ES2828873T3 - Vacuna contra la disentería porcina - Google Patents

Abstract

Composición que comprende bacterias de al menos tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae, en la que al menos una de las cepas es la cepa con el número de depósito CNCM I-4720, al menos una de las cepas es la cepa con el número de depósito CNCM I-4721 y al menos una de las cepas es la cepa con el número de depósito CNCM I-4722.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna contra la disentería porcina

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición que comprende bacterias de Brachyspira hyodysenteriae, particularmente en el campo de la inmunización contra la disentería porcina.

Antecedentes de la técnica

La disentería porcina (DP), provocada por infección colónica con la espiroqueta Brachyspira hyodysenteriae, sigue siendo un problema importante en todo el mundo. Afecta a los cerdos principalmente durante el periodo de engorde. Brachyspira hyodysenteriae es una espiroqueta anaerobia Gram-negativa, tolerante al oxígeno que coloniza el intestino grueso porcino y provoca disentería porcina (DP). Este estado se caracteriza por una diarrea mucohemorrágica grave que afecta principalmente a los animales durante el periodo de crecimiento-finalización y se ha notificado en todos los principales países de cría de cerdos (Hidalgo, A. et al., Journal of clinical microbiology (2010), 48(8):2859-2865).

La DP es una enfermedad ampliamente distribuida en todo el mundo, aunque los estudios sobre epidemiología son escasos y la prevalencia notificada varía significativamente entre ellos. Por tanto, la prevalencia notificada de B. hyodysenteriae oscila de desde el 0% hasta casi el 40%. Las variaciones en la prevalencia pueden deberse al uso de diferentes métodos de diagnóstico o a diferencias entre países en cuanto a alojamiento, manejo, regímenes de alimentación, etc. Además, mientras que en muchos países la prevalencia puede ocultarse mediante el uso de agentes antimicrobianos tales como aditivos alimenticios, en otros la prohibición de los antibióticos como promotores del crecimiento puede haber dado lugar a un aumento de la prevalencia de la DP (Alvarez-Ordóñez, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

Los cerdos portadores desempeñan un papel fundamental en la epidemiología de la disentería porcina y se consideran la principal fuente de transmisión entre piaras. B. hyodysenteriae sobrevive en el medio ambiente durante largos periodos, especialmente en las heces líquidas contenidas en pozos y lagunas, donde puede permanecer infecciosa hasta 60 días. Por ejemplo, puede sobrevivir durante varios meses en heces de cerdo a bajas temperaturas. Esta espiroqueta también puede colonizar naturalmente ratones, ñandúes, pollos y ánades reales, y junto con vectores mecánicos o fómites, esto aumenta las formas en las que B. hyodysenteriae puede diseminarse dentro y entre piaras (Hidalgo, A. et al., Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865).

La enfermedad provoca importantes pérdidas económicas directas, especialmente en las granjas porcinas intensivas, derivadas de una disminución de la eficiencia de conversión alimenticia, la mortalidad, el alargamiento del periodo de engorde y también pérdidas indirectas, como un aumento de los gastos veterinarios, medicación, etc. La erradicación de la enfermedad a través de la medicación es bastante difícil, ya que muchos animales recuperados clínicamente siguen excretando el organismo durante mucho tiempo mientras actúan como portadores.

El tratamiento de la DP implica el uso de antibióticos. Las pleuromutilinas (tiamulina y valnemulina) se han usado para este propósito en la Unión Europea (UE). La tiamulina y la valnemulina son derivados semisintéticos del antibiótico diterpeno natural pleuromutilina que muestran una actividad sobresaliente contra las bacterias anaerobias y se usan exclusivamente en animales, principalmente en cerdos. Además, los macrólidos (tilosina y, más recientemente, tilvalosina) y la lincomicina (lincosamida) estrechamente relacionada se han incluido comúnmente en las estrategias terapéuticas de la DP. Sin embargo, la aparición de cepas de B. hyodysenteriae con susceptibilidad reducida a uno o más de estos antibióticos y la presencia de aislados multirresistentes genéticamente diversos se ha confirmado en varios países. Este hecho complica el tratamiento y el control de la DP y debe alertar a los veterinarios y a los criadores de cerdos de la necesidad de un enfoque estratégico para seleccionar antibióticos, que sólo deben usarse en indicaciones estrictas siguiendo un diagnóstico de campo y laboratorio adecuado para garantizar su eficiencia a largo plazo. para el tratamiento de la DP (Alvarez-Ordóñez, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

Los altos costes de la medicación, junto con el hecho de que en muchas ocasiones es imposible erradicar completamente la infección, y la creciente preocupación por la presencia de residuos de medicamentos tanto en los productos cárnicos como en el medio ambiente, justifica el desarrollo de métodos inmunoprofilácticos eficientes para controlar la DP (Diego, R. et al., Vaccine (1995), 13(7):663-667).

