NL194603C - Immunologisch adjuvans. - Google Patents

Description

1 194603

Immunologisch adjuvans

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een immunologisch adjuvans ter verbetering van de immunorespons tegen natuurlijke of polysaccharideantigeen, dat: (1) een emulsiesysteem en (2) een 5 gezuiverd, ontgift endotoxine (RDE) bevat.

Een dergelijk adjuvans is bekend uit de Franse octrooiaanvrage FR-A-2.550.945, die betrekking heeft op het gebruik van een gezuiverd, ontgift endotoxine als immuunstimulator en als hulpmiddel. FR-A-2.550.945 beschrijft een preparaat dat bij een warmbloedig dier een doeltreffende hulprespons kan geven of de immuunrespons kan stimuleren en dat een doeltreffende hoeveelheid van een gezuiverd ontgift endotoxine 10 bevattend product zonder waarneembaar 2-ketodeoxyoctonaat en 350—475 mmol/mg fosfor en 1700-2000 nmol/mg vetzuur en eventueel een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat. Het preparaat kan ter behandeling van warmbloedige dieren en mensen gebruikt worden in de vorm van een oliedruppelemulsie. De oliedruppelemulsie bevat een wasactieve stof, die een gebruikelijke wasactieve stof kan zijn.

Er bestaat echter behoefte aan het verder verbeteren van de immuunrespons, met name de immuun-15 respons op polysaccharideantigenen. In de literatuur wordt vermeld dat polysaccharideantigenen voornamelijk IgM-antilichamen met weinig of geen IgG-respons stimuleerden. Bovendien was een amnastische respons of immunologisch geheugen moeilijk met polysaccharideantigenen bij proefdieren en mensen te verkrijgen. Dientengevolge was de immuniteit die door toepassing van polysaccharideantigeen werd geïnduceerd van korte duur. Bovendien bleken de polysaccharidevaccins niet erg immunogeen bij jonge 20 kinderen te zijn. Daardoor bestond de behoefte aan een methode waarmee polysaccharideantigenen meer immunogeen gemaakt kunnen worden om aldus meer de vorming van antilichamen, waaronder een IgG-respons en immunologisch geheugen te stimuleren.

Gevonden is nu dat de immuunrespons tegen antigenen kan worden verbeterd door in een immunologisch adjuvans dat een emulsiesysteem en een gezuiverd ontgift endotoxine bevat een polysaccharideanti-25 geen op te nemen. Derhalve voorziet de uitvinding in een immunologisch adjuvans als in de aanhef omschreven met het kenmerk, dat het verder bevat (3) een polysaccharideantigeen, en desgewenst (4) trehalosedimycolaat (TDM), waarbij het emulsiesysteem (1) wordt gekozen uit: 30 (A) een lipide-emuisiesysteem (LES) omvattende: (a) een metaboliseerbare olie, (b) een polyol met een laag molecuulgewicht en (c) lecithine, en (B) een olie-in-wateremulsiesysteem (O/W) bevattende: 35 (a) een lichte, niet biologisch ontleedbare koolwaterstofolie of een biologisch ontleedbare olie en (b) een wasactief middel.

De immuunresponsen opgewekt door de polysaccharide antigenen en de adjuvantssystemen volgens deze uitvinding verschillen in vele opzichten van de responsen die door het antigeen alleen worden geïnduceerd. Waargenomen werd dat het met adjuvantia behandelde antigeen een grotere antilichaampro-40 ductie stimuleert, zoals gemeten aan de hand van hogere titers, dan door het antigeen alleen kan worden geïndiceerd. Bovendien stimuleert het met adjuvantia behandelde antigeenmengsel de vorming van antilichamen van de IgG-klasse met een hogere titer dan met het antigeen alleen werd verkregen.

Eveneens werd waargenomen dat het met adjuvantia behandelde antigeenmengsel volgens de onderhavige uitvinding een immunologisch geheugen opwekt, zoals blijkt uit een hogere antilichaamrespons volgende op 45 een tweede injectie van antigeen dan verkregen wordt na primaire immunisatie.

