CH675076A5 - - Google Patents

Description

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CH 675 076 A5

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein immunologisches Adjuvans zur Erhöhung der Immunwirkung gegenüber natürlichen oder Polysaccharid-Antigenen. Das erfindungsgemässe Adjuvans enthält ein Emuisions-System, das nachfolgend definiert wird sowie ein raffiniertes entgiftetes Endotoxin. Das genannte Adjuvans kann dazu verwendet werden, um Polysaccharid-Antigene mehr immunogen zu machen, wenn sie mit den Adjuvantien der vorliegenden Erfindung kombiniert werden.

Bevor der vorliegenden Erfindung wurde in der Literatur berichtet, dass Polysaccharid-Antigene hauptsächlich den IgM-Antikörper mit geringer oder keiner IgG-Antwort stimulierten. Ausserdem war es schwierig mit Polysaccharid-Antigenen bei Versuchstieren und Menschen eine amnastische Antwort oder ein immunologisches Gedächtnis zu erhalten. Demgemäss hatte die Immunität, die unter Verwendung der Polysaccharid-Antigene induziert wurde, ein kurzes Leben. Zusätzlich haben sich Polysaccha-rid-Vakzine bei jungen Kindern als nicht mehr immunogen erwiesen. Aus diesem Grund besteht das Bedürfnis zur Bereitstellung eines Verfahrens, bei welchem Polysaccharid-Antigene mehr immunogen gemacht werden könnten und auf diese Weise eine grössere Antikörperproduktion stimulieren, einschliesslich einer IgG-Antwort und des immunologischen Gedächtnisses.

In ihrem breitesten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf neue immunologische Adjuvantien für natürliche oder Polysaccharid-Antigene gerichtet. Das erfindungsgemässe immunologische Adjuvans, das sich für die Erhöhung der Immun-Antwort gegenüber natürlichen oder Polysaccharid-Antigenen als nützlich erweist, ist dadurch gekennzeichnet, dass es

(i) ein Emulsions-System der Gruppe (A) ein Lipid-Emulsions-System, das

(a) ein metabolisierbares Öl,

(b) ein Polyol mit niederem Molekulargewicht und

(c) Lezithin der Formel worin Ri und R2 Fettsäuren darstellen, die bis zu 22 Kohlenstoffatome enthalten und R3 Cholin ist, enthält, oder

(B) ein ÖI-in-Wasser-Emulsionssystem, das

(a) ein leichtes, nicht-bioabbaubares Kohlenwasserstoff-Öl oder ein bioabbaubares Öl und

(b) ein Detergens enthält und

(ii) ein raffiniertes entgiftetes Endotoxin umumfasst.

Das erfindungsgemässe Adjuvans umfasst gegebenenfalls auch ein Trehalose-dimycolat (TDM).

Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Adjuvans zur Verfügung, durch dessen Verwendung man Polysaccharid-Antigene stärker immunogen machen kann, wenn man sie mit diesen Adjuvantien, die sich in einem Lipid-Emulsionssystem oder in einem ÖI-in-Wasser-Emulsions-System befinden, kombiniert. Die Immuno-Antworten, die durch die Polysaccharid-Antigene und die erfindungsgemässen Adjuvans-Sy-steme ausgelöst werden, unterscheiden sich auffallend in verschiedenen Beziehungen von den Antworten, die durch das Antigen alleine ausgelöst werden. Es wurde beobachtet, dass das mit dem Adjuvans kombinierte Antigen eine höhere Antikörperproduktion stimuliert, als diejenige, die durch das Antigen allein induziert werden kann, wie durch höhere Titer gemessen wurde. Zusätzlich stimuliert die Adjuvans-Antigen-Mischung die Produktion des Antikörpers der IgG-Klasse mit einem höheren Titer, als demjenigen, der mit dem Antigen allein erhalten wurde.

Es wurde ebenfalls beobachtet, dass die genannte Adjuvans-Antigen-Mischung ein immunologisches Gedächtnis auslöst, wie durch eine höhere Antikörper-Antwort, die einer zweiten Injektion des Antigens folgte, im Vergleich mit dem Resultat, das mit einer primären Immunisierung erhalten würde, gezeigt wurde.

