<Desc/Clms Page number 1>
Adjuvants immunologiques pour vaccins polysaccharidiques
La présente invention concerne de nouveaux adjuvants immunologiques pour des vaccins polysaccharidiques. Suivant une autre de ses caractéristiques, la présente invention concerne de nouveaux systèmes immunologiques constitués d' antigènes polysaccharadiques en combinaison avec certains adjuvants biologiques dans des systèmes en émulsion lipids- que, ou sur des gouttelettes d'huile ou oleo-gouttelettes.
Suivant une autre de ses caractéristiques, la presente invention concerne un procédé conformement auquel on rend des antigenes polysaccharadiques plus immunogenes en les combinant aux adjuvants suivant la présente invention.
Antérieurement ä la présente invention, la litterature technique a relaté que des antigènes polysaccharidiques stimulaient principalement les anticorps IgM avec peu ou pas de réponse IgG. En outre, il était difficile d'obtenir une réponse amnastique ou une mémoire immunologique avec des antigènes polysaccharidiques chez des êtreshumairts et des animaux soumis ä l'experience. Par conséguent, l' immunité induite par l'emploi d'antigènes polysaccharidiques avait une courte période de vie. En outre, il s'est revel6 que les vaccins polysaccharidiques n'etaJLentpa trbs
<Desc/Clms Page number 2>
immunogènes chez les jeunes enfants.
Par conséquent, existait le besoin de la mise au. point d'un procédé grâce auquel on pEt rendre des antigènes polysaccharidiques plus immunogènes et, de ce fait, stimuler une plus ample production d'anticorps, y compris une reponse d'IgG et une mémoire immunologique.
Suivant son apsect le plus large, la présente invention concerne de nouveaux adjuvants immunologiques pour des antigènes polysaccharidiques, des procédés de préparation de ces adjuvants et leur emploi pour rendre des antigènes polysaccharidiques plus immunogènes.
La présente invention, comme on l'a indiqué précédem ment, concerne de nouveaux adjuvants immunologiques pour des antigènes polysaccharidiques, des procédés de préparas-iode ces adjuvants et l'utilisation de ces derniers. L'adjuvant immunologique qui est interessant pour accro#tre la réponse immune vis-à-vis d'antigènes polysaccharidiques se compose de : (1) Un système en émulsion choisi dans le groupe constitue de : (A) un Systeme en emulsion lipidique (SEL) contenant
EMI2.1
(a) une huile metabolizable, (b) un polyol de faible poids moleculaire et (c) la lecithine, ou (B) un système en émulsion huile-dans-eau (H/E) contenant :
(a) une huile biodégradable ou une huile non biodegradable formée d'hydrocarbures legers et (b) un détergent, (2) une endotoxine détoxifiée raffinée (EDR), et facultativement, (3) du dimycolate de tétrahalose (DMT).
La présente invention a par consequent pour jetun procédé conformément auquel on peut rendre des antigenes polysaccharidiques plus immunogenes lorsqu'on les combine ä
<Desc/Clms Page number 3>
certains adjuvant biologiques dans un Systeme en émulsion lipidique biodegradable ou dans un Systeme en émulsion huile-dans-eau. Les reponses immunes induites par les antigua- nes polysaccharidiques et les systèmes d'adjuvants suivant la présente invention different nettement des réponses provoquées par l'antigene seul, ä de nombreux égards. Comme on a pu le mesurer par des titres supérieurs, on a observé que l'antigene"adjuvantisé"stimulait une plus ample production d'anticorps que celle pouvant être induite par l'antigène seul.
En outre, le mélange d'antigènes adjuvantisés stimule la production d'anticorps de la classe IgG avec un titre t
EMI3.1
périeur ä celui obtenu l'aide de l'antigène seul. On a également observé que le mélange d'adjuvant et d'antigene suivant la présente invention induisait une mémoire immunologique, comme on peut le mettre en évidence, après une seconde injection d'antigène, par une réponse en anticorps nprieure ä celle obtenue après une immunisation primaire.
