CN102286431B - 抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，涉及抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用。分泌抗乙脑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4，2011年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5124。一种抗乙脑病毒的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No.5124的杂交瘤细胞株2B4产生。该单克隆抗体能够特异性地识别乙型脑炎病毒，细胞和动物实验都表明该单克隆抗体具有中和活性，可在制备检测乙脑病毒的检测试剂中应用。本发明抗JEV单克隆抗体的成功制备对于JEV的进一步研究以及建立更快速、灵敏、方便的检测方法以及开发相关的诊断试剂盒、试纸条和疫苗奠定了基础。

Description

抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及抗乙型脑炎病毒的单克隆抗体及其应用。

背景技术

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，属于黄病毒科黄病毒属，有包膜的单股正链RNA病毒，结构蛋白有3种：C、M和E，分为4个基因型(I、II、III、IV型)。三带喙库蚊为主要传播媒介，主要在亚洲流行，我国主要流行基因I型和III型，是危害我国人民生命及畜牧业的最重要的虫媒病毒之一，可引起严重的神经系统症状，致死率高达30％左右，另有50％的患者会留下永久性的神经系统后遗症。据统计，亚洲每年乙脑发病人数达16000例左右，死亡5000例左右，中国除新疆、西藏、青海外，其它各省均有发病与流行，脑炎发病数占世界总发病数的80％以上。近年来，该病的流行区域在不断扩大，成为严重的公共卫生问题。加强监测和诊断是十分重要的。

目前，乙脑诊断方法主要有血清学诊断、分离培养和分子生物学方法。

1、血清学检测：

传统的血清学方法有血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CT)、中和试验(NT)等。目前主要应用的有酶联免疫法(ELISA)，免疫荧光(IFA)、滴金免疫法。血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验是流行病学调查常用的传统方法，需要采集急性期和恢复期双份血清进行检测，诊断费时费力，不能达到早期快速诊断的目的，特异性和敏感性不高，双份标本的采集有困难；酶联免疫包被技术、酶标记技术、单克隆抗体技术的发展推动了ELISA检测乙脑IgM的应用和发展。现应用于诊断乙脑IgM的ELISA方法有捕获法和间接法；免疫荧光技术操作比较复杂，需要专业的人员及设备，而滴金免疫法则由于其简单，快速，有望推广生产使用。

2、分离培养：

主要有乳鼠脑组织接种和BHK、Vero等细胞分离，是获得毒株进行分子流行病学研究和疫苗株构建的基础。通过分离培养取得毒株，进行分子生物学等鉴定，可研究其基因型、是否本地区主要流行株或外来输入株、是否发生变异等。

3、分子生物学检测

由于黄病毒间存在广泛的血清学交叉反应，发病早期部分患者还未产生抗体，使乙脑血清学诊断不能达到满意效果；乙脑患者毒血症期很短，病毒分离培养时间长，阳性率低RT-PCR技术的产生给病毒检测提供了早期、快速、敏感、特异的方法。JEV全基因序列测定取得的进展、分子生物学及生物信息学的发展，为乙脑的快速基因检测提供了可能。主要的检测方法有PCR-ELISA微板杂交法、RT-PCR、套式PCR、半套式PCR、实时荧光PCR和基因芯片。

自1975年，Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术。单克隆抗体制备技术因其很强的特异性和专一性，尤其是单抗的人源化技术的发展，广泛地运用于生物学及医学的各个领域。在乙型脑炎病毒的检测中，杂交瘤细胞技术和单克隆抗体技术在ELISA、中和试验、免疫荧光、免疫胶体金试剂盒、噬菌体展示技术等方面起到了举足轻重的作用。中和性的单克隆抗体则在疫苗及检测试剂盒的开发研制方面具有巨大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌抗JEV的单克隆抗体的杂交瘤。

本发明的另一目的是提供抗JEV的单克隆抗体。

本发明的又一目的是提供该单克隆抗体的应用。

分泌抗乙脑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4，2011年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5124。

