고, 알카리포스파타아제의 경우에는 기질로서 오르토니트로페닐포스페이트, 파라니트로페닐인산 등을 사용하고, β-D-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는 기질로서 플루오레세인-디-(β-D-갈락토피라노시드), 4-메틸운베리페닐-β-D-갈락토피라노시드 등을 사용하는 것이 알려져 있다.

이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 설명하지만 본 발명이 이들 실시예에 국한되는 것은 결코 아니다.

실시예 1 : 일본뇌염바이러스(JEV) 발현 구조체 제작 및 정제

본 실시예에서는 일본뇌염바이러스의 외피 단백질(Envelope protein)을 벡터를 이용하여 클로닝(cloning)한 뒤 증폭된 단백질을 확인, 정제하였다. 표적 유전자로서는 JEV Nakayama 주의 외피 단백질을 암호화하는 핵산 서열(서열번호 1)을 사용하였으며, 클로닝에 사용된 재조합 바이러스 벡터는 바큘로바이러스의 게놈을 변형시킨 pAcGP67-A transfer vector (BD bioscience)를 이용하였다. 이 벡터는 다-클로닝 부위(multicloning site) 앞부분에 gp67 secretion signal sequence가 존재하여, 발현하였을 때 cell 외부로 더 잘 secretion될 수 있도록 하는 특징을 가지고 있다. 그리고 위의 vector에서 Not I enzyme이 인식하는 site 뒤쪽에 trombin site와 Fc (IGHM immunoglobulin heavy constant, Homo sapiens)를 붙여주었다. 면역력 증가와 발현 후 확인하기 위하여 Fc tagging을 해주었고, 발현 후에 원하는 단백질만 정제하기 위해서 thrombin site를 넣어주었다. 그리고 MCS 부분에서의 BamH I enzyme과 Not Ⅰ enzyme을 이용하여 insert (JEV)와 cloning 하였다. 사용된 재조합 바이러스 벡터에 서열번호 1의 외피 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입시켜 이미 알려진 방법에 따라 클로닝하였다. 외피 단백질이 정확하게 클로닝되었는지를 알아보기 위해서, 얻어진 클론을 대상으로 표적 유전자가 삽입되었는지를 확인하였다.

인서트(insert)인 JEV 유전자를 Web cutter 2.0 프로그램을 이용하여 사용된 벡터의 서열과 비교하여 제한 효소를 선택하였다. JEV의 forward primer로는 BamHⅠ 인식 부위(GGATCC)를 가지는 올리고머(GGCGGATCCCTTCAACTGTCTGGGAATGGGG; 서열번호 4)를, reverse primer로는 NotⅠ 인식 부위(GCGGCCGC)를 가지는 올리고머(GAGGCGGCCGCAAGCATGCACATTGGTCGCTAAGAACACG; 서열번호 5)를 합성하여 제작하였다. PCR을 위해서 template 1 ㎕, dNTP 1 ㎕, forward primer와 reverse primer 각각 1 ㎕, 10X Pfu buffer 5 ㎕, Pfu polymerase 1 ㎕, D.W. 40 ㎕의 PCR 용액을 사용하였고, PCR은 95℃에서 2분 먼저 수행한 후, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 4분 순서로 30 cycle를 반복하였다. 그 이후 72℃에서 5분간 enzyme inactivation을 하였다.

제한 효소에 의한 절단과 관련해서, insert(5 ㎍) 42 ㎕, BamH Ⅰ 1 ㎕, Not Ⅰ 1 ㎕, Buffer-3 5 ㎕, BSA 1 ㎕로 구성된 1번 튜브 용액과, vector(5 ㎍) 21 ㎕, BamH Ⅰ 1 ㎕, Not Ⅰ 1 ㎕, Buffer-3 5 ㎕, BSA 20 ㎕, D.W. 20 ㎕로 구성된 2번 튜브 용액을 각각 37℃에서 3시간 동안 incubation하고, HiYield Gel/PCR DNA extraction kit(RBC 제품)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 gel purification을 수행하였다. ligation을 위해서 RBC rapid ligatin kit(RBC 제품)을 사용하여, Insert인 JEV 용액(A buffer 2 ㎕, B buffer 2 ㎕, insert 6 ㎕, vector 1 ㎕, ligase 1 ㎕, D.W. 8 ㎕)과 벡터 용액(A buffer 2 ㎕, B buffer 2 ㎕, vector 1㎕, ligase 1 ㎕, D.W. 14 ㎕)을 22℃에서 overnight 반응시켰으며, insert가 삽입되지 않은 vector control 역시 transformation 시에 실험 과정 확인을 위해 함께 진행하였다.

Transformation을 위해서 DH5α competent cell 30 ㎕, ligation DNA 5 ㎕를 혼합한 뒤, 15분 동안 ice에서 incubation하고, 42℃에서 45초 동안 heat shock을 가하고 다시 15분 동안 ice에서 incubation하였다. Ampicilin/LB agar 배지에 도말한 후, 37℃에서 overnight incubation하였다. colony 확인을 위해서, 자란 colony를 Ampicilin/LB broth 4 ㎖에 접종하여 37℃에서 incubation하였다. miniprep을 이용하여 colony의 DNA를 얻고, BamH I 과 Not I enzyme을 이용하여 DNA를 cutting하였다. 원하는 크기의 JEV (1.5kb), vector (10.5 kb)를 확인하였다.

도 1은 본 실시예에 따라 바큘로바이러스 유래의 벡터를 사용하여 JEV 외피 단백질의 클로닝 여부를 확인한 결과를 도시한 사진이다. 도 1에서 M은 마커이고, 레인 1은 pAcGP67-A 벡터, 레인 2는 삽입된 DNA를 대상으로 한 것이며, 레인 3 ~ 7은 효소로 절단한 뒤 표적 유전자의 삽입 여부를 확인한 것이다. 레인 7에서 1,500 bp 크기의 DNA insert가 관찰되어 JEV 외피 단백질의 클로닝을 확인하였다.