Antérieurement ä la presente invention, on n'a jamais relaté que des adjuvants de quelque type que ce fat constituassent des immunopotentialisateurs efficaces d'antigenes polysaccharidiques purs. Par consequent, la présente invention apporte un moyen pour augmenter l'immunogénicité d'antigènes polysaccharidiques, qui n'existait pas jusqu'à ce jour. Les adjuvants suivant la présente invention sont concomitamment interessants pour stimuler des réponses immunes ä la fois primaires et secondaires (c'est-à-dire de mémoire) chez des animaux ä sang chaud, ä des vaccins contenant des antigènes polysaccharidiques provenant de diverses sources.
Par exemple, les antigènes polysaccharidiques que l'on peut utiliser avec des adjuvants suivant laLpreseCh- te invention comprennent ceux purifiés à partir des capsules de bactéries telles que Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoiae, Salmonella typhi ou Hemophilus influenzae. D'autres antigènes polysaccharidiques, comme ceux obtenus à partir de capsules ou de pa-
<Desc/Clms Page number 4>
rois cellulaires de champignons, ou de parois cellulaires de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, peuvent également etre utilisés avec des adjuvants suivant l'invention.
La seule exigence de l'antigène polysaccharidique rEside dans le fait que la reponse immune induite par un tel antigène en soit une qui puisse être augmentee par la présence d'un adjuvant biologique approprie.
Comme on l'a précédemment mentionne, on sait que de nombreux antigènes polysaccharidiques stimulent le système immun. Cependant, la réponse induite est principalement le type IgM d'anticorps avec l'aptitude ou pouvoir d'induire une mémoire immunologique pour une réponse secondaire. Par consequent, conformément ä la présente invention, on forme une émulsion (avec SEL ou H/E) qui contient l'antigène po- 1ysaccharidique et l'adjuvant biologique. Ceci se traduit par la présentation de l'antigène sous une forme particulaire à des cellules du Systeme immun, la lente libération de 1'antigène vis-ä-vis du système immun et une stimulation de cellules progenetrices impliquées dans la réponse immune.
Comme on l'a mentionne plus haut, l'adjuvant immunologique de la présente invention se compose de deux constituants. Le premier constituant est soit un système en ému1- sion lipidique (SEL), soit un Systeme en émulsion huile- -dans-eau (H/E). Le second constituant est formé par un ou plusieurs adjuvants biologiques du type endotoxine detoxifiée raffinée. Le système en emulsion lipidique (SEL) contient une huile metabolisable, un polyol de faible poids moléculaire et de la lécithine. En pratique, on a constaté que l'huile métabolisable utilisée dans le SEL était, de preference, une huile aliphatique principalement constituée de diglycérides et de triglycerides des acides oleique et linoléique.
On donne une preference toute particuliere à des huiles végétales aliphatiques telles que celles contenues dans, ou obtenues à partir de l'huile d'arachide, de l'huile de tournesol, de l'huile de carthame, de l'huile de
<Desc/Clms Page number 5>
mais et analogues. On peut également employer d'autres huiles, comme l'huile d'olive, l'huile de coton ou le squalene dans les adjuvants conformes ä la presente invention. Ilest ainsi préférable que l'huile soit métabolisable, compatible avec les constituants du système en mulsion et l'adjuvant bactérien lui-même, et soient efficaces en combinaison avec les autres constituants pour augmenter la reponse immune vis-à-vis d'antigènes polysaccharidiques.
En pratique, on peut utiliser une grande variété de polyols dans le système en emulsion lipidique. Les polyols utilisés sont des polyols de faibles poids moléculaires qui sont liquides, miscibles ä l'huile métabolisable et danse quels le constituant du type lécithine est soluble. Des polyols appropriés englobent, entre autres, l'éthylèneg1ycol, le 1, 2-propanediol, le 1, 3-propanediol, la glycerine, le 1, 4-butanediol, le 1,3-butanediol, le 1,2,4-butanetriol, le 1,5-pentanediol et analogues.