一种抗乙脑病毒的单克隆抗体，由所述的保藏号为CGMCC No.5124的杂交瘤细胞株2B4产生。

所述的单克隆抗体在制备检测乙脑病毒的检测试剂中的应用。所述的单克隆抗体在体外抗原抗体反应中用于检测病原、病毒蛋白以及宿主细胞和动物实验中的中和作用。例如用于酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质印迹(Western Blot)、间接免疫荧光(IndirectImmunofluorescence)、细胞及动物的中和实验以及流式细胞术(Flow Cytometry Assay)等的检测中，以检测其与抗原的结合性、特异性以及是否具有中和活性。

本发明制得的抗JEV的单克隆抗体，为JEV的研究和建立新的乙脑病毒检测方法以及相关的诊断试剂盒和疫苗提供了有利的工具。

有益效果：

本文利用BHK-21细胞培养出的JEV病毒，经过超速离心浓缩和蔗糖密度梯度离心纯化，作为抗原免疫BALB/C小鼠，经过常规的细胞融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌抗JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2B4)。经过ELISA、Western Blot等方法的鉴定，杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性地识别乙型脑炎病毒，细胞和动物实验都表明该单克隆抗体具有中和活性。

本发明抗JEV单克隆抗体的成功制备对于JEV的进一步研究以及建立更快速、灵敏、方便的检测方法以及开发相关的诊断试剂盒、试纸条和疫苗奠定了基础。

本发明抗JEV单克隆抗体的应用：

(1)该抗体可以检测脑脊液和各种体液如血浆、淋巴液、血清等中的JEV的水平。

(2)利用该单抗进行动物实验。

(3)可以利用单抗进行药理学研究，用于治疗以JEV引起的乙型脑炎。

附图说明

图1蔗糖密度梯度离心后各层样品的RT-PCR检测结果，

其中泳道1为加样区一层吸取的样品，泳道2为45％-60％一层吸取的样品，泳道3为30％-45％一层吸取的样品，泳道4为30％-加样区一层吸取的样品。

图2电镜观察下的JEV病毒粒子，

其中“-”均表示100nm，A为45％-60％一层吸取的样品，B为30％-45％一层吸取的样品。

图3单抗2B4各稀释梯度的荧光图片，

A是单抗2B4稀释10^-1的荧光图片，B是单抗2B4稀释10^-2的荧光图片，C是单抗2B4稀释10^-3的荧光图片，D是单抗2B4稀释10^-4的荧光图片，P为阳性对照，N为阴性对照。

图4Western Blot检测单抗2B4与BHK细胞裂解液以及JEV细胞毒的特异性反应，其中泳道1为BHK细胞裂解液+单抗2B4，泳道2为JEV细胞毒+单抗2B4。

图5流式细胞术分析单抗2B4在自然条件下与BHK细胞以及感染JEV的BHK细胞的结合情况，其中A空白对照，B只加荧光二抗的阴性对照，C单抗2B4与BHK细胞的反应，D单抗2B4与感染JEV的BHK细胞的反应。

图6细胞中和实验。

图7中和实验-间接免疫荧光。

图8单抗2B4检测患乙型脑炎乳鼠脑脊液的间接免疫荧光结果照片，

其中，A～D依次为本发明单抗2B4检测作10倍的梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)检测样品BS-V结果图，E为多抗的阳性对照(用常规方法免疫兔产生)，F为本发明单抗2B4检测BS结果图，G为只加荧光二抗的阴性对照。

生物样品保藏信息

杂交瘤细胞株2B4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5124，保藏日期2011年8月3日。

具体实施方式

实施例1制备纯的全病毒抗原

步骤1病毒的增殖

用BHK细胞(上海晶科生物有限公司)培养于含有8％的犊牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，100U/ml的青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM中，长成细胞单层后倒掉营养液，用PBS(pH7.2)或无血清的营养液洗1遍，接种JEV(SA14-14-2，湖南中岸生物药业有限公司)，37℃作用1.5-2h，然后用PBS(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L)或无血清的营养液洗1遍，加2％的维持液，置37℃CO2培养箱培养，2～3天后显微镜下观察，当细胞病变(CPE)达85％时，-20℃冻存待用。

