CN103777022B - 一种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法 - Google Patents

一种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其要点是：首先在96孔酶标板上包被乙脑病毒多克隆抗体，包被完成后每孔分别加入乙脑阳性、阴性对照及经过梯度稀释后的待检样品，37℃孵育后清洗酶标板，加入乙脑病毒E蛋白单克隆抗体，37℃孵育后清洗酶标板，加入辣根酶标记结合物，37℃孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止后酶标仪读取OD值，计算P/N值，确定抗原含量。本发明可快速检测乙脑抗原含量，以及鉴别乙脑疫苗的真伪，并为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。

Description

一种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法
技术领域
本发明涉及一种生物制剂的检测方法，特别是涉及一种利用双抗夹心ELISA原理快速检测乙脑病毒抗原含量、鉴别乙脑疫苗真伪的用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，属于生物技术领域。特别适合应用在乙型脑炎疫苗生产企业的质量控制环节。
背景技术
流行性乙型脑炎是由乙脑病毒引起、由蚊虫传播的一种急性传染病。乙脑的病死率和致残率高，是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。我国是乙脑高流行区，在20世纪60年代和70年代初期全国曾发生大流行，70年代以后随着大范围接种乙脑疫苗，乙脑发病率明显下降，近年来维持在较低的发病水平。由此可见乙脑疫苗在预防乙脑流行上起着重要作用。而乙脑病毒抗原作为乙脑疫苗的最主要成分，其含量对疫苗质量起到至关重要的作用。
在现有技术中，国内并没有公开乙脑病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企业的相关报道。根据生产企业实际的生产情况，迫切需要能有一种检测乙脑病毒抗原含量的方法，以便有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并用于快速鉴别疫苗真伪。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的上述不足，公开一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法。本发明应用ELISA双抗体夹心原理，首先在96孔酶标板上包被乙脑病毒多克隆抗体，包被完成后每孔分别加入乙脑阳性、阴性对照及经过梯度稀释后的待检样品，37℃孵育后清洗酶标板，加入乙脑病毒E蛋白单克隆抗体，37℃孵育后清洗酶标板，加入辣根酶标记结合物，37℃孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止后酶标仪读取OD值。计算P/N值，确定抗原含量。本发明可快速检测乙脑抗原含量，以及鉴别乙脑疫苗的真伪。并为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。
本发明给出的技术方案是：这种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步骤：
(1)兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备
1)注射抗原制备(乳化)震荡CFA(完全弗氏佐剂)或IFA(不完全弗氏佐剂)，4℃下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内混合，直至乳状剂形成，挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用，如液滴分散，继续混匀，将配置成的乳状剂转移至2.5ml注射器，准备注射；
2)免疫程序
注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照：
初次免疫
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量1ml/点，共注射5ml(使用CFA)注射病毒蛋白量约0.8mg；
加强免疫(间隔一周)
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.5ml/点，注射共2.5ml(使用IFA)注射病毒蛋白量约0.4mg。
加强免疫(间隔一周)
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.2ml/点，注射共1ml(使用IFA)注射病毒蛋白量约0.2mg，
间隔一周后，心脏采血制备抗血清；
3)分离血清检测抗体
将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4℃下放置过夜使血块缩小；使用无菌枪头剥离血块，将血清转移至另一新离心管中，3000g离心10min，保留上清液，然后对血清中抗体进行检测；
4)抗血清IgG纯化
盐析法粗体—硫酸铵沉淀
4-1在离心管中加入5ml血清和5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀，用枪头吸取10mlSAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50％，用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性，加完后在室温放置4℃过夜，以3000r/min离心10min，白蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白，弃去上清液，留下沉淀部分；
4-2将所得沉淀再溶于5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液中，滴加2.7mlSAS，使溶液的饱和度达35％，加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG，弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀；
4-3将获得的粗IgG沉淀溶解于5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液中；
5)蛋白A亲和纯化
5-1柱平衡：用Bindingbuffer清洗柱，5-10个体积；
5-2上样：使用注射器缓慢挤压1ml样品进入柱内；
5-3清洗：使用Bindingbuffer清洗柱，5-10个柱体积；
