DE69410270T2

DE69410270T2 - Impfstoff gegen der hämorrhagische Schweine - Dysenterie und Impfstoffbausatz

Info

Publication number: DE69410270T2
Application number: DE69410270T
Authority: DE
Inventors: Marc Jean F-69003 Lyon Guillaud; Francis William F-69160 Tassin Milward; Joris Frans Camille Maurice F-38790 Diemoz Vandeputte
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1993-07-08
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1998-11-26
Anticipated expiration: 2014-07-09
Also published as: AU688777B2; AU7264594A; DK0707494T3; EP0707494B1; EP0707494A1; CA2166718C; FR2707168A1; CA2166718A1; FR2707168B1; WO1995001805A1; TW279803B; BR9407007A; DE69410270D1; US5750118A; ES2115245T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff gegen die hämorrhagische Schweine-Dysentene und auf einen Impfsatz zur Anwendung dieses Impfstoffs.
Der für das Syndrom der hämorrhagischen Dysentene verantwortliche Organismus heißt Serpulina hyodysenteriae (früher Treponema hyodysenteriae). Heute sind 9 Serotypen bekannt, die im wesentlichen in den USA, aber auch in Mexiko, England, Däne-mark, Holland, Australien [Klassifizierung nach Mapother und Joens, J. Clin. Microbiol., 1985, 22, 161-164] und kürzlich in Kanada mit den Serotypen 8 und 9 [Z. Li, J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 2794-2797; 30 (11), 2941-2947] identifiziert wurden.
Bis heute wurden zahlreiche Impfversuche durchgeführt. So konnte die Machbarkeit eines Impfstoffs im Rahmen verschiedener Versuchsmodelle demonstriert werden. Aufgrund mangelnder Wirksamkeit und Verträglichkeitsproblemen wurden nur wenige Produkte auf dem Gebiet ausgewertet.
Die Impfoptionen, die Gegenstand früherer Untersuchungen waren oder Gegenstand aktueller Untersuchungen sind, decken alle Möglichkeiten in bezug auf den Impfstoff ab, d.h.:
- Impfstoffe aus ganzen, inaktivierten oder lebenden, abgeschwächten Bakterien, sog. klassische Impfstoffe,
- Impfstoffe aus bakteriellen, klassischen oder rekombinierten Untereinheiten.
Das Patent US-A-4 100 272 hat z.B. für die parenterale Verabreichung einen Impfstoff aus abgetöteten Zellen vorgeschlagen, der systemisch zur teilweisen oder vollständigen Immunisierung führen sollte. Das Patent US A-4 152 413 hat einen oralen Impfstoff in Form von abgetötete Zellen enthaltenden Darmkapseln vorgeschlagen, zur Freisetzung des Wirkstoffs im Darm; die gleiche Vorgehensweise empfehlen die Patente US-A-4 152 414 und US-A-4 203 968, bei denen S. hyodysenteriae mit abgetöteten Zellen von Bacteroides vulgatus oder Furobacterium necrophorium assoziiert ist. Das Patent US- A-4 152 415 schlägt die parenterale Verabreichung eines Impfstoffs mit abgetöteten Zellen und anschließender oraler Verabreichung eines Impfstoffs in Darmkapseln vor. Das Patent US-A-4 203 968 empfiehlt eine parenterale Zubereitung, die abgetötete Zellen von S. hyodysenteriae und abgetötete Zellen von Bacteroides vulgatus enthält, und schlägt ebenfalls ihre Kombination mit einer oralen Formulierung vor. Die Patente US-A-4 469 672 und US-A-4 748 019 empfehlen eine Impfung durch Verabreichen abgetöteter Zellen auf parenteralem und dann oralem Wege. Die Patentanmeldung EP-A-201 796 beschreibt ein Verfahren zur Kultur von S. hyodysenteriae in einem Nährmedium, das im Hinblick auf die Produktion eines Totimpfstoffs eine bovine cholesterinreiche Fraktion enthält, formuliert in Form einer Emulsion mit einem Adjuvans aus Polyacrylsäure und Polysaccharid in vernetzter Form. Gemäß diesem Dokument würde eine Resistenz nach zwei intramuskulären Injektionen erreicht, während die bekannten Impfstoffe mehrere intravenöse Injektionen erfordern. Schließlich schlägt die europäische Patentanmeldung EP-A-339 040 die parenterale Verabreichung lebender und abgetöteter Zellen in Gegenwart von Sauerstoff vor.
Keine dieser Vorgehensweisen hat die Realisierung eines wirksamen Impfstoffs ermöglicht.
