CN111018970B - 一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法 - Google Patents

一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及血清的制备方法，具体涉及一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法。所述制备方法以豚鼠或兔作为免疫动物，采用传代细胞的病毒液作为猪乙型脑炎病毒抗原进行基础免疫。所制得的乙型脑炎特异性阳性血清效价高达1：2000倍以上，比直接免疫猪所得血清效价高，可满足乙型脑炎诊断技术和疫苗质量控制的要求。同时，免疫动物为兔和豚鼠，降低了成本，减少了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险。

Description

一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法
技术领域
本发明涉及血清的制备方法，具体涉及一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法。
背景技术
猪乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)引起的一种经蚊虫传播的人畜共患病，是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主，是乙型脑炎的主要传染源，是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。在乙型脑炎流行季节前，对猪进行预防接种，可有效降低人乙型脑炎发病率。目前，仍没有特效药物治疗乙型脑炎感染，主要通过预防接种措施来防制。
已发文章和专利文献上发表的猪乙型脑炎病毒阳性血清的制备是免疫猪或SPF鸡，免疫原是原代细胞培养的毒液，尚未有使用豚鼠或兔为免疫动物，传代细胞培养的毒液为免疫原制备阳性血清的报道。然而，采用现有技术中的方法制得的血清一般效价较低，而且在用猪制备阳性血清时，还可能会因为属于同源动物而引起同源其他外源病毒的污染。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了提升猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的效价，满足乙型脑炎诊断技术和疫苗质量控制的要求，本发明提供了一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清及其制备方法。
(二)技术方案
本发明首先提供了一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法，以豚鼠或兔作为免疫动物，在进行基础免疫时，采用传代细胞的病毒液作为猪乙型脑炎病毒抗原。
本发明发现，在按上述方案改变免疫动物和免疫原后，可以改善免疫效果，较大地提升阳性血清的效价。
优选地，依次采用所述猪乙型脑炎病毒抗原和猪乙型脑炎病毒活疫苗对所述免疫动物进行基础免疫，其中，所述猪乙型脑炎病毒活疫苗中含有所述猪乙型脑炎病毒抗原和佐剂；更优选所述猪乙型脑炎病毒抗原的效价≥107.0PFU/ml。
进一步优选地，所述基础免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～10天。优选在进行第1次基础免疫时，接种猪乙型脑炎病毒抗原；在进行第2次基础免疫时，接种所述猪乙型脑炎病毒活疫苗。通过这种方式，可以降低免疫动物的副反应，使得免疫原性更持久，血清效价进一步得到提高。
作为优选，所述免疫动物为体重350～450g的豚鼠或体重2000～3000g的兔。
在所述基础免疫中，所述猪乙型脑炎病毒抗原的具体制备过程如下：将乙型脑炎病毒接种在传代细胞中后，培养至50～75％细胞出现病变时收获病毒液；
优选所述传代细胞为Vero细胞。
按照本领域常识，应当在细胞状态较好的时候接种病毒，优选在接种时，所述Vero细胞呈致密单层的生长状态。而细胞的培养条件一般为37℃、5％CO2。
在所述基础免疫之后，还包括加强免疫，作为优选方案，所述加强免疫具体包括：
采用猪乙型脑炎病毒灭活疫苗对所述免疫动物进行加强免疫；
优选所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备方法如下：将猪乙型脑炎病毒液灭活后，与佐剂混合制得；其中，所述乙型脑炎病毒液优选为乙型脑炎P3株的病毒液；
更优选在灭活前，所述猪乙型脑炎病毒液的效价LD50≥10-6.52/0.03ml。
进一步优选地，所述加强免疫的免疫次数为3～4次，间隔时间为7～10天。
进一步优选地，所述灭活的具体过程如下：将β-丙内酯与所述猪乙型脑炎病毒液按重量比1：(3800～4200)于4℃搅拌灭活22～26小时，再于37℃水浴条件下水解1.5～2.5小时，制得猪乙型脑炎病毒灭活抗原。
进一步优选地，在本发明中，所述的佐剂含有如下重量份组分时，免疫效果更好：
注射用水溶液 90～95份；
聚合物组合：
壳聚糖 1.5～2.5份；
聚乙二醇交酯酸共聚物 1.5～2.5份；
聚乙二醇600 0.8～1.2份；
乳化剂：
烷基糖苷 0.8～1.2份；
助剂：
月桂醇 0.8～1.2份。
其中，所述烷基糖苷优选为月桂基葡糖苷，更优选为APG1416。
进一步优选地，所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备过程包括：在1800～2200转/分钟的搅拌速度下，将所述猪乙型脑炎病毒灭活抗原缓慢加入灭菌后的所述佐剂中进行分散乳化，优选在上述搅拌速度下分散乳化30分钟。
为了优化免疫效果，本发明进一步分别对豚鼠和兔的接种方式进行了优化，得到如下优选方案：
作为一种优选方案，在以豚鼠为免疫动物时，免疫接种具体包括：
(1)基础免疫：分别对每只豚鼠腿部肌肉分点注射2ml的所述猪乙型脑炎病毒抗原，间隔7～10天后，分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml所述猪乙型脑炎病毒活疫苗；