이어서, 클로닝이 확인된 벡터를 이용하여 곤충 세포주(SF-9 cell)를 이용하여 바큘로바이러스를 증식시키고, 동물 세포주를 이용하여 재조합된 JEV 외피 단백질을 발현 및 정제하였다. 구체적으로, JEV의 외피 단백질을 발현하는 DNA와 바큘로바이러스 DNA의 co-transfection을 이용하여 곤충 세포주인 SF-9 cell에서 일본뇌염 외피 항원을 발현하는 바큘로바이러스를 제작하여 곤충 세포주에서 증식시키고, JEV의 외피 항원 단백질이 Fc tagging되어 있는 점을 이용하여 column에 정제한 후, 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 도 2에 그 결과가 도시되어 있다. 도 2에서 레인 1은 재조합 바큘로바이러스로 감염된 상층액(supernatant)을, 레인 2는 재조합 2는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 상층액을 column에 정제한 것이고, 레인 3은 재조합 바큘로바이러스에 감염한 cell을 column에 정제한 것을 대상으로 웨스턴 블롯팅을 수행한 것이다. 도시된 것처럼 JEV-외피 항원 단백질이 30 KDa의 Fc tagging되어 총 83 KDa의 단백질이 cell lysate의 정제 샘플에서 검출된 것을 확인하였다. 보통 재조합 바큘로바이러스는 상층액에서 검출되는데, 본 실험에서 cell lysate에서 검출된 것은 증식 시간이 짧아(48시간 이내), 재조합 바큘로바이러스가 cell 내에서 증식이 이루어졌으나 방출이 되지 않았기 때문인 것으로 추측된다.

실시예 2 : 일본뇌염바이러스에 대한 마우스 면역 및 반응성 확인

본 실시예에서는 실시예 1에서 확인된 JEV의 외피 단백질을 마우스에 면역시킨 뒤, 그 반응성을 확인하였다. 이를 위하여 실시예 1에서 확인된 재조합 JEV 항원 단백질을 정제하여 마우스에 면역시켰다. 우선, 일본뇌염바이러스(JEV)를 정제하기 위해서, JEV를 비중에 따라 분리하였다. 이를 위해서 CsCl을 이용하여 초-원심분리하여 정제 한 후 1차원 전기영동과 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인하였다. 도 3에서 그 결과가 도시되어 있는데, 레인 1은 JEV의 1차원 전기영동(SDS-PAGE), 레인 2는 JEV의 웨스턴 블롯팅으로서, JEV에서 항원성이 높을 것으로 예상된 50 KDa의 메이저 캡시드(major capsid)를 확인하였다.

계속해서, 도 4a에 도시되어 있는 면역 스케줄에 따라 JEV를 동물 세포에 면역시켰다. 5주령의 BalB/c 웅성 마우스 3마리에 1마리당 100 ㎍의 정제된 JEV 항원을 1주 단위로 3회 면역시킨 후, 마우스 혈청을 채혈하여 ELISA와 웨스턴 블롯팅을 이용하여 마우스 혈청의 항원 단백질과의 반응성을 검토하여, JEV의 다클론항체(polyclonal antibody) 형성 여부를 확인하였다. 사용된 재료는 JEV 감염 세포, Nakayama strain 감염 세포, KV1899 strain 감염 세포 및 Mock 감염 세포였으며, 도 4a의 절차에 따라 면역된 마우스의 혈청에 대한 면역학적 분석을 위해서, 인산완충 희석용매인 PBST(phosphated buffered saline with Tween-20)를 사용하여 상온에서 1시간 동안 1/20부터 2진 희석하여 사용하였다. 2차 항체로는 PBST에 용해되어 있는 1gG FITC(luorescein isothiocyanate) 10 ㎍/㎖를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 도 4b에서는 이러한 절차에 따른 ELISA 분석 결과가 도시되어 있으며, 표 1에서는 그 IFA에 따른 titer를 나타낸 것이다. 도 4b에 도시된 결과를 참조하면, ELISA 전체의 흡광도(O.D) 값을 볼 때, 음성 대조군(negative control)인 PBS coat-JEV 혈청군과 비교하여, 면역 후 BalB/c 마우스의 혈청 내에 JEV에 대한 다클론항체가 생성된 것을 확인할 수 있다.

JEV 면역 마우스 혈청에 대한 IFA 결과

Mouse	End Point Titer
Mouse	JEV Nakayama	KV1899	Mock
1	160	160	< 20
2	80	80	< 20
3	80(Weak)	80(Weak)	< 20
Control	< 20	< 20	< 20

한편, 면역 마우스에 대한 웨스턴 블롯팅을 위해서 SDS-PAGE(12%)를 사용하였으며, 항원으로서 각각 53 KDa의 단백질을 발현하는 JEV whole cell(2 ㎎/㎖)을 200 ㎍/㎖의 로딩 농도로, JEV HI Ag (0.98 ㎎/㎖)을 98 ㎍/㎖의 로딩 농도로 사용하였다. 1차 항체로 마우스의 혈청 2두를 사용하여 1/500로 희석한 뒤 실온에서 1시간 반응시켰으며, 2차 항체로 PBST로 1/4000로 희석된 Anti-mouse IgG HRP(horseradish peroxidase) 200 ng/㎖로 실온에서 1시간 반응시키고, DAB(Diaminobenzidine)를 이용하여 발색시켰다. 웨스턴 블롯팅 결과가 도 5에 도시되어 있다. 레인 1-4는 JEV whole cell을 사용한 것이고, 레인 5-6은 JEV HI 항원을 사용한 것이며, 레인 1, 2, 5, 6은 1번 마우스의 혈청을, 레인 3, 4, 7, 8은 2번 마우스의 혈청을 사용한 것이다. 도시된 것처럼, 마우스의 혈청에서 JEV 53 KDa의 외피 단백질과의 반응성을 확인하여 JEV 외피 단백질에 의해 면역되었음을 알 수 있다.

