CN101363864A - 一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条、其制备方法及其应用 - Google Patents
一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条、其制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于检测乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被乙脑病毒E基因抗原域III和抗乙脑病毒的多克隆抗体，结合胶体金标记的乙脑病毒E基因抗原域III，用膜层析双抗原夹心法，检测动物或人血清标本中乙脑病毒特异性IgG抗体。或包被乙脑病毒E基因抗原域III和抗鼠IgG，结合胶体金标记的抗人IgG单克隆抗体，采用捕获法检测人血清标本中乙脑病毒特异性IgG抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对乙脑病毒感染诊断起到辅助作用，并可用于对疫苗接种后的效果观察。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条、其制备方法及其应用。
背景技术
流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)简称乙脑，是由嗜神经的乙脑病毒(JEV)所致的中枢神经系统性传染病[1].JEV属包膜病毒科黄病毒属，呈球型，直径20～30nm，核心含单股RNA，有衣壳，有三个结构蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M.E蛋白为糖蛋白，包裹在病毒的表面，它决定着病毒的毒力及其宿主范围，不仅在与宿主细胞受体结合及随后的膜融合中发挥重要作用，而且可刺激产生中和抗体在免疫保护方面起着主要作用。其典型特征为高热头痛，随后出现一系列脑症状及脑膜刺激症。病死率一般在10-30％之间，有相当一部分留有后遗症。
研究结果显示，E蛋白是乙脑病人血清IgG识别的主要蛋白。目前认为E蛋白的空间结构共分三个部分，其中结构域III独立地在病毒表面折叠，存在着乙脑病毒的主要中和抗原表位。因此通过基因工程获得该区域的表达蛋白，并用其作为抗原检测乙脑病毒的特异性抗体。
目前乙脑传统的检测方法是病毒分离，用C6/36细胞分离病毒；小鼠脑内接种。鉴定乙脑病毒的血清学方法中，中和试验、补体结合试验及凝酶抑制试验是第一代方法，第二代有免疫荧光方法。
抗体检测中主要有以下几种：(一)特异性1gM检测：乙脑病毒感染发病早期即产生特异性1gM，病后2～3周达到高峰，故单份血清可做出早期诊断。可使用：①1gM捕捉ELISA法；②2ME-NI法，血凝抑制抗体存在于1gM及1gG中，将早期单份血清分成二份，一份用2巯基乙醇(2ME)处理，以破坏1gM，另一份不处理，然后同时做HI试验，若处理血清抗体滴度比未处理的下降≥4倍，则为1gM阳性；③微量间接免疫荧光法，用荧光素标记的抗u链血清，检测已与细胞抗原片结合的1gM，根据特异性荧光颗粒，判断血清标本中的1gM存在。
(二)常规血清学试验：1.血凝抑制试验对乙脑诊断而言，本法特异性较低，但敏感性高，简便易行。2.补体结合试验补体结合抗体仅存在于1gG中，病后出现迟，消失快，适用于诊断近期感染。3.中和试验抗体存在于1gG、1gM中，出现早，维持久。中和试验特异性和敏感性都高，但操作繁杂，需用大量动物或组织培养管，需时较久，不适于临床诊断常规使用，而在血清学流行病学调查和病毒鉴定上有价值。
胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
针对乙脑的流行现状和防治要求，对于乙脑的诊断，不但要求高的特异性和敏感性的试剂，还需要快速、简便、易于基层医疗和卫生单位使用的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测乙脑病毒特异性IgG抗体的试纸条，检测人类或动物标本中乙脑病毒特异性抗体，用于乙脑病毒的辅助诊断。
本发明的另一目的是提供一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条的应用。
本发明的乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，其包含：同时包被乙脑病毒E基因抗原域III和抗乙脑病毒的多克隆抗体/二抗IgG两个条带的硝酸纤维膜；及含有胶体金标记的乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的玻璃纤维膜。
其中，所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。
所述硝酸纤维膜中乙脑病毒E基因抗原域III的浓度为3.5～4mg/ml，抗乙脑病毒的多克隆抗体或抗鼠IgG抗体的浓度为2～3mg/ml。
所述玻璃纤维膜中胶体标记的乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的最适pH值为8.0～8.2，乙脑病毒E基因抗原域III与胶体金的配比为15～18μg/ml胶体金；抗人IgG单克隆抗体与胶体金的最佳配比为18～20μg/ml胶体金。
本发明所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，还包括反应支持物、金标抗体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。
反应支持物优选PVC板；吸水垫优选滤油纸；金标抗体保护膜同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
本发明所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备乙脑病毒E基因抗原域III；
2)硝酸纤维膜的制备：将乙脑病毒E基因抗原域III稀释成3.5～4mg/ml，抗乙脑病毒的多克隆抗体或抗鼠IgG抗体稀释成2～3mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；
