NL8700892A - Immunologische adjuvantia en immunologische systemen die deze adjuvantia bevatten. - Google Patents

Description

·* * .

* immunologische adjuvantia en .immunologische systemen die deze adju- vantia bevatten.

Deze uitvinding heeft in het algemeen betrekking op nieuwe immunologische adjuvantia voor polysaccharide vaccins. Een ander aspect van deze uitvinding heeft betrekking op nieuwe immuunsystemen die polysaccharide antigenen gecombineerd met bepaalde biologische 5 adjuvantia in lipide emulsiesystemen of op oliedruppels bevatten.

Weer een ander aspect van de uitvinding is gericht op een methode waarmede polysaccharide antigenen meer immunogeen worden gemaakt indien ze met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden gecombineerd.

10 Voor de onderhavige uitvinding was in de literatuur ver meld dat polysaccharide antigenen voornamelijk IgM antilichamen met weinig of geen IgG response stimuleerden. Bovendien was een amnasti-sche respons of immunologisch geheugen moeilijk met polysaccharide antigenen bij proefdieren en mensen te verkrijgen. Dientengevolge was 15 de immuniciteit die door toepassing van polysaccharide antigenen werd geïnduceerd van korte duur. Bovendien bleken de polysaccharide vaccins niet erg immunogeen bij jonge kinderen te zijn. Daardoor bestond de behoefte aan een methode waarmede polysaccharide antigenen meer immunogeen gemaakt zouden kunnen worden om aldus meer de vorming van.

20 antilichamen, waaronder een IgG response en immunologisch geheugen, te stimuleren.

In algemene zin is de onderhavige uitvinding gericht op nieuwe immunologische adjuvantia voor polysaccharide antigenen, methoden voor het bereiden van dergelijke adjuvantia en op de toepassing 25 ervan om polysaccharide antigenen meer immunogeen te maken.

De uitvinding zoals hiervoor aangegeven is gericht op nieuwe immunologische adjuvantia voor polysaccharide antigenen, methoden voor de bereiding en toepassing ervan. Het immunologische adju-vans dat bruikbaar is voor de vergroting van de immuunrespons tegen 30 polysaccharide antigenen omvat: (1) Een emulsiesysteem gekozen uit de groep bestaande uit: (A) een lipide emulsiesysteem (LES) dat bevat: (a) een metaboliseerbare olie, (b) een polyol met laag molecuulgewicht en 35 (c) lecithine, of (B) een olie in water emulsiesysteem (O/W) dat bevat: 5700892 * -ϊ - 2 - (a) een lichte, niet bioontleedbare koolwaterstofolie of een bioontleedbare olie en (b) een wasactief middel, (2) een gezuiverd, ontgift endotoxine (RDE) en desgewenst, 5 (3) trehalosedimycolaat, (TDM).

De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een methode waarmede polysaccharide antigenen meer immunogeen gemaakt kunnen worden indien ze met bepaalde biologische adjuvantia in een bioont-leedbaar lipide emulsiesysteem of in een olie-in-water emulsiesysteem 10 worden gecombineerd. De immuunresponsen opgewekt door de poly saccharide antigenen en de adjuvantssystemen volgens deze uitvinding verschillen in vele opzichten van de responsen die door het antigeen alleen worden geïndüceerd. Waargenomen werd dat het met adjuvantia behandelde antigeen een grotere antilichaamproduktie stimuleert, zoals 15 gemeten aan de hand van hogere titers, dan door het antigeen alleen kan worden geïndiceerd. Bovendien stimuleert het met adjuvantia behandelde antigeenmengsel de vorming van antilichamen van de IgG-klasse met een hogere titer dan met het antigeen alleen werd verkregen. Eveneens werd waargenomen dat het met adjuvantia behandelde 20 antigeenmengsel volgens de onderhavige uitvinding een immunologisch geheugen opwekt, zoals blijkt uit een hogere antilichaamrespons volgende op een tweede injectie van antigeen dan verkregen wordt na primaire immunisatie.