5-4洗脱：使用Elutionbuffer洗脱柱，同时收集3个柱体积洗脱组分；
5-5合并洗脱组分，测定IgG的含量为5mg/ml和抗体活性；
(2)ELISA方法的建立(方阵滴定)
将兔抗乙脑病毒多克隆抗体不同稀释浓度(5μg/ml，10μg/ml)包被96孔板，200μl/孔，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜，取出倒空板，加300μl/孔封闭液，用封口膜封严后置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；
样品以2倍法稀释256\512\1024三个稀释度，将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板，加样200μl/孔，空白孔由稀释液代替，用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，加乙脑病毒E蛋白单克隆抗体(稀释度分别10-410-5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，加辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物(稀释度分别10-410-5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min；
取出板，洗板机清洗6次，洗液300μl/孔，加OPD显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min；
显色后H2SO4终止液，50μl/孔，使用酶标仪，并在492nm测定各孔OD值。
(3)具体实验样品检测
将兔抗乙脑病毒多克隆抗体(浓度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜后取出倒空板，加300μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；
样品以2倍法稀释(64、128、256、512)，将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板，加样200μl/孔，由低稀释度往高稀释度加，每次实验设空白对照、阳性对照、阴性对照各两孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，将稀释度为10-4的乙脑病毒E蛋白单克隆抗体加到酶标板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，将稀释度10-5的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物加到酶标板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min；
取出酶标板，洗板机清洗6次，洗液300μl/孔。加入OPD显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min；
显色后加50μl/孔终止液，设定相应的空白，酶标仪492nm测定；
结果判定：
当阴性对照OD值≤0.1，阳性对照OD值≥1.0时，该试验成立；
若阴性对照平均OD值≤0.05，按0.05计算；
若阴性对照平均OD值＞0.05，按实际OD值计算；
当P/N≥2.1时，则判定样品在该稀释度下呈阳性，并确定呈阳性的最大稀释度；
其中：P是样品平均OD值N是阴性对照平均OD值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
在现有技术中，国内并没有公开乙脑病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企业的相关报道。建立此方法可以根据生产企业实际的生产情况，有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并能快速鉴别疫苗真伪，缩短实验时间，几小时内出结果，不使用实验动物，节省实验资金，特别适用于快速鉴别疫苗真伪。
具体实施方式
实施例1
这种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，有以下步骤：
一兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备
1.注射抗原制备(乳化)震荡CFA(完全弗氏佐剂)或IFA(不完全弗氏佐剂)。4℃下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内强力混合。直至乳状剂形成。挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用。如液滴分散，继续混匀。将配置成的乳状剂转移至2.5ml注射器，准备注射。
2免疫程序
注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照
初次免疫
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量1ml/点。共注射5ml(使用CFA)注射病毒蛋白量约0.8mg。
加强免疫(间隔一周)
注射部位为两肩后侧及两髋附近。为皮下、肌肉注射5点。注射剂量0.5ml/点。注射共2.5ml(使用IFA)注射病毒蛋白量约0.4mg。
加强免疫(间隔一周)
注射部位为两肩后侧及两髋附近。为皮下、肌肉注射5点。注射剂量0.2ml/点。注射共1ml(使用IFA)注射病毒蛋白量约0.2mg
间隔一周后，心脏采血制备抗血清。
3.分离血清检测抗体
将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4℃下放置过夜使血块缩小。使用无菌枪头剥离血块。将血清转移至另一新离心管中，3000g离心10min，保留上清液。然后对血清中抗体进行检测。(见表1)
表1：血清中抗体测定结果
酶结合物稀释浓度 血清空白对照(未免疫) 纯化原液免疫血清(1∶40稀释)
1∶10,000 0.723 2.476
1∶50,000 0.155 0.564
1∶100,000 0.144 0.267
相对于空白血清OD值，注射后抗血清OD值后明显增大。
4.抗血清IgG纯化
盐析法粗体—硫酸铵沉淀
4-1.在离心管中加入5ml血清和5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀。用枪头吸取10mlSAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50％。用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。加完后在室温放置4℃过夜，以3000r/min离心10min，白蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白。弃去上清液，留下沉淀部分。