Voor de onderhavige uitvinding waren geen adjuvantia van enig type bekend als doeltreffende immuno-potentiatoren van zuivere polysaccharide antigenen. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een methode voor het vergroten van de immunogeniciteit van polysaccharide antigenen, welke hiervoor niet bestond. Dientengevolge zijn de adjunvantia van de onderhavige uitvinding bruikbaar voor het stimuleren 50 van zowel primaire als secundaire (dat wil zeggen geheugen) immuunresponsen van warmbloedige dieren op vaccins die polysaccharide antigenen uit vele bronnen bevatten. Zo vallen bijvoorbeeld onder de polysaccharide antigenen die met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden toegepast die welke gezuiverd zijn uit de capsules van bacteriën, zoals Streptococcus pneumoniae,

Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, of Hemophilus influenzae. Andere 55 polysaccharide antigenen, zoals die welke verkregen kunnen worden uit capsules of celwanden van fungi of de celwanden van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën kunnen eveneens met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast. De enige eis die aan het polysaccharide antigeen wordt 194603 2 gesteld is dat de immuunrespons die door een dergelijk antigeen wordt opgewekt een respons is die door de aanwezigheid van een geschikt biologisch adjuvans kan worden verhoogd.

Zoals reeds eerder werd vermeld, is van vele polysaccharide antigenen bekend dat ze het immuunsysteem stimuleren. De opgewekte respons is echter voornamelijk van antilichamen van het IgM-type, 5 zonder het vermogen een immunologisch geheugen voor een secundaire respons te induceren. Zo wordt volgens de onderhavige uitvinding een emulsie (met LES of O/W) gevormd die het polysaccharide antigeen en biologisch adjuvans bevat. Dit leidt tot de presentatie van het antigeen in deeltjesvorm aan cellen van het immuunsysteem, een langzame antigeenafgifte aan het immuunsysteem en een stimulering van voorouder cellen die betrokken zijn bij de immuunrespons.

10 Zoals hiervoor reeds werd vermeld bevat het immunologische adjuvans volgens de onderhavige uitvinding naast het polysaccharideantigeen twee bestanddelen. Het eerste bestanddeel is hetzij een lipide emulsiesysteem (LES) of een olie-in-water emulsiesysteem (O/W). Het tweede bestanddeel is één of een aantal gezuiverde, ontgifte, endotoxine biologische adjuvantia. Het lipide emulsiesysteem (LES) bevat een metaboliseerbare olie, een polyol met laag molecuulgewicht en lecithine. In de praktijk is gebleken dat de 15 metaboliseerbare olie die in het LES wordt toegepast bij voorkeur een hogere olie is die voornamelijk uit diglyceriden en triglyceriden van oliezuur en linoleïnezuur bestaat. Bijzonder aanbevolen worden de hogere plantaardige oliën, zoals die welke aanwezig zijn in, of verkregen worden uit, aardnotenolie, zonnebloem-zadenolie, saffloerzadenolie, maïsolie enzovoorts. Andere oliën, zoals olijfolie, katoenzaadolie of squaleen, kunnen eveneens in de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast. Het verdient dus 20 aanbeveling dat de olie metaboliseerbaar is, verenigbaar is met de bestanddelen van het emulsiesysteem en het bacteriële adjuvans zelf en doeltreffend is in combinatie met de andere bestanddelen voor het verhogen van de immuunrespons tegen polysaccharide antigenen.

In de praktijk kan een grote verscheidenheid van polyolen in het lipide emulsiesysteem worden toegepast. De gebruikte polyolen zijn polyolen met laag molecuulgewicht die vloeibaar zijn, gemengd 25 kunnen worden met de metaboliseerbare olie en waarin het lecithine-bestanddeel oplosbaar is. Onder geschikte polyolen vallen onder andere: ethyleen-glycol, 1,2-propaandiol, 1,3-propaandiol, glycerine, 1,4-butaandiol, 1,3-butaandiol, 1,2,4-butaantriol, 1,5-pentaandiol enzovoort.