Voor de onderhavige uitvinding waren geen adjuvantia van 25 enig type bekend als doeltreffende immunopotentiatoren van zuivere polysaccharide antigenen. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een methode voor het vergroten van de immunogeniciteit van polysaccharide antigenen, welke hiervoor niet bestond. Dientengevolge zijn de adjunvantia van de onderhavige uitvinding bruikbaar voor het stimu-30 leren van zowel primaire als secundaire (dat wil zeggen geheugen) immuunresponsen van warmbloedige dieren op vaccins die polysaccharide antigenen uit vele bronnen bevatten. Zo vallen bijvoorbeeld onder de polysaccharide antigenen die met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden toegepast die welke gezuiverd zijn uit de 35 capsules van bacteriën, zoals Streptococcus pneumoniae, Neisseria me ningitidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, of Hemophilus influenzae .Andere polysaccharide antigenen, zoals die welke verkregen kunnen worden uit capsules of celwanden van fungi of de celwanden van 8700392 - 3 - * i gram-positieve en gram-negatieve bacteriën kunnen eveneens met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast. De enige eis die aan het polysaccharide antigeen wordt gesteld is dat de immuunrespons die door een dergelijk antigeen wordt opgewekt een 5 respons is die door de aanwezigheid van een geschikt biologisch adju- vans kan worden verhoogd.

Zoals reeds eerder werd vermeld, is van vele polysaccharide antigenen bekend dat ze het immuunsysteem stimuleren. De opgewekte respons is echter voornamelijk van antilichamen van het IgM-type, 10 zonder het vermogen een immunologisch geheugen voor een secundaire respons te induceren. Zo wordt volgens de onderhavige uitvinding een emulsie (met LES of O/W) gevormd die het polysaccharide antigeen en biologisch adjuvans bevat. Dit leidt tot de presentatie van het antigeen in deeltjesvorm aan cellen van het immuunsysteem, een langzame 15 antigeen.-afgifte aan het immuunsysteem én een stimulering van voorouder cellen die betrokken zijn bij de immuunrespons.

Zoals hiervoor reeds werd vermeld bevat het immunologische adjuvans volgens de onderhavige uitvinding twee bestanddelen. Het eerste bestanddeel is hetzij een lipide emulsiesysteem (LES) of een 20 olie-in-water emulsiesysteem (O/W). Het tweede bestanddeel is één of een aantal gezuiverde, ontgifte, endotoxine biologische adjuvantia.

Het lipide emulsiesysteem (LES) bevat een metaboliseerbare olie, een polyol met laag molecuulgewicht en lecithine. In de praktijk is gebleken dat de metaboliseerbare olie die in het LES wordt toegepast 25 bij voorkeur een hogere olie is die voornamelijk uit diglyceriden en triglyceriden van oliezuur en linolelnezuur bestaat. Bijzonder aanbevolen worden de hogere plantaardige oliën, zoals die welke aanwezig zijn in, of verkregen worden uit, aardnotenolie, zonnebloemzadenolie, saffloerzadenolie, maïsolie enzovoorts. Andere oliën, zoals olijfolie, 30 katoenzaadolie of squaleen ^kunnen eveneens in de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast. Het verdient dus aanbeveling dat de olie metaboliseerbaar is, verenigbaar is met de bestanddelen van het emulsiesysteem en het bacteriële adjuvans zelf en doeltreffend is in combinatie met de andere bestanddelen voor het verhogen van 35 de immuunrespons tegen polysaccharide antigenen.

In de praktijk kan een grote verscheidenheid van polyolen in het lipide emulsiesysteem worden toegepast. De gebruikte polyolen zijn polyolen met laag molecuulgewicht die vloeibaar zijn, gemengd kun- 8700392 -ί ·* - 4 - nen worden met de metaboliseerbare olie en waarin het lecithine-be-standdeel oplosbaar is.'Onder geschikte polyolen vallen onder andere: ethyleen-glycol, 1,2-propaandiol, 1,3-propaandiol, glycerine, 1,4-bu-taandiol, 1,3-butaandiol, 1,2,4-butaantriol, 1,5-pentaandiol enzovoort. 5 Zoals reeds werd vermeld, is het derde bestanddeel van het lipide emulsiesysteem lecithine. De in deze beschrijving en de daarna volgende conclusies toegepaste uitdrukking "lecithine" beoogt elke groep fosfolipiden met de algemene formule 1. te omvatten, waarin en vetzuren zijn die maximaal 22 koolstofatomen bevat-10 ten en R^ choline is. Deze fosfolipiden zijn gewoonlijk een mengsel van de diglyceriden van stearinezuur, palmitinezuur,lino.leinezuur of linoleenzuur vetzuren die met de choline-ester van fosforzuur zijn gebonden.