Comme on l'a indiqué, le troisième constituant du système en émulsion lipidique est la lecithine. Le terme "lécithine" comme on l'utilise dans le présent mémoire et les revendications qui le terminent, vise à englober n'importe quelle substance dans le groupe de phospholipides répondant ä la formule générale suivante :
EMI5.1
EMI5.2
l 2 dans laquelle R et R2 représentent des restes d'acides gras contenant jusqu'à 22 atomes de carbone et R3 représente la choline. Ces phospholipides sont habituellement un mé1ange de diglycérides des acides gras stéarique, palmitique, lino- 1éique ou linoléique 1iés à l'ester de la choline de l' acide phosphorique.
<Desc/Clms Page number 6>
En pratique, on a constaté que la partie non aqueuse du systeme en émulsion lipidique devait, de préférence, contenir d'environ 30 à environ 60 % en poids de l'huile metabolisable, d'environ 30 ä environ 60 % en poids de polyol et d'environ 1 à environ 15 % en poids de lécithine.
Pour illustrer la preparation du systeme an enulsion lipidique, on a dissous une partie (10 g) de lécithine sterile dans 10 parties (100 g) de glycérien blanche, sous chauffage modere ä 60 C sur une plaque chaude, tout en procédant ä l'agitation avec une barre magnetique. Avant son utilisation, on a filtre la glycerine par son passage ä travers une unité filtrante de 0, 2 micrometre en vue d'assurer sa stérilisation.
Ensuite, on a introduit le mélange de glycerine et de lécithine dans une cuvette mélangeuse sterile et on a lentement ajouté 10 parties d'huile darachide (100 g, stérilisée par passage ä travers un filtre de 0,2 micromètre) au mélange de glycérien et de lécithine tout en mélangeant le tout ä vitesse modérée.
Comme on l'a décrit précédemment, le premier constituant de l'adjuvant immunologique peut être un système en émulsion huile-dans-eau (H/E) au lieu du système en émilsion lipidique. Ce système H/E peut se composer d'une huile métabolisable, comme le squalène, ou une huile non métabolisable, comme le squalane, une huile minérale légère, le 7-n-hexyl-octadécane, l'huile minérale superoil ou Drakeol 6 VR Conoco (produite par la société Pennreco Company, Butler, Pa.). L'émulsion huile-dans-eau contient régalement un détergent. La quantité de détergent est typiquement comprise entre environ 0, 02 et 0, 20, et de préférence entre envi-
EMI6.1
ron 0, 10 et 0, 20, % en volume par rapport à la partie aqueuse de l'emulsion.
On peut utiliser n'importe quelle matière détergente courante, y compris le Tween-80 et l'Arlacel (produit par la société Atlas Chemical Company). L'huile doit constituer d'environ 0, 5 ä 3 % du volume total de 1' emulsion. Les constituants employés dans le systeme d'lémul-
<Desc/Clms Page number 7>
sion lipidique et dans le système huile-dans-eau sont, bien évidemment, fortement raffines et d'une qualité acceptable dans le domaine pharmaceutique.
Le second constituant de l'adjuvant immunologique est un adjuvant bactérien détoxifié raffiné. comme une endotoxine détoxifiée raffinée. L'endotoxine dtoxifiée, que l' on appelera également EDR dans la suite du présent mémoire, s'obtient ä partir de souches Re mutantes de Salmonella. peut egalement obtenir l'endotoxine détoxifiee ä partir d' entérobactériacées telles que décrites dans le brevet U. 5. - 4, 436, 728 dont la description est incorporée au present mémoire ä titre de reference. On peut également préparer l' endotoxine detoxifiee par voie synthétique et en faisant appel ä des techniques d'ingénierie génétique.
Un autre aspect du second constituant est l'addition facultative de dimycolate de tréhalose (DMT). On obtient le DMT ä partir de n'importe quelle mycobactérie comprenant, mais sans sty limiter, M. avium, M. phlei, M. tuberculosis, (souches H37RV et Ayoma B), M. bovis - BCG, M smegmatis, M. kansaii
EMI7.1
ou M. bovinis ; on peut egalement obtenir le DMT ä partir de Nocardia rubra et Corynebacterium diphteriae. On peut préparer le DMT de la manière d6crite dans le brevet U. 5. - 4 505 900 accordé le 19 mars 1985.