실시예 3 : 단일클론항체 제작 및 하이브리도마 세포 선별

(1) 하이브리도마 세포 제작

본 실시예에서는 실시예 2에서 면역된 마우스에서 추출한 비장 세포와 마우스 유래의 골수종 세포인 SP2 세포와 세포 융합하여 단일클론항체를 분비하는 융합세포인 하이브리도마를 얻었다. 실시예 2의 절차에 따라 JEV 외피 단백질로 마우스를 면역시켰다. 항원으로는 JEV 백신 접종 항원을 사용하였으며 마우스 1 마리당 100 ㎍의 농도로 접종하였다. 면역동물은 Balb/C 마우스 3마리였으며, 도 4a에 도시된 절차에 따랐다. 퓨전 전에 마우스 혈청을 채취하여 ELISA 방법으로 면역 검사를 수행하였고, 최종 boosting 후 4일 후 PEG 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합하였다. 면역시킨 마우스의 비장을 추출하고, 골수종 세포인 SP2/0 Ag 14 세포(ATCC, USA)와 세포 융합하여 잡종 세포인 하이브리도마를 만들어 단일클론항체를 제작하였다. 마우스의 비장 세포와 SP2/0 세포를 융합하고, D-MEM/HAT 배지에서 배양하였다. 각각의 supernatant에서 항체 여부를 test하여 각각의 positive culture를 clone한 뒤, 다시 각각의 supernatant에서 항체 여부를 test하였다. 이어서, 양성 클론을 성숙, 번식시켰다. 구체적으로 정제한 JEV를 면역한 마우스에 마지막 boosting 후 4일 째 마우스를 희생시켜 마우스의 비장 세포를 적출하고, 골수종 세포(myeloma cell line)인 SP2/0-Ag14 (ATCC, USA)와 PEG method 법을 이용하여 세포 융합하였다. 이때, D-MEM/HAT & HT 배지를 이용하였다.

(2) 단일클론항체 중에서 클론 선별

위에서 제작된 하이브리도마 세포 중에서 항체 생성 능력이 우수할 것으로 예상된 클론을 IFA, 웨스턴 블롯팅 및 isotyping을 통해 선별(screening)하고 클로닝하였다. IFA와 관련해서는 클론의 supernatant를 취하였으며, 목적항원으로는 JEV Nakayama 감염 Vero cell을, 양성항원으로 JEV KV1899 감염 Vero cell을, 음성 대조항원으로 Mock 감염 Vero cell을 사용하였으며, 기본적으로 목적 및 양성 항원에 반응하면서 음성 대조항원에 반응하지 않는 클론에 주목하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해서 supernatant를 이용하였고, 목적항원으로 JEV Nakayama Virus/JEV E 단백질을 사용하였다. isotyping과 관련해서는 Zymed Mouse ID Isotypig reagent를 이용하여 가능한 IgG class를 선별하였다.

최초 선별을 위한 IFA 분석을 위해, 바이러스 감염된 vero cell로서 JEV Nakayama strain과 Mock 감염 세포를 사용하였으며, 클론의 상층액을 원액으로 사용하였고, 2차 항체로 PBST로 희석한 Anti-mouse IgG FITC를 사용하였다. 도 6a 내지 도 6d에서 1차 IFA 실험 결과가 도시되어 있다. 96-well을 사용한 4개의 plate에서 JEV Nakayama에 반응한 양성 클론은 262개, 음성 대조군인 mock 감염 양성 클론은 135개였으며, 그 중에서 음성 대조군에 반응하지 않고 JEV에 반응하는 양성 클론 127개 중에서 각 플레이트에서 5개씩 총 20종의 클론을 선별하였다. 이어서, JEV1899에 대한 IFA와 웨스턴 블롯팅을 통해서 한계 희석(limit dilution)할 클론을 1차로 선별하였다. 먼저 선별된 20개 클론에 대한 western blotting을 수행하였다. JEV whole cell에 대한 각 클론의 항원성 여부를 파악하였다. 200 ㎍의 JEV whole cell을 12% SDS-PAGE 하여, 각 클론의 supernatant와 Anti-mouse IgG HRP를 각각 1, 2차 항체로 사용 후, DAB 발색으로 결과를 살펴보았다. 53 kDa 위치에서 강한 항원성을 나타내는 클론을 주목하였다. 1차 선별된 20개 클론에 대한 웨스턴 블롯팅 수행 결과와 각 항원에 대한 반응도 분석 결과가 도 7에 도시되어 있다.

이어서, JEV에 대한 높은 중화항체가를 나타내는 단일클론항체를 선별하여 다량 발현시켰다. 이를 위하여 제작한 일본뇌염바이러스에 대하여 1차로 선별된 단일클론항체 중에서 E 단백질에 반응하는 항체를 선별하기 위해서 다양한 세포에 대한 IFA 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 양성 주(positive strain)로서, JEV의 JEV의 Nakayama strain과 KV1899 strain을 사용하여 JEV 단일클론 항체의 선별에 사용하였다.

IFA 분석 절차는 다음과 같다. JEV Nakayama infected Vero cell을 목적항원으로 음성 대조 항원 Mock infected Vero cell 에 대한 IFA를 수행하여, 목적항원에 반응하면서 음성 대조 항원에 반응하지 않는 클론을 선발하기 위해, JEV의 Nakayama와 KV1899 Strain을 Vero 세포에 감염시켰다. 반면, 대조군은 아무것도 감염시키지 않았다. 96-well plate에 심어진 Vero 세포에 각 JEV를 감염시키고, 마우스 혈청을 1/20부터 PBST 용액(0.05% tween-20 in PBS)을 사용하여 2진 희석하고, JEV 감염 세포에 실온에서 1시간 반응시킨 후, PEST 용액으로 반응되지 않은 항체를 3번 5분씩 세척하였다. Anti-mouse IgG FITC를 2차 항체로 사용하여 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 실온에서 1시간 반응시킨 후, 현미경으로 검경하였다.

한편, 본 실시예에서의 웨스턴 블롯팅은 다음과 같은 절차에 따라 진행하였다. JEV Nakayama strain과 JEV E 단백질을 sample buffer(40% Glycerol, 240 mM Tris/HCl pH 6.8, 8% SDS, 0.04% bromophenol blue, 5% beta-mercaptoethanol)에 넣고 100℃에서 5분 끓인 후, 12% gel에서 1차원 전기영동(SDS-PAGE, polyacrylamide gel eletrophoresis)하였다. 전기영동이 끝난 gel을 NitroCelluose(NC) membrane에 transfer하고, JEV를 면역한 마우스 혈청을 1/500로 희석하여(1차 항체) 실온에서 1시간 반응시킨 후, PBST 용액(0.05% tween-20 in PBS)로 3번 5분씩 세척하였다. anti-mouse IgG HRP 항체를 1/4,000으로 희석하여 1시간 반응시킨 후, 0.05% tween-20 in PBS로 3번 5분씩 씻어냈다. GE Healthcare에서 판매되는 ECL western blot detection kit를 사용하여 암실 내에서 X-ray 필름에 현상시키거나, DAB (3,3'-Diaminobenzidine) 발색시켰다.