In de praktijk is gebleken dat het niet-waterige gedeelte 15 van het lipide emulsiesysteem bij voorkeur ongeveer 30 tot ongeveer 60 gew.% van de metaboliseerbare olie, ongeveer 30 tot ongeveer 60 gew.% polyol en ongeveer 1 tot ongeveer 15 gew.% lecithine zal bevatten.

Ter illustratie van de bereiding van het lipide emulsie-20 systeem wordt één deel (10 gram) steriel lecithine opgelost in 10 delen (100 gram) witte glycerine door op een hete plaat onder roeren met een magneetstaaf zachtjes te verhitten op 60°C. Voor het gebruik was de glycerine geleid door een 0,2 micrometer filtereenheid teneinde deze vloeistof te steriliseren. Daarna werd het mengsel van glycerine 25 en lecithine geplaatst in een steriele mengkop en voegde men langzaam 10 delen aardnotenolie (100 gram, gesteriliseerd met behulp van een 0,2 micrometer filter) langzaam aan het mengsel van glycerine en lecithine toe onder mengen met matige snelheid.

Zoals hiervoor reeds werd opgemerkt, kan het eerste bestand-30 deel van het immunologische adjuvans. een olie-in-water (0/W) emulsie systeem in plaats van het lipide emulsie-systeem zijn. Dit 0/W system, kan een metaboliseerbare olie,, zoals squaleen, of een niet-metaboli-seerbare olie, zoals squalaan, een lichte minerale olie, 7-n.-hexyl-octadecaan, Conoco superolie of Drakeol 6 VR minerale olie (een pro-35 duct van de Pennreco Company, Butler, Pa.) bevatten. De olie-in-water emulsie bevat eveneens een wasactief middel. De hoeveelheid van dit middel ligt typerend tussen ongeveer 0,02 en 0,20, bij voorkeur tussen ongeveer 0,10 en 0,20, volumeprocent, ten opzichte van het wateri- 87Q08S2 ^ * - 5 - ge gedeelte van de emulsie. Elk gebruikelijk wasactief middel kan worden toegepast, waaronder Tween-80 en Arlacel (een product van Atlas Chemical Company). De olie zal tussen ongeveer 0,5 en 3% van het totale volume van de emulsie uitmaken. De in het lipide emulsiesysteem en 5 in het olie-in-water systeem toegepaste bestanddelen zijn natuurlijk erg zuiver en van een farmaceutisch aanvaardbare kwaliteit.

Het tweede bestanddeel van het immunologische adjuvans is een gezuiverd, ontgift, bacterieel adjuvans, zoals gezuiverd, ontgist endotoxine. Het ontgifte endotoxine, hierna eveneens aangeduid 10 als RDE, wordt verkregen uit SE mutant stammen Salmonella. Het ontgifte endotoxine kan eveneens worden verkregen uit andere enterobac-teriaciae, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.436.728. Het ontgifte endotoxine kan eveneens synthetisch en volgens genetische manupulatietechnieken worden verkregen. Een ander aspect 15 van. het tweede bestanddeel vormt het desgewenst toevoegen van trehalose dimycolaat (TDM). TDM kan uit elke mycobacterie worden verkregen, waarvan genoemd kan worden M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (de stammen H37RV en Ayoma B), M. bovis - BCG, M. smegmatis, M. kansaii, of M. bovinis, doch TDM kan eveneens worden verkregen uit Nocardia 20 rubra en Corynebacterium diphtheriae. TDM kan eveneens worden bereid volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.505.900.

Het bereiden van de polysaccharide vaccins onder opneming van LES geschiedt als volgt: het tweede bestanddeel(en) (RDE en desgewenst TDM) opgelost in een mengsel van chloroformen methanol (4:1) 25 wordt gebracht in een steriel vat en het oplosmiddel wordt in een stroom steriele stikstof verdampt. Aan het tweede bestanddeel(en) wordt polysaccharide antigeen in een steriele zoutoplossing toegevoegd, waarna innig wordt gemengd. In de praktijk worden op ongeveer drie volumen van het polysaccharide antigeen bacteriële adjuvans meng-30 sel één volume van het LES mengsel dat op de hiervoor beschreven wijze was bereid toegevoegd en dit waterige-oliemengsel wordt gemengd in een vortex-machine of in een menginrichting totdat een witte, melkachtige emulsie wordt verkregen. Het mengen van de twee bestanddelen onder vorming van de emulsie wordt gewoonlijk uitgevoerd in 2 tot 35 5 minuten. De concentratie van het polysaccharide antigeen in de uiteindelijke emulsie is ongeveer 0,1 tot 1000 microgram per 0,2 ml; de concentratie van RDE ligt tussen ongeveer 25 en ongeveer 200 microgram per 0,2 ml en de concentratie van TDM, indien aanwezig, is tussen 8700892 J ^ - 6 - ongeveer 50 en 400 microgram per 0,2 ml gelegen.