步骤2病毒的浓缩与纯化

将收集的病毒反复冻融3次，悬液5000r/min离心20min，取上清(S1)待用，将沉淀用0.01M的PBS重新悬浮，用超声波裂解之，100W，30S/次，反复3次。再用6000r/min离心20分钟取上清(S2)，弃去沉淀。将S1和S2混合，加入NaCl和PEG6000，使其终浓度分别达到2％-3％和7％，在4℃下搅拌过夜，次日7000r/min离心20分钟，弃去上清，沉淀用TNC(10mM Tris、10mM NaCl和2mMCaCl2，pH7.8)，缓冲液悬浮至240ml，再以27000r/min离心(SW28转子)2小时，弃去上清，用TNC悬浮沉淀至12ml。将此病毒悬液轻轻加于30％、45％、60％的非线性蔗糖密度梯度上，再以100000g/min离心3h，分别收集各梯度区带上的蛋白提取物。再分别用TNC稀释各梯度区带上的蛋白提取物，以27000r/min离心2小时，弃上清，用少量TNC悬浮沉淀，冻存待用。步骤3RT-PCR鉴定以及电镜观察

此步骤整个过程除水浴锅及PCR部分以外均在生物洁净工作台操作。

对实施例1步骤2中所收集的各梯度区带上的蛋白提取物，即四组样品(加样区，30％-加样区、30％-45％、45％-60％；离心管各组分加入顺序是60％的蔗糖溶液，45％的蔗糖溶液，30％的蔗糖溶液，样品；加样区就是指加样时加入样品的那段体积，然后分别取相邻两种不同密度蔗糖溶液界面上的样品。)提RNA，依照JEV Cap蛋白的体系做RT-PCR，鉴定病毒所在区域，并对四组样品进行电镜观察，过程如下：

(1)RT-PCR

每组样品取250μl，并加PBS稀释到500μl，加入700μl Trnzol(裂解)，上下温和混匀，静置2min。加入氯仿200μl(去蛋白)，剧烈震荡后静置2min，12000r/min离心15min。取上清，并加入等体积异丙醇(沉淀RNA)，于-20℃放置15min以上。然后，12000r/min离心20min，弃上清，并用75％的乙醇洗涤一次，充分晾干。最后，用20μlRNAse free H₂O重悬。

按体系(dNTP-4μl；Oligo DT-1μl；样品，即上述步骤中提取的RNA-5μl；RNAse freeH₂O-3μl)加好所有的组分，放入65℃水浴锅5min后，再置于冰盒上2min。然后，按照体系(5×Fsbuffer-4μl；DTT-2μl；RNA酶抑制剂-0.5μl)加好所有的组分，放入37℃水浴锅2min，然后置于冰盒加入0.7μl鼠逆转录酶，然后放入PCR仪中，设置37℃50min，75℃15min。

按照PCR体系：

10×Fs buffer          5μl；

dNTP                   4μl；

上游引物为(SEQ ID NO.1)1μl；

下游引物为(SEQ ID NO.2)1μl；

rTag酶                 0.5μl；

RNAse free H₂O         34μl；

样品                   5μl

加好所有的组分后放入PCR仪，95℃预变性1min，扩增条件为：94℃1min，57℃1min，72℃1min，35cycles，72℃延伸1min。

最后，跑胶鉴定(水平电泳系统购自Bio Rad公司产品)，如图1所示，在30％-45％和45％-60％之间有病毒。

(2)电镜观察

对实施例1步骤3中所提到的4组样品进行电镜观察，结果如图2，30％-45％一层样品中有比较多的病毒粒子，而45％-60％一层样品中含量比较少，且有许多杂蛋白，因此，比较而言，30％-45％一层样品中的病毒比较纯，测浓度后作为以下实施例中免疫原备用。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