한편, isotyping 절차는 다음과 같다. IsoStripTM mouse monoclonal antibody isotyping kit를 사용하였으며, 산타크루즈 사의 키트화 되어 있는 실험으로 (제품번호 sc-24958) 다음의 과정을 거쳐 typing하였다. 마우스 단일클론항체를 식염수(PBS)에 1:10에서 1:100까지 다양하게 희석하고, 최종 농도는 0.1 ~ 1 ㎍/㎖로 조정하였다. 150 ㎕의 샘플을 잘 섞은 뒤에, Isotyping strip에 담가두었다. 5 ~ 10분 후에 여러 class line 중 단일클론항체의 type 라인이 발색되는 것을 확인하였다. 다량으로 생산된 20개의 클론 세포주 중에서 IFA, 웨스턴 블롯팅 및 isotyping을 통해 최종적으로 18개의 서브클론을 선별하였으며, 18개의 선별된 서브클론에 대한 면역학적 분석 결과는 표 2에 요약되어 있다.

표 2의 결과를 토대로, IFA, 웨스턴 블롯팅에서의 반응 강도, isotyping 결과를 참조하여, JEV의 E 항원 단백질에 대하여 특이적으로 결합하며 음성 대조군에 대해서는 항체를 분비하지 않는 하이브리도마 세포주 클론을 선별하였다. 여러 번 반복 실험을 통하여 JEV 목적 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별한 후 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 이들 클론을 클로닝하여 동결하였고 서브클래스 타입(subclass type)을 확인한 결과, 2차 선별된 모든 클론이 모두 IgG 패밀리였으며 중화 항체가 역시 양호하다는 점을 확인하였다.

선별된 단일클론항체 후보군에 대한 스크리닝 결과

Clone No.	screen results			Isotype	2차선별
Clone No.	IFA Nakayama	IFA-KV1889	웨스턴 블롯팅		2차선별
J1	+++	++	-	IgG1, kappa	●
J2	++	++	-	IgG1, kappa
J3	+++	+++	+++	IgG1, kappa	●
J4	+++	+++	++	IgG1, kappa	●
J5	+++	++	+	IgG1, kappa	●
J6	+++	++	+	IgG1, kappa	●
J7	+++	++	+	IgG1, kappa
J8	++	++	++	IgG1, kappa	●
J9	+++	++	++	IgG1, kappa	●
J10	+++	++	+++	IgG1, kappa	●
J11	+++	++	+++	IgG1, kappa	●
J12	++	++	+	IgG1, kappa	●
J13	++	++	+	IgG1, kappa	●
J14	++	++	-	IgG1, kappa	●
J15	++	++	-	IgG1, kappa
J16	++	++	-	IgG1, kappa
J17	++	+	++	IgG1, kappa	●
J18	++	+	++	IgG1, kappa	●

표 2에서 PP 또는 +++는 Strong Positive, ++는 Positive, +는 Weak Positive, -는 Negative를 의미한다.

실시예 4 : 생물학적 시료에 대한 면역학적 분석을 통한 최종 단일클론항체 선별

본 실시예에서는 전술한 실시예를 통해서 JEV 중화 능력이 확인된 2차 선별된 단일클론항체를 사용하여 JEV의 항원의 양을 측정하기 위한 최적의 단일클론항체를 선별하기 위해서 더블-샌드위치 ELISA(double-sandwich ELISA, DS ELISA)를 수행하였다. 2차 선별된 단일클론항체들의 역가를 높여주기 위해 각각의 단일클론항체들에 대한 ascetic fluid를 제작하여 항체의 역가를 올린 후 단일클론항체를 정제하였음. 정제된 단일클론항체들을 상호 pair로 JEV 항원을 중심으로 반응 시켜 가장 좋은 반응 조건을 보이는 단일클론 항체 pair를 찾기 위해서(즉 서로 epitope이 다른 항체 pair set 찾기 위해) 정제된 각 단일클론항체 set pair를 이용하여 DS ELISA를 수행하였다. 이 때 반응의 background를 감소시키기 위해 정제된 각 단일클론항체들의 Fc 영역에 peroxidase labeling을 실시하였다.

먼저 Acetic fluid를 제작하기 위해서, 마우스 내 ascetic fluid 생성을 위해 실시예 3에서 제작, 보관하였던 2차 선별된 하이브리도마를 사용하였다. 10⁵~ 10⁷ 개의 세포를 10~14일 키운 후 단일클론항체의 생성을 확인하였다. 이어서 다른 감염성 물질의 오염을 차단한 후 마우스에 주입하였다. 이때 마우스가 받을 고통이나 스트레스는 최소화하기로 하며, 최소한의 동물을 사용하며, 지속적으로 세심히 관찰하기로 하였다. 마우스의 ascetic fluid 생성의 조짐이 보이면 (복부 팽만, 창백한 눈, 귀, 호흡 곤란, 운동 어려움 등) 18 ~ 22 규격 등의 가장 작은 바늘을 사용하여 주의하여 ascetic fluid를 채취하였다. 2차 선별된 클론 외에도 상업적인 제품화 항체인 30.16 clone과 77.22 clone 역시 사용하였다.

계속해서 Acetic fluid 안의 단일클론항체를 정제하기 위해서, 마우스에서 얻은 ascetic fluid 내에 생성된 단일클론항체의 정제를 위해 column binding 법을 이용하였다. 먼저 ascetic fluid를 원심분리한 후, HiTrap protein G(GE healthcare,17-0407-01) column 내에 중력을 이용해 flow-down 시켜 binding시켰다. 이때 적정한 속도는 1㎖/min이다. Binding한 column에 elution buffer를 이용하여 녹여내고, 이 정제 항체를 24 시간 dialysis하여 농축시킨 후, BCA assay 또는 SDS-PAGE 등을 이용하여 항체의 유무를 확인하였다.