Zoals reeds werd vermeld, is het derde bestanddeel van het lipide emulsiesysteem lecithine. De in deze beschrijving en de daarna volgende conclusies toegepaste uitdrukking ’’lecithine” beoogt elke groep 30 fosfolipiden met de algemene formule 1 te omvatten, waarin FL en R2 vetzuren zijn die maximaal 22 koolstofatomen bevatten en R3 choline is. Deze fosfolipiden zijn gewoonlijk een mengsel van de diglyceriden van stearinezuur, palmitinezuur, linoleïnezuur of linoleenzuur vetzuren die met de choline-ester van fosforzuur zijn gebonden.

In de praktijk is gebleken dat het niet-waterige gedeelte van het lipide emulsiesysteem bij voorkeur 30 tot 35 60 gew.% van de metaboliseerbare olie, 30 tot 60 gew.% polyol en 1 tot 15 gew.% lecithine zal bevatten.

Ter illustratie van de bereiding van het lipide emulsiesysteem wordt één deel (10 gram) steriel lecithine opgelost in 10 delen (100 gram) witte glycerine door op een hete plaat onder roeren met een magneetstaaf zachtjes te verhitten op 60°C. Voor het gebruik was de glycerine geleid door een 0,2 micrometer filter-eenheid teneinde deze vloeistof te steriliseren. Daarna werd het mengsel van glycerine en lecithine 40 geplaatst in een steriele mengkop en voegde men langzaam 10 delen aardnotenolie (100 gram, gesteriliseerd met behulp van een 0,2 micrometer filter) langzaam aan het mengsel van glycerine en lecithine toe onder mengen met matige snelheid.

Zoals hiervoor reeds werd opgemerkt, kan het eerste bestanddeel van het immunologische adjuvans een olie-in-water (O/W) emulsiesysteem in plaats van het lipide emulsiesysteem zijn. Dit O/W-systeem kan een 45 metaboliseerbare olie, zoals squaleen, of een niet-metaboiiseerbare olie, zoals squalaan, een lichte minerale olie, 7-n.-hexyloctadecaan, Conoco superolie of Drakeol 6 VR minerale olie (een product van de Pennreco Company, Butler, Pa.) bevatten. De olie-in-water-emulsie bevat eveneens een wasactief middel. De hoeveelheid van dit middel ligt typerend tussen 0,02 en 0,20, bij voorkeur tussen 0,10 en 0,20, volume-procent, ten opzichte van het waterige gedeelte van de emulsie. Elk gebruikelijk wasactief middel kan 50 worden toegepast, waaronder Tween-80 en Arlacel (een product vn Atlas Chemical Company). De olie zal tussen 0,5 en 3% van het totale volume van de emulsie uitmaken. De in het lipide emulsiesysteem en in het olie-in-water-systeem toegepaste bestanddelen zijn natuurlijk erg zuiver en van een farmaceutisch aanvaardbare kwaliteit.

Het tweede bestanddeel van het immunologische adjuvans is een gezuiverd, ontgift endotoxine, hierna 55 eveneens aangeduid als RDE. Dit wordt verkregen uit RE mutant stammen Salmonella. Het ontgifte endotoxine kan eveneens worden verkregen uit andere enterobacteriaciae, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.436.728. Het ontgifte endotoxine kan eveneens synthetisch en volgens 3 194603 genetische manupulatietechnieken worden verkregen. Een ander aspect van het tweede bestanddeel vormt het desgewenst toevoegen van trehalose dimycolaat (TDM). TDM kan uit elke mycobacterie worden verkregen, waarvan genoemd kan worden M. avium, M. phlei, M, tuberculosis (de stammen H37RV en Ayoma B), M. bovis - BCG, M, smegmatis, M. kansaii, of M. bovinis, doch TDM kan eveneens worden 5 verkregen uit Nocardia rubra en Corynebacterium diphtheriae. TDM kan eveneens worden bereid volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.505.900.