步骤1小鼠免疫

以实施例1中纯化的30％-45％的乙脑全毒免疫3只BALB/C小鼠(6-8周龄，购自人民解放军军事医学科学院实验动物中心)：i第一次免疫：乙型脑炎病毒150μg/只，加等体积福式完全佐剂(CFA，sigma公司)充分混匀后以1ml/只皮下多点注射BALB/C小鼠，0.2ml/点，间隔3周。ii第二次免疫：剂量及途径同上，此次加等体积福式不完全佐剂(IFA，sigma公司)，间隔3周。iii第三次免疫：剂量同上，不加佐剂，改用等体积的生理盐水，腹腔注射BALB/C小鼠；10天后取被免疫小鼠的眼球血(采集后即置4℃冰箱过夜，次日以2000r/min离心10min后，留上清备用)。以纯化的乙脑病毒包被，通过ELISA测定血清效价。iv第四次加强免疫：剂量及途径同第三次免疫，取血清效价大于1∶10000的小鼠于融合前3天腹腔注射。

步骤2ELISA法检测被免疫小鼠的血清效价流程

检测前一天，用包被缓冲液(0.05mol·L^-1NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液，pH9.6)稀释纯化的乙脑病毒(实施例1制备或纯化的30％-45％的乙脑全毒)加入酶联免疫吸附板中，每孔100μl，置4℃冰箱过夜；次日到出已包被的酶联免疫吸附板孔内的液体，以洗涤缓冲液(每1L PBS加入0.5ml Tween-20，PH7.4)洗涤共3次，每次拍干，加入封闭液150μl/孔(每100ml的PBS加入1gBSA，pH7.4，BSA购自北京鼎国生物技术有限公司)，置37℃作用2小时；用上述方法洗涤3遍，拍干，加入PBST进行梯度稀释的待检血清(稀释度分别为：1∶100、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000)100μl/孔，以未免疫的BALB/C小鼠的血清为阴性对照，以免疫后抗体效价大于1∶10000的BALB/c小鼠眼球血中分离的血清为对照阳性血清，置37℃作用恒温箱1小时；再次用PBST洗涤，方法同上，拍干，每孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(北京鼎国昌盛生物技术有限公司，用PBST进行1∶20000稀释)100μl，置37℃作用恒温箱1小时；洗涤3遍，拍干，每孔加TMB显色液(现配现用；底物缓冲液为0.05mol·L-1PH5.0磷酸-柠檬酸；TMB使用液为每10ml底物缓冲液中加入100μl TMB和75％的双氧水35μl，TMB购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司)100μl，置37℃作用恒温箱15-20min；然后加入终止液(2M H2SO4)100μl/孔，用酶标仪检测OD450nm值，以空白对照调零，S为各检测孔的值，N为阴性对照的平均值，P为阳性对照的平均值。在P/N≥3的情况下，S/N＝待检孔的OD450nm值/阴性对照孔的OD450nm，平均值≥3时判定为阳性。

步骤3骨髓瘤细胞、脾细胞及饲养细胞的制备

(1)骨髓瘤细胞的制备

在融合前2周复苏骨髓瘤SP2/0细胞(上海雅吉生物科技有限公司)，于液氮罐取出后在37℃水浴中迅速解冻，1500r/min离心8min，弃上清后用20％胎牛血清的1640(Gibco公司)培养基重悬，置37℃、5％CO2培养箱中培养，次日换液，连续培养几天待骨髓瘤瘤细胞的活性恢复后，用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞，1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植(其目的是为了使细胞处于对数生长期)。融合前12h换液一次。融合当天，将细胞从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000r·min^-1离心5-10min，弃上清。将沉淀细胞用30mL不完全培养基，同法离心一次，然后重悬于10ml无血清的1640中混匀。加0.4％台酚蓝染色液作活细胞计数，备用，约4×10⁷/ml。