마지막으로 정제된 IgG 계열의 단일클론항체에 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 표지(labeling)를 위해 충분히 정제된 IgG 정제된 IgG fraction에 HRP labelling을 위해 충분히 농축한 단일클론항체를 peroxidase와 반응시켰다. Conjugate의 역가를 확인하기 위해, western blot 또는 표준혈청을 이용하여 ELISA로 검사하였다. 하기 표 3에서는 본 실시예에 따라 더블 샌드위치 ELISA를 위해 정제한 acetic fluid의 농도와 부피를 정리하였다.

정제한 ascetic fluid의 농도와 부피

clone No.	전체 부피 (㎖)	FA Titer	정제		HRP conjugation
clone No.	전체 부피 (㎖)	FA Titer	농도 (㎎/㎖)	부피 (㎖)	농도 (㎎/㎖)	부피 (㎖)
J10	5	12,800	11.0	0.38	1.57	0.9
11	5	3,200	6.2	1.05	1.58	0.5
J14	5	25,600	6.9	0.50	1.32	1.1
J17	4	12,800	7.3	0.62	0.88	1.2
J9	3.5	25,600	7.9	0.49	1.67	1.0
J3	5	6,400	5.6	0.48	1.30	0.9
J5	5	25,600	8.1	0.59	1.17	1.2
30.16^*	antibodies		1.0
77.22^*	antibodies		1.0

^* : 상업적 항체

본 실시예에 따른 DS ELISA와 관련해서는 다음과 같은 절차 및 조건을 따랐다. ELISA plate는 Greiner (Germany) High Binding; 단일클론항체의 코팅을 위해서 0.05M Carbonate-Bicarbonate buffer, 4℃ Overnight reaction 시켰으며, Blocking을 위해서 1% BSA / PBS-T, 실온에서 1시간 반응시켰다. 한편, 항원과의 반응을 위해서 JEV standard(1vial/2 ㎖ ddH₂O)와 Vero cell lysate를 PBST (0.1% Tween20)에 희석 후 37℃에서 1시간 반응시켰고, 세척 용액으로는 PBST (0.1% Tween20)을 사용하였으며, HRP-conjugation을 위해서 PBST (0.1% Tween-20)에 희석 후 37℃에서 1시간 반응시켰고, 흡광도는 TMB를 15분 동안 발색한 후 450 ㎚에서 측정하였다. 검출 가능한 최소 항원의 양을 확립하기 위해서 항원의 희석을 통해 최소 검출량을 확인하였다. 2차 선별된 각각의 단일클론항체를 포획 항체로 사용하고 여러 단계로 희석하여 ELISA 플레이트에 고정화하고 Cheker board titeration을 이용하여 이들 항체의 농도를 최적화하였다. 마찬가지로 2차 선별된 각각의 단일클론항체를 검출 항체로 사용하기 위해 정제하여 HRPO 또는 APase를 표식하고 동일한 방법으로 최적화하였다. DS ELISA에서 각 마커별로 선발된 항체를 각각 Pair로 테스트하여 최적한 고정화 항체와 검출용 항체를 선별하였다. 하기 표 4에서는 본 실시예에 따라 2차 선별된 단일클론항체를 사용한 더블-샌드위치 ELISA에 있어서, 포획항체 및 검출항체로 사용하였을 경우를 분석한 것이다. 표 4에서 알 수 있는 것처럼 검출 항체로 5번 클론의 하이브리도마에서 생산된 단일클론항체를 사용하고, 포획 항체로 17번 클론의 하이브리도마에서 생산된 단일클론항체를 사용하면 JEV 목적 항원의 검출에 있어서 가장 효율적이라는 것을 확인하였다. 이에, 1차 선별된 20개의 클론 중에서, 검출항체로 유용한 단일클론항체를 생산하는 5번 클론의 하이브리도마 세포(JEV_1)와, 포획 항체로 유용한 단일클론항체를 생산하는 17번 클론의 하이브리도마 세포(JEV_2)에 대하여, 각각 2011년 2월 15일자로 국제기탁기관인 서울시 종로구 연건동 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00258, KCLRF-BP-00259로 기탁하였다.

DS pairing 분석 결과

검출 항체 (100 ng/㎖)	포획 항체(2 ng/㎖; clone No.)
검출 항체 (100 ng/㎖)	J10	J11	J14	J17	J9	J3	J5	30.16^*	77.22^*
J10	1.7	1.3	1.1	1.0	0.9	1.0	0.9	0.8	0.8
K11	1.5	1.2	1.1	1.4	1.1	1.0	0.8	0.8	1.3
J14	1.3	1.3	1.0	1.2	1.4	1.6	1.5	1.7	0.6
J17	1.4	0.9	1.3	1.2	1.1	1.2	1.2	1.4	1.2
J9	1.6	1.5	2.3	1.5	1.0	2.3	2.0	1.6	1.2
J3	2.5	3.2	3.6	4.4	3.9	1.3	4.1	3.7	1.7
J5	4.6	4.6	5.7^*	9.8^*	3.8	6.1^*	5.6^*	7.7^*	1.6

^* : 상업적 항체

실시예 5 : 최적 항체량 확립 및 유효한 정량범위 설정

실시예 5에서 최종적으로 선별된 2종의 단일클론항체를 이용하여 JEV 표적 항원을 검출하기 위한 최적의 조건을 살펴보았다.

(1) JEV 항원 검출이 가능한 최적 항체량 확립

최소 항원량을 검출할 수 있는 항체의 희석을 통해 최적 항체 농도 확인하였다. 실시예 5에서 확인된 최적화 상태로 조건이 확립된 DS ELISA를 이용하여 정제된 JEV envelope 단백질을 이용하여 농도를 달리하여 희석한 후 항원 검출 한계를 확인하였다. 도 9는 본 실시예에 따른 포획 항체 및 검출 항체의 농도 변화에 다른 회귀분석(Regression analysis)를 표시한 그래프이고, 하기 표 5에서는 본 실시예에 따라 최종적으로 선별된 2개의 단일클론항체의 농도 변화에 따른 O.D 값의 변화를 측정한 결과를 도시하고 있다. 도 9의 (A) 부분은 포획 항체가 4 ㎍/㎖인 경우이고 (B)는 2 ㎍/㎖인 경우이며, 그래프에서 연두색 부분, 붉은색 부분 및 푸른색 부분은 각각 검출 항체가 50 ng/㎖, 100 ng/㎖ 및 200 ng/㎖으로 사용한 것이다.