La preparation des vaccins polysaccharidiques comprenant le SEL s'effectue comme suit : on dissout le ou les seconds constituants (EDR et, facultativement, DMT) dans un mé1ange de chloroforme et de méthanol (4 : 1) et on introduit la solution dans une fiole sterile et on évapore le solvant sous un courant d'azote sterile. On ajoute l'antigène polysaccharidique en solution saline stérile au ou aux seconds constituants, cette opération etant suivie d'un me- lange intime.
En pratique, ä environ 3 volumes du melange d'adjuvant bactérien et d'antigene polysaccharidique, on ajoute un volume du mélange de SEL préparé de la manière décrite plus haut et on malaxe ce melange oleoaqueux dans
<Desc/Clms Page number 8>
une machine ä toubillonnement ou dans un malaxeur jusqu'à l'obtention d'une emulsion laiteuse blanche. On réalise habituellement le melange des deux composants pour obtenir l' emulsion en l'espace de 2 à 5 minutes.
La concentration d' antigène polysaccharidique dans l'emulsion finale varie d' environ 0, 1 ä 1000 microgrammes par 0, 2 millilitre ; la concentration en EDR varie d'environ 25 à environ 200 microgrammes par 0, 2 millilitre} et la concentration en DMT, lorsque ce dernier est présent, fluctue d'environ 50 ä 400 microgrammes par 0, 2 millilitre.
Bien que le rapport optimal des deux phases de la forme contenant du SEL de l'adjuvant immunologique soit d' environ 3 volumes de la solution saline d'adjuvant bactérien détoxifié-antigène polysaccharidique pour environ un volume du Systeme en émulsion lipidique, le rapport du systeme en émulsion lipidique ä la solution d'adjuvant-antigène peut varier d'environ 1 ä environ 1 à 8, un rapport d'en-
EMI8.1
viron 1 ä 3 étant préféré.
Une exemple d'un système huile-dans-eau illustratif est le suivant : on introduit 5 mg de EDR et 10 mg de DMT, dissous chacun dans un mélange de chloroforme et de metanol 4 : 1, dans un appareil d'homogdnéisation de tissus d' une contenance de 350 ml (Bellco). On évapore le solvant du mé1ange d'EDR-DMT sous un courant d'azote stérile. Cette opération est suivie de l'addition de 2 ml d'huile sterile (huile minérale Drakeol 6 VR Tennreco Company, Butler, PA@, huile minérale légère, squalane, squalène, 7-n-hexyloctadécane) et on homogénéise le melange pendant une minute en se servant d'un pilon entrain par un moteur, jusqu'à l'obtention d'une consistance olêoP8teuse.
On introduit ensuite 98 ml de Tween-80 ä 0, 2 % dans une solution saline dans l'appareil d'homogénéisation, En utilisant un pilon entrainé par un moteur, on poursuit l'homogénéisation pendant environ 4 ä 5 minutes jusqu'à l'obtention d'une emulsion.
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
On ajoute une quantité approprie d'antigène polysaccharidique dans de l'eau ä l'emulsion liquide que l'on melange ensuite par des aspirations et des injections repetees en utilisant une seringue et une aiguille de calibre 20 pendant au moins 2 minutes, jusqu'à l'émulsion resultan- te ait acquis un aspect laiteux nuageux.
On peut eventuellement lyophiliser l'emulsionhulle- - dans-eau en introduisant 5 ml de l'emulsion dans une fiole à serum Wheaton de 10 ml. On congèle la fiole dans un congelateur Revco ä une température de -95OC et on la lyophilise dans un récipient sterile en se servant d'un lyophilisateur Labconoco. On place ensuite une capsule sur la fiole en se servant d'une technique sterile. On reconstitue l'émulsion DMT-EDR lyophilisée par l'injection de 5 ml d'eau sterile contenant la concentration souhait$e en antigène polyaaocha- ridique. On l'émulsionne par des aspirations et injections rlpétées en utilisant une seringue pendant au moins 2 minutes, jusqu'à ce que l'émulsion obtenue ait un aspect laiteux nuageux.