Hoewel de optimale verhouding van de twee fasen van de LES-bevattende vorm van het immunologische adjuvans ongeveer drievolumai van het polysaccharide antigeen-ontgifte bacteriële adjuvans zoutop-5 lossing tot ongeveer één volume van het lipide emulsiesysteem bedraagt, kan de verhouding van het lipide emulsiesysteem tot de antigeen-adju-vans-oplossing variëren van ongeveer 1 tot 1 tot ongeveer 1 tot 8, waarbij een verhouding van ongeveer 1 tot 3 wordt aanbevolen.

Een toelichting van het olie-in-water systeem is de volgen-10 de; 5 mg RDE en 10 mg TDM, elk opgelost in een mengsel van chloroform en methanol (4:1), worden gebracht in een weefsel-homogenisator van 350 ml (Bellco). Het oplosmiddel wordt met een stroom steriele stikstof uit het RDE—TDM mengsel verdampt. Dit wordt gevolgd door toevoeging van 2 ml steriele olie (Drakeol 6 VR minerale olie /Pennreco Com-15 pany, Butler, Pa7, lichte minerale olie, squalaan, squaleen, 7-n.- hexyloctadecaan) en het mengsel wordt gehomogeniseerd gedurende 1 minuut onder toepassing van een met een motor aangedreven stamper, totdat een consistentie van een olie-pasta wordt verkregen. Daarna worden 98 ml van een 0,2%-ige oplossing van Tween-80 in een zoutoplossing 20 in de homogenisator gebracht. Onder toepassing van een door een motor aangedreven stamper wordt het mengsel daarna verder gehomogeniseerd gedurende ongeveer 4 tot 5 minuten, totdat een emulsie wordt verkregen.

Aan de vloeibare emulsie wordt een geschikte hoeveelheid polysaccharide antigeen in water toegevoegd, waarna wordt gemengd door 25 herhaalde malen aan te zuigen en te injecteren onder toepassing van een injectiespuit en een naald van 20 gauge, gedurende tenminste twee minuten, totdat de verkregen emulsie een troebel-melkachtig uiterlijk heeft.

De olie-in-water emulsie kan desgewenst worden gelyofili-30 seerd door 5 ml te brengen in een 10 ml Wheaton serumflesje. Het fles je wordt bevroren in een Revco vriesinrichting bij een temperatuur van -95°C en gelyofiliseerd in een steriele houder met een Labconoco vriesdroger. Onder toepassing van een steriele techniek wordt het flesje vervolgens afgesloten. De gelyofiliseerde RDE-TDM emulsie 35 wordt weer terug verkregen door injectie van 5 ml steriel water dat de gewenste concentratie van het polysaccharide antigeen bevat. Het wordt geemulgeerd door herhaalde malen aan te zuigen en te injecteren met behulp van een injectiespuit gedurende tenminste twee minuten tot 8700392 'i - 7 - dat de verkregen emulsie een troebel-melkachtig uiterlijk heeft verkregen.

Volgens elk van de hiervoor genoemde werkwijzen (dat wil zeggen LES of o/W) worden emulsies van de waterige polysaccharide an-5 tigeenoplossing verkregen hetgeen tot een langzame afgifte van het antigeen, een verlenging van de antigeenstimulering en een cellulaire stimulering verwant aan het antigeen dat geïnduceerd is door de ont-gifte bacteriële adjuvans-(tia) leidt.Deze combinatie van activiteiten vergroot de respons van de gastheer voor het antigeen, zoals duide-10 lijk uit de tabellen van de voorbeelden blijkt.

