CN105816873A - 一种动物疫苗的聚合物组合佐剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗佐剂，具体公开了一种动物疫苗的聚合物组合佐剂及其应用。所述聚合物组合佐剂按重量份计包括如下组分：注射用水溶液，聚合物，乳化剂及助剂。本发明所述的聚合物组合佐剂稳定且高效，与已知的疫苗佐剂相比具有安全高效的特点，易于产品工艺质量控制，具有广阔的应用前景。本发明提供的聚合物组合佐剂，易于疫苗的工业化生产。本发明中所使用的聚合物可以是水溶液或可形成颗粒结构的悬浮液，如胶囊或胶束形式。所制成疫苗的抗原可以是以储存的形式在聚合物形成的囊腔中被包裹，也可以被聚合物均匀地吸收，分布于聚合物内。

Description

一种动物疫苗的聚合物组合佐剂及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂，具体地说，涉及一种动物疫苗的聚合物组合佐剂及其应用。

背景技术

佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。佐剂对疫苗起着至关重要的作用，它能同时对抗原和机体起作用，适当运用佐剂可以调节甚至改变机体免疫系统产生抗原特异性的体液和(或)细胞免疫应答的类型。

佐剂的作用机理与机体的免疫应答过程一致，首先激活抗原提呈细胞，摄取外来抗原，处理并提呈，然后进一步活化T细胞和B细胞，通细胞因子网络的精细调节，佐剂组成可被设计为有利于增强对疫苗抗原的Th1或Th2免疫应答。

佐剂包括矿物质佐剂、油乳佐剂、微生物佐剂、细胞因子等类型。油佐剂作为是兽用生物制品中一种常用佐剂，是来源于石油工业的矿物油，成分为不能生物降解吸收的长链烷烃且含有致癌的稠环芳烃，注射后往往引起组织炎性反应，动物发热不适等副反应，从而导致免疫效果不佳甚至失败。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种动物疫苗的聚合物组合佐剂，应用该聚合物组合佐剂的疫苗具有优良的生物相容性，可有效的避免炎症、发热不适等副反应，具有很好的免疫效果。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种动物疫苗的聚合物组合佐剂，按重量份计，包括如下组分：

本发明所述的聚合物具体包括两大类：①天然聚合物，如蜂胶、淀粉、木质素、果胶、明胶、纤维素、甘露聚糖、白蛋白、甲壳素、壳聚糖等，上述聚合物经改性得到的产物也可应用于聚合物组合佐剂，如羧甲基纤维素，是天然纤维素聚合物经改性处理得到；②合成聚合物，包括化学合成和生物合成，如含乙烯亚胺，乳酸，丙烯酸，己内酯，乙二醇，丙三醇，丙内酯等单体的聚合物，如聚羟基丁酸酯(PHB)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯)、聚丙烯酸-甲基丙烯酸、聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚酯、聚乳酸、聚丙交酯、聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚谷氨酸、聚富马酸-癸二酸，聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚己内酯、聚羟丁酸、聚甘油、聚甲基丙烯酸甲酯、聚交联丙烯酸酯或聚乙二醇交酯酸共聚物等。

所述聚合物选自以上成分中的一种或几种的组合。

天然聚合物可以通过改性处理，合成聚合物可通过改变单体比例及聚合条件等措施，另外也可通过化学修饰基团或者生物活性基团修饰对聚合物进行处理，来调节聚合物对抗原的吸附、包裹的状况以及在体内的降解速度，从而来调节聚合物的免疫增强效果。合成聚合物的理化性质稳定，控制工艺条件即可得到所需规格，批间质量差异小，具有良好的生物相容性、安全性高。

本发明提供的聚合物组合佐剂，易于疫苗的工业化生产。本发明中所使用的聚合物组合佐剂可以是水溶液或可形成颗粒结构的悬浮液，如胶囊或胶束形式。所制成疫苗的抗原可以是以储存的形式在聚合物形成的囊腔中被包裹，也可以被聚合物均匀地吸收，分布于聚合物内。