항원 희석 titer에 따른 양성(P) 및 음성(N) 값

		포획 항체(JEV_2)
		4 ㎍/㎖			2 ㎍/㎖
검출 항체 (JEV_1, ng/㎖)		200	100	50	200	100	50
JEV	1/5	37.8^*	34.6^*	18.8^*	34.9^*	33.3^*	10.9^*
	1/10	35.8^*	22.6^*	12.0^*	29.0^*	20.7^*	6.4^*
	1/20	23.9^*	14.3^*	6.5^*	19.9^*	12.8^*	3.7^*
	1/40	14.2^*	8.0^*	3.8^*	11.7^*	7.2^*	2.1
	1/80	7.1^*	4.2^*	2.2	6.3^*	3.9^*	1.4
	1/160	4.5^*	2.5	1.5	3.6^*	2.2	1.0
	1/320	2.9	1.9	1.2	2.3	1.6	0.8
	1/640	1.9	1.5	0.9	1.6	1.2	0.6

^* : 직선성을 보인 부분임

회귀분석 결과, 검출 항체가 200 ng/㎖일 때, 포획 항체가 4.0 ㎍/㎖에서는 0.9686, 포획 항체가 2.0 ㎍/㎖에서는 0.9928; 검출 항체가 100 ng/㎖일 때, 포획 항체가 4.0 ㎍/㎖에서는 0.9578, 포획 항체가 2.0 ㎍/㎖에서는 0.9418; 검출 항체가 50 ng/㎖일 때, 포획 항체가 4.0 ㎍/㎖에서는 0.9315, 포획 항체가 2.0 ㎍/㎖에서는 0.9073이었다.

포획 항체(JEV_2에서 분비)와 검출 항체(JEV_1에서 분비)의 농도에 따른 회귀분석과 각 항원 희석 농도에 따른 Positive/Negative 값의 변화를 비교하였을 때, 최종적으로 선별된 2개의 단일클론항체 중에서 JEV_1에서 분비되는 단일클론항체를 검출 항체로 사용하는 경우 100 ng/㎖, JEV_2에서 분비되는 단일클론항체를 포획 항체로 사용하는 경우 2 ㎍/㎖ 및 4 ㎍/㎖ 모두 JEV standard의 1/80배 희석까지 직선성을 나타냈으며, 이는 이 정도의 희석 농도에서 최적 항원/항체 값이 신뢰 구간에 들어갔음을 의미한다.

(2) DS 정량 반응성 검사를 통한 유효한 정량범위 설정

검출 항체가 100 ng/㎖일 때, 포획 항체 4.0 ㎍/㎖ 및 2.0 ㎍/㎖에서의 정량 반응성을 비교하였다. 하기 표 6에 결과가 표시되어 있다.

표 6에서 알 수 있듯이, 포획 항체를 2 ㎍/㎖로 coating하고, 검출 항체 100 ng/㎖를 반응시킬 때, JEV standard의 1/20 ~ 1/80 (정량적으로 2 ㎍)까지 유효한 정량 범위를 나타냈다. 결국, 본 실시예를 통해 Double 샌드위치 ELISA를 세팅하기 위한 포획 항체의 최적 농도는 2 ~ 4 ㎍/㎖이고, 검출 항체의 최적 농도는 100 ~ 200 ng/㎖ 정도인 것으로 확인되었다. 최적화된 상태에서 DS ELISA 결과는 각각의 희석 농도에 대해 직진성을 나타냈으며, JEV의 정량범위는 JEV 표준 바이러스(식약청, 5 ㎎/㎖)의 1/20 ~ 1/100이므로 약 2 ng의 JEV가 검출 가능할 것으로 추측되었다.

유효한 정량범위 분석

		검출 항체 (100 ng/㎖)
항원	희석	포획 항체 (4 ㎍/㎖)			포획 항체 (2 ㎍/㎖)
항원	희석	JEV	S/P	Unit	JEV	S/P	Unit
JEV	1/5	2.438	11.1	55.7	2.552	12.1	60.5
	1/10	1.590	7.1	71.2	1.582	7.3	73.2
	1/20	1.005	4.3	86.9	0.981	4.4	87.1
	1/40	0.562	2.2	89.9	0.550	2.2	89.3
	1/80(PC)	0.299	1.0	80.0	0.300	1.0	80.0
	1/160	0.175	0.4	66.0	0.171	0.4	58.2
	1/320	0.131	0.2	65.3	0.123	0.1	40.8
	1/640	0.108	0.1	60.8	0.089	0.0	-25.7
VERO(n = 8)	평균+3SD	0.088			0.097
	CPC	0.211			0.203

CPC = 양성 흡광도 (PC O.D., 1/80) - Vero 대조군 흡광도(평균(mean) + 3 표준편차(3SD)

S/P = 샘플 흡광도(JEV O.D.) - VERO 대조군 O.D(Mean+3SD)) / CPC

Unit = S/P × 희석 배수(Dilution factor)

실시예 6 : 생물학적 시료에서의 항원 검정

본 실시예에서는 실시예 5에서 최종적으로 선별된 단일클론항체를 생물학적 시료의 하나인 JEV 백신을 표적으로 하여 샌드위치 ELISA를 수행하여, 단일클론항체가 생물학적 시료와 유효하게 항원-항체 복합체를 형성하는지를 살펴보았다. 실시예 7에서 선별된 단일클론항체 및 최적화된 DS ELISA를 이용하여 현재 시판 중인 2개의 제조사 백신 제품의 제조 배치별 역가를 측정하고, 제조사 및 제조 배치에 따른 백신의 차이를 측정하여, 백신 역가 측정 방법을 검증하였다.