4-2.将所得沉淀再溶于5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液中。滴加2.7mlSAS，使溶液的饱和度达35％。加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min。α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀。
4-3.将获得的粗IgG沉淀溶解于5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液中。
5.蛋白A亲和纯化
5-1.柱平衡：用Bindingbuffer清洗柱，5-10个体积。
5-2.上样：使用注射器缓慢挤压1ml样品进入柱内。
5-3.清洗：使用Bindingbuffer清洗柱，5-10个柱体积。
5-4.洗脱：使用Elutionbuffer洗脱柱，同时收集3个柱体积洗脱组分。
5-5.合并洗脱组分，测定IgG的含量为5mg/ml和抗体活性。(见表2)
表2
相对于杂蛋白，洗脱组分OD值明显增大。证明收集的组分为有特异性的蛋白。
二ELISA方法的建立(方阵滴定)
将兔抗乙脑病毒多克隆抗体不同稀释浓度(5μg/ml，10μg/ml)包被96孔板。200μl/孔，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜。取出倒空板，加300μl/孔封闭液，用封口膜封严后置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存。
样品以2倍法稀释256\512\1024三个稀释度。将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板。加样200μl/孔，空白孔由稀释液代替；用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min。
取出板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔。加乙脑病毒E蛋白单克隆抗体(稀释度分别10-410-5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min。
取出板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔。加辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物(稀释度分别10-410-5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min。
取出板，洗板机清洗6次，洗液300μl/孔。加现配制的OPD显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min。
显色后H2SO4终止液，50μl/孔。使用酶标仪，并在492nm测定各孔OD值。
表3：方阵滴定的结果(选取各个抗体之间适合的稀释度配比)
包被抗体：兔抗乙脑病毒多克隆抗体5微克/ml
单抗：(鼠抗乙脑病毒E蛋白单克隆抗体)稀释度10-4
酶标二抗：山羊抗小鼠抗酶结合物稀释度10-5
样品：稀释倍数可从64倍开始
5具体实验样品检测
将兔抗乙脑病毒多克隆抗体(浓度5mg/ml)配制成包被液。每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜后取出倒空板，加300μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存。
样品以2倍法稀释(64、128、256、512)。将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板。加样200μl/孔，由低稀释度往高稀释度加，每次实验设空白对照、阳性对照、阴性对照各两孔；加样后酶标板用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min。
取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔。将稀释度为10-4的乙脑病毒E蛋白单克隆抗体加到酶标板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min。
取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔。将稀释度10-5的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物加到酶标板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min。
取出酶标板，洗板机清洗6次，洗液300μl/孔。加入现制的OPD显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min。
显色后加50μl/孔终止液。设定相应的空白，酶标仪492nm测定。结果判定：
当阴性对照OD值≤0.1，阳性对照OD值≥1.0时，该试验成立。
若阴性对照平均OD值≤0.05，按0.05计算；
若阴性对照平均OD值＞0.05，按实际OD值计算。
当P/N≥2.1时，则判定样品在该稀释度下呈阳性，并确定呈阳性的最大稀释度。
其中：P是样品平均OD值N是阴性对照平均OD值
以此方法检测某公司乙型脑炎灭活疫苗纯化液批号纯JC1201-1。
实验数据如下：
阳性对照OD值1：1.33321.443平均值1.388
阴性对照OD值1：0.09920.096平均值0.098N取值0.098
样品稀释度 1/128 1/256 1/512 1/1024
样品OD值(P) 0.477 0.326 0.255 0.174
P/N 4.9 3.3 2.6 1.8
阳性判定 是 是 是 否
样品呈阳性最大稀释度：1/512。

Claims (1)

1.一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步骤：
（1）兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备
1）注射抗原制备
震荡CFA完全弗氏佐剂或IFA不完全弗氏佐剂，4℃下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内混合，直至乳状剂形成，挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用，如液滴分散，继续混匀，将配置成的乳状剂转移至2.5mL注射器，准备注射；