(2)加强免疫：在进行所述基础免疫后，每隔7～10天分别对每只豚鼠腹腔注射1ml所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，共进行3～4次。
作为一种优选方案，在以兔为免疫动物时，免疫接种具体包括：
(1)基础免疫：分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml的所述猪乙型脑炎病毒抗原，间隔7～10天，分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml所述猪乙型脑炎病毒活疫苗；
(2)加强免疫：在进行所述基础免疫后，每隔7～10天分别对每只兔皮下或肌肉注射1ml所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，共进行3～4次，最后一次免疫接种时，分别对每只兔耳源静脉注射1ml所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
在将佐剂与抗原进行混合时，一般是按照质量比1:1的方式进行配比，在此不做进一步限定。
按照本领域常识，在所述免疫接种后，还包括采集血清和测定效价的步骤，其中，采集血清的时间一般根据免疫接种的间隔时间进行确定，在此不做进一步限定。
在本发明的一些实施方案中，一般在最后一次免疫后7～10天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，以蚀斑减数试验方法测定血清中和抗体效价，效价在1：2000以上，即得猪乙型脑炎病毒阳性血清。
本发明进一步提供一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清，采用上述的制备方法制得；优选所述猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的效价在1：2000以上。
本发明中的血清经过过滤、检验、冻干、分装等工艺过程后，最终可用于鉴别检验、外源病毒检验和诊断等方面。
本领域人员可对本发明的优选方案进行组合，得到本发明的较佳实施例。
(三)有益效果
(1)本发明所制得的乙型脑炎特异性阳性血清效价高达1：2000倍以上，比直接免疫猪所得血清效价高，可满足乙型脑炎诊断技术和疫苗质量控制的要求。
(2)本发明中免疫动物为兔和豚鼠，降低了成本，减少了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险。
(3)本发明在基础免疫中所涉及的免疫原是采用传代细胞繁殖的病毒液，病毒收获率高，有更好的免疫原性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
在以下实施例的基础免疫中，注射猪乙型脑炎病毒活疫苗时，所使用的佐剂与猪乙型脑炎病毒灭活疫苗中的佐剂相同。
在以下实施例中，基础免疫中的猪乙型脑炎病毒抗原的效价≥107.0PFU/ml。加强免疫中，在灭活前，乙型脑炎P3毒液的效价LD50≥10-6.52/0.03ml。
实施例1猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法
(1)猪乙型脑炎病毒抗原的制备。
将乙型脑炎SA14-14-2株接种生长致密单层的传代细胞Vero细胞，37℃、5％CO2条件下进行培养，当50～75％细胞出现病变时收获毒液，作为基础免疫中的猪乙型脑炎病毒抗原。-70℃保存。
(2)猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备。
1)佐剂的选择：所采用动物疫苗的聚合物组合佐剂组成为注射用水、聚合物、乳化剂、助剂。依次将下述比例的助剂、乳化剂、聚合物组合加入到注射用水溶液中，边加入边搅拌，搅拌速度控制在为2000转/分钟，混合均匀即得聚合物组合佐剂。
注射用水溶液 93％；
聚合物组合：
壳聚糖 2％；
聚乙二醇交酯酸共聚物 2％；
聚乙二醇600 1％；
乳化剂：
月桂基葡糖苷(APG1416) 1％；
助剂：
月桂醇 1％。
2)灭活：用β-丙内酯对乙型脑炎P3毒液进行灭活，灭活方法为：用1:4000β-丙内酯于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时。
3)抗原乳化：a,将经121℃灭菌30分钟冷却至室温的所述动物疫苗聚合物组合佐剂加入到乳化罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度为2000转/分钟；
b,将乙脑灭活抗原缓慢加入到制备的所述聚合物组合佐剂中，加入量等于动物疫苗聚合物组合佐剂质量，搅拌30分钟；
c,乳化完成后，进行标记分装，即得猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
(3)免疫接种。
基础免疫：分别对每只豚鼠腿部肌肉分点注射2ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔7天，分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒活疫苗(猪乙型脑炎病毒抗原：佐剂质量比为1：1)。
加强免疫：基础免疫后每隔7天分别对每只豚鼠腹腔注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。免疫4次。
(4)采集血清。
最后一次免疫后7天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，以蚀斑减数试验方法测定血清中和抗体效价，效价为1：2399。
实施例2猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法
(1)猪乙型脑炎病毒抗原的制备。
将乙型脑炎SA14-14-2株接种生长致密单层的传代细胞Vero细胞，37℃、5％CO2条件下进行培养，当50～75％细胞出现病变时收获毒液，作为基础免疫中的猪乙型脑炎病毒抗原。-70℃保存。
(2)猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备。
1)佐剂的选择：所采用动物疫苗的聚合物组合佐剂组成为注射用水、聚合物、乳化剂、助剂。依次将下述比例的助剂、乳化剂、聚合物组合加入到注射用水溶液中，边加入边搅拌，搅拌速度控制在为2000转/分钟，混合均匀即得聚合物组合佐剂。