Zoals hiervoor reeds werd aangegeven, kunnen de immunologische adjuvans-(tia) desgewenst behalve het gezuiverde, ontgifte endotoxine trehalosedimycolaat bevatten. Zoals vermeld in het Amerikaanse octrooischrift 4.505.900 kan trehalosedimycolaat (TDM) worden 15 verkregen uit organismen zoals bijvoorbeeld M. avium, M. phlei, M.tuberculosis (stam H 37 RV en Ayoma B), M.bovis BCG, M. smegmatis, M.kansaii, Nocardia rubra, M.bovinis en Corynebacterium diphteriae.

Men laat bacteriën, zoals M.avium groeien, oogst ze en } doodtze daarna onder verhitting. Vervolgens wordt de celmassa geextra-20 heerd met verschillende oplosmiddelen, hetgeen tot de isolatie van een actieve, in oplosmiddel oplosbare fractie leidt.Deze fractie wordt verder gezuiverd met behulp van een reeks extracties met oplosmiddelen, ter verkrijging van ruw TDM. (Zie Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell 25 Wall Skeleton and Component P3; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, deel 52, biz. 95-101, 1974). Zoals beschreven in het artikel van Azuma en medewerkers, kan het ruwe TDM daarna verder worden gezuiverd door centrifugale microdeeltjesvormige silicagelchroma-tografie, waardoor gezuiverd TDM wordt verkregen. Het zuiveren van 30 TDM kan eveneens geschieden volgens de methode beschreven in de samenhangende octrooiaanvrage met het serial nummer 372.843, ingediend op 29 april 1982, op dezelfde naam.

Bij toepassing in het adjuvans - systeem wordt het trehalose -dimycolaat toegepast in een concentratie van ongeveer 50 tot ongeveer 35 5000 microgram per milliliter, bij voorkeur ongeveer 250 tot ongeveer 2000 microgram per milliliter.

Zoals hiervoor reeds werd toegelicht, verhogen de immunologische adjuvantia van de onderhavige uitvinding gemengd met verschil- 8700392 - 8 - lende polysaccharide antigenen de immuunrespons tegen dergelijke an-tigenen en zijn dus bruikbaar in een reeds vaccins voor zowel veterinaire als humane gastheren. In de praktijk is gebleken dat het gezuiverde, ontgifte endotoxine wordt toegepast in een concentratie van on-5 geveer 25 tot ongeveer 200 microgram per dosis^waarbij een speciaal verhoogde immuunrespons wordt opgewekt bij ongeveer 100 microgram per dosis. De trehalose.dimycolaten worden bij voorkeur toegepast in een concentratie van ongeveer 50 tot ongeveer 400 microgram per dosis.

Desgewenst kunnen andere bestanddelen of toevoegsels teza-10 men met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast. In de hierna volgende voorbeelden werden de passieve hemaggluti-nine proeven onder toepassing van dextran en SSS III polysacchariden als volgt uitgevoerd:

Voorschrift voor de passieve hemagglutinatie (HA) proef 15 onder toepassing van dextran.

Men waste 5 ml rode bloedcellen van schapen (SRBC) in Alsever's oplossing 5 malen in een zoutoplossing. Men loste palmitoyl-dextran op in een zoutoplossing in een concentratie van 1 mg/ml en voegde 0,5 ml (500 ^ig palmitoyl-dextran) toe aan 5 ml van een 10%-ige 20 gewassen SRBC-oplossing. Dit mengsel werd goed gemengd en 30 minuten geïncubeerd bij 37°C. De dextran-SRBC oplossing werd 5 malen gewassen in een zoutoplossing en daarna werden de cellen weer gesuspendeerd in een concentratie van 10%.

Onder toepassing van een microtiterplaat met een V-bodem 25 en 96 holten werden serummonsters in tweevoudige stappen verdund onder toepassing van een 0,5%-ige runderserium albumine (BSA) zoutbuffer.

Het eindvolume in elke holte was 50 ƒ,1. Aan elke holte werden 50 ƒ1 0,5% dextran SRBC toegevoegd. De platen werden een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd.

30 Aan een identiek stel microtiterplaten werden 50 ƒ1 0,1M

2-mercaptoethanol toegevoegd na de verdunning van de serummonsters en dit werd daarna gevolgd door toevoeging van 50 ƒ11 van het met dextran beklede SRBC.

Voorschrift voor de passieve hemagglutinatie (HA) proef 35 onder toepassing van SSS III polysaccharide.