Bevor dieser Erfindung wurde über keine Adjuvantien irgendeines Types jemals berichtet, dass sie wirksame Immuno-Potentiatoren von reinen Polysaccharid-Antigenen sind. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Erhöhung der Immunogenizität von Polysaccharid-Antigenen zur Verfügung, welche bisher noch nicht existiert haben. Dementsprechend sind die Adjuvantien der vorliegenden Erfindung zum Stimulieren von primären sowohl als auch sekundären (nämlich das Gedächtnis) Immun-Ant-worten warmblütiger Tiere auf Vakzine, die Polysaccharid-Antigene von den verschiedensten Quellen enthalten, nützlich. So z.B. umfassen Polysaccharid-Antigene, die man mit den Adjuvantien der vorlie-

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genden Erfindung verwenden kann, solche, die aus den Kapseln von Bakterien, wie z.B. Streptococcus pneumoniae, Neusseria meningitidis, Klebsiella pneumonia, Salmonella typhi oder Hemophilus influenza, gereinigt wurden. Andere Polysaccharid-Antigene, wie man sie aus Kapseln oder Zellwänden von Pilzen oder Zellwänden gram-positiven und gram-negativen Bakterien erhalten kann, können ebenfalls mit den Adjuvantien der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die einzige Bedingung für das Polysaccha-rid-Adjuvans beruht darauf, dass die Immun-Antwort, die durch solch ein Antigen ausgelöst wird, derartig ist, dass sie durch die Gegenwart eines geeigneten biologischen Adjuvans verstärkt werden kann.

Wie schon vorher erwähnt wurde, ist von vielen Polysaccharid-Antigenen bekannt, dass sie das Im-mun-System stimulieren. Jedoch ist die ausgelöste Antwort primär der IgM-Typ des Antikörpers, ohne die Fähigkeit, ein immunologisches Gedächtnis für eine zweite Antwort zu induzieren. Hier wird gemäss der vorliegenden Erfindung eine Emulsion (mit einem Lipid-Emulsions-Systém (LES) oder O/W) gebildet, welche das Polysaccharid-Antigen und ein biologisches Adjuvans enthält. Das resultiert in der Präsentation des Antigens in einer besonderen Form für die Zellen des Immunsystems, in einer langsamen Anti-gen-Abgabe an das Immunsystem und in einer Stimulierung von Progenitor-Zellen, die für die Immun-Antwort infrage kommen.

Wie schon weiter oben erwähnt, umfasst das immunologische Adjuvans gemäss der vorliegenden Erfindung zwei Komponenten. Die erste Komponente ist entweder ein Lipid-Emulsions-System (LES) oder ein ÖI-in-Wasser-Emulsions-System (O/W). Die zweite Komponente stellt eines oder mehrere gereinigte, entgiftete Endotoxinbiologische - Adjuvantien dar. Das Lipid-Emulsions-System (LES) enthält ein me-tabolisierbares Öl, ein Polyol mit niederem Molekulargewicht und Lezithin der weiter oben angeführten Formel. In der Praxis wurde gefunden, dass das in dem LES verwendete metabolisierbare Öl vorzugsweise ein Fettöl ist, das hauptsächlich aus Diglyceriden und Triglyceriden von Öl- und Linolsäuren besteht. Besonders bevorzugt sind die pflanzlichen Fettöle, die in Erdnussöl, Sonnenblumensamenöl, Di-stelsamenöl, Maisöl und ähnlichen enthalten sind oder aus diesen erhalten werden können. Andere Öle, wie z.B. Olivenöl, Baumwollsamenöl oder Squalen, können ebenfalls in den Adjuvantien gemäss der vorliegenden Erfindung enthalten sein. Das Öl ist metabolisierbar, es sollte mit den anderen Komponenten des Emulsionssystems und dem bakteriellen Adjuvans selbst verträglich sein und es muss in Kombination mit den anderen Komponenten bei der Erhöhung der Immun-Antwort gegenüber Polysaccharid-Antigenen wirksam sein.

In der Praxis kann man eine grosse Mannigfaltigkeit an Polyolen in dem Lipid-Emulsions-System verwenden. Die verwendeten Polyole sind Polyole mit niederem Molekulargewicht, die vorzugsweise flüssig und mit dem metabolisierbaren Öl, in welchen die Lezithin-Komponente löslich ist, mischbar sind. Geeignete Polyole umfassen unter anderem Ehtylenglycol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, Glycerin, 1,4-Butandi-ol, 1,3-Butandiol, 1,2,4-Butantriol, 1,5-Pentandiol und ähnliche.