作为优选，本发明所述的聚合物组合佐剂，按重量份计，包括如下组分：

进一步地，所述聚合物优选为环糊精、甘露聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚交联丙烯酸酯、聚乙二醇和聚甘油。

其中，所述注射用水溶液可以为注射用纯水、生理盐水、缓冲液或培养基缓冲液等。

所述乳化剂选自山梨醇脂肪酸酯、蔗糖酯、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯、癸基葡糖苷、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷等糖苷、甘油脂肪酸酯或聚甘油脂肪酸酯等非离子乳化剂中的一种或几种，优选为聚甘油脂肪酸酯，糖苷，山梨醇脂肪酸酯中的一种或几种。

所述助剂为碳链长度为3～22的直链或有支链的脂肪酸或脂肪醇。

所述脂肪酸选自硬脂酸、异硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、月桂酸、蓖麻醇酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、琥珀酸中的一种或多种。

所述脂肪醇选自丙二醇，丙三醇，正辛醇，正壬醇，正癸醇，十一烷醇，十二烷醇(月桂醇)，十四烷醇(鲸蜡醇)，十八烷醇(硬脂醇)，二十烷醇(花生醇)，二十二醇中的一种或几种的混合物。

作为优选，所述助剂选自丙二醇、丙三醇、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂醇、十四烷醇或十八烷醇中的一种或几种，优选为硬脂酸，丙二醇，丙三醇、十二烷醇(月桂醇)中的一种或几种。此类助剂有助于聚合物在溶液中溶胀分布，提高对疫苗抗原的吸附能力。

第二方面，本发明提供了所述的聚合物组合佐剂的制备方法，依次将助剂、乳化剂、聚合物组合加入到注射用水溶液中，混合均匀即得聚合物组合佐剂。

进一步地，所述助剂、乳化剂、聚合物加入到注射用溶液的过程中，边加入边搅拌，搅拌速度控制在为2000转/分以内。

更进一步地，混合过程中可进行加热，温度控制在40～80℃。

上述制备方法简单可控，有利于大规模工业化生产和产品工艺质量控制。

第三方面，本发明提供一种含有前述聚合物组合佐剂的动物疫苗。

所述动物疫苗为可以单苗或至少两种疫苗的联苗。

本发明提供的佐剂格外适用禽用疫苗、圆环疫苗、支原体疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗和口蹄疫疫苗。

禽用疫苗包括但不限于禽流感疫苗、鸡新城疫灭活疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗或上述疫苗的联苗。

猪用疫苗包括猪口蹄疫灭活疫苗、猪圆环病毒疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪链球菌双价灭活菌苗、副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗、猪支原体灭活疫苗或上述疫苗的联苗。

牛用疫苗包括牛口蹄疫灭活疫苗、牛沙门氏菌灭活苗或上述疫苗的联苗。

基于本发明所述的动物疫苗聚合物组合佐剂，所制备的疫苗具有安全高效的优点。

本发明还提供了上述动物疫苗的制备方法，所述方法优选包括如下步骤：

(1)将所述聚合物组合佐剂加入到疫苗制备罐中，搅拌混合均匀，控制搅拌速度至2000转/分以下；

(2)经121℃灭菌30分钟冷却至25℃；

(3)将动物疫苗水相抗原缓慢加入的所述聚合物组合佐剂中，聚合物组合佐剂的量为动物疫苗抗原质量的1～50％，搅拌均匀；

完成后，进行标记分装，即得动物疫苗。

本发明的有益效果在于：

本发明所述聚合物组合佐剂稳定且高效，与已知的疫苗佐剂相比具有安全高效的特点，易于产品工艺质量控制，具有广阔的应用前景。

本发明提供的聚合物组合佐剂，易于疫苗的工业化生产。本发明中所使用的聚合物可以是水溶液或可形成颗粒结构的悬浮液，如胶囊或胶束形式。所制成疫苗的抗原可以是以储存的形式在聚合物形成的囊腔中被包裹，也可以被聚合物均匀地吸收，分布于聚合物内。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所涉及的聚合物组合佐剂疫苗指标检测的相关说明如下：