3)玻璃纤维膜的制备：乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的最适标记pH值为8.0～8.2，乙脑病毒E基因抗原域III与胶体金的配比为15～18μg/ml胶体金；抗人IgG单克隆抗体与胶体金的最佳配比为18～20μg/ml胶体金。经稳定剂(含0.05％BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用。
4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。
本发明所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条在检测乙脑病毒特异性IgG抗体中的应用。
本发明采用纯化的乙脑病毒E基因抗原域III和抗乙脑病毒特异性抗原的多克隆抗体或抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的乙脑病毒特异性抗原或抗人IgG，应用膜层析双抗原夹心法或捕获法的原理检测标本中的乙脑病毒特异性IgG抗体。
本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的乙脑病毒特异性抗体，达到快速筛检病人，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对乙脑病毒感染诊断起到辅助作用。
附图说明
图1A为本发明乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条的正面示意图；
图1B为本发明乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条的侧面示意图；
其中，1吸水垫；2硝酸纤维膜(T：乙脑病毒E基因抗原域III；C：包被抗乙脑病毒多克隆抗体或抗鼠IgG抗体的质控条带)；3含有胶体金标记的乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG的玻璃纤维膜；4金标抗体保护膜；5反应支持物。
图2为本发明检测结果示意图。其中，
从左至右依次为：T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1乙脑病毒E基因抗原域III的制备
(1)目的基因的获得
根据目的基因片段序列及pGEX-4T-1表达载体的特点设计两端含有限制性内协酶BamH1、HindIII酶切位点的引物：
5’TAAGGATCCCACCTGAAATGTAGGCTG3’
5’CGGGAAGCTTGAAGACCCCTCCAATAGA3’
用常规方法提出病毒总RNA，然后，立即进行RT-PCR，反转录产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。
(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选
将回收的PCR扩增产物与PMD-18T克隆载体16℃过夜连接后，转化到DH5a感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测定序列。
(3)融合表达载体的构建
用限制性内切酶BamH1、HindIII分别酶切T/EIII和pGEX-4T-1，1％琼脂糖电泳切胶回收目的片段和pGEX-4T-1双酶切后的大片段，用T4连接酶将两者16℃过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养10～12小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。
(4)pGEX-EIII融合蛋白的诱导表达
筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照1：100的比例接种至1000mlLB液体培养基中，37℃摇床培养。基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm0.5)，IPTG浓度0.6mmol/L，29℃诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。
(5)pGEX-EIII融合蛋白的纯化、鉴定
将(4)中1000ml菌液12000r/m、4度离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，用GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。
融合蛋白的Western-Blot鉴定
切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为乙脑病毒单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。
实施例2乙脑病毒E基因抗原域III多克隆抗体的制备
(1)动物免疫：
选择1～2kg的新西兰白兔，用乙脑病毒E基因抗原域III于背部皮下多点注射，免疫剂量为0.5～1mg/kg。共免疫3～5次。
(2)免疫效价检测：
包被乙脑病毒E基因抗原域III蛋白酶标板，每孔4μg。按间接ELISA法检测免疫血清的效价。血清效价达到1:20000以上，可采集血清。
(3)抗体提纯及检定：
采用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示一条蛋白带。活性采用ELISA检定，效价大于1:20000。
实施例3乙脑病毒特异性IgG抗体胶体金快速检测试纸条(参见图1)
(1)胶体金抗体结合物的制备：
乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的最适标记pH值为8.0，乙脑病毒E基因抗原域III与胶体金的配比为18μg/ml胶体金；抗人IgG单克隆抗体与胶体金的最佳配比为20μg/ml胶体金。经稳定剂(含0.05％BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用。
(2)包被抗原于硝酸纤维膜：
将乙脑病毒E基因抗原域III稀释成3.5mg/ml，抗乙脑病毒的多克隆抗体或抗鼠IgG抗体稀释成2mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；