Wie schon gezeigt, ist die dritte Komponente des Lipid-Emulsions-Systems Lezithin. Der Ausdruck «Lezithin», wie er hier in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, soll alle Gruppen von Phospholipiden umfassen, welche die folgende allgemeine Formel aufweisen:

worin Ri und R2 Fettsäuren darstellen, die bis zu 22 Kohlenstoffatome enthalten und R3 Cholin ist. Diese Phospholipide stellen gewöhnlich eine Mischung der Diglyceride von Stearin-, Palmitin-, Linol- oder Lino-lenfettsäuren dar, die an den Cholinester von Phosphorsäure gebunden sind.

In der Praxis wurde gefunden, dass der nichtwässrige Teil des Lipid-Emulsions-Systems vorzugsweise 30 bis 60 Gew.-% des metabolisierbaren Öls, 30 bis 60 Gew.-% Polyol und 1 bis 15 Gew.-% Lezithin enthalten sollte.

Zur Erläuterung der Herstellung des Lipid-Emulsion-Systems löste man vorzugsweise einen Teil (10 g) steriles Lezithin in 10 Teilen (100 g) weissem Glycerin durch sorgfältiges Erhitzen bei einer Temperatur von 60°C auf einer heissen Platte, während man mit einem magnetischen Rührer rührte. Vor der Verwendung gab man das Glycerin durch eine Filtereinheit von 0,2 Mikrometer hindurch, um es zu sterilisieren. Anschliessend gab man die Glycerin- und Lezithin-Mischung in ein steriles Mischgefäss und fügte 10 Teile Erdnussöl (100 g; sterilisiert durch Verwendung eines 0,2 Mikrometer-Filters) langsam zu der Glycerin- und Lezithin-Mischung, während man bei mässiger Geschwindigkeit mischte. Wie schon vorher erwähnt wurde, kann die erste Komponente des immunologischen Adjuvans ein Öl-in-Wasser (O/W) Emulsions-System anstelle eines Lipid-Emulsions-Systems sein. Dieses O/W-System kann ein metaboli-sierbares Öl, wie z.B. Squalen, enthalten oder ein nicht metabolisierbares Öl, wie z.B. Squalan, ein leichtes Mineralöl, 7-n-Hexyl-octadecan, Kokosnussöl oder «Drakeöl-6 VR-Mineralöl» (hergestellt von Pennreco Company, Butler, Pa.). Die ÖI-in-Wasser-Emulsion enthält ebenfalles ein Detergens. Die

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Menge des Detergens liegt typischerweise in einem Bereich von 0,02 und 0,20 und vorzugsweise in einem Bereich zwischen 0,10 und 0,20 Vo!.-%, bezogen auf den wässrigen Anteil der Emulsion. Jedes beliebige bekannte Detergensmaterial kann verwendet werden, einschliesslich von «Tween-80» und Ar-lacel (hergestellt von Atlas Chemical Company). Das Öl sollte 0,5 bis 3% des gesamten Volumens der Emulsion ausmachen. Die in dem flüssigen Emulsions-System und in dem Öl-in-Wasser-System verwendeten Komponenten sind selbstverständlich hoch rein und von einem pharmazeutisch annehmbaren Grad.

Die zweite Komponente des immunologischen Adjuvans ist ein gereinigtes, entgiftetes Endotoxin. Das entgiftete Endotoxin, anschliessend auch mit RDE bezeichnet, kann aus Re-Mutant-Stämmen von Salmonella erhalten werden. Das gereinigte Endotoxin kann ebenfalls aus anderen Enterobakterien erhalten werden, wie es im US-Patent 4 436 728 offenbart ist, welches hier durch" Referenz eingeschlossen ist. Das entgiftete Endotoxin kann ebenfalls synthetisch oder durch genetische Ingenieurtechniken hergestellt werden. Fakultativ kann das erfindungsgemässe Adjuvans Trehalose-dimycolat (TDM) enthalten. TDM kann man ebenfalls aus beliebigen Mycobakterien erhalten, einschliesslich, aber nicht einschränkend aus M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stämme H 37 RV und Ayoma B), M. bovis BCG, M. smeg-matis, M. kansaii oder M. bovinis; TDM kann man ebenfalls aus Nocardia rubra und Carynebacterium diphtheriae erhalten. TDM kann man herstellen, wie es im U.S. Patent 4 505 900 beschrieben ist.