Het bereiden van de polysaccharide vaccins onder opneming van LES geschiedt als volgt: het tweede bestanddeel(en) (RDE en desgewenst TDM) opgelost in een mengsel van chloroform en methanol (4:1) wordt gebracht in een steriel vat en het oplosmiddel wordt in een stroom steriele stikstof verdampt. Aan het 10 tweede bestanddeel(en) wordt polysaccharide antigeen in een steriele zoutoplossing toegevoegd, waarna innig wordt gemengd. In de praktijk wordt op ongeveer drie volumen van het polysaccharide antigeen bacteriële adjuvans mengsel één volume van het LES-mengsel dat op de hiervoor beschreven wijze was bereid toegevoegd en dit waterige-oliemengsel werd gemengd in een vortex-machine of in een meng-inrichting totdat een witte, melkachtige emulsie wordt verkregen. Het mengen van de twee bestanddelen 15 onder vorming van de emulsie wordt gewoonlijk uitgevoerd in 2 tot 5 minuten. De concentratie van het polysaccharide antigeen in de uiteindelijke emulsie is 0,1 tot 1000 microgram per 0,2 ml; de concentratie van RDE ligt tussen 25 en 200 microgram per 0,2 ml en de concentratie van TDM, indien aanwezig, is tussen 50 en 400 microgram per 0,2 ml gelegen.

Hoewel de optimale verhouding van de twee fasen van de LES-bevattende vorm van het immunologi-20 sche adjuvans ongeveer drie volumedelen van het polysaccharide antigeen-ontgifte bacteriële adjuvans zoutoplossing tot ongeveer één volumedeel van het iipide emulsiesysteem bedraagt, kan de verhouding van het Iipide emulsiesysteem tot de antigeen-adjuvans-oplossing variëren van 1 tot 1 tot 1 tot 8, waarbij een verhouding 1 tot 3 wordt aanbevolen.

Een toelichting van het olie-in-water-systeem is de volgende: 5 mg RDE en 10 mg TDM, elk opgelost in 25 een mengsel van chloroform en methanol (4:1), worden gebracht in een weefsel-homogenisator van 350 ml (Bellco). Het oplosmiddel wordt met een stroom steriele stikstof uit het RDE-TDM-mengsel verdampt. Dit wordt gevolgd door toevoeging van 2 ml steriele olie (Drakeol 6 VR minerale olie [Pennreco Company, Butler, PA], lichte minerale olie, squalaan, squaleen, 7-n.-hexy!octadecaan) en het mengsel wordt gehomogeniseerd gedurende 1 minuut onder toepassing van een met een motor aangedreven stamper, totdat een 30 consistentie van een olie-pasta wordt verkregen. Daarna worden 98 ml van een 0,2%-ige oplossing van Tween-80 in een zoutoplossing in de homogenisator gebracht. Onder toepassing van een door een motor aangedreven stamper wordt het mengsel daarna verder gehomogeniseerd gedurende 4 tot 5 minuten, totdat een emulsie wordt verkregen.

Aan de vloeibare emulsie wordt een geschikte hoeveelheid polysaccharide antigeen in water toegevoegd, 35 waarna wordt gemengd door herhaalde malen aan te zuigen en te injecteren onder toepassing van een injectiespuit en een naald van 20 gauge, gedurende ten minste twee minuten, totdat de verkregen emulsie een troebel-melkachtig uiterlijk heeft.

De olie-in-water-emulsie kan desgewenst worden gelyofiliseerd door 5 ml te brengen in een 10 ml Wheaton serumflesje. Het flesje wordt bevroren in een Revco vriesinrichting bij een temperatuur van -95°C 40 en gelyofiliseerd in een steriele houder met een Labconoco vriesdroger. Onder toepassing van een steriele techniek wordt het flesje vervolgens afgesloten. De gelyofiliseerde RDE-TDM-emulsie wordt weer terug verkregen door injectie van 5 ml steriel water dat de gewenste concentratie van het polysaccharide antigeen bevat. Het wordt geëmulgeerd door herhaalde malen aan te zuigen en te injecteren met behulp van een injectiespuit gedurende ten minste twee minuten totdat de verkregen emulsie een troebel-melkachtig uiterlijk 45 heeft verkregen.