(3)乙脑病毒特异性IgG抗体胶体金检测试纸条(双抗原夹心法)
反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫1为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗乙脑病毒的多克隆抗体，乙脑病毒E基因抗原域III，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的乙脑病毒E基因抗原域III的玻璃纤维膜3；金标抗体保护膜4为2.7cm×0.4cm的聚脂膜；即形成了乙脑病毒IgG抗体胶体金快速检测试纸条。
(4)乙脑病毒特异性IgG抗体胶体金检测试纸条特异性及敏感度：
本品用于检测人血清，因此其特异性检测设计以下阴性质控品，包括：正常人血清、流感病人血清、风疹病人血清、麻疹病人血清、呼吸道合胞病毒病人血清、支原体肺炎病人血清。检测结果表明，乙脑病毒IgG抗体检测试剂盒与上述病人的血清无交叉反应。其敏感度检测标准用中和实验筛选阳性血清，共11份，抗体效价从1:10～1:80。检测结果表明，本品最低检出量为1：20。
实施例4：乙脑病毒特异性IgG抗体胶体金快速检测试纸条(捕获法)
如图1所示，反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫1为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗鼠IgG，乙脑病毒E基因抗原域III，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的抗人IgG的玻璃纤维膜3；金标抗体保护膜4为2.7cm×0.4cm的玻璃纤维；即形成了乙脑病毒抗体胶体金快速检测试纸条。
实施例5检测方法(参见图2)
将检测标本(全血、血浆或血清)100～150μl直接滴加入实施例2或3中试纸条“4”处，样品上行，10～15分钟判读结果。
结果：
如检测标本中含有乙脑病毒IgG抗体，则与试纸条上胶体金标记的乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的乙脑病毒E基因抗原域III结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带。
无论是否含有相对应的抗体，胶体金标记乙脑病毒抗原继续向上爬行与包被在膜上的抗乙脑病毒多克隆抗体或抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司
<120>一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条、其制备方法及其应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
Claims (7)
1、一种乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，其特征在于，其包含：同时包被乙脑病毒E基因抗原域III和抗乙脑病毒的多克隆抗体/二抗IgG抗体两个条带的硝酸纤维膜(2)；及含有胶体金标记的乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的玻璃纤维膜(3)。
2、根据权利要求1所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，其特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。
3、根据权利要求1或2所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维膜中乙脑病毒E基因抗原域III的浓度为3.5～4mg/ml，抗乙脑病毒的多克隆抗体的浓度为2～3mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的浓度为2～3mg/ml。
4、根据权利要求1-3任意一项所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜中乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的最适标记pH值为8.0～8.2，乙脑病毒E基因抗原域III与胶体金的配比为15～18μg/ml胶体金；抗人IgG单克隆抗体与胶体金的最佳配比为18～20μg/ml胶体金。
5、根据权利要求1-4任意一项所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条，其特征在于，还包括反应支持物(5)、金标抗体保护膜(4)和吸水垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维膜(2)和吸水垫(1)。
6、一种制备权利要求5所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条的方法，包括如下步骤：
1)制备乙脑病毒E基因抗原域III；
2)硝酸纤维膜的制备：将乙脑病毒E基因抗原域III稀释成3.5～4mg/ml，抗乙脑病毒的多克隆抗体或抗鼠IgG抗体稀释成2～3mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；
3)玻璃纤维膜的制备：乙脑病毒E基因抗原域III或抗人IgG单克隆抗体的最适标记pH值为8.0～8.2，乙脑病毒E基因抗原域III与胶体金的配比为15～18μg/ml胶体金；抗人IgG单克隆抗体与胶体金的最佳配比为18～20μg/ml胶体金，经稳定剂处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；
4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。
7、权利要求1-6任意一项所述乙脑病毒特异性IgG抗体检测试纸条在检测乙脑病毒特异性IgG抗体中的应用。
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