Die Herstellung der Polysaccharid-Vakzine unter Einverleibung von LES geschieht vorzugsweise folgendermassen: Die zweite Komponente oder Komponenten (RDE und fakultativ TDM), aufgelöst in Chloroform: Methanol 4:1, werden in eine sterile Ampulle gegeben und man dampft das Lösungsmittel in einem Strom von sterilem Stickstoff ab. Man gibt das Polysaccharid-Antigen in steriler Salzlösung zu der zweiten Komponente oder Komponenten, gefolgt durch vollständiges Mischen. In der Praxis werden etwa 3 Volumen der Polysaccharid-antigenbakterielien-Adjuvansmischung zu einem Volumen der LES-Mischung gegeben, deren Herstellung weiter oben beschrieben wurde, und diese wässrig-ölige Mischung wird in einer Vortex-Vorrichtung oder in einer Mischmaschine so lange gemischt, bis man eine weisse milchige Emulsion erhält. Die Mischung der zwei Komponenten, um die Emulsion zu erhalten, wird üblicherweise in 2-5 Minuten vollendet. Die Konzentration des Polysaccharid-Antigens in der endgültigen Emulsion beträgt gewöhnlich 0,1 bis 1000 Mikrogramm pro 0,2 Milliliter; die Konzentration von RDE beträgt vorzugsweise 25 bis 200 Mikrogramm pro 0,2 Milliliter; und die Konzentration von TDM, falls anwesend, kann 50 bis 400 Mikrogramm pro 0,2 Milliliter betragen.

Obgleich das Optimalverhältnis der zwei Phasen der LES-enthaltenden Form des immunologischen Adjuvans gewöhnlich etwa drei Volumen der Polysaccharid-Antigen-entgifteten bakteriellen Adjuvans-Salzlösung zu etwa einem Volumen des Lipid-Emulsions-Systems beträgt, kann das Verhältnis des Lipid-Emulsions-Systems zu der Antigen-Adjuvans-Lösung von 1:1 zu 1:8 variieren, wobei ein Verhältnis von 1-3 bevorzugt ist.

Eine bevorzugte Erläuterung des Öl-in-Wasser-Systems ist wie folgt: 5 mg RDE und 10 mg TDM, jede jeweils in Chloroform:Methanol 4:1 gelöst, werden in einen 350 ml Gewebe-Homogenisator (Bellco) gegeben. Das Lösungsmittel wird von der RDE-TDM-Mischung mit einem Strom sterilen Stickstoffs abgedampft. Danach folgt die Zugabe von 2 ml sterilem Öl (Drakeol 6 VR Mineralöl [Pennreco Company, Butler, PA], leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan) und die Mischung wird eine Minute lang unter Verwendung eines mit einem Motor angetriebenen Stössels homogenisiert, bis man eine Öl-Paste Konsistenz erhält. 98 ml 0,2%iges Tween-80 in Salzlösung werden dann in den Homogenisator hineingegeben. Unter Verwendung eines mit einem Motor angetriebenen Stössels wird die Mischung dann weiter etwa 4-5 Minuten lang homogenisiert, bis man eine Emulsion erhält.

Eine entsprechende Menge des Polysaccharid-Antigens in Wasser wird zu der flüssigen Emulsion gegeben, welches man dann durch wiederholtes Ansaugen und Injektionen unter Verwendung einer Spritze und einer 20-Kalibernadel mindestens zwei Minuten lang mischt, bis die entstandene Emulsion ein wolkig-milchiges Aussehen erhalten hat.

Die ÖI-in-Wasser-Emulsion kann optimal lyophilisiert werden, indem man 5 ml in einer 10 ml Wheaton-Serum-Ampulle dispensiert. Die Ampulle wird in einer Revco-Gefriervorrichtung bei einer Temperatur von 95°C gefroren und in einem sterilen Behälter auf einem Labconoco-Gefrier-Trockner lyophilisiert. Die Ampulle wird dann unter Anwendung steriler Techniken geschlossen. Die lyophilisierte RDE-TDM-Emulsion wird in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt, indem man 5 ml steriles Wasser, das die gewünschte Konzentration des Polysaccharid-Antigens aufweist, injiziert. Durch wiederholtes Ansaugen und Injektionen unter Verwendung einer Spritze für mindestens zwei Minuten, bis die entstandene Emulsion ein wolkiges, milchiges Aussehen erhält, wird emulgiert.