Volgens elk van de hiervoor genoemde werkwijzen (dat wil zeggen LES of O/W) worden emulsies van de waterige polysaccharide antigeenoplossing verkregen hetgeen tot een langzame afgifte van het antigeen, een verlenging van de antigeenstimulering en een cellulaire stimulering verwant aan het antigeen dat geïnduceerd is door de ontgifte bacteriële adjuvans-(tia) leidt. Deze combinatie van activiteiten vergroot de 50 respons van de gastheer voor het antigeen, zoals duidelijk uit de tabellen van de voorbeelden blijkt.

Zoals hiervoor reeds werd aangegeven, kunnen de immunologische adjuvans-(tia) desgewenst behalve het gezuiverde, ontgifte endotoxine trehalosedimycolaat bevatten. Zoals vermeld in het Amerikaanse octrooischrift 4.505.900 kan trehalosedimycolaat (TDM) worden verkregen uit organismen zoals bijvoorbeeld M. avium, M, phlei, M. tuberculosis (stam H 37 RV en Ayoma B), M. bovis BCG, M. smegmatis, M. kansaii, 55 Nocardia rubra, M. bovinis en Corynebacterium diphteriae.

Men laat bacteriën, zoals M. avium groeien, oogst ze en doodt ze daarna onder verhitting. Vervolgens wordt de celmassa geëxtraheerd met verschillende oplosmiddelen, hetgeen tot de isolatie van een actieve, 194603 4 in oplosmiddel oplosbare fractie leidt. Deze fractie wordt verder gezuiverd met behulp van een reeks ' .

extracties met oplosmiddelen, ter verkrijging van ruw TDM. (Zie Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P3; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, deel 52, biz. 95-101, 1974). Zoals beschreven in het artikel van 5 Azuma en medewerkers, kan het ruwe TDM daarna verder worden gezuiverd door centrifugale microdeel-tjesvormige silicagelchromatografie, waardoor gezuiverd TDM wordt verkregen. Het zuiveren van TDM kan eveneens geschieden volgens de methode beschreven in de samenhangende octrooiaanvrage met het serial nummer 372.843, ingediend op 29 april 1982, op dezelfde naam.

Bij toepassing in het adjuvans-systeem wordt het trehalose-dimycolaat toegepast in een concentratie van 10 50 tot 5000 microgram per milliliter, bij voorkeur 250 tot 2000 microgram per milliliter.

Zoals hiervoor reeds werd toegelicht, verhogen de immunologische adjuvantia van de onderhavige uitvinding gemengd met verschillende polysaccharide antigenen de immuunrespons tegen dergelijke antigenen en zijn dus bruikbaar in een reeds vaccins voor zowel veterinaire als humane gastheren. In de praktijk is gebleken dat het gezuiverde, ontgifte endotoxine wordt toegepast in een concentratie van 25 tot 15 200 microgram per dosis, waarbij een speciaal verhoogde immuunrespons wordt opgewekt bij 100 microgram per dosis. De trehalose-dimycolaten worden bij voorkeur toegepast in een concentratie van 50 tot 400 microgram per dosis.

Desgewenst kunnen andere bestanddelen of toevoegsels tezamen met de adjuvantia volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast. In de hiernavolgende voorbeelden werden de passieve hem-20 agglutinine proeven onder toepassing van dextran en SSS III polysacchariden als volgt uitgevoerd:

Voorschrift voor de passieve hemagglutinatie (HA) proef onder toepassing van dextran

Men waste 5 ml rode bloedcellen van schapen (SRBC) in Alsever’s oplossing 5 malen in een zoutoplossing.

Men loste palmitoyldextran op in een zoutoplossing in een concentratie van 1 mg/ml en voegde 0,5 ml (500 25 pg palmitoyl-dextran) toe aan 5 ml van een 10%-ige gewassen SRBC-oplossing. Dit mengsel werd goed gemengd en 30 minuten geïncubeerd bij 37°C. De dextran-SRBC-oplossing werd 5 malen gewassen in een zoutoplossing en daarna werden de cellen weer gesuspendeerd in een concentratie van 10%.