Bekannt ist auch der Bakterienstamm von Taylor (1972), der durch 80 Passagen auf Gelose aus Pferdeblut abgeschwächt wurde, und dessen Wirksamkeit durch orale Impfung in wiederholten Dosierungen in der Größenordnung von 5 10&sup9; UFC nach 9 Wochen untersucht wurde (Hudson, Br. Vet. J. 1974, 130, 37-40 und Res. Vet. Sci. 1976, 21, 366-367). Dieser Impfstoff zeigt nur eine begrenzte Wirksamkeit.
Es wurde auch der als spontan abgeschwächt bezeichnete Bakterienstamm VSI von Lysons der British Technology Group (NCTC-Stamm 11628) eingesetzt, und zwar in wiederholten Dosen von 10&sup8; UFC zusammen mit 2 Injektionen einer inaktivierten, mit einem Adjuvans in Öl versetzten Rezeptur (Bakterienstamm P18A, NCTC 11615, Dosis: 5 10&sup9; UFC).
Eine derzeit empfohlene Lösung zur Herstellung eines abgeschwächten Lebendimpfstoffs besteht darin, die Virulenzfaktoren aus dem Bakterium zu deletieren, indem man dem Chromosom nur seine Funktionen für das Überleben des Bakteriums beläßt (M.B. Koopman, Infect. Immun. 1992, 60, 2920-2925).
Der Mißerfolg der herkömmlichen Vorgehensweise beim Impfen wurde kürzlich von J.P. TRONEL bestätigt (Dissertation an der Ecole Nationale Vétérinaire in Lyon: "Beitrag zur Suche und Entwicklung eines Impfstoffs gegen die hämorrhagische Schweine-Dysentene", veröffentlicht am 17. Februar 1993). Die getesteten Totimpfstoffe haben die Nachteile von Impfstoffen aus inaktivierten ganzen Bakterien aufgezeigt, vor allem nämlich ein geringes Immunisierungsvermögen und entzündliche Läsionen an der Injektionsstelle. Der Autor schließt daraus, daß dieser Typ Impfstoff nicht geeignet ist, eine ausreichend schützende Immunitätsreaktion auszulösen, wie dies auch bei der einzigen im Handel erhältlichen Rezeptur (mit einem Adjuvans versetzter Totimpfstoff aus ganzen Bakterien) der Fall ist, die parallel auf dem Gebiet getestet wurde.
Angesichts des Mißerfolges beim Umgang mit sogenannten klassischen Impfstoffen beschäftigten sich die verschiedenen Arbeitsgruppen mit Impfstoffen aus Untereinheiten und mit der rekombinanten Vorgehensweise. Als Beispiele kann man die internationalen (WO90/2565, WO90/15132) und europäischen Patentanmeldungen (EP-A-350 715, EP-A-282 9655, EP-A-491 859, EP-A-502 100) und das Patent US-A-5 176 910 anführen.
Dies entspricht auch den Schlußfolgerungen von J.P. Tronel (siehe oben), der darüber hinaus "die Kombination einer systemischen Verabreichung bakterieller Schutzantigene in Verbindung mit vorausgehendem In- Kontakt-bringen der digestiven Schleimhäute mit den gleichen Antigenen" als in diesem Zusammenhang wesentliche Bedingung vorschlägt.
Die Anmelderin hat jetzt auf sehr überraschende Weise entdeckt, daß es möglich war, Schweine wirksam gegen die hämorrhagische Dysentene zu impfen bei Verwendung eines herkömmlichen Impfstoffs unter besonderen Bedingungen, und ohne daß Verträglichkeitsprobleme aufgetreten wären.
Die Erfindung hat somit einen Impfstoff gegen die hämorrhagische Schweine-Dysentene zum Gegenstand, bestehend aus einer intradermal wirksamen Menge des inaktivierten und mit einem Adjuvans versetzten Antigens Serpulina hyodysenteriae (virulenter oder abgeschwächter Stamm) in einem für die intradermale Verabreichung geeigneten Vehikel. Man kann sich auch mit fraktionierten Antigenen begnügen oder einer Mischung aus fraktionierten und ganzen Antigenen (intakte, nicht fraktionierte Bakterienkörper). Unter fraktionierten Antigenen hat man vor allem solche Antigenfraktionen zu verstehen, die sich in der Antigenkultur wiederfinden (siehe beispielsweise den Verfahrensteil), sowie die Lysate von Bakterienkörpern, die zum Beispiel durch Beschallung erhalten werden.
Das Dosisvolumen ist vorzugsweise gering und liegt vor allem zwischen etwa 0,1 und 0,3 ml und ganz besonders in der Größenordnung von 0,2 ml.
Das Adjuvans kann vorzugsweise ein öliges Produkt sein und insbesondere eine Mischung aus hoch gereinigten Mineralölen und nichtionogenen Tensiden umfassen, und der Impfstoff kann vor allem als Wasser-in-Öl-Emulsion formuliert werden. Man kennt heute eine Reihe von Emulsionen auf der Basis von Mineralölen, bei denen es sich um durch Erdölraffination erhaltene Kohlenwasserstoffe handelt. Tenside dienen bekanntlich dazu, Emulsionen zu stabilisieren, und es ist bekannt, daß nichtionogene hydrophile Tenside dafür geeignet sind. Man kann auch lipophile Tenside mit ganz niedrigem Hydrophil/Lipophil-Gleichgewicht (HLB-Wert) einsetzen, die ebenfalls als Adjuvans geeignet sind.