Durch ein beliebiges, der weiter oben beschriebenen Verfahren (nämlich LES oder O/W), können Emulsionen der wässrigen Polysaccharid-Antigenlösung erhalten werden, welche eine langsame Abgabe des Antigens, eine Verlängerung der Antigen-Stimulierung und eine Zell-Stimulierung, ähnlich dem Antigen, welches durch das oder die entgifteten antibakteriellen Adjuvantien induziert wird, zur Folge hat. Diese Kombination von Aktivitäten vergrössert die Antwort des Gastes auf das Antigen, wie es aus den Tabellen und den Beispielen ersichtlich ist.

Wie schon weiter oben erwähnt wurde, kann das oder die immunologisches Adjuvantien optimal Treha-losedimycolat zusätzlich zu dem gereinigten, entgifteten Endotoxin enthalten. Trehalose-dimycolat (TDM) kann erhalten werden, wie es im U.S. Patent Nr. 4 505 900 beschrieben ist, aus Organismen wie

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z.B. M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis BCG. M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphtheriae.

Vorzugsweise arbeitet man folgendermassen: Bakterien, wie z.B. M.avium, werden gezüchtet, geerntet und dann durch Hitze getötet. Die Zellmasse wird anschliessend mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, was zu der Isolierung einer aktiven, in Lösungsmitteln löslichen Fraktion führt. Diese Fraktion wird weiter durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, um reines TDM zur Verfügung zu stellen. (Siehe Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P3; Azuma, et al., Journal of the National Cander Institute, Band 52, Seiten 95-101, 1974, hier durch Referenz eingeschlossen.) Wie von Azuma et al. offenbart wurde, kann man dann rohes TDM weiter durch Zentrifugal-Mikroteilchen-Silicagel-Chromatogra-phie reinigen, um gereinigtes TDM zu ergeben. Die Reinigung von TDM kann auch durchgeführt werden, indem man das Verfahren anwendet, welches im US Patent Nr. 4 579 945 eingereicht am 29. April 1982, offenbart ist.

Falls in dem Adjuvans-System vorhanden, verwendet man das Trehalose-dimycolat vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 5000 Mikrogramm pro Milliliter und mehr bevorzugt 250 bis 2000 Mikrogramm pro Milliliter.

Wie schon weiter oben erwähnt, erhöhen die immunologischen Adjuvantien der vorliegenden Erfindung in Mischung mit einer Vielfalt von Polysaccharid-Antigenen die Immun-Antwort gegen solche Antigene und daher sind sie in einer Vielfalt von Vakzinen nützlich, sowohl für Tier- als auch menschliche Gäste. In der Praxis wurde gefunden, dass das gereinigte, entgiftete Endotoxin mit einer Konzentration von 25 bis 200 Mikrogramm pro Dose verwendet wird, wobei eine besonders verstärkte Immun-Antwort bei etwa 100 Mikrogramm pro Dose ausgelöst wird. Die Trehalose-dimycolate werden vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 400 Mikrogramm pro Dose verwendet. Falls gewünscht, kann man andere Komponenten oder Zusatzstoffe in Verbindung mit den Adjuvantien gemäss der vorliegenden Erfindung verwenden.

In den nachfolgenden Beispielen wurden die passiven Hämagglutinin-Proben unter Verwendung von Dextran und SSS-lll-Polysaccharide wie folgt ausgeführt:

Protokoll für die passive Hämaaalutinin (HAVProbe unter Verwendung von Dextran

5 ml roter Blutzellen von Schafen (SRBC) in Alsever-Lösung wurden fünfmal mit Salzlösung gewaschen. Palmitoyl-dextran wurde in Salzlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst und 0,5 ml (500 ng Palmitoyl-dextran) wurden zu 5 ml von 10% gewaschener SRBC-Lösung gegeben. Diese Mischung wurde gut gemischt und 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 373C inkubiert. Die Dextran-SRBC-Lösung wurde fünfmal in Salzlösung gewaschen und dann wurden die Zellen bei einer Konzentration von 10% wieder suspendiert.

Unter Verwendung einer V-Boden-96-Gruben-Microtiter-Platte wurden Serumproben in 2-fachen Stufen unter Verwendung eines 0,5% Ochsen-Serum-Albumin-(BSA)-SalzIösung-Puffers verdünnt. Das endgültige Volumen jeder Grube betrug 50 jil. Zu jeder Grube gab man 50 nl 0,5% Dextran-SRBC. Die Platten wurden über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert.