Par n'importe lequel des procédés ci-dessus (c'est- - à-dire, SEL ou H/E), on obtient des émulsions de la solution d'antigène polysaccharidique aqueuse qui donne une li- ration lente de l'antigene, un prolongement de la stimulation antigenique et une stimulation cellulaire proche de 11 antigène qui est induit par le ou les adjuvants bactériens détoxifies. Cette combinaison d'activités augmente la reponse de l'höte ä l'antigène, ainsi que cela ressort de toute évidence des tableaux qui accompagnent les exemples.
Comme on l'a noté plus haut, le ou les adjuvants immunologiques peuvent eventuellement contenir du dimycolate de tréhalose en plus de l'endotoxine détoxifiée raffinée.
On peut obtenir le dimycolate de tréhalose (DMT) de la maniere decrite dans le brevet U.S.- 4,505,900, à partir des organismes tels que, par exemple M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Souches H 37 RV et Ayoma B), M. bovis BCG, M.
<Desc/Clms Page number 10>
smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis et Corynebacterium diphteriae.
On fait croltre des bactéries telles que M. avium, on les récolte et on les tue ä la chaleur. On extrait ensuite la masse cellulaire ä l'aide de plusieurs solvants, conduisant ä l'isolement d'une fraction active, soluble dans les solvants. On purifie davantage cette fraction par une série d'extractions aux solvants de manière ä obtenir du DMT brut (voir Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P3 ; Azuma, et coll., Journal of the National Cancer Institute, Volume 52, p. 95-101,1974, incorporé au présent mémoire à titre de référence).
Comme decrit par Azuma et coll., on peut ensuite davantage purifier le DMT brut par chromatographie en gel de silice microparticulaire ä centrifugation de façon ä obtenir du DMT purifié.
On peut également réaliser la purification du DMT par le procédé décrit dans la demande de brevet copendantedes EJJ. A.
NO de série 372 843, déposée le 29 avril 1982 qui est cédée au même cessionnaire que la présente invention.
Lorsqu'on l'utilise dans le système d'adjuvant, on emploie le dimycolate de tréhalose en une concentration qui varie d'environ 50 ä environ 5000 microgrammes par millilitre et, plus avantageusement, d'environ 250 à environ 2000 microgrammes par millilitre.
Comme on l'a indiqué plus haut, les adjuvants immunologiques suivant la présente invention, en mélange à toute une serie d'antigènes polysaccharidiques, augmentent la réponse immunitaire contre les antigens en question et sont, par conséquent, intéressants pour la confection de toute une série de vaccins pour des hôtes tant humains qu' animaux. En pratique, on a constaté que l'endotoxine déto- xifiée raffinée s'utilisait en une concentration d'environ 25 à environ 200 microgrammes par dose, une réponse immunitaire particulièrement augmentée étant induite en une con-
<Desc/Clms Page number 11>
centration d'approximativement 100 microgrammes par dose.
Les dimycolates de tréhalose s'utilisent de préférence en une concentration d'environ 50 ä environ 400 microgrammes par dose. Si on le souhaite, on peut utiliser d'autres constituants ou additifs en combinaison avec les adjuvants suivant la présente invention.
Dans les exemples ci-dessous, les titrages d'hema- glutinine passive en utilisant du dextrane et des polysaccharides SSS III ont été effectués comme suit : Protocole pour le titrage d'hémglutinine passive (TH) en utilisant du dextrane
On a lavé 5 ml de globules rouges de sang de mouton
EMI11.1
(GRSM) dans une solution d''Alsever dans une solution saline, le lavage s'effectuant ä 5 reprises. On a dissous du palmitoy-dextrane dans une solution saline en une concentration de 1 mg/ml et on a ajouté 0, 5 ml (500 zuzug de palmitoyl-dextrane) ä 5 ml de solution ä 10 % de GRSM lavés. On a convenablement agite ce mélange et on l'a incubé pendant 30 minu-
EMI11.2
tes ä 37 C.