Als ölige Phase kann man zum Beispiel eine Mischung aus dünnflüssigem Paraffin, dem Ester aus einer Fettsäure und einem Polyol sowie dem Ester aus einer Fettsäure und einem ethoxylierten Polyol anführen, zum Beispiel im jeweiligen Mengenverhältnis von 500 bis 700 mg : 10 bis 100 mg : 1 bis 33 mg.
Man kann auch ein wäßriges Adjuvans verwenden wie etwa ein Aluminiumoxidgel.
Der Impfstoff nach der Erfindung enthält vorzugsweise ein Antigen vom Serotyp 1, Hinterlegungsnummer 27 164 der American Type Culture Collection.
Für den Fall, daß eine Impfung gegen verschiedene Serotypen vorteilhaft wäre, kann der Impfstoff nach der Erfindung eine Mischung aus Antigenen verschiedener bekannter Serotypen sein, die man in der geographischen Region antrifft, für die der Impfstoff bestimmt ist. Ein Schutz über unterschiedliche Serotypen hinweg erlaubt es, auf ein einziges Antigen oder eine geeignete Mischung aus Antigenen zurückzugreifen.
Der Impfstoff enthält vorzugsweise etwa 10&sup7; bis 10&sup9; UFC-Äquivalente eines Antigens oder einer pro Dosis geeigneten Mischung aus Antigenen, besonders etwa 10&sup8; UFC- Äquivalente.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des inaktivierten Antigens Serpulina hyodysenteriae für die Herstellung eines Impfstoffs in einem für die intradermale Verabreichung beim Schwein geeigneten Vehikel.
Die Tiere können durch eine oder mehrere Injektionen, vor allem zwei, geimpft werden, zum Beispiel nach etwa 6 Wochen, und dann erneut nach etwa 9 Wochen.
Man kann den Impfstoff nach der Erfindung auch erwachsenen Schweinen kurz vor dem sogenannten "Ende der Mast" verabreichen (das zum Beispiel in der Größenordnung von einem Monat vor dem Schlachten des Tieres liegen kann). Dieses Vorgehen gewährleistet einen guten Schutz gegen das Hämorrhagische Dysentene-Syndrom in Bezug auf einen Gewichtsverlust und eine Verzögerung der Vermarktung der Tiere in dem Zeitraum, wo die vorsorglich durchgeführte Behandlung mit Antibiotika, die eingestellt werden mußte, vor der durch diesen Keim hervorgerufenen Infektion nicht mehr schützen kann. Zum Beispiel kann man den Impfstoff nach der Erfindung zwischen 2 und 5 Wochen, vorzugsweise etwa 2 Wochen vor Beginn dieser Periode verabreichen. Die Impfung kann namentlich aus eins bis zwei Injektionen bestehen. Im letzteren Fall ist es die zweite Injektion, die im Hinblick auf den Terminplan für die Impfung berücksichtigt wird, der gerade festgelegt wurde. Beide Injektionen können zum Beispiel in einem zeitlichen Abstand von etwa 2 Wochen oder mehr aufeinanderfolgen.
Es ist verständlich, daß in beiden Fällen die Bedingungen für die Impfung in Abhängigkeit von den Methoden für die Durchführung der Zucht voneinander abweichen können, wobei diese Methoden von einem Land zum anderen und auch innerhalb des gleichen Landes variieren.
Die Erfindung hat auch einen Impfsatz zum Gegenstand, der ein für die intradermale Verabreichung von Einzeldosen des Impfstoffs gebautes Applikationsgerät umfaßt, das mit einem Vorrats gefäß verbunden ist, das einen Impfstoff wie oben beschrieben enthält.
Das Applikationsgerät ist vorzugsweise eine Apparatur für die Verabreichung mittels Druckstrahl, wobei diese einen Einzelstrahl oder gleichzeitig mehrere Druckstrahlen erzeugen kann. Eine geeignete Apparatur ist zum Beispiel der in der Europäischen Patentanmeldung EP- A-420 744 beschriebene, mit Druckstrahl arbeitende Appukationsapparat. Selbstverständlich kann jedes andere geeignete Gerät verwendet werden, wie etwa eine Spritze.
Die Erfindung soll jetzt etwas ausführlicher beschrieben werden mit Hilfe eines Herstellungsverfahrens für einen mit der Erfindung übereinstimmenden Impfstoff und mit Hilfe eines Impfversuchs, die beide aber nur unverbindlich mitgeteilt werden können.

1. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DES ANTIGENS

- Das Impfantigen wird ausgehend von dem Bakterienstamm "Treponema hyodysenteriae, Nr. 27164, ATCC" hergestellt, der auf einem mit Schweineserum angereicherten Nährboden aus Soja-Trypticase(TS) unter strikt anaeroben Bedingungen gezüchtet wird. Wenn das Optimum des Wachstums erreicht ist, wird die Züchtung angehalten und danach durch Zugabe einer Merthiolat- Lösung (Endkonzentration: 1 : 1000 Vol/Vol) inaktiviert.
- Die inaktivierte Kultur wird anschließend gewaschen und durch Zentrifugieren konzentriert. Das Impfantigen ist somit eine inaktivierte, mit PBS gewaschene, konzentrierte und bei 4ºC aufbewahrte Suspension von Bakterienkörpern und deren Fraktionen (Bakterienwand, Membran, Hämolysin, Toxin). Die Berechnung des Titers der Kultur vor der Behandlung gestattet es, die äquivalente Endkonzentration an Keimen (UFC) des hergestellten Antigens zu kennen.
- Der Impfstoff wird mit einer Verdünnung des Impfantigens formuliert, was. es erlaubt, das Äquivalent von 10&sup9; UFC pro Dosis zu verabreichen, die mit einem öligen Adjuvans emulgiert ist (Öl als äußere Phase). Das Endvolumen des Antigens entspricht 1/4 des Volumens der injizierten Dosis.