더블 샌드위치 ELISA 시험품을 제작하기 위해서 정제된 포획 항체 2 ㎍/㎖를 ELISA plate(Greiner (Germany) high binding)에 반응시킨 뒤, 0.1M Carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6), 4℃, 15 시간 동안 코팅하였다. 블록킹을 위해서 1% BSA (Fraction V, Moagate) with PBS/Tween-20을 사용하여 상온(24-26 ℃)에서 1시간 반응시켰다. 5초 동안 Air Blowing을 하고 37℃ 오븐에서 40분 동안 건조시켰다. HRP에 conjugation된 검출 항체 100 ng/㎖를 사용하고, HRP 안정화제를 사용하여 희석시켰다. 기질은 TMB(Moss)ddjT으며, 정지 용액으로 0.1 M sulfuric acid를 사용하였다.

위 조건에서 현재 시판 중인 JEV 백신을 이용하여 최적화된 더블 샌드위치 ELISA 시험품의 적정성 여부를 평가하였다. 검사 시료인 JEV 백신으로는 제조사 A의 백신 (제조번호 J202008, J202013 ~ J202021; 9 batch, 각 2 bottle)과 제조사 B의 백신(제조번호 00409007 ~ 00409011, 00410001~ 004100004; 9 batch, 각 2 bottle)을 사용하였고, 표준물질 2로서 JEV standard (1 viral/2㎖ ddH₂O)를, 음성 대조군으로 정상 Vero cell lysate 1/10을 희석하였다. 희석 용액으로는 TBS/Tween20(0.5%) 및 1% BSA의 혼합 용액을 사용하였고, 세척 용액으로 PBS/Tween20(0.5%)을 사용하였다.

구체적으로 JEV 이중 샌드위치 ELISA에 적용될 시험품 각 시약을 실온에 1시간 동안 적응시켰으며, 시료는 희석용액에 1/10 부터 계단 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 37 ℃에서 1시간 반응한 후 세척용액으로 3회 세척하고, HRP conjugated 검출 항체를 HRB stabilizer에 희석하여 100 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 다시 37 ℃에서 1시간 반응한 후 세척용액으로 3회 세척한 뒤, TMB 100 ㎕를 첨가하고 15분 발색 후 반응 정지(50 ㎕)시킨 뒤 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

우선, JEV 표준시료(식약청)와 음성 대조군인 정상 Vero cell을 대상으로 ELISA를 수행한 결과가 각각 도 9a 및 도 9b에 도시되어 있다. 이를 근거로 JEV 표준품의 정량분석을 위해서 전술한 실시예와 동일하게 회귀분석을 행하였다. 본 실시예에서 희석배수 20 ~ 160 배 사이에서 회귀분석은 0.92 수준으로 정량성이 확인되었다.

이어서, 제조사별 백신제품의 역가를 측정하였다. 각 제조사의 이름은 익명성을 보호하기 위해 제조사 A(manufacture A)와 제조사 B(manufacture B)로 표기한다. 양성 대조군으로 JEV 표준시료(식품의약품안전청) 희석 배수 1/80(PC80, 평균 = 0.246, 도 9a 참조), 음성 대조군으로 정상 Vero cell 평균 흡광도(NC 평균 = 0.045, 도 9b 참조)를 사용하였다. 각각의 제조사별 백신을 1/10 ~ 1,280/1 까지 2-fold 계단 희석하여 검사하였고, 검정은 다음의 절차에 따라 구하였다.

PCx : 양성대조 평균 흡광도 0.2 이상 (최소 2-well)

NCx : 음성대조 평균 흡광도 0.1 이하 (최소 2-well)

한편, 역가 계산은 다음의 식을 참조하여 계산하였다.

PCx / NCx : 양성/음성 대조 흡광도 평균값

S/P = (Sample O.D - NCx)/(PCx - NCx)

ELISA unit = S/P × dilution factor (희석배수)

제조사 A의 백신에 대해서는 도 10에, 제조사 B의 백신에 대해서는 도 11에 각각 그 결과를 표시하였다. 아울러, 이들 백신 제품에 대한 측정값에 근거하여 평균값 정도의 분산 정도를 나타내는 표준 편차와, 표준편차를 평균값으로 나누어서 백분율로 나타낸 변이계수(coefficent of variation)를 계산하여 검사물질의 반응재현성, 안전성을 살펴보았다(결과 미도시). 제조사 A와 B의 JEV 백신 배치별 항원 역가와 변이계수 모두 낮은 값의 변이를 나타냈다. 아울러, 이들 백신 제품에 대하여 백신의 역가를 측정하였으며, 그 결과가 도 12에 각각 도시되어 있다. 제조사 A의 제품에 비하여 제조사 B의 제품의 역가가 편차를 더 보이기는 하였으나, 예측된 범위 이내의 오차로서 이들 백신 모두 본 발명에 따른 더블 샌드위치 ELISA에 의해 역가 측정 시 의미를 가지는 것으로 해석된다.

비교 실시예 1 : 국가 표준품 in vivo 검정

위에서 사용한 국가 표준품을 사용하여 생체내에서 중화항체가를 측정하여 본 발명에 따라 만들어진 단일클론항체를 사용하여 ELISA를 수행한 것이 적합한지를 측정하였다. PRNT를 이용하였으며, 검체 및 일본뇌염백신의 역가를 측정하였다. 검체 일본뇌염백신 표준품을 마우스에 면역하여 얻은 항체를 별도의 공격용 바이러스 부유액과 동량을 혼합하여 반응시킨 중화액을 계태아 세포에 접종한 후 플라크 수의 감소율로 중화항체가를 측정하였다. JEV 표준품(5 ㎎/㎖)을 1 : 1(100 ㎍)부터 2 fold로 희석하여 1 : 64(1.56 ㎍)까지 in vivo에서 중화항체가를 조사해본 결과가 도 13 및 표 7에 표시되어 있다.