Onder toepassing van een microtiterplaat met een V-bodem en 96 holten werden serummonsters in tweevoudige stappen verdund onder toepassing van een 0,5%-ige runderserum albumine (BSA) zoutbuffer.

30 Het eindvolume in elke holte was 50 pl. Aan elke holte werden 50 μΙ 0,5% dextran SRBC toegevoegd. De platen werden een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd.

Aan een identiek stel microtiterplaten werden 50 μΙ 0,1 M 2-mercaptoethanol toegevoegd na de verdunning van de serummonsters en dit werd daarna gevolgd door toevoeging van 50 μΙ van het met dextran beklede SRBC.

35

Voorschrift voor de passieve hemagglutinatie (HA) proef onder toepassing van SSS III polysaccharide Men waste 5 ml rode bloedcellen van schapen (SRBC) 5 malen in een zoutoplossing (0,85%). Men loste SSS III polysaccharide op in een zoutoplossing tot 1 mg/ml. Men voegde aan 0,5 ml gepakte SRBC toe: 1) 1 ml van een zoutoplossing en 2) 1 ml SSS III in een zoutoplossing (1000 pg). Het mengsel werd 40 zachtjes in werveling gebracht en onder voortzetting van deze behandeling druppelde men 1 ml van een 0,1%-ige chromichloride (CrCI3.6H20) oplossing in een zoutoplossing toe. Men liet het mengsel 5 minuten staan bij kamertemperatuur. Het met SSS III beklede SRBC werd 5 malen gewassen in een zoutoplossing en weer gesuspendeerd als een 10%-ige celsuspensie in een zoutoplossing.

Het serum van individuele muizen in elke groep werd verdund in tweevoudige stappen in holten van een 45 microtiterplaat met V-bodem en 96 holten. De aanvangsverdunning was 1:10 en het eindvolume van het verdunde serum per holte bedroeg 50 μΙ.

Men voegde aan elke holte die het verdunde serum bevatte 50 μΙ met SSS III bekleed SRBC (0,5%-ige celsuspensie) toe in incubeerde de platen een nacht bij kamertemperatuur. Aan een identieke reeks microtiterplaten voegde men, na verdunning van de serummonsters, 50 μΙ 0,1 M 2-mercaptoethanol toe, 50 gevolgd door 50 μΙ van het beklede SRBC.

In de hiernavolgende voorbeelden werden dextran, palmitoyldextran en polysaccharide (SSS III) in capsulevorm van het type III Streptococcus pneumoniae verschaft door Dr. P.J. Baker van het N.I.H.

Laboratory of Microbial Immunity, Bethesda, Maryland.

De volgende voorbeelden lichten de onderhavige uitvinding toe: 5 194603

Voorbeeld 1

Bij deze proef diende men BALB/C muizen (6 muizen per groep) een subcutane injectie (0,2 ml/dier) van het volgende toe: groep 1,100 pg dextran in een zoutoplossing; groep 2,100 pg dextran + 50 pg RDE in een zoutoplossing; 5 groep 3,100 pg dextran + 50 pg RDE in een zoutoplossing geëmulgeerd in een gelijk volume LES lipide emulsie; groep 4, 100 pg dextran geëmulgeerd in een flesje dat gelyofiliseerde olie-in-water-emulsie van 50 pg RDE + 50 pg TDM/dosis bevatte; groep 5 ontving geen antigenen.

Op de 20® dag na de primaire immunisatie ontvingen alle muizen in elke groep een tweede injectie, die op dezelfde wijze als de eerste injectie was bereid.