Zu einem identischen Set von Microtiter-Platten gab man 50 nl 0,1 M 2-Mercaptoethanol, nachfolgend der Verdünnung der Serumproben, und dann wurden 50 (il des Dextran-überzogenen SRBC's hinzugefügt.

Protokoll für die passive Hämaaalutinin (HAVProbe unter Verwendung von SSS-lll-PoIvsaccharid

5 ml rote Blutzellen von Schafen (SRBC) wurden fünfmal in Salzlösung (0,85%) gewaschen. Man löste SSS-lll-Polysaccharid in Salzlösung mit 1 mg/ml. Zu 0,5 ml des gepackten SRBC gab man: 1) 1 ml Salzlösung und 2) 1 ml SSS III in Salzlösung (1000 ng). Die Mischung wurde vorsichtig aufgewirbelt und man gab ein ml von 0,1%igem Chrom(lll)-chlorid (CrCl3.6H20) in Salzlösung tropfenweise während der Auf-wirbelung hinzu. Man liess die Mischung 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen. Das SSS-III-überzogene-SRBC wurde fünfmal in Salzlösung gewaschen und dann wieder als 10%ige Zellsuspension in Salzlösung suspendiert.

Das Serum für einzelne Mäuse in jeder Gruppe wurde in zweifachen Stufen in Gruben einer V-Boden-96-Gruben-Microtiter-Platte verdünnt. Die Anfangsverdünnung betrug 1:10 und das endgültige Volumen des verdünnten Serums pro Grube war 50 nl.

Zu jeder Grube, die verdünntes Serum enthielt, gab man 50 (il von SSS-lll-überzogenes-SRBC (0,5%ige Zell-Suspension) und die Platten wurden bei Zimmertemperatur über Nacht inkubiert. Zu einem identischen Set von Microtiter-Platten gab man 50 fil 0,1 M 2-Mercaptoethanol nach Verdünnung der Serumproben und das wurde dann gefolgt von 50 jd des überzogenen SRBC.

In den folgenden Beispielen wurde das Dextran, das Palmitoyl-dextran und das kapsuläre Polysaccharid (SSS III) vom Typ III Streptococcus pneumoniae von Dr. P.J. Baker vom N.I.H. Laboratory of Micio-bial Immunity, Bethesda, Maryland zur Verfügung gestellt.

Die vorliegende Erfindung ist in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben:

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Beispiel 1

In diesem Versuch gab man BALB/C-Mäusen (6 Mäuse/Gruppe) eine subcutane Injektion (0,2 ml/Tier) des folgenden: Gruppe 1,100 ng Dextran in Salzlösung; Gruppe 2,100 ng Dextran + 50 [ig RDE in Salzlösung; Gruppe 3, 100 ftg Dextran + 50 u.g RDE in Salzlösung emulgiert in einem gleichen Volumen der LES-Lipid-Emulsion; Gruppe 4, 100 jxg Dextran, emulgiert in einer Ampulle, die eine lyophilisierte Öl-in-Was-ser-Emulsion von 50 pg RDE + 50 |ig TDM/ Dose enthält; Gruppe 5 erhielt kein Antigen.

Am Tag 20 nach der primären Immunisierung erhielten alle Mäuse in jeder Gruppe eine zweite Injektion, die auf die gleiche Weise wie die erste Injektion hergestellt worden war.

Die einzelnen Serum-Proben wurden durch reihenmässige Aderlasse bei verschiedenen Zeiten nach der Immunisierung gesammelt.

Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt:

Tabelle I

Passive Hämagglutinin (HA)-TIter von Seren aus Mäusen, immunisiert mit dem Polysaccharid-Antigen-Dextran alleine oder in Kombination mit RDE und anderen Adjuvantien in verschiedenen Typen von Lösungen

Gruppen-Behandlung Reziproker Wert von HA-Titern

(Tage nach der Immunisierung)

6 16 30 48

1

Dextran3

163 (15)b

340 (33)

672 (54)

240 (60)

2

Dextran + RDE

800 (50)

1228(126)

2368 (248)

1386 (168)

3

Dextran + RDE + (LES)

928 (76)

2668 (660)

3200(400)

2816(232)

4

Dextran + RDE + TDM

373(10)

1120(88)

1813(173)

1493 (163)

(Öl-in-Wasser)

5

Keine

20(10)

40 (20)

40 (20)

10(10)

a Alle Gruppen, die ein Antigen erhielten, injizierte man subcutan am Tag 0 und am Tag 20.

b Die Resultate sind ausgedrückt als mittlerer reziproker Titer für jede Gruppe. Die Ausgangsverdünnung für jede Serum-Probe war 1:10. Zahlen in Klammern stellen die mittleren Titer von Seren dar, die mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol behandelt waren. Diese stellen die IgG-Antworten dar.