(2)脾细胞的制备

取免疫后抗体效价为阳性的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清为抗体检测时的阳性对照血清。脱颈处死小鼠，浸入75％酒精中消毒5min，放入超净工作台中，无菌打开腹腔，取出脾脏，置于含10mL不完全1640培养基的平皿中，轻轻洗涤，剥离脾脏表面的结缔组织，然后将脾脏放在另一个含10mL不完全1640培养液的平皿中，并置于200目筛网中，用注射器内芯轻轻研磨，使其释放出脾细胞。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液，1000r·min^-1离心5-10min，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将脾细胞重悬于含10mL不完全1640培养液的50mL V形离心管中，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用，约2×10⁸/ml。

(3)饲养细胞的制备

在细胞融合前1-2天制备饲养细胞(腹腔巨噬细胞)按上述采小鼠(6周龄的BALB/C小鼠)脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用无菌剪刀剪开腹部皮肤以暴露腹膜，用酒精棉球擦拭消毒，用无菌注射器每次注射10ml不完全1640培养液至腹腔，反复冲洗，吸出冲洗液放入50ml离心管中(共约40ml)，以1000r/min离心5-10分钟，弃上清后先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据计数结果，补加到2×10⁵/ml，加入96孔细胞培养板，100μl/孔，放入37℃5％的CO₂细胞培养箱培养。

步骤4细胞融合过程

a将50％PEG(pH8.0)1ml预热至40℃，将不完全培养基(20-30ml)预热至37℃。

b将1×10⁸脾细胞与3×10⁷个骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管里，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。1000r/min离心5-10min，尽量将上清吸干净(很重要，会影响融合作用效率)。用手轻轻拍打融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置40℃中水浴中预热。

c用1ml吸管沿管壁在45s左右加预热的50％PEG，边加边轻轻搅拌。用10ml吸管在90s内沿管壁加预热的不完全培养基，37℃静置10min，1000r/min离心5min，弃上清。

d加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。

e分装至96孔细胞培养板，100-500μl/孔，将培养板置于37℃5％的CO₂细胞培养箱培养。5天后用HAT(Sigma公司)培养基换出1/2培养基。7-10天后用HT(Sigma公司)培养基患处HAT培养基，14天以后可用普通完全培养基。

f观察杂交瘤细胞的生长状态，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测用。步骤5杂交瘤的筛选

融合2周左右可以开始筛选，按照实施例2步骤2进行操作，不同之处是用包被缓冲液稀释纯化的乙脑病毒至15μg/ml；加入待检杂交瘤细胞上清稀释度分别为：1∶100、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000，结果阳性值高的孔便进行克隆化。

步骤6杂交瘤的克隆化、扩大培养及冻存

杂交瘤的克隆化采用有限稀释法进行，具体方法如下：

a制备饲养细胞悬液：方法同实施例2步骤3中(3)一致。

b制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3种不同的稀释度，按5×10⁴-1×10⁵/ml的比例分别加入腹腔巨噬细胞。每种杂交瘤细胞分装一块96孔板，每个稀释度32孔，200μl/孔，每孔的数量分别为0.5、3、10。

c37℃5％的CO₂细胞培养箱培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测，将阳性孔中细胞进行下一次的克隆化，如此重复3次后便得到能稳定分泌单抗的杂交瘤(进行克隆化的一株细胞下一次克隆化的所有单克隆孔均为阳性)。

d选取阳性最强的单克隆孔中的细胞2B4转入24孔板中培养(一孔转一孔)，3天后于24孔板中分成2孔，再3天后分成4孔，再隔2天后将此4孔的细胞一并转入50ml细胞培养瓶中扩大培养，从而得到了分泌抗JEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，送交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，杂交瘤细胞株2B4保藏号为CGMCC No.5124，保藏日期2011年8月3日。

e杂交瘤细胞的冻存：待50ml培养瓶内细胞铺满瓶底约70％时，将培养瓶中的细胞用吸管吹打至完全悬浮起来，将细胞悬液移于50ml无菌离心管内并计数，离心1200r/min，6min；弃上清，以细胞冻存液(30％胎牛血清、60％不完全1640培养液、10％DMSO)(胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMSO购自上海凌峰化学试剂有限公司)重悬沉淀，调节细胞密度为1×10⁷/ml；分装于冻存管，1ml/支，置4℃冰箱1h，再转入-20℃冰箱放置1h，再转入-40℃冰箱1h，再转入液氮罐口过夜，次日将冻存的细胞浸入液氮冻存。