Se han realizado grandes esfuerzos para desarrollar vacunas para controlarla DP desde que Joens y coautores (Joens, L.A., et al., American Journal of Veterinary Research (1979), 40:1352-1354, notificaron que los cerdos que se han recuperado de la DP aguda están protegidos de la enfermedad cuando vuelven a exponerse posteriormente a B. hyodysenteriae, indicando que la infección puede inducir una respuesta inmunitaria protectora (Alvarez-Ordóñez, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947). Sin embargo, los intentos de desarrollar vacunas para controlar la DP han tenido un éxito limitado. Hudson (Hudson, M.J. et al., British Veterinary Journal (1974), 130:37-40; Hudson, M.J. et al., Research in Veterinary Science (1976), 21: 366-367) desarrolló una vacuna viva atenuada que no pudo proteger contra una exposición posterior. Glock (Glock, R.D. et al., Proceedings of the 6th International Pig Veterinary Society Congress (1980), Copenhague, Dinamarca, pág. 521) notificó cierto grado de protección tras la exposición después de seis inyecciones intravenosas, a intervalos de seis días, de una vacuna inactivada. Las vacunas avirulentas vivas atenuadas o modificadas genéticamente pueden mostrar una colonización reducida y provocar menos estimulación inmunitaria (Alvarez-Ordóñez, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

Un enfoque alternativo es generar vacunas de subunidades que pueden administrarse mediante la expresión de proteínas de B. hyodysenteriae recombinantes en un vector de administración bacteriana. Se han realizado esfuerzos para identificar proteínas de B. hyodysenteriae para su uso en vacunas de subunidades, pero la vacunación con una proteína flagelar recombinante de 38 kDa no logró evitar la colonización en cerdos infectados experimentalmente (Gabe et al., Infection and Immunity (1995), 63: 142-148). Por otro lado, la vacunación con una lipoproteína de membrana externa recombinante de 29,7 kDa (Bhlp29.7) dio como resultado una protección parcial, desarrollando menos animales la enfermedad que en los grupos de control. Los autores de este estudio concluyeron que la vacunación también tendía a retrasar la aparición de la excreción fecal de las espiroquetas, pero no necesariamente impedía que se produjera (La, T. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). En un estudio realizado por Holden et al., se evaluó la eficacia de la vacunación con smpB (una proteína de la membrana externa de B. hyodysenteriae). Sin embargo, la respuesta inducida después de la vacunación con proteínas ofreció sólo una protección moderada contra la enfermedad (Holden, J. et al., Veterinary Microbiology (2008), 128:354-363). En la mayoría de las ocasiones, las vacunas recombinantes sometidas a prueba no han proporcionado suficiente protección en los cerdos (Alvarez-Ordóñez, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).

Las vacunas que consisten en bacterinas de células completas inducen respuestas de anticuerpos séricos a Brachyspira hyodysenteriae, sin embargo, generalmente no protegen a los cerdos de la enfermedad. El uso de bacterinas de B. hyodysenteriae preparadas a partir de lisados de células completas pueden incluso exacerbar la enfermedad tras la infección (Waters, W.R. et al., Vaccine (2000), 18:711-719). Además, las vacunas de bacterina tienden a ser específicas del serogrupo de lipopolisacáridos, lo que luego requiere el uso de bacterinas autógenas. Además, las bacterinas de B. hyodysenteriae son relativamente difíciles y costosas de producir a gran escala debido a los exigentes requisitos de crecimiento de la espiroqueta anaerobia (La, T. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). En algunos países, las vacunas de bacterina para la DP están disponibles comercialmente y brindan cierto grado de protección. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, tienden a ser específicos del serogrupo de lipooligosacárido (LOS), que luego requiere el uso de preparaciones autógenas o multivalentes (Hampson, D.J. et al., Diseases of Swine (2006), 10a edición, Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, EE.UU., págs. 687-688). Pueden encontrarse otras referencias a las vacunas contra la DP en la técnica en la siguiente bibliografía de patentes:

El documento US 4748019: Los autores encontraron que un régimen eficaz de vacunación comprende administrar por vía parenteral a los cerdos una dosis de primovacunación de T. hyodysenteriae patógenos o virulentos desactivados eficaz para estimular la respuesta inmunitaria del cerdo (cepa “P18A”, NCTC 11615) a una dosis posterior de una cepa viva avirulenta o no patógena de T. hyodysenteriae (cepa “VSI”, NCTC 11628) y aproximadamente al mismo tiempo o después de administrar esta cepa viva por vía oral.