On a lavé 5 fois la solution de GRSM-dextrane dans une solution saline et on a ensuite remis les globules en suspension ä la concentration de 10 %.
En utilisant une plaque de microtitrage ä 96 puits ä fond en V, on a dilué des échantillons de sérum en échelons doubles en utilisant un tampon de solution saline ä albumine de sérum bovin (ASB) à 0, 5 %. Le volume final dans chaque puits était de 50 ul. A chaque puits on a ajouté 50 11 de GRSM-dextrane ä 0, 5 %. On a incubé les plaques ä la température ambiante jusqu'au lendemain.
A un jeu identique de plaques de microtitrage, on a ajouté 50 ul de 2-mercaptoéthanol 0, 1 M après la dilution des échantillons de sérum et cette addition était suivie de celle de 50 ul de GRSM enrobes de dextrane.
<Desc/Clms Page number 12>
Protocole pour le titrage d'hemaglutination passive (TH) en utilisant un polysaccharide SSS III
On a lavé 5 ml de globules rouges de sang de mouton (GRSM) ä 5 reprises dans une solution saline (0, 85 %).
On a dissous du polysaccharide SSS III dans une solution saline ä raison de 1 mg/ml. A 0, 5 ml de GRSM tassés, on a ajoute : 1) un ml de solution saline et 2) un ml de SSS III en solution saline (1000 ug). On a ensuite modérément fait toubillonner le melange et on a ajouté goutte ä goutte un ml de chlorure chromique ä 0, 1 % (CrCl3.6H2O) en solution saline, toute en poursuivant le tourbillonnement. On alaia- sö reposer le mélange ä la temperature ambiante pendant 5 minutes. On a lavé les GRSM enrobés de SSS-III ä 5 reprises en solution saline et on les a remis en suspension sous la forme d'une suspension ä 10 % de globules en solution saline.
On a dilué le sérum de souris individuelles de chaque groupe en echelons doubles dans des puits d'une plaque
EMI12.1
de microtitrage ä 96 puits ä fond en V. La dilution initiale était de 1 : 10 et le volume final de serum dilué par puits était de 50 ul.
A chaque puits contenant du serum dilué, on a ajouté 50 ul de GRSM enrobés de SSS III (suspension de globules ä 0, 5 %) et on a incubé les plaques ä la température ambiante jusqu'au lendemain. On a ajoute 50 ul de 2-mercaptoéthanol 0, 1 M à un jeu identique de plaques de microtitrage, apres dilution des échantillons de sérum, cette addition étant alors suivie de celle de 50 l de GRSM enrobés.
Dans les exemples qui suivent, on s'est procure le palmitoyldextrane et le polysaccharide (SSS III) capsuleur de Streptococcus pneumoniae type 111 chez le docteur P. J.
Baker du N. 1. H. Laboratory of Mic ob Immunity, Bethesda, Maryland, E. U. A.
Les exemples qui suivent illustrent la présente invention.
<Desc/Clms Page number 13>
Exemple 1
Au cours de cette experience, des souris BALB/C (6 souris/groupe) ont reçu une injection sous-cutanée (0, 2 ml/ animal) de ce qui suit : groupe 1, 100 ug de dextrane en solution saline ; groupe 2, 100 ng de dextrane + 50 ug d' EDR en solution saline, groupe 3,100 pg de dextrane + 50 19 d'EDR en solution saline, le tout émulsionné dans un égal volume d'émulsion lipidique SEL ; groupe 4, 100 ug de dextrane émulsionné dans une fiole contenant une émulsion huile-dans-eau lyophilisée de 50 jug d'EDR + zig de DMT/ dose ; le groupe 5 ne reçut pas d'antigène.
Le jour 20 après l'immunisation primaire, toutes souris de chaque groupe reçurent une seconde injection qui fut préparée de la même manière que la première injection.
On a recueilli des échantillons de sérum individueis par des saignées sériées ä divers moments après l'immunisation.
Les résultats obtenus sont présentes dans le tableau 1 qui suit.