实施例3体内诱生腹水法制备单抗

取10只6-8周龄的BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡0.4ml/只预致敏，7d后用杂交瘤细胞2B4(CGMCC No.5124)以1×10⁶个/只(等量生理盐水稀释成500μl/只)的量腹腔注射上述预致敏的小鼠，10-14d后观察小鼠，腹胀明显、行动迟缓、不思饮食且毛发错乱时即处死采腹水，用注射器将腹水收集到离心管中，2000r/min，离心10min，取上清即为大量单克隆抗体2B4的腹水，置4℃冰箱备用，长期保存则冻-20℃或-40℃。

实施例4单克隆抗体亚类的鉴定

采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit试剂盒(Pierce公司)，具体步骤参照其说明书如下：

(1)取出酶标板，每个标本需要6孔，将细胞培养上清50μl/孔加入酶标板，每个标本加6孔，阳性对照和阴性对照也是各加6孔每孔50μl，然后每孔再加入50μl标本稀释液，贴上封板膜37℃温育30-40min。

(2)洗板机(BIO-TEK公司产品)洗5遍，再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗(IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA)各100μl，通用阳性对照的6孔也一样，在加样图上或酶标板上做好标记，贴上封板膜37℃温育30-40min。

(3)洗板机洗5遍，每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20-30min，终止反应判定结果。

测定结果，杂交瘤细胞株2B4(CGMCC No.5124)分泌的单抗为IgG1，κ。

实施例5单抗的纯化

用HiTrap affinity columns(GE公司)进行腹水的纯化，步骤如下：

(1)腹水用binding buffer(20mM Na₂HPO₄，PH 8-9)稀释成3倍，用0.22的滤器过滤。

(2)10倍柱体积的binding buffer洗柱子，排掉恒流泵上样管中的气泡，流速为1ml·min^-1。

(3)用恒流泵加入上述(1)中过滤好的腹水样品。

(4)用5-10倍柱体积的binding buffer洗涤

(5)用2-5柱体积的elution buffer(0.1M柠檬酸，PH4.5-6.0)洗脱单抗并收集于提前准备好的收集管中(每管加60-200μl的1M Tris-HCl，pH 9.0)

(6)每管各取15μl进行SDS-PAGE分析其纯化效果，并测浓度，浓度为2.173mg/ml。

实施例6单抗的特性鉴定

步骤1杂交瘤细胞培养上清及单抗的效价测定

两种测定的方法基本一致：

按照实施例2步骤2进行操作，不同之处是加入待检细胞上清(杂交瘤CGMCC No.5124上清)稀释度分别为：1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，测腹水效价时稀释度为1∶1000、1∶3000、1∶9000、1∶27000、1∶81000。以未免疫的BALB/C小鼠的血清为阴性对照，用抗JEV的兔血清多抗(以常规方法制备)作为阳性对照(1∶50)，多抗相应的二抗为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白HRP-SPA(1∶5000，构自武汉博士德试剂公司)结果如表1和表2，可见杂交瘤细胞CGMCC No.5124上清的效价大于1∶2500，单克隆抗体2B4(实施例4纯化)的效价为1∶80000左右。

表1、2B4的细胞上清的效价测定

表2、2B4单克隆抗体的效价测定

步骤2抗体分泌稳定性测试

将杂交瘤细胞(CGMCC No.5124)连续培养两个月及液氮冻存后复苏，取5、10、20代的细胞培养上清，按实施案例2步骤2程序以间接ELISA法测其抗体效价，以SP2/0细胞培养液为阴性对照。结果如表3所示，抗体分泌稳定。