Men waste 5 ml rode bloedcellen van schapen (SRBC) 5 malen in een zoutoplossing (0,85%). Men loste- SSS III polysaccharide op in 8700392 Ί - 9 - een zoutoplossing tot 1 mg/ml. Men voegde aan 0,5 ml gepakte SRBC toe: 1) 1 ml van een zoutoplossing en 2) 1 ml SSS III in een zoutoplossing (lOOO^ig). Het mengsel werd zachtjes in werveling gebracht en onder voortzetting van deze handeling druppelde men 1 ml van een 0,1%-5 ige chromichloride (CrCl^.öH^O) oplossing in een zoutoplossing toe.

Men liet het mengsel 5 minuten staan bij kamertemperatuur. Het met SSS

III beklede SRBC werd Emalengevassen ineen zoutoplossingen weer gesuspen- /» deerd als een 10%-ige celsuspensie in een zoutoplossing.

Het serum van individuele muizen in elke groep werd ver-10 dund in tweevoudige stappen in holten van een microtiterplaat met V-bodem en 96 holten. De aanvangsverdunning was 1:10 en het eindvolume van het verdunde serium per holte bedroeg 50 jil.

Men voegde aan elke holte die het verdunde serum bevatte 50 jxl met SSS III-bekleed SRBC (0,5%-ige celsuspensie) toe en incubeer-15 de de platen een nacht bij kamertemperatuur. Aan een identieke reeks raicrotiterplaten voegde men, na verdunning van de serummonsters, 50ƒ11 0,1M 2-mercaptoethanol toe, gevolgd door 50 ƒ.1 van het beklede SRBC.

In de hierna volgende voorbeelden werden dextran, palmitoyl-20 dextran en polysaccharide (SSS III) in capsulevorm van het type III Streptococcus pneumoniae verschaft door Dr. P.J, Baker van het N.I.H. Laboratory of Microbial Immunity, Bethesda, Maryland.

De volgende voorbeelden lichten de onderhavige uitvinding toe: 25 Voorbeeld 1.

Bij deze proef diende men BALB/C muizen (6 muizen per groep) een subcutane injectie (0,2 ml/dier) van het volgende toe: groep 1, 100 ^zg dextran in een zoutoplossing? groep 2, 100 ^zg dextran + 50 jig RDE in een zoutoplossing; groep 3, 100 ^ig dextran + 50 ^ig 30 RDE in een zoutoplossing geemulgeerd in een gelijk volume LES lipide emulsie; groep 4, 100 ^ig dextran geemulgeerd in een flesje dat gelyo- filiseerde olie-in-water emulsie van 50 jig RDE + 50 jig TDM/dosis bevatte; groep 5 ontving geen antigeen.

6

Op de 20 -dag na de primaire immunisatie ontvingen alle 35 muizen in elke groep een tweede injectie, die op dezelfde wijze als de eerste injectie was bereid.

Individuele serummonsters werden verzameld door een reeks bloedingen op verschillende tijden na de immunisatie.

8700892 - 10 -

De verkregen resultaten zijn vermeld in tabel I:

Tabel I

Passieve hemagglutinine (HA) titers van sera van muizen geïmmuniseerd met het polysaccharide antigeen Dextran al-5 leen of gecombineerd met RDE en andere adjuvantia in ver- _schillende typen oplossingen

Recipro'ke HA titers (dagen na immunisatie)

Groep behandeling 6 16 30 48 10 1 Dextran3, . 163 (15)b 340(33) 672(54) 240(60) 2 Dextran+RDE 800(50) 1228(126) 2368(248) 1386(168) 3 Dextran+RDE+(LES) 928(76) 2668(660) 3200(400) 2816(232) 4 Dextran+RDE+TDM 373(10) 1120(88) 1813(173) 1493(163) (olie-in-water) 15 5 Geen 20(10) 40(20) 40(20) 10(10) a Alle groepen die antigeen ontvingen werden op de dag 0 en 20 subcu-taan geïnjecteerd.

b De resultaten zijn uitgedrukt in de gemiddelde reciproke titer voor elke groep. Die beginverdunning voor elk serummonster was 1:10.

20 De getallen tussen haken zijn de gemiddelde titers van de sera behan deld met 0,1M 2-mercaptoethanol. Deze geven IgG responsen weer.

Voorbeeld 2.