Beispiel 2

In diesem Beispiel injizierte man BALB/C-Mäusen subcutan (0,2 ml) des Polysaccharid-Antigens (0,5 (ig/Maus) alleine oder in Kombination mit dem RDE-Adjuvans wie folgt: Gruppe 1, SSS III wurden in Form einer wässrigen Lösung verabreicht; Gruppe 2, SSS-lll-wässrige Lösung wurde in einer Ampulle emulgiert, die ein OI-in-Wasser-Emulsion von RDE (50 ng/Maus) und TDM (50 ng/Maus) enthielt; Gruppe 3, SSS-lll-wässrige Lösung gab man zu RDE (100 ng/Maus) in einer wässrigen Lösung und die Mischung wurde zu einem gleichen Volumen von LES gegeben und emulgiert; Gruppe 4, wässrige SSS III gab man zu wässrigem RDE (50 ng/Maus) und mischte mit einem gleichen Volumen von Aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel); Gruppe 5 wurde nicht immunisiert.

Alle Gruppen enthielten 10 Mäuse, welche 6-8 Wochen alt waren. Den Mäusen in jeder Gruppe gab man eine zweite subcutane Injektion am Tag 21, die aus SSS III (0,5 ng/Maus) bestand, emulgiert in einer RDE-TDM-Ölin-Wasser-Emulsion. Die Zahlen in den Klammern stellen die Haupttiter dieser Seren nach der Behandlung mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol dar.

Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt:

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Tabella II ; .

Passive Hämagglutinin (HA)-Titer von Seren aus Mäusen, immunisiert mit 0,5 jig Pneumococcus-Poly-saccharid-Antigen (SSS III) alleine oder in Kombination mit RDE und anderen Adjuvantien. Gruppen-Behandlung Reziproker Wert von HA-Titern

(Tage nach der Immunisierung) 7 14 28 42

1

SSS ll!a

240 (28)b

56 (17)

520 (164)

182(40)

2

SSS III + RDE + TDM (Öl-in-Wasser)

792(104)

240 (58)

960 (400)

1296(480)

3

SSS III + RDE + LES

1472 (232)

448 (120)

1152 (672).

1536(736)

4

SSS III + RDE + Alhydrogel

80 (10)

23 (12)

100(26)

62(8)

5

Keine

10(0)

20 (15)

20 (10)

10(0)

a SSS III ist das gereinigte kapsuläre Polysaccharid vom Typ SSS Iii Streptococcus pneumoniae. Die Mäuse wurden subcutan am Tag 0 und am Tag 21 immunisiert.

b Die Resultate sind als reziproke Titer für jede Gruppe ausgedrückt. Die Ausgangsverdünnung für jede Serum-Probe betrug 1:10. Die Zahlen in Klammern sind die mittleren Titer von Seren, die mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol behandelt worden waren.

Beispiel 3

In diesem Beispiel injizierte man BALB/C-Mäusen subcutan (0,2 ml/Maus) SSS-lll-Polysaccharid-An-tigen alleine oder vermischt mit RDE in dem LES-Lipid-Emulsions-Adjuvans-System. Allen Mäusen verabreichte man eine zweite Injektion von SSS III (0,5 |ig), vermischt mit der RDE-TDM-ÖI-in-Wasser-Emulsion 21 Tage nach der primären Immunisierung.

Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt:

Tabelle III

Passive Hämagglutinin (HA)-Titervon Mäuse-Seren, immunisiert mit verschiedenen Dosen von Pneumo-coccus Polysaccharid-Antigen (SSS III), vermischt mit RDE in dem Lipid-Emulsions-System (LES). Gruppen-Behandlung Dose ((ig) Reziproker Wert der HA-Titer

(Tage nach der Immunisierung)

7

14

28

42

1

SSS U!a

0,5

240 (28)b

56(17)

520 (164)

182(40)

2

SSS III + RDE

0,5+100

1472(232)

448 (12)

1152(672)

1536(736)

3

SSS III + RDE

0,5 + 50

3104(240)

624(144)

1152(640)

1280(800)

4

SSS III + RDE

0,25 + 100

512 (84)

168(50)

1152(386)

800 (220)

5

SSS III + RDE

0,25 + 50

304 (48)

144(34)

928 (320)

928(144)

a SSS-llI ist das kapsuläre Polysaccharid vom Typ III Streptococcus pneumoniae. Die Mäuse wurden subcutan am Tag 0 und am Tag 21 immunisiert.

b Die Resultate sind als mittlerer HA-Titer der einzelnen Serum-Proben aus serienmässigen Blutabnahmen ausgedrückt. Die Zahlen in Klammern stellen die mittleren HA-Titer von Seren dar, die mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol behandelt worden waren. Diese stellen die IgG-Antworten dar.

Claims (11)

Patentansprüche

1. Immunologisches Adjuvans zur Erhöhung der Immunwirkung gegenüber natürlichen oder Polysaccharid-Antigenen, dadurch gekennzeichnet, dass es (i) ein Emulsions-System der Gruppe (A) ein Lipid-Emulsions-System, das

(a) ein metabolisierbares Öl,

(b) ein Polyol mit niederem Molekulargewicht und

(c) Lezithin der Formel

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 675 076 A5

CHo0R.

| 2 1

CH0Ro (I)

I 2

CH20P020HR3

worin Ri und R2 Fettsäuren darstellen, die bis zu 22 Kohlenstoffatome enthalten und R3 Cholin ist, enthält, oder

(B) ein ÖI-in-Wasser-Emulsionssystem, das

(a) ein leichtes, nicht-bioabbaubares Kohlenwasserstoff-Öl oder ein bioabbaubares Öl und

(b) ein Detergens enthält und

(ii) ein raffiniertes entgiftetes Endotoxin umumfasst.

2. Adjuvans nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Trehalose-dimycolat um-fasst.

3. Adjuvans nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das s das metabolisierbare Öl ein Fettöl pflanzlichen Ursprungs ist, welches hauptsächlich Glyceride und Triglyceride umfasst.

4. Adjuvans nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das metabolisierbare oder bioabbaubare Öl Erdnussöl, Sonnenblumensamenöl, Distelöl, Maisöl, Olivenöl, Baumwollsamenöl oder Squalen ist.

5. Adjuvans nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-bioabbaubare Kohlenwasser-stoff-ÖI leichtes Mineralöl, Squalan, 7-n-Hexyl-octadecan; oder ein Mineralöl ist.

6. Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid-Emulsions-System 30 bis 60 Gew.-% metabolisierbares Öl, 30 bis 60 Gew.-% eines Polyols mit niederem Molekulargewicht und 1 bis 15 Gew.-% Lezithin der Formel I umfasst.

7. Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl-in-Wasser-Emulsions-System 0,5 bis 3 Gew.-% eines leichten nicht-bioabbaubaren Kohlenwasserstoff-Öls oder bioabbaubaren Öls und ein Detergens enthält.

8. Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polysaccharid-Antigen enthält.

9. Adjuvans nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen und das raffinierte entgiftete Endotoxin in einer sterilen Salzlösung enthalten sind.

10. Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Antigens in der sterilen Salzlösung 0,1 bis 5000 ng/ml ausmacht und dass die Konzentration des raffinierten entgifteten Endotoxins in der sterilen Salzlösung 125 bis 1000 ng/ml beträgt.

11. Adjuvans nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid-Emulsions-System 30 bis 60 Gew.-% eines metabolisierenden Öls, 30 bis 60 Gew.-% eines Polyols mit niederem Molekulargewicht und 1 bis 15 Gew.-% Lezithin der Formel I umfasst oder dass das Öl-in-Wasser-Emul-sions-System 0,5 bis 3 Gew.-% eines leichten nicht-abbaubaren Kohlenwasserstoff-Öls oder eines abbaubaren Öls und ein Detergens umfasst und die Konzentration des Antigens in der sterilen Salzlösung 0,5 bis 5000 ng/ml beträgt und die Konzentration des raffinierten entgifteten Endotoxins in der sterilen Salzlösung 125 bis 1000 ng/ml ausmacht

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