10 Individuele serummonsters werden verzameld door een reeks bloedingen op verschillende tijden na de immunisatie.

De verkregen resultaten zijn vermeld in tabel I:

TABEL I

15 Passieve hemagglutinine (HA) titers van sera van muizen geïmmuniseerd met het polysaccharide antigeen Dextran alleen of gecombineerd met RDE en andere adjuvantia in verschillende typen oplossingen

Reciproke HA titers (dagen na immunisatie)

Groep behandeling 6 16 30 48 20 ----——-——--- 1 Dextran® 163(15)b 340(33) 672(54) 240(60) 2 Dextran+RDE 800(50) 1228(126) 2368(248) 1386(168) 3 Dextran+RDE+(LES) 928(76) 2668(660) 3200(400) 2816(232) 4 Dextran+RDE+TDM 373(10) 1120(88) 1813(173) 1493(163) 25 (olie-in-water) 5 Geen 20(10) 40(20) 40(20) 10(10) a Alle groepen die antigeen ontvingen werden op de dag 0 en 20 subcutaan geïnjecteerd.

b De resultaten zijn uitgedrukt in de gemiddelde reciproke titer voor elke groep. Die beginverdunning voor elk serummonsters was 1:10.

30 De getallen tussen haken zijn de gemiddelde titers van de sera behandeld met 0,1 M 2-mercaptoethanol. Deze geven IgG responsen weer.

Voorbeeld 2

Bij deze proef werden BALB/C muizen subcutaan geïnjecteerd (0,2 ml) met polysaccharide antigeen (0,5 pg/muis) alleen of gecombineerd met RDE adjuvans en wel op de volgende wijze: groep 1, SSS III 35 werd toegediend als een waterige oplossing, groep 2, SSS III waterige oplossing werd geëmulgeerd in een flesje dat een olie-in-water emulsie van RDE (50 pg/muis) en TDM (50 pg/muis) bevatte, groep 3, SSS III waterige oplossing werd toegevoegd aan RDE (100 pg/muis) in een waterige oplossing en het mengsel werd toegevoegd aan een gelijk volume van LES en geëmulgeerd. Groep 4, waterige SSS III werd toegevoegd aan waterige RDE (50 pg/muis) en gemengd met een gelijk volume aluminiumhydroxidegel 40 (Alhydrogel), terwijl groep 5 niet geïmmuniseerd werd.

Alle groepen bevatten 10 muizen die 6-8 weken oud waren. Aan de muizen in elke groep werd een tweede subcutane injectie op dag 21 toegediend, bestaande uit SSS III (0,5 pg/muis) geëmulgeerd in RDE-TDM olie-in-water-emulsie. De tussen haken gegeven tabellen geven de gemiddelde titer van deze zelfde sera na behandeling met 0,1 M 2-mercaptoethanol weer.

45 De verkregen resultaten zijn vermeld in de hierna volgende tabel II:

TABEL II

Passieve hemagglutinine (HA) titers van sera van muizen die geïmmuniseerd zijn met 0,5 pg pneumococ-caal polysaccharide antigeen (SSS III) alleen of gecombineerd met RDE en andere adjuvantia 50 -—---

Reciproke waarden van HA-titers (dagen na immunisering)

Groep behandeling 7 14 28 42 1 SSS lil® 240(28)b 56(17) 520(164) 182(40) 55 2 SSS lll+RDE+TDM 792(104) 240(58) 960(400) 1296(480) (olie-in-water)

Claims (4)

194603 6 TABEL II (vervolg) Passieve hemagglutinine (HA) titers van sera van muizen die geïmmuniseerd zijn met 0,5 Mg pneumococ-caal polysaccharide antigeen (SSS III) alleen of gecombineerd met RDE en andere adjuvantia 5 Reciproke waarden van HA-titers (dagen na immunisering) Groep behandeling 7 14 28 42