Bij deze proef werden BALB/C muizen subcutaan geïnjecteerd (0,2 ml) met polysaccharide antigeen (0,5 ^ig/muis) alleen of gecombi-25 neerd met RDE adjuvans en wel op de volgende wijze: groep 1, SSS III

werd toegediend als een waterige oplossing, groep 2, SSS III waterige oplossing werd geemulgeerd in een flesje dat een olie-in-water emulsie van RDE (50 ^ig/muis) en TDM (50 ^rg/muis) -bevatte, groep 3, SSS III waterige oplossing werd toegevoegd aan RDE (100 ^ig/muis) in een 30 waterige oplossing en het mengsel werd toegevoegd aan een gelijk vo lume van LES en geemulgeerd. Groep 4, waterige SSS III werd toegevoegd aan waterige RDE (50 ^ig/muis) en gemengd met een gelijk volume aluminiumhydroxydegel (Alhydrogel), terwijl groep 5 niet geïmmuniseerd werd.

35 Alle groepen bevatten 10 muizen die 6-8 weken oud waren.

Aan de muizen in elke groep werd een tweede subcutane injectie op dag 21 toegediend, bestaande uit SSS III (0,5 ^ig/muis) geemulgeerd in 87 0 0 3 9 2' - 11 - RDE-TDM olie-in-water emulsie. De tussen haken gegeven getallen geven de gemiddelde titer van deze zelfde sera na behandeling met 0,1M 2-mercaptoethanol weer.

De verkregen resultaten zijn vermeld in de hierna volgende 5 tabel II:

Tabel II

Passieve hemagglutinine (HA.) titers van sera van muizen die geïmmuniseerd zijn met 0,5 ^ig pneumococcaal polysaccharide antigeen (SSS III) alleen of gecombineerd met RDE en 10 andere adjuvantia.

Reciproke waarden van" HA-ti-ters (dagen na immunisering)

Groep behandeling 7 14 28 42 1 SSS IIia 240(28)b 56(17) 520(164) 182(40) 15 2 SSS III+RDE+TDM 792(104) 240(58) 960(400) 1296(480) (olie-in-water) 3 SSS III+RDE+LES 1472(232) 448(120) 1152(672) 1536(736) 4 SSS III+RDE+Alhydro- gel 80(10) 23(12) 100(26)· 62(8) 20 5 Geen 10(0) 20(15) 20(10) 10(0) a SSS III is het gezuiverde capsulaire polysaccharide van type III Streptococcus pneumoniae. De muizen werden subcutaan geïmmuniseerd op dag 0 en op dag 21.

De resultaten zijn uitgedrukt in de gemiddelde reciproke titer 25 van elke croep. De beginverdunning voor elk serummonster bedroeg 1:10. De getallen tussen haken zijn de gemiddelde titers van sera behandeld met 0,1M 2-mercaptoethanol.

Voorbeeld 3

Bij deze proef werd aan BALB/C muizen een subcutane injectie (0,2 ml/muis) van SSS III polysaccharide antigeen, alleen of ge-30 mengd met RDE in het LES lipide emulsie adjuvans-systeem toegediend.

Men diende 21 dagen na de primaire immunisatie aan alle muizen een tweede injectie van SSS III (0,5 ^ig) gemengd in de RDE-TDM olie-in-water emulsie toe.

De verkregen resultaten zijn vermeld in tabel III: 8700892 - 12 -

Tabel III

Passieve hemagglutinine (HA) titers van sera van muizen die zijn geïmmuniseerd met verschillende doses pneumococ-caal polysaccharide antigeen (SSS III) gemengd met RDE 5 in het lipide emulsie systeem (LES).

Reciproke waarden van HA-titers (dagen na immunisatie)

Groep behandeling Dosis (ugs) 7 14 28 42 1 SSS IIia 0,5 240.(28)b 56(17) 520(164) 182(40) 10 2 SSS III+RDE 0,5+100 1472(232) 448(12) 1152(672)1536(736) 3 SSS III+RDE 0,5+50 3104(240 624(144) 1152(64Q) 1280(800) 4 SSS III+RDE 0,25+100 512(84) 168(50) 1152(386) 800(220) 5 SSS III+RDE 0,25+50 304(48) 144(34) 928(320) 928(144) SSS III is het gezuiverde capsulaire polysaccharide van type III 15 Streptococcos pneumoniae. De muizen werden subcutaan geïmmuniseerd op dag 0 en dag 21.