El documento US 5750118: La invención se refiere a una vacuna contra la DP que comprende una cantidad eficaz de antígeno de T. hyodysenteriae inactivado y que contiene adyuvante (cepa virulenta o atenuada) para administración intradérmica. El antígeno de la vacuna se prepara a partir de la cepa n.° 27164 ATCC, que está inactivada.

El documento US 5281416: La invención se refiere a un método de vacunación de un cerdo contra la DP caracterizado por la administración parenteral, preferiblemente intramuscular al cerdo de una cepa viva o de una cepa no viable tratada con oxígeno de T. hyodysenteriae. Las cepas representativas que pueden usarse son cepas virulentas de referencia ATCC 31287, ATCC 31212 y la cepa avirulenta de referencia At CC 27164.

Sin embargo, se encontró que la eficacia de estas vacunas era variable. Se han usado preparaciones autógenas (también conocidas como “autovacunas”, que pueden definirse como vacunas preparadas a partir de cultivos de organismos aislados de los tejidos o secreciones del propio animal enfermo) para mejorar aún más estas vacunas. Este enfoque, aunque eficiente, es muy costoso y lleva mucho tiempo y confiere protección sólo para una única cepa de B. hyodysenteriae. Además, la vacunación se produce en algún momento después de que se haya identificado la cepa que provoca la enfermedad, lo que puede llevar varias semanas (por ejemplo, según los procedimientos convencionales, el procedimiento de aislamiento de las muestras de la granja, el cultivo inicial y la producción de la autovacuna pueden tardar al menos 6 semanas). Este retraso en el tiempo a menudo provoca la propagación de las bacterias en otros animales de la piara, o en circunstancias extremas, incluso a otras granjas porcinas. También provoca graves pérdidas económicas y es en sí mismo un procedimiento costoso de aplicar de forma rutinaria. Por tanto, la DP sigue siendo una enfermedad infecciosa endémica importante en muchos países donde se crían cerdos. Existe una gran necesidad de una vacuna eficaz y económicamente asequible para la Dp .

Sumario de la invención

La disentería porcina (DP) es una enfermedad entérica mucohemorrágica grave de los cerdos provocada por Brachyspira hyodysenteriae, que tiene un gran impacto en la producción porcina y provoca importantes pérdidas por mortalidad y rendimiento subóptimo. Teniendo en cuenta la aparición de cepas multirresistentes y la preocupación de que puedan estar presentes residuos de fármacos en los productos cárnicos o en el medio ambiente, se necesitan con urgencia métodos inmunoprofilácticos eficaces para controlar la DP. Sin embargo, las vacunas disponibles no confieren un grado satisfactorio de protección contra la infección e incluso si confieren un determinado grado de protección, no brindan una adecuada inmunidad protectora cruzada contra cepas de diferentes serogrupos. Además, la fabricación y comercialización de autovacunas presenta muchos inconvenientes. Por consiguiente, existe una necesidad de vacunas contra la DP que confieran una fuerte protección contra las cepas de diferentes serogrupos, concretamente una vacuna contra la Dp eficaz y universal.

Los inventores han desarrollado una vacuna contra la DP que, inesperadamente, es tan eficaz como una autovacuna, a pesar de no tener en su composición la cepa que provoca la infección. Este efecto es muy sorprendente, ya que está en conflicto con la teoría de la autovacuna. Esta invención proporciona una vacuna según se reivindica con una protección general y eficaz contra Brachyspira hyodysenteriae, concretamente una “vacuna universal”.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición tal como se reivindica que comprende bacterias de al menos tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae. La composición de la invención puede comprender cepas inactivadas y la diversidad genética puede conferirse seleccionando las al menos tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae de diferentes complejos clonales. En un aspecto preferido, las cepas genéticamente diversas se detectan al menos en una proporción del 1% con respecto al total de cepas detectadas en una región de interés. La región de interés puede ser cualquier región, preferiblemente España.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a la composición de la invención para su uso como vacuna, preferiblemente una vacuna contra la disentería porcina provocada por Brachyspira hyodysenteriae.