1. Immunologisch adjuvans ter verbetering van de immunorespons tegen natuurlijke of polysaccharideanti-genen bevattende: (1) een emulsiesysteem en (2) een gezuiverd, ontgift endotoxine (RDE), met het kenmerk, dat het adjuvans verder bevat: (3) een polysaccharideantigeen, en desgewenst 50 (4) trehalosedimycolaat (TDM), waarbij het emulsiesysteem (1) wordt gekozen uit: (A) een lipide-emulsiesysteem (LES) bevattende: (a) een metaboliseerbare olie, (b) een polyol met een laag molecuulgewicht, en (c) lecithine, en 55 (B) een olie-in-wateremulsiesysteem (O/W) bevattende: (a) een lichte, niet biologisch ontleedbare koolwaterstofolie of een biologisch ontleedbare olie, en (b) een wasactief middel. 7 194603

1 SSS IIIs 0,5 240.(28)b 56(17) 520(164) 182(40)

2. Adjuvans volgens conclusie 1, waarbij het antigeen en het gezuiverde, ontgifte endotoxine in een steriele zoutoplossing aanwezig zijn.

2 SSS lll+RDE 0,5+100 1472(232) 448(12) 1152(672) 1536(736)

3. Adjuvans volgens conclusie 2, waarbij de antigeenconcentratie in de steriele zoutoplossing tussen 0,1 en 5000 pg/ml ligt en de concentratie van het gezuiverde, ontgifte endotoxine in de steriele zoutoplossing 5 tussen 125 en 1000 pg/ml ligt.

3 SSS lll+RDE 0,5+50 3104(240) 624(144) 1152(640) 1280(800)

4 SSS lll+RDE 0,25+100 512(84) 168(50) 1152(386) 800(220)

35. SSS lll+RDE 0,25+50 304(48) 144(34) 928(320) 928(144) a SSS III is het gezuiverde capsulaire polysaccharide van type III Streptococcos pneumoniae. De muizen werden subcutaan geïmmuniseerd op dag 0 en dag 21. b De resultaten zijn uitgedrukt in de gemiddelde HA-titer van individuele serummonsters van een reeks bloedingen. De getallen tussen 40 haken geven de gemiddelde HA-titers van sera behandeld met 0,1 M 2-mercaptoethanol weer. Deze stellen IgG responsen voor.

3 SSS lll+RDE+LES 1472(232) 448(120) 1152(672) 1536(736)

4 SSS lll+RDE+Alhydrogel 80(10) 23(12) 100(26) 62(8)

10. Geen 10(0) 20(15) 20(10) 10(0) a SSS III is het gezuiverde capsulaire polysaccharide van type III Streptococcus pneumoniae. De muizen werden subcutaan geïmmuniseerd op dag 0 en op dag 21. b De resultaten zijn uitgedrukt in de gemiddelde reciproke titer van elke groep. De beginverdunning voor elk serummonsters bedroeg 1:10. 15 De getallen tussen haken zijn de gemiddelde titers van sera behandeld met 0,1 M 2-mercaptoethanol. Voorbeeld 3 Bij deze proef werd aan BALB/C muizen een subcutane injectie (0,2 ml/muis) van SSS III polysaccharide antigeen, alleen of gemengd met RDE in het LES lipide emulsie adjuvans-systeem toegediend. Men diende 20 21 dagen na de primaire immunisatie aan alle muizen een tweede injectie van SSS III (0,5 pg) gemengd in de RDE-TDM olie-in-water-emulsie toe. De verkregen resultaten zijn vermeld in tabel III. TABEL III

25 Passieve hemagglutinine (HA) titers van sera van muizen die zijn geïmmuniseerd met verschillende doses pneumococcaal polysaccharide antigeen (SSS III) gemengd met RDE in het lipide emulsie systeem (LES). Reciproke waarden van HA-titers (dagen na immunisatie) Groep behandeling Dosis (ugs) 7 14 28 42 30 -----

4. Adjuvans volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de lipide-emulsie 30 tot 46 gew.% van de metaboliseerbare olie, 30 tot 60 gew.% van het polyol met een laag molecuulgewicht en 1 tot 15 gew.% lecithine bevat, of het olie-in-wateremulsiesysteem 0,5 tot 3 gew.% van een niet biologisch ontleedbare lichte koolwaterstofolie of een biologisch ontleedbare olie, en een wasactief middel bevat. Hierbij 1 blad tekening