2. IMPFVERSUCH

- Der Impfstoff gemäß der Erfindung wird abgesetzten EOPS-Ferkeln im Alter von vier und sechs Wochen intradermal (id) verabreicht (Nachinjektion am Tag vor der Prüfung). Unter den gleichen kalendarischen Bedingungen wird eine Gruppe Schweine mit einem handelsüblichen Impfstoff (inaktivierter und mit einem Adjuvans versetzter Impfstoff aus ganzen Bakterien) intramuskulär (im) geimpft (indizierte Verabreichung, Dosisvolumen = 5 ml). Die zu Vergleichsgruppen bestimmten Schweine werden nicht geimpft. Eine weitere Gruppe Schweine wird intramuskulär mit dem Impfstoff nach der Erfindung geimpft.
- Die Schweine (mit Ausnahme einer Gruppe von 5 unter den gleichen Bedingungen der Haltung als Vergleichstiere benutzten Schweinen) werden zwei Wochen nach der ersten Impfung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen intragastral mit 10&sup9; UFC titrierenden Inocula überprüft; die Schweine sind dann sechs Wochen alt.
- Die klinische weiterbeobachtung der Schweine nach der Prüfung erfolgt auf der Basis der täglichen Erfassung individueller klinischer Meßwerte und im Abstand von 7 Tagen vorgenommenen Wägungen (4 Wägungen nach der Überprüfung).
Es liegen folgende experimentelle Resultate vor : Wachstum der Schweine
* = Durchschnittsgewicht der Gruppe Schweine, effektiv von 5 Tieren, Mittelwert in kg. (der festgestellte Unterschied im Gewicht zwischen Vergleichstieren und gemäß der Erfindung intramuskulär und intradermal geimpften Tieren ist nicht signifikant). Durchschnittliche kumulierte klinische Meßwerte
Die Schwelle des klinischen Meßwerts für das Hämorrhagische Dysenterie-Syndroms = 5
- Die angegebenen Meßwerte sind für den jeweiligen Zeitraum kumulierte Tagesmittelwerte auf der Basis folgender Notierungen :
- Konsistenz des Kots
Normal, fest = 1
Weich = 2
Sehr weich, dünn = 3
Wäßriger Durchfall = 4
- Zusammensetzung des Kots
Normal = 1
Spuren von Schleim = 2
Spuren von Blut = 3
Hämorrhagisch = 4
- Allgemeinzustand des Tieres
Normal = 1.
Matt = 2
Deutlich abgemagert = 3
Moribund = 4
- Jedes Kriterium wird täglich erfaßt, der individuelle Meßwert ist die Summe aus drei Aufzeichnungen. Ein Mittelwert dieser Aufzeichnungen wird aus der Gesamtheit der durchgeführten Messungen errechnet (35 Messungen, 5 Schweine an 7 Tagen) für die jeweilige Gruppe während der Beobachtungsperiode (hier 7 Tage), den man als "mittleren kumulierten Meßwert" bezeichnet. Serologische Reaktionen / Kinetik
* - Mittelwert der abgelesenen DO-Werte für die betreffende Gruppe
** - Standardabweichung gegenüber dem Mittelwert (keine Angaben zum handelsüblichen Impfstoff und dem intramuskulär verabreichten Impfstoff nach der Erfindung)
Diese Ergebnisse verdeutlichen den Schutzeffekt der Vorgehensweise beim Impfen gemäß der Erfindung im Versuchsmodell:
- die mit dem Antigen gemäß der Erfindung intradermal und intramuskulär geimpften Schweine behalten gegenüber einer Vergleichsgruppe ihr normales Wachstum bei, während die mit handelsüblichem Impfstoff geimpften Tiere ein Verhalten zeigen, das mit dem der geprüften Vergleichstiere identisch ist.
- Die klinischen Meßwerte verdeutlichen, daß die mit dem Antigen gemäß der Erfindung intradermal geimpfte Gruppe keine Symptome einer hämorrhagischen Dysentene zeigt (Meßwert < 5), was dagegen bei den Tieren der geprüften Vergleichgruppen und bei den mit handelsüblichem Impfstoff oder mit Impfstoff gemäß der Erfindung intramuskulär geimpften Schweinen der Fall ist.
- Die serologischen Ergebnisse zeigen eine sehr gute Serumkonversion 14 Tage nach der ersten mit dem Impfstoff nach der Erfindung intradermal vorgenommenen Injektion.
- Bei der intramuskulären Impfung der Schweine zeigt es sich, daß an der Injektionsstelle Verträglichkeitsprobleme auftreten. Bei intradermal geimpften Schweinen wird nichts derartiges festgestellt.
- Zusammenfassung: der intradermal verabreichte Impfstoff nach der Erfindung macht es möglich, einen Schutz gegen die Krankheit zu erreichen unter Fortdauer des Wachstums, ohne daß Verträglichkeitsprobleme auftreten.

Claims

1. Impfstoff gegen die hämorrhagische Schweine- Dysenterie, der eine intradermal wirksame Menge des inaktivierten und mit einem Adjuvans versetzten Antigens Serpulina hyodysenteriae in einem für die intradermal erfolgende Verabreichung geeigneten Vehikel enthält.

2. Impfstoff nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem Dosisvolumen zwischen etwa 0,1 und 0,3 ml formuliert wird, vor allem in der Größenordnung von 0,2 ml.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antigen um ein ganzes oder ein fraktioniertes Antigen handelt, oder um eine Mischung aus ganzem und fraktioniertem Antigen.

4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein öliges Adjuvans ist.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form einer Wasser-in-Öl- Emulsion vorliegt.

6. Impfstoff nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das ölige Adjuvans aus einer Mischung hoch gereinigter Mineralöle und nichtionogener Tenside besteht.

7. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein Aluminiumoxidgel ist.

8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Antigen des Serumtyps 1 Hinterlegungsnummer 27164 der American Type Culture Collection enthält.

9. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Mischung aus Antigenen unterschiedlicher bekannter Serumtypen enthält, die in der geographischen Region angetroffen werden, für die der Impfstoff bestimmt ist.

10. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er 10&sup7; bis 10&sup9; CFU-Äquivalente Antigen pro Dosis enthält, insbesondere etwa 10&sup8; CFU- Äquivalente.

11. Verwendung des inaktivierten Antigens Serpulina hyodysenteriae für die Herstellung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem für die intradermale Verabreichung beim Schwein geeigneten Vehikel.

12. Impfsatz, der ein für die intradermale Verabreichung von Einzeldosen des Impfstoffs gebautes Applikationsgerät umfaßt, das mit einem Vorratsgefäß verbunden ist, das einen Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthält.

13. Impfsatz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Applikationsgerät um eine Apparatur für die Verabreichung mittels Druckstrahl handelt.