Además, la divulgación proporciona un método para producir la composición de la invención, que comprende seleccionar al menos dos cepas genéticamente diferentes y mezclarlas en igual cantidad para lograr una concentración de al menos entre 108 y 109 bacterias/ml.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Dendrograma de los 44 tipos de MLVA de B. hyodysenteriae encontrados en el presente estudio y agrupados usando UPGMA. Los números romanos I a VI indican complejos clonales definidos en el nivel de variante de locus único. La barra de escala representa la distancia genética como el número absoluto de diferencias en alelos marcadores entre genotipos. Se muestran valores de muestreo con reposición de > 40%.

Figura 2. Tipos de MLVA (encerrados en un círculo) y relaciones encontradas entre ellos según el algoritmo goeBURST. Las líneas continuas muestran el nivel de variante de locus único, las líneas discontinuas muestran el nivel de variante de locus doble y las líneas de puntos muestran el nivel de variante de locus triple. Los grupos en el nivel de variante de locus único se indican mediante números romanos I a VI.

Figura 3. Selección de las cepas de la vacuna universal de los ejemplos (“tipo 3” (por ejemplo, cepa con número de depósito CNCM I-4720), “tipo 14” (por ejemplo, la cepa con número de depósito CNCM I-4721) y “tipo 20” (por ejemplo, la cepa con número de depósito CNCM I-4722). Se seleccionó la cepa de tipo ancestral de los complejos clonales mencionados (II, V y I). Las cepas seleccionadas se detectan en una proporción de al menos el 1% con respecto al total de cepas detectadas en España.

Figura 4. Curvas de supervivencia que comparan los grupos vacunados con la autovacuna (gris oscuro), vacuna universal (negro) y no vacunados (control, gris claro), usando la prueba del orden logarítmico a a = 0,05.

Figura 5. Eliminación de B. hyodysenteriae durante el tiempo tras la exposición (porcentaje de hisopados rectales positivos por semana) (negro, autovacuna; gris oscuro, vacuna universal; gris claro, animales no vacunados (control)).

Figura 6. Periodo de incubación (número de días entre la exposición y la aparición de diarrea o excreción fecal de las bacterias) en los diferentes grupos (negro, autovacunación; gris oscuro, vacuna universal; gris claro, animales no vacunados (control)).

Figura 7. Porcentaje de cerdos con diarrea (a) y diarrea sanguinolenta (b) después de la exposición (negro, autovacuna; gris oscuro, vacuna universal; gris claro, animales no vacunados (control)).

Figura 8. Aumento diario promedio (ADG) en los días tras la exposición (negro, autovacuna; gris oscuro, vacuna universal; gris claro, animales no vacunados (control)).

Figura 9. Aumento de peso diario (DWG) en los primeros 9 días después de la exposición (día 0 a día 9) (negro, autovacuna; gris oscuro, vacuna universal; gris claro, animales no vacunados (control)).

Figura 10. Medición de la respuesta de anticuerpos (la absorbancia a 450 nm se correlaciona directamente con la cantidad de anticuerpo producido) de los conejos hiperinmunizados con cepas A, B y C contra LPS de la cepa A (CNM I-4720) a lo largo del experimento (ensayo de potencia).

Figura 11. Medición de la respuesta de anticuerpos (la absorbancia a 450 nm se correlaciona directamente con la cantidad de anticuerpo producido) de los conejos hiperinmunizados con cepas A, B y C contra LPS de la cepa B (CNM I-4721) a lo largo del experimento (ensayo de potencia).

Figura 12. Medición de la respuesta de anticuerpos (la absorbancia se correlaciona directamente con la cantidad de anticuerpo producido) de los conejos hiperinmunizados con cepas A, B y C contra LPS de la cepa C (CNM I-4722) a lo largo del experimento (ensayo de potencia).

Descripción detallada de la invención

Composición de la invención

La presente invención se refiere a una composición tal como se reivindica que comprende bacterias de al menos tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae. El término “genéticamente diverso”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a un conjunto definido de características genéticas diversas medibles en la composición genética de una especie. Para determinar la diversidad de microorganismos en ambientes definidos (ecosistemas) o para identificar la diseminación de cepas particulares entre huéspedes, se usan técnicas de tipado genéticas que tienen la capacidad de distinguir diversos organismos de la misma especie. Es importante destacar que cuando se compara la diversidad de una sola especie entre diferentes ecosistemas, se requiere un enfoque estadístico sólido que permita una evaluación objetiva. Con este fin, se han definido matemáticamente índices de diversidad que se basan en la frecuencia con la que los organismos de un tipo particular se producen en una población o pueden ser discriminados por una determinada herramienta de tipado (Grundmann, H. et al., Journal of Clinical Microbiology (2001), 39: 4190-4192).