2）免疫程序
注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照：
初次免疫
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量1mL/点，共注射5mL，使用CFA，注射病毒蛋白量0.8mg；
加强免疫，间隔一周，
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.5mL/点，注射共2.5mL，使用IFA，注射病毒蛋白量0.4mg；
加强免疫，间隔一周,
注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.2mL
/点，注射共1mL,使用IFA,注射病毒蛋白量0.2mg，
间隔一周后，心脏采血制备抗血清；
3）分离血清检测抗体
将新鲜采集的血液，分装至15mL无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4℃下放置过夜使血块缩小；使用无菌枪头剥离血块，将血清转移至另一新离心管中，3000g离心10min,保留上清液，然后对血清中抗体进行检测；
4）抗血清IgG纯化
盐析法粗体—硫酸铵沉淀
4-1在离心管中加入5mL血清和5ml0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液,混匀，用枪头吸取10mlSAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50%，用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性，加完后在室温放置4℃过夜，以3000r/min离心10min，白蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白，弃去上清液，留下沉淀部分；
4-2将所得沉淀再溶于5mL0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液中，滴加2.7mlSAS，使溶液的饱和度达35%，加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG，弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀；
4-3将获得的粗IgG沉淀溶解于5mL0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液中；
5）蛋白A亲和纯化
5-1柱平衡：用Bindingbuffer清洗柱，5—10个体积；
5-2上样：使用注射器缓慢挤压1mL样品进入柱内；
5-3清洗：使用Bindingbuffer清洗柱，5-10个柱体积；
5-4洗脱：使用Elutionbuffer洗脱柱，同时收集3个柱体积洗脱组分；
5-5合并洗脱组分，测定IgG的含量为5mg/mL和抗体活性；
（2）ELISA方法的建立
将兔抗乙脑病毒多克隆抗体不同稀释浓度,5μg/mL，10μg/mL,包被96孔板，200μL/孔，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜，取出倒空板，加300μL/孔封闭液，用封口膜封严后置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；
样品以2倍法稀释256\512\1024三个稀释度，将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300μL/孔，倒空板，加样200μL/孔，空白孔由稀释液代替，用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出板，洗板机清洗5次，洗液300μL/孔，加乙脑病毒E蛋白单克隆抗体,稀释度分别10-410-5,200μL/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出板，洗板机清洗5次，洗液300μL/孔，加辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物稀释度分别10-410-5,200μL/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min；
取出板，洗板机清洗6次，洗液300μL/孔，加OPD显色液，200μL/孔，室温下避光反应30min；
显色后H2SO4终止液，50μL/孔，使用酶标仪，并在492nm测定各孔OD值；（3）具体实验样品检测
将兔抗乙脑病毒多克隆抗体,浓度5mg/mL,配制成包被液，每孔加包被液200μL，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜后取出倒空板，加300μL/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；
样品以2倍法稀释64、128、256、512，将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，洗板机清洗4次，洗液300μL/孔，倒空板，加样200μL/孔，由低稀释度往高稀释度加，每次实验设空白对照、阳性对照、阴性对照各两孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μL/孔，将稀释度为10-4的乙脑病毒E蛋白单克隆抗体加到酶标板上，200μL/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；
取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μL/孔，将稀释度10-5的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物加到酶标板上，200μL/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min；
取出酶标板，洗板机清洗6次，洗液300μL/孔，加入OPD显色液，200μL/孔，室温下避光反应30min；
显色后加50μL/孔终止液，设定相应的空白，酶标仪492nm测定；
结果判定：
当阴性对照OD值≤0.1，阳性对照OD值≥1.0时，该试验成立；
若阴性对照平均OD值≤0.05，按0.05计算；
若阴性对照平均OD值＞0.05，按实际OD值计算；
当P/N≥2.1时，则判定样品在该稀释度下呈阳性，并确定呈阳性的最大稀释度；
其中：P是样品平均OD值N是阴性对照平均OD值。
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