表3、不同代次杂交瘤细胞上清的ELISA抗体效价

步骤3间接免疫荧光(IFA)

(1)病毒培养

用含8％犊牛血清的DMEM营养液培养乙脑的敏感细胞BHK(上海晶科生物有限公司)，在转瓶中长成单层后倒掉营养液，用胰酶消化后，用吸管吹打下来制成细胞悬液，接入96孔细胞板中，置37℃5％的CO₂细胞培养箱培养。第二天等每孔细胞长到70-80％左右，倒掉营养液，PBS或无血清的DMEM或维持液(2％DMEM)洗一次，轻轻在吸水纸上拍干，加入JEV病毒液100μl/孔，设不加毒的孔作为阴性对照37℃5％的CO₂细胞培养箱作用2h。倒去病毒液，用PBS或无血清的DMEM或维持液(2％DMEM)洗一次，用移液器吸干(防止交叉污染)，加入维持液100μl/孔，置37℃5％的CO₂细胞培养箱培养。

(2)间接免疫荧光

48h后，倾去维持液，PBS洗涤后用-20℃冷丙酮/4℃纯乙醇固定10min，弃去固定液，将96孔细胞板自然晾干。单克隆抗体2B4按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个梯度稀释(原始浓度为2.173mg/ml)，50μl/孔，设阳性(多抗)对照和阴性(PBS)对照，37℃温箱作用45min，PBS洗涤3次，晾干。加入50μl/孔羊抗鼠荧光二抗，37℃温箱作用45min，PBS洗涤3次，置倒置荧光显微镜下观察结果。结果判定：阳性细胞孔内可观察到阳性细胞的胞浆有典型的特异性亮绿色荧光，而阴性及空白对照的细胞孔内无特异性绿色荧光。如图3，参照阴阳性对照，10^-1与10^-2时2B4的荧光比较强。

步骤4免疫印迹(Western Blot)

根据实施例1步骤1，将收集的JEV细胞毒经3次反复冻融、超声波破碎、初步离心提纯，进行15％SDS-PAGE电泳，未感染过JEV的BHK细胞裂解液为阴性对照，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液(含5％脱脂奶粉的TBS)在4℃摇床(TY-80S型脱色摇床为南京大学南达生物技术开发公司产品)封闭过夜，加入由实施例3制备并纯化的单克隆抗体2B4，室温置摇床反应2小时，TBST(PH7.5，0.05mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)洗涤3次，每次10min。然后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，母液为封闭液，室温摇床反应2h，洗涤3次(方法如上)。最后，在一个清洁平皿中按照DAB显色试剂盒配制显色液5mL(现配现用)，然后将洗涤好的硝酸纤维素滤膜放入其中，轻轻摇动，一旦条带显色较清楚即用蒸溜水漂洗硝酸纤维素滤膜以终止反应，取出后拍照保存备用。如图4所示，2B4与JEV有较强且很单一的反应，而与BHK细胞裂解液并不反应。

步骤5流式细胞术分析单抗2B4在自然条件下与BHK细胞以及感染JEV的BHK细胞的结合情况

参照本实施例步骤3(1)中的培养方法，将BHK细胞置于六孔板中长成单层，接近长满时，用无血清的DMEM洗一遍，以500μl/每孔的量接种JEV，37℃温箱作用1.5-2h，以不做处理的细胞为对照(2组)。然后加入1ml消化液(PBS+0.02％EDTA)放置10min，将细胞吹成悬液，离心(1500r/8min)，去上清，加入200μlPBS重悬，再离心，弃上清后用200μl稀释好的一抗(2B4为21.73μg/ml，母液是PBS)进行重悬(空白对照不加)，室温孵育1h，照上述洗涤方法用PBS洗两次，然后加入羊抗鼠荧光二抗室温孵育40min(阴性对照加入荧光二抗，而空白对照不加)，用PBS洗涤两次后，用流式细胞仪(BD Biosciences)进行观察。