Una diversidad relativamente alta entre B. hyodysenteriae aislados se ha descrito clásicamente. La capacidad para comprender la epidemiología de la DP y progresar hacia su control depende de la disponibilidad de métodos fiables de tipado de cepas para caracterizar los aislados. Basándose en el análisis de lipopolisacáridos semipurificados (LPS), se identificaron cuatro serotipos diferentes, por Baum & Joens (Baum, D.H. et al., Infection and immunity (1979), 25:792-796), aunque otros estudios finalmente diferenciaron un total de 11 serogrupos que incluían varios serotipos (Hampson, D.J. et al., Epidemiology and Infection (1989), 102:75-84; Hampson, D.J. et al., Epidemiology and Infection (1990), 105:79-85; Hampson, D.J. et al., Swine dysentery. En: Intestinal Spirochaetes in Domestic Animals and Humans, págs. 175-209, editado por D. J. Hampson y T. B. Stanton. Wallingford: CAB Internacional, 1997).

Se demostraron poco después diferencias en la distribución geográfica de B. hyodysenteriae. Las cepas de referencia de EE.UU. se clasificaron dentro de los serotipos 1 y 2, mientras que se describió una mayor variabilidad con respecto a la clasificación de serotipos para los aislados de Europa y Australia (Harris et al., Swine Dysentery. En: Straw, B.E., D'Allaire, S.D., Mengeling, W.D. y Taylor, D.J. (eds.) Disease of Swine. Iowa State University Press (1999), Ames Iowa EE.UU., págs. 579-600). Sin embargo, casi no hay información reciente sobre la distribución de serotipos de aislados de B. hyodysenteriae. Como consecuencia de reacciones cruzadas, las técnicas necesarias para determinar el serotipo son lentas y engorrosas de realizar y dan resultados no concluyentes en un número muy elevado de aislados. Por esa razón, estas técnicas se han reemplazados por varios métodos moleculares.

Se han desarrollado diferentes herramientas de tipado para discriminar entre aislados de campo de B. hyodysenteriae y proporcionar una mejor comprensión de la epidemiología molecular del patógeno. Entre ellos, una herramienta útil para el tipado de cepas de microorganismos patógenos que se ha introducido durante los últimos años es el análisis de repetición en tándem de número variable de múltiples locus o MLVA. Se ha desarrollado como una herramienta epidemiológica importante para el tipado de cepas de microorganismos patógenos. MLVA se basa en la amplificación por PCR de varios loci bien seleccionados y caracterizados que contienen secuencias de repetición cortas (múltiples loci de minisatélites denominados números variables de repeticiones en tándem (VNTR)). Este tipo de minisatélite consiste en repeticiones de ADN directas únicas de principio a fin, que pueden encontrarse en todos los genomas bacterianos y pueden usarse para definir aislados específicos de especies bacterianas. Además, los VNTR se han usado para inferir la estructura de la población bacteriana y la filogenia de diversas especies de bacterias. Dentro de cada locus de secuencia de repetición, el número de copias de repetición puede variar entre diferentes cepas. Midiendo el tamaño de cada loci amplificado por PCR, puede deducirse el número de unidades de repetición. Hidalgo y sus colaboradores desarrollaron y sometieron a prueba un método de análisis de repetición en tándem de número variable de múltiples locus (MLVA) que podía usarse en laboratorios de microbiología de diagnóstico veterinario básico equipados con tecnología de PCR o en laboratorios más avanzados con acceso a electroforesis capilar. Basándose en ocho loci, y cuando se realizó en aislados de diferentes granjas en diferentes países, así como el tipo y cepas de referencia, la técnica de MLVA desarrollada fue altamente discriminatoria (índice discriminatorio de Hunter y Gaston, 0,938 [intervalo de confianza del 95%, de 0,9175 a 0,9584]) mientras se conserva un alto valor filogenético. Usando la técnica, se demostró que las especies eran diversas (44 tipos de MLVA de 172 aislados y cepas), aunque los aislados se mantuvieron estables en las piaras a lo largo del tiempo. La estructura de la población parecía ser clonal. El hallazgo de MLVA de B. hyodysenteriae tipo 3 en granjas porcinas en tres países europeos, así como en otras cepas relacionadas en diferentes países, sugiere que es probable que se propague el patógeno a través de los cerdos portadores. MLVA supera los inconvenientes asociados con técnicas de tipado anteriores para B. hyodysenteriae y es un método potente para estudios epidemiológicos y de estructura poblacional sobre esta importante espiroqueta patógena (Hidalgo, A. et al., Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865).