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
Tableau 1 Titres d'h6magg ! utinine passive (TH) de sérums provenant de souris immunisées par le dextrane antigène polysaccharidique seul, ou en combinaison avec de l' EDR et d'autres adjuvants dans divers types de solutions
EMI14.2
<tb>
<tb> Inverse <SEP> des <SEP> titres <SEP> TH <SEP> (jours
<tb> Grou- <SEP> après <SEP> immunisation)
<tb> pe <SEP> Traitement <SEP> 6 <SEP> 16 <SEP> 30 <SEP> 48
<tb> 1 <SEP> Dextrane <SEP> 163(15)b <SEP> 340933) <SEP> 672(54) <SEP> 240(60)
<tb> 2 <SEP> Dextrane+EDR <SEP> 800 <SEP> (50) <SEP> 1228 <SEP> (126) <SEP> 2368 <SEP> (248) <SEP> 1386 <SEP> (168)
<tb> 3 <SEP> Dextrane#DDR+9SEL) <SEP> 928(76) <SEP> 2668(660) <SEP> 3200(400) <SEP> 2816(232)
<tb> 4 <SEP> Dextrane+EDR+DMt <SEP> 373(10) <SEP> 1120(88)
<SEP> 1813(173) <SEP> 1493(163)
<tb> (hjile-d-im-em)
<tb> 5 <SEP> Neant <SEP> 20 <SEP> (10) <SEP> 40 <SEP> (20) <SEP> 40 <SEP> (20) <SEP> 10 <SEP> (10)
<tb>
On a procédé ä une injection sous-cutanée le jour 0 et le jour 20 dans le cas de tous les groupes recevant l'anti- gène. b Les resultats sont exprimes sous forme de titre inverse moyen pour chaque groupe. La dilution initiale pour chaque échantillon de serum 6tait de 1 : 10. Les nombresartrepe- renthèses indiquent les titres moyens de sérums traités par du 2-mercaptoethanol 0, 1 M. Ces données représentent les réponses d'IgG.
Exemple 2
Dans cette exérience, on a injecte ä des souris BALB/C par la voie sous-cutanée (0, 2 ml) de l'antigène polysaccharidique (0, 5 jUg/souris) seul ou en combinaison avec de l' adjuvant EDR, comme suit : groupe 1, on a administré le SSS III sous forme d'une solution aqueuse, groupe 2, on a
<Desc/Clms Page number 15>
émulsionné une solution aqueuse de SSS III dans une fiole contenant une émulsion huile-dans-eau d'EDR (50 ug/souris) et du DMT (50 ug/souris); groupe 3, on a ajouté une solution aqueuse de SSS III ä de l'EDR (100 yg/souris) en solution aqueuse et on a ajouté le melange ä un égal volume de SEL et on a émulsionné le tout.
Groupe 4, on a ajouté du SSS III aqueux à de l'EDR aqueuse (50 ug/souris) et on a mélangé le tout ä un égal volume de gel d'hydroxyde d'as nium (Alhydrogel); le groupe 5 ne fut pas immunisé.
Tous les groupes contenaient 10 souris âgées de 6 à 8 semaines. Les souris de chaque groupe ont recu une seconde injection sous-cutanée le jour 21, constituée de SSS III (0, 5 yg : souris) émulsionné en emulsion d'EDR-DMT huile- - dans-eau. Les chiffres entre parenthèses représentent le titre moyen de ces mêmes serums après traitement par du
EMI15.1
2-mercaptoethanol 0, 1 M.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 qui suit.