如图5，根据空白和阴性对照，当BHK细胞感染JEV后，单抗2B4的结合率显著上升，说明单抗2B4在自然状态下能与JEV结合。

实施例7单抗2B4的中和活性

步骤1在细胞实验中的中和活性

(1)中和实验

将实施例5纯化的单抗2B4做3个梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3)稀释到50μg，并与等体积的100TCID50的JEV混合，4℃孵育过夜。同时，参照实施例5步骤4(1)中的培养方法，将BHK细胞置于96孔板中长成单层，倾去营养液，用无血清的DMEM洗一遍，加入上述反应液(100μl/孔)，每个梯度重复10次，置于37℃作用1.5-2h。然后，倒掉反应液，用无血清的DMEM洗一遍，加入维持液(含2％小牛血清的DMEM，100μl/孔)。6-8天后观察细胞生长状况，有出现细胞变圆或不规则、脱落、细胞粘连、单层细胞空洞等情况则判定细胞发生病变。计算每个梯度的病变百分比，绘成图6。

如图6，可见稀释10^-3开始，单抗2B4的中和活性减弱，因此证明其有一定的中和活性。

(2)中和实验-间接免疫荧光

将单抗2B4做4个梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，原始浓度为2.173mg/ml)，每个梯度重复4次，设置空白对照，按照步骤1中中和实验的步骤操作，72h后按照实施例4步骤4操作，设置阴性对照(病毒感染过的细胞且只加荧光二抗的)，以中和性的多抗(PAB)为阳性对照，所不同的是一抗稀释度均为10^-2。结果如图7，有1/2数量的孔有荧光的判定荧光强度为1，3/4以上的孔有荧光的判定荧光强度为2，1/4以下有荧光的判定荧光强度为0，因此，对于中和性多抗PAB荧光强度一直为0，而阴性对照荧光强度一直为2，相比较而言，在稀释度为10^-1、10^-2时2B4有中和活性，这与中和实验的结果一致。

步骤2在动物实验中的中和活性

将含50mg单抗蛋白的2B4与500μl的JEV细胞毒(根据LD50预实验所得的量)混合后在4℃反应过夜，注射BALB/c小鼠(9-12日龄)，10只一组，500μl/每只，并且设置对照组，只注射JEV。结果如表4，小鼠的存活数明显提高，而死亡时间也发生延迟，说明在自然状态下2B4具有一定的中和活性，很有希望进行疫苗的开发研究。

表4、动物中和实验

注：死亡时间指的是从注射后到开始发生死亡的间隔时间

实施例8单抗2B4检测患乙型脑炎乳鼠脑脊液的应用

(1)取攻乙脑强毒并发病而亡的乳鼠(3天)脑组织，同时取同批次以未攻毒且生长状态良好的乳鼠脑组织。用生理盐水冲洗干净后，加入1ml进行充分研磨，3000r/min离心10min，取上清，用0.22的滤器过滤(无菌操作)，作为提取液备用，攻乙脑强毒并发病身亡的小鼠脑组织处理后的最终样品标记为BS-V，而未攻毒且生长状态良好的小鼠脑组织处理后的最终样品标记为BS。

(2)按照实施例6步骤3中间接免疫荧光的步骤，将BS-V作10倍的梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4)，BS不作稀释，与BHK-21细胞感作1.5-2h，单抗按10^-2加入50μl/孔，其余步骤相同。

结果如图8，BS-V在梯度10^-1、10^-2、10^-3有较强的荧光(显微镜倍数调低以观察更多的细胞)，而BS则与阴性对照一致。该实验证明单抗2B4能够在临床条件下检测脑脊液中JEV的存在，从而为进一步研究开发乙型脑炎病毒的检测方法、检测试剂盒以及疫苗等奠定了基础，对于乙脑的临床诊断及治疗有重要的应用前景。

Claims (3)

1.分泌抗乙脑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B4，2011年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5124。

2.一种抗乙脑病毒的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测乙脑病毒的检测试剂中的应用。

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