De resultaten zijn uitgedrukt in de gemiddelde HA-titer van individuele serummonsters van een reeks bloedingen. De getallen tussen haken geven de gemiddelde HA-titers van sera behandeld met 0,1M 20 2-mercaptoethanol weer. Deze stellen igG responsen voor.

87 0 0 9 9 2

Claims (13)

1. Een immunologisch adjuvans ter verbetering van de im-muunrespons tegen natuurlijke of polysaccharide antigenen, bevattende: (1) een emulsie-systeem gekozen uit de groep bestaande uit: (A) een lipide emulsie systeem (LES), dat bevat: 5 (a) een metaboliseerbare olie, (b) een polyol met laag molecuulgewicht, (c) lecithine, of (B) een olie-in-water emulsie-systeem 0/W dat bevat: (a) een lichte, niet-bioontleedbare koolwater- 10 stofolie of een bioontleedbare olie, en (b) een wasactief middel, (2) een gezuiverd, ontgift endotoxine (RDE), en desgewenst, (3) trehalosedimycolaat, (TDM).

2. Het adjuvans volgens conclusie 1, waarin de metaboli- 15 seerbare olie een hogere olie van plantaardige oorsprong die voorna melijk glyceriden en triglyceriden bevat is.

3. Het adjuvans volgens conclusie 1 of 2, waarin de meta boliseerbare of bioontleedbare olie, zonnebloemzaadolie, saffloerzaad-olie, maïsolie, olijfolie, katoenzaadolie, squaleen of aardolie is.

4. Het adjuvans volgens conclusie 1, waarin de niet-bioont leedbare olie een lichte minerale olie, squalaan, 7-n-hexy1-octadecaan, Drakeol 6 VR, of minerale olie is.

5. Het adjuvans volgens één der voorgaande conclusies waarin het lipide emulsiesysteem ongeveer 30 tot ongeveer 60 gew.% van een 25 metaboliseerbare olie, ongeveer 30 tot 60 gew.% van een polyol met laag molecuulgewicht en ongeveer 1-15 gew.% lecithine bevat.

6. Het adjuvans volgens één der voorgaande conclusies, waarin het olie-in-water emulsiesysteem ongeveer 0,5 tot ongeveer 3 gew.% van een niet-bioontleedbare of bioontleedbare lichte koolwater-30 stofolie en een wasactief middel bevat.

7. Het adjuvans volgens één der voorgaande conclusies, dat een polysaccharide antigeen bevat.

8. Het adjuvans volgens conclusie 7, waarin het antigeen en het gezuiverde, ontgifte endotoxine in een steriele zoutoplossing 35 aanwezig zijn. 8700892 , - 14 - *·»-

9. Het adjuvans volgens één der voorgaande conclusies waarin de antigeenconcentratie in de steriele zoutoplossing tussen ongeveer 0,1 en ongeveer 5000 jig/ml en de concentratie van het gezuiverde, ongifte endotoxine in de steriele zoutoplossing tussen 5 ongeveer 125 en 1000^ig/ml ligt.

10. Het adjuvans volgens één der voorgaande conclusies waarin het lipide emulsiesysteem ongeveer 30 tot ongeveer 60 gew.% van een metaboliseerbare olie, ongeveer 30 tot 60 gew.% van een polyol met laag molecuulgewicht en ongeveer 1 tot 15 gew.% lecithine bevat, 10 of het olie-in-water emulsiesysteem ongeveer 0,5 tot 3 gew.% van een niet-bioontleedbare, lichte koolwaterstofolie of een bioontleedbare olie en een wasactief middel bevat en de concentratie van antigeen in de steriele zoutoplossing tussen ongeveer 0,5 en ongeveer 5000 ^ig/fnl en de concentratie van het gezuiverde, ontgifte endotoxine in de ste- 15 riele zoutoplossing tussen ongeveer 125 en 1000^g/ml ligt.

11. Immuunsysteem dat polysaccharide antigenen gecombineerd met de adjuvantia volgens één der voorgaande conclusies bevat.

12. Adjüvantia en immuunsystemen zoals beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden.

13. Werkwijze als beschreven in de beschrijving en/of voor beelden. '^7 0 0 8 9 2 - ,· Μ- ~ CHjOR, CHORj, CHt0P0e0HR5 1 RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH, INC., Hamilton, Montana, Ver. St.v.Amerika 8700392 -- w ________