1.稳定性测试

制备的疫苗在4～8℃条件下放置2年稳定有效；常温25℃条件下放置一年稳定有效。

2.无菌检测

酪胨10g，肉浸液1000ml，氯化钠5g，15～20g琼脂，取酪胨和氯化钠，琼脂加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。接种疫苗与培养基后经30～35℃培养48小时，观察结果无菌。

2.动物安全性和免疫效果评价内容如下：

a.用体重18—22g的小白鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5ml。连续观察7日，观察临床反应。

实验结果：动物存活100％，未见发热等副反应，未出现异常症状，疫苗注射部位未见肉芽肿或炎症反应。

b.效力试验

将本发明所述佐剂动物疫苗免疫评价动物，动物接种疫苗后无异常反应，根据需要进行采血测试抗体水平。

实施例1

实施例1用于说明本发明所述的聚合物组合佐剂。

组成及质量百分比如下：

1、注射用水溶液90％；

2、聚合物组合：

聚乙烯吡咯烷酮2％；

聚乳酸-羟乙酸(PLGA)3％；

聚乙二醇60001％；

3、乳化剂：

烷基糖苷(癸基葡糖苷)(APG0816)2％；

聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯1％；

4、助剂：

鲸蜡醇1％。

实施例2

实施例2用于说明本发明所述的聚合物组合佐剂。

组成及质量百分比如下：

1、注射用水溶液99.9％；

2、聚合物组合：

羧甲基纤维素0.05％；

聚丙交酯乙交酯(PLCG)0.05％。

实施例3

实施例3用于说明本发明所述的聚合物组合佐剂。

组成及质量百分比如下：

1、注射用水溶液94％；

2、聚合物组合：

甘露聚糖2％；

聚羟基丁酸酯(PHB)1％；

聚乙二醇80001％；

3、乳化剂：

聚甘油脂肪酸酯1％；

4、助剂：

丙二醇1％。

实施例4

实施例4用于说明本发明所述的聚合物组合佐剂。

组成及质量百分比如下：

1、注射用水溶液93％；

2、聚合物组合：

环糊精2％；

聚乙二醇交酯酸共聚物2％；

聚乙二醇6001％；

3、乳化剂：

烷基糖苷(月桂基葡糖苷)(APG1416)1％；

4、助剂：

月桂醇1％。

实施例5

实施例5用于说明本发明所述的聚合物组合佐剂。

组成及质量百分比如下：

1、注射用水溶液92％；

2、聚合物组合：

聚己内酯3％；

聚富马酸-癸二酸2％；

水溶性淀粉1％；

3、乳化剂

聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯1.5％；

烷基糖苷(APG0812)0.5％。

实施例6

实施例6用于说明本发明所述的聚合物组合佐剂。

组成及质量百分比如下：

1、注射用水溶液65％；

2、聚合物组合：

3、乳化剂

聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯10％；

烷基糖苷(APG0816)2％；

4、助剂

丙二醇3％。

实施例7

本实施例用于说明实施例1-6所述聚合物组合佐剂的制备方法，具体如下：

按比例称取定量的助剂、乳化剂、聚合物，依次加入到称量好的注射用溶液中，控制搅拌速度，进行混合，混合过程中可采取加热助溶的方式，温度控制在80℃以下，混合均匀成液体即得动物疫苗油佐剂。

实施例8

本实施例用于说明含有本发明所述聚合物组合佐剂的动物疫苗。

实验组：

本实施例以猪圆环疫苗为例，制备方法具体如下：

根据上述实施例6的配方，按实施例7所述方法制备成动物疫苗聚合物组合佐剂佐剂，经121℃灭菌15分钟冷却至25℃，取500ml加入到疫苗混合罐中，搅拌速率控制2000转/分钟条件下，将生产用符合标准猪圆环抗原500ml缓慢加入搅拌混合罐中，搅拌混合5分钟制备成猪圆环疫苗，分装标记后待检测。放置24小时后进行物理指标检测和动物实验。