注射用水溶液 93％；
聚合物组合：
壳聚糖 2％；
聚乙二醇交酯酸共聚物 2％；
聚乙二醇600 1％；
乳化剂：
月桂基葡糖苷(APG1416) 1％；
助剂：
月桂醇 1％。
2)灭活：用β-丙内酯对乙型脑炎P3毒液进行灭活，灭活方法为：用1:4000β-丙内酯于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时。
3)抗原乳化：a,将经121℃灭菌30分钟冷却至室温的所述动物疫苗聚合物组合佐剂加入到乳化罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度为2000转/分钟；
b,将乙脑灭活抗原缓慢加入到制备的所述聚合物组合佐剂中，加入量等于动物疫苗聚合物组合佐剂质量，搅拌30分钟；
c,乳化完成后，进行标记分装，即得猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
(3)免疫接种。
基础免疫：分别对每只豚鼠腿部肌肉分点注射2ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔10天，分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒活疫苗(猪乙型脑炎病毒抗原：佐剂质量比为1：1)。加强免疫：基础免疫后每隔10天分别对每只豚鼠腹腔注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。免疫4次。
(4)采集血清。
最后一次免疫后10天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，以蚀斑减数试验方法测定血清中和抗体效价，效价为1：2455。
实施例3猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法
(1)猪乙型脑炎病毒抗原的制备。
将乙型脑炎SA14-14-2株接种生长致密单层的传代细胞Vero细胞，37℃、5％CO2条件下进行培养，当50～75％细胞出现病变时收获毒液，作为基础免疫中的猪乙型脑炎病毒抗原。-70℃保存。
(2)猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备。
1)佐剂的选择：所采用动物疫苗的聚合物组合佐剂组成为注射用水、聚合物、乳化剂、助剂。依次将下述比例的助剂、乳化剂、聚合物组合加入到注射用水溶液中，边加入边搅拌，搅拌速度控制在为2000转/分钟，混合均匀即得聚合物组合佐剂。
注射用水溶液 93％；
聚合物组合：
壳聚糖 2％；
聚乙二醇交酯酸共聚物 2％；
聚乙二醇600 1％；
乳化剂：
月桂基葡糖苷(APG1416) 1％；
助剂：
月桂醇 1％。
2)灭活：用β-丙内酯对乙型脑炎P3毒液进行灭活，灭活方法为：用1:4000β-丙内酯于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时。
3)抗原乳化：a,将经121℃灭菌30分钟冷却至室温的所述动物疫苗聚合物组合佐剂加入到乳化罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度为2000转/分钟；
b,将乙脑灭活抗原缓慢加入到制备的所述聚合物组合佐剂中，加入量等于动物疫苗聚合物组合佐剂质量，搅拌30分钟；
c,乳化完成后，进行标记分装，即得猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
(3)免疫接种。
基础免疫：分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔7天，分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒活疫苗(猪乙型脑炎病毒抗原：佐剂质量比为1：1)。
加强免疫：基础免疫后每隔7天分别对每只兔进行皮下或肌肉注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，最后一次免疫接种分别对每只兔进行耳源静脉注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。免疫4次。
(4)采集血清。
最后一次免疫后7天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，以蚀斑减数试验方法测定血清中和抗体效价，效价为1：2630。
实施例4猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法
(1)猪乙型脑炎病毒抗原的制备。
将乙型脑炎SA14-14-2株接种生长致密单层的传代细胞Vero细胞，37℃、5％CO2条件下进行培养，当50～75％细胞出现病变时收获毒液，作为基础免疫中的猪乙型脑炎病毒抗原。-70℃保存。
(2)猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备。
1)佐剂的选择：所采用动物疫苗的聚合物组合佐剂组成为注射用水、聚合物、乳化剂、助剂。依次将下述比例的助剂、乳化剂、聚合物组合加入到注射用水溶液中，边加入边搅拌，搅拌速度控制在为2000转/分，混合均匀即得聚合物组合佐剂。
注射用水溶液 93％；
聚合物组合：
壳聚糖 2％；
聚乙二醇交酯酸共聚物 2％；
聚乙二醇600 1％；
乳化剂：
月桂基葡糖苷(APG1416) 1％；
助剂：
月桂醇 1％。
2)灭活：用β-丙内酯对乙型脑炎P3毒液进行灭活，灭活方法为：用1:4000β-丙内酯于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时。
3)抗原乳化：a,将经121℃灭菌30分钟冷却至室温的所述动物疫苗聚合物组合佐剂加入到乳化罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度为2000转/分钟；
b,将乙脑灭活抗原缓慢加入到制备的所述聚合物组合佐剂中，加入量等于动物疫苗聚合物组合佐剂质量，搅拌30分钟；