<Desc/Clms Page number 16>
Tableau II
Titre en hémagghtinine passive (TH) de serums pro- venant de souris immunisées par 0,5 ug d'antigène polysaccharidique pneumococcique (SSS III) seul ou en combinaison à de l'EDR et d'autres adjuvants
EMI16.1
<tb>
<tb> Inverse <SEP> des <SEP> titres <SEP> Ha
<tb> (jours <SEP> après <SEP> immunisation)
<tb> Groupe <SEP> Traitement <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 28 <SEP> 42
<tb> 1 <SEP> SSS <SEP> III <SEP> 240(28)b <SEP> 56(17) <SEP> 520(164) <SEP> 182(40)
<tb> 2 <SEP> SSS <SEP> III+EDR+DMT <SEP> 729(104) <SEP> 240(58) <SEP> 960(400) <SEP> 1296(480)
<tb> (hjdJe-dans-eaLi)
<tb> 3 <SEP> SSS <SEP> III+EDR+SEL <SEP> 1472(232) <SEP> 448(120) <SEP> 1152(672) <SEP> 1536(736)
<tb> 4 <SEP> SSS <SEP> III+EDR+ <SEP> Alhydrogel <SEP> 80(10) <SEP> 23(12) <SEP> 100(26) <SEP> 62(8)
<tb> 5 <SEP> nuant <SEP> 10 <SEP> (0) <SEP> 20 <SEP> (15)
<SEP> 20 <SEP> (10) <SEP> 10 <SEP> (0)
<tb>
a Le SSS III est le polysaccharide capsulaire purifia pro- venant de Streptococcus pneumoniae type III. Ona1m les souris par la voie sous-cutanée le jour 0 et le jour
21.
Les resultats sont exprimes sous forme de titre inverse moyen pour chaque groupe. La dilution initiale pour cha- que échantillon de serum etait de 1 : 10. Les chiffres en- tre parenthèses représentent les titres moyens de serums traités par du 2-mercaptoéthanol 0, 1 M.
Exemple 3
Au cours de cette experience, des souris BALB/C ont reçu une injection ous-cutanée (0,2 ml/souris) d'antigène polysaccharidique SSS III seul ou en melange à de 1'EDRdaTS le système d'adjuvant en emulsion lipidique SEL. Toutes les souris reçurent une seconde injection de SSS 111 (0,5 ug) en mélange à l'émulsion huile-dans-eau d'EDR-DMT 21 jours
<Desc/Clms Page number 17>
après l'immunisation primaire.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau III qui suit.
Tableau III
Titres en hemagglutinine passive (TH) de serums prove- nant de souris immunisees par diverses doses d'anti- gène polysaccharidique pneumococcique (SSS III) en me- lange ä de l'EDR dans le système en emulsion lipidique (SEL)
EMI17.1
<tb>
<tb> Inverse <SEP> des <SEP> titres <SEP> TH
<tb> (jours <SEP> après <SEP> immunisation)
<tb> Grape <SEP> Traitement <SEP> Dose <SEP> (ug) <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 28 <SEP> 42
<tb> 1 <SEP> SSS <SEP> III <SEP> 0,5 <SEP> 240.(28)b <SEP> 56(17) <SEP> 520(164) <SEP> 182(40)
<tb> 2 <SEP> SSS <SEP> III+EDR <SEP> 0.5+100 <SEP> 1472(232) <SEP> 448(12) <SEP> 1152(672) <SEP> 1536(736)
<tb> 3 <SEP> SSS <SEP> III+EDR <SEP> 0,5+50 <SEP> 3104(240) <SEP> 624(144) <SEP> 1152(640) <SEP> 1280(800)
<tb> 4 <SEP> SSS <SEP> EEE+EDR <SEP> 0,26+100 <SEP> 512(84)
<SEP> 168(50) <SEP> 1152(386) <SEP> 800(200)
<tb> 5 <SEP> SSS <SEP> III+EDR <SEP> 0,25+50 <SEP> 304(48) <SEP> 144(34) <SEP> 928(320) <SEP> 928(144)
<tb>
a SSS 111 est 1e polysaccharide capsulaire purifie prove- nant de Streptococcus pneumoniae de type III. On a immu- nisé les souris par la voie sous-cutanee le jour 0 et le jour 21. b Les resultats sont exprimes sous forme de titre moyen
TH d'échantillons de sérum individuels provenant de sai- gnées seriees. Les chiffres entre parenthèses représen- tent les titres TH moyens de sérums traités par du 2- - mercaptoethanol 0, 1 M. Ces données représentent les re- ponses d'IgG.