对照试验：

对照组：对市售矿物油佐剂采用同样抗原同样比例进行剪切乳化，制备疫苗，分装标记为20140911A待检验。

实验例1

本实验例用于说明含有本发明所述聚合物组合佐剂的动物疫苗的指标检测，相关说明如下：

1.稳定性测试

将实施例8所述方法制备的实验组猪圆环疫苗在2～8℃中放置2年稳定。

市售佐剂所制备的圆环疫苗20140911A(对照组)在2～8℃中放置2年稳定，在37℃中放置10天未见破乳，经4000转/分离心15分钟未见出油出水。

2.无菌检测

酪胨10g，肉浸液1000ml，氯化钠5g，15～20g琼脂，取酪胨和氯化钠，琼脂加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。接种制备的实验组和对照组疫苗与培养基后经30～35℃培养48小时，观察结果均无菌。

3.动物免疫评价

评价内容如下：动物接种疫苗后无异常反应，在规定的时间采血分离血清，检测血清抗体效价。

实验组：本发明实施例8的猪圆环疫苗；

对照组：实验批号为20140911A的猪圆环疫苗；

空白对照组：不注射任何疫苗。

a.动物安全性试验

1.用体重350—450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml：用体重18—22g的小白鼠5只，每只皮下注实验组和对照组疫苗0.5ml。连续观察7日，观察均无异常临床反应。

b.抗体检测

实验方法：

按照规程要求进行动物免疫：用5～6周龄PCV2ELISA抗体阴性、健康雌性清洁级Balb/c(PCV2ELISA抗体效价不高于1:50)15只，分成三组，每组5只，第1组和第2组分别皮下接种本发明提供的实验组猪圆环聚合物组合佐剂疫苗和对照组疫苗(20140911A)，每只0.2毫升，第3组不接种，为空白对照。各组小鼠均隔离饲养观察。分别在免疫后1周，2周，3周，4周，5周采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体效价。对照组应全部为阴性，本发明提供的聚合物组合佐剂组平均抗体效价均高于对照组20140911A，且在免疫后一周即出现较高抗体。具体数据如表1所示。

表1动物免疫评价结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种聚合物组合佐剂，其特征在于，按重量份计，包括如下组分：

所述聚合物选自天然聚合物和/或合成聚合物。

2.根据权利要求1所述的聚合物组合佐剂，其特征在于，按重量份计，包括如下组分：

3.根据权利要求1或2所述的聚合物组合佐剂，其特征在于，所述聚合物为环糊精、甘露聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚富马酸-癸二酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚交联丙烯酸酯、聚乙二醇和聚甘油中一种或几种。

4.根据权利要求1或2所述的聚合物组合佐剂，其特征在于，所述乳化剂选自山梨醇脂肪酸酯、蔗糖酯、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯、癸基葡糖苷、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷等糖苷、甘油脂肪酸酯或聚甘油脂肪酸酯等非离子乳化剂中的一种或几种，优选为聚甘油脂肪酸酯，糖苷，山梨醇脂肪酸酯中的一种或几种。

5.根据权利要求1或2所述的聚合物组合佐剂，其特征在于，所述助剂为碳链长度为3～22的直链或有支链的脂肪酸或脂肪醇。

6.根据权利要求5所述的聚合物组合佐剂，其特征在于，所述助剂选自丙二醇、丙三醇、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂醇、十四烷醇或十八烷醇中的一种或几种，优选为硬脂酸，丙二醇，丙三醇、月桂醇中的一种或几种。

7.权利要求1～6任一项所述的聚合物组合佐剂的制备方法，其特征在于，将助剂、乳化剂和聚合物，依次加入到注射用水溶液中，混合均匀即得聚合物组合佐剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述助剂、乳化剂和聚合物依次加入到注射用水溶液，边加入边搅拌，搅拌速度为控制在2000转/分钟。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，混合过程中可进行加热，温度控制在40～80℃。

10.一种动物疫苗，其特征在于，含有权利要求要求1～6任一项所述的聚合物组合佐剂。