c,乳化完成后，进行标记分装，即得猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。
(3)免疫接种。
基础免疫：分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔10天，分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒活疫苗(猪乙型脑炎病毒抗原：佐剂质量比为1：1)。加强免疫：基础免疫后每隔10天分别对每只兔进行皮下或肌肉注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，最后一次免疫接种分别对每只兔进行耳源静脉注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。免疫4次。
(4)采集血清。
最后一次免疫后10天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，以蚀斑减数试验方法测定血清中和抗体效价，效价为1：2512。
对比例1猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法
采用实施例2制得的猪乙型脑炎病毒抗原、猪乙型脑炎病毒活疫苗和猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，对猪进行免疫接种，具体接种方法如下：
基础免疫：分别对每只乙脑抗体阴性的仔猪(40～45日龄)耳后肌肉注射1ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔10天，分别对仔猪耳后肌肉分点注射10ml猪乙型脑炎病毒活疫苗(猪乙型脑炎病毒抗原：佐剂质量比为1：1)。
加强免疫：基础免疫后每隔10天分别对每只仔猪进行耳后肌肉注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，最后一次免疫接种分别对每只猪进行耳后肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗。免疫4次。
最后一次免疫后10天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，以蚀斑减数试验方法测定血清中和抗体效价，效价为1：724。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，以豚鼠或兔作为免疫动物进行制备；
在以豚鼠为免疫动物时，免疫接种具体包括：
(1)基础免疫：分别对每只豚鼠腿部肌肉分点注射2ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔7～10天后，分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒活疫苗；
(2)加强免疫：在进行所述基础免疫后，每隔7～10天分别对每只豚鼠腹腔注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，共进行3～4次；
在以兔为免疫动物时，免疫接种具体包括：
(1)基础免疫：分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml的猪乙型脑炎病毒抗原，间隔7～10天，分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml猪乙型脑炎病毒活疫苗；
(2)加强免疫：在进行所述基础免疫后，每隔7～10天分别对每只兔皮下或肌肉注射1ml猪乙型脑炎病毒灭活疫苗，共进行3～4次，最后一次免疫接种时，分别对每只兔耳源静脉注射1ml所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗；
其中，所述猪乙型脑炎病毒抗原为传代细胞的病毒液，其具体制备过程如下：将乙型脑炎SA14-14-2株接种在Vero细胞中后，培养至50～75％细胞出现病变时收获病毒液，所述猪乙型脑炎病毒抗原的效价≥107.0PFU/ml；
所述猪乙型脑炎病毒活疫苗中含有所述猪乙型脑炎病毒抗原和佐剂；
所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备方法如下：将乙型脑炎P3株的病毒液灭活后，与佐剂混合制得，在灭活前，所述乙型脑炎P3株的病毒液的效价LD50≥10-6.52/0.03ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述免疫动物为体重350～450g的豚鼠或体重2000～3000g的兔。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭活的具体过程如下：将β-丙内酯与所述乙型脑炎P3株的病毒液按重量比1：(3800～4200)于4℃搅拌灭活22～26小时，再于37℃水浴条件下水解1.5～2.5小时，制得乙型脑炎病毒P3株灭活抗原。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂含有如下重量份组分：
注射用水溶液 90～95份；
聚合物组合：
壳聚糖 1.5～2.5份；
聚乙二醇交酯酸共聚物 1.5～2.5份；
聚乙二醇600 0.8～1.2份；
乳化剂：
烷基糖苷 0.8～1.2份；
助剂：
月桂醇 0.8～1.2份。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述猪乙型脑炎病毒灭活疫苗的制备过程包括：在1800～2200转/分钟的搅拌速度下，将所述乙型脑炎病毒P3株灭活抗原缓慢加入灭菌后的所述佐剂中进行乳化。
6.一种猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清，其特征在于，采用权利要求1～5中任一项所述的制备方法制得。
7.根据权利要求6所述的猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪乙型脑炎病毒特异性阳性血清的效价在1：2000以上。
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