표준품에 대한 in vivo 중화항체가 측정

	1차		2차		3차		평균
표준품 (ug/ml)	감소율 % Red	중화 항체가	감소율 % Red	중화 항체가	감소율 % Red	중화 항체가	감소율 % Red	중화 항체가
100	87.2	1.779	90.5	1.846	85.4	1.741	87.7	1.789
50	86.3	1.760	92.7	1.893	83.4	1.700	87.5	1.784
25	91.8	1.871	91.6	1.875	86.6	1.767	90.0	1.836
12.5	81.4	1.656	90.2	1.841	83.4	1.700	85.0	1.733
6.25	83.9	1.709	88.5	1.807	84.4	1.721	85.6	1.746
3.125	81.5	1.677	83.2	1.695	83.7	1.705	83.1	1.692
1.56	62.3	1.246	63.1	1.275	63.6	1.266	62.9	1.269

감소율: 50% plaque reduction : (VC Mean - Test Mean)/VC Mean x 100%

중화항체가는 Z = (Y-50)/47.7622 + log X, where Z: NT-Ab titer (log10), Y: plaque reduction rate (%), Y = 10 ?? 90%, X: reciprocal of serum dilution used 의 방법으로 계산하였음. [참고문헌 : Am. J. Biomed. Sci. 2010, 2(2), 184-189, Stability of Freeze-dried Inactivated Japanese Encephalitis Vaccine under Different Experimental Conditions, Dipa Gowal et al.]

도 13과 표 7을 참고하면 100 ㎍/㎖부터 3.125 ㎍/㎖ 까지가 신뢰성 구간에 속한 것으로 확인되었다. 일본뇌염 백신 제품의 ELISA unit은 대략 250 이상 310 이하였으며, 제조사 A와 B의 JEV 백신 모두 JEV 표준품보다 동등하거나 약간 높은 항원을 가지고 있는 것으로 분석되었다.

실시예 7 : 에피토프 확인

서열번호 1의 1500 bp의 염기를 가지는 JEV 단백질이 500개의 아미노산으로 번역된다(서열번호 2). 이를 10개의 아미노산로 overlap하여 15-mer 크기의 peptide를 합성한 후, 합성된 98개의 peptide를 biotinylated 하여 DS ELISA에 사용된 두 개의 단일클론항체와의 반응성을 조사하였다. 단일클론항체 클론(JEV_1, JeV_2)을 적정 농도 이상(150ug/ul)으로 준비하여 일정한 시간을 두어 반응성을 알아보았다. 더블 샌드위치 ELISA에 사용된 2개의 단일클론항체를 peptide library synthesis system을 도입하여 구상한 결과는 도 14에 표시되어 있다. 10개의 아미노산이 중복되는 15-mer 크기의 peptide를 합성하였으며, 총 97개의 peptide가 합성되어 biotinylated시켰다. 이어서, 후보 biotinylated peptide를 ELISA plate에 반응시키고, biotnylated peptide는 0.2 uM의 농도로 streptavidin-coating된 plate에 적용시킨 후 blocking 후 사용하였다. 단일클론항체는 1 ㎍/㎖와 0.5 ㎍/㎖의 농도로 반응시켰으며, peptide 와 반응한 항체는 Horseradish peroxidase conjugated된 rabbit anti-mouse 단일클론항체를 사용하고, chemiluminescent substrate로 확인하였다. 전체 후보 peptide와 항체와의 반응은 다음과 같이 수행하였다. 배경과의 혼돈을 피하기 위하여 대조군을 설정하고 함께 실험하였으며, 양성 대조군으로 mouse IgG1 kappa 항체를 함께 실험하였다. 항체 반응 결과는 luminescence index법으로 측정하며, 각 peptide별 형광 신호는 peptide-specific background를 제외하고 측정함으로써, 전체 후보군 peptide 중 항체와의 반응도가 가장 높은 부분을 선별하는데 근거를 제공할 수 있도록 하였다.

아울러, Linear B cell mapping에 대한 결과를 알아보았다. JEV_1, JEV_2 단클론항체와 JEV E 항원의 분획화 peptide들과의 반응을 위해서, ruminescence index법으로 측정한 각 peptide와 sample의 반응은 2번 반복해서 실험하였으며, 각각의 표준편차를 고려하여 수치화 되었으며 JEV_1에 대해서는 도 15a 및 도 15b에서, JEV_2에 대해서는 도 16a 및 도 16b에 도시되어 있다. JEV_1 단일클론항체와 분획화된 peptide와의 반응을 보아 15-mer 아미노산 길이의 짧은 각 peptide와의 반응성은 보이지 않았다. 따라서 JEV_1 단일클론항체는 표적 단백질이 linear 상태가 아니라 형태학적으로 접힘(folding) 상태인 경우에 그 구조 단백질을 인식하여 한 부분을 에피토프로 인식하는 것으로 추정된다. 한편, JEV_2 단일클론항체와 각 peptide과의 반응 결과로 보아, JEV_2는 98번째 펩타이드와 반응하는데, 이는 JEV_2 단일클론항체는 JEV E 단백질의 C-말단 부근(E 단백질 중 486 ~ 500)에 결합하는 것으로 분석되었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 생각해 낼 수 있을 것이다. 하지만, 그와 같은 변형과 변경은 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은, 첨부하는 청구의 범위를 통해서 분명해질 것이다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00258BP

20110215

한국세포주연구재단

KCLRFBP00259BP

20110215

서열목록 전자파일 첨부

Claims

일본뇌염바이러스(JEV)의 외피 단백질을 에피토프(epitope)로 인식하는 단일클론항체를 사용하여 생물학적 시료의 중화항체가 생산을 생체외(in vitro)에서 검증할 수 있도록 상기 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법으로서,
포획 항체로서 기탁번호 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체를 2.0 ~ 4.0 ㎍/㎖의 농도로 고체 지지체에 코팅하는 단계;
상기 생물학적 시료를 상기 포획 항체와 접촉시키는 단계; 및
검출 항체로서 기탁번호 KCLRF-BP-00258의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체를 50 ~ 200 ng/㎖의 농도로 사용하여 상기 생물학적 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출 항체는 100 ~ 200 ng/㎖의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 일본뇌염백신인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서 상기 생물학적 시료는 1/5 내지 1/160로 희석되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성하는 물질로 표지(labeling)되어 있는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 검출 가능한 신호를 생성하는 물질은 서양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알카리포스파타아제 및 β-D-갈락토시다아제로 구성되는 군에서 선택되는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계는, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00258의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체를 1차 검출 항체로 사용하고, 상기 1차 검출 항체를 인식하는 표지된 2차 검출 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 기탁번호 KCLRF-BP-00259의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론항체는 JEV의 외피 단백질 중 C-말단의 서열번호 3을 에피토프로 인식하는 생물학적 시료의 JEV 항원 마커를 검출하는 방법.