Los inventores y sus colaboradores han aplicado este método en una colección internacional de aislados de B. hyodysenteriae, incluyendo 115 aislados de campo españoles, así como cepas de referencia y aislados de Australia, Canadá, EE.UU., Reino Unido y Países Bajos.

El análisis de MLVA revela que los aislados de campo españoles de B. hyodysenteriae son heterogéneos y que la población tiene una estructura clonal. Se identificaron un total de 15 tipos de MLVA entre los aislados españoles. Además, se identificaron aislados con el mismo tipo de MLVA en España, Reino Unido y Países Bajos. Por otro lado, se concluyó que los aislados de Australia o Estados Unidos no tienen MLVA común con los aislados españoles.

Al agrupar los tipos de MLVA a nivel de variante de locus único, se estableció un número total de seis complejos clonales (I a VI) (figura 2).

La composición de la invención puede comprender tres, o cuatro, o cinco o más cepas genéticamente diversas. La diversidad genética de las cepas de la composición de la invención se confiere seleccionando las al menos tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae de diferentes complejos clonales. “Complejo clonal”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a los varios grupos establecidos agrupando los tipos de MLVA en el nivel de variante de locus único, tal como se describió anteriormente. Más preferiblemente, al menos una cepa pertenece al complejo clonal II y/o al menos una cepa pertenece al complejo clonal V y/o al menos una cepa pertenece al complejo clonal I.

En la composición de la presente invención, las cepas genéticamente diversas pertenecen al tipo ancestral del complejo clonal.

El antepasado común dentro de cada complejo clonal se predijo usando el algoritmo goeBUST disponible en http://goeburst.phyloviz.net/#Software, una implementación global del algoritmo eBURST. Para más detalles véanse las publicaciones Feil et al., 2004 y Francisco et al., 2009, gratis en http://goeburst.phyloviz.net/#Publications.

La composición de la presente divulgación puede comprender además una cepa que pertenece a un tercer complejo clonal. Preferiblemente, el tercer complejo clonal se selecciona del grupo que consiste en complejo clonal I, complejo clonal II y complejo clonal V.

Por consiguiente, la composición de la presente divulgación comprende al menos dos, preferiblemente tres, cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae, en la que al menos una de las cepas pertenece al complejo clonal I, y/o al menos una de las cepas pertenece al complejo clonal II y/o al menos una de las cepas pertenece al complejo clonal V.

La composición de la invención comprende tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae en la que una de las cepas pertenece al complejo clonal I, una de las cepas pertenece al complejo clonal II y una de las cepas pertenece al complejo clonal V.

En la composición de la presente invención al menos una de las cepas es la cepa depositada dentro de la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), Instituto Pasteur, el 14 de marzo de 2013, con número de registro CNCM I-4720, al menos una de las cepas es la cepa depositada en la misma fecha dentro del CNCM con número de registro CNCM I-4721 y al menos una de las cepas es la cepa depositada en la misma fecha dentro del CNCM con número de registro Cn Cm I-4722.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona las cepas depositadas dentro de la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), Instituto Pasteur, el 14 de marzo de 2013, con el número de registro CNCM I-4720.

La cepa con número de registro CNCM I-4720 pertenece al complejo clonal II. La cepa con número de registro CNCM I-4721 pertenece al complejo clonal V. La cepa con número de registro CNCM I-4722 pertenece al complejo clonal I.

En la composición de la presente invención, las cepas genéticamente diversas son preferiblemente epidemiológicamente relevantes. En el contexto de la presente invención, “epidemiológicamente relevante” significa que las cepas se detectan al menos en una proporción del 1-100%, preferiblemente al menos el 1%, al menos el 2%, al menos el 3%, al menos el 4%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 50%, al menos el 75%, al menos el 90% o el 100% con respecto al total de cepas detectadas en una región de interés. Preferiblemente, las cepas genéticamente diversas se detectan al menos en un 1% con respecto al total de cepas detectadas en una región de interés. En el contexto de la presente invención, “detectado” significa que dichas cepas se identificaron en la región de interés. La detección de las bacterias de Brachyspira hyodysenteriae puede realizarse, por ejemplo, en hisopados rectales, mucosa colónica y/o muestras fecales de cerdos. Por ejemplo, las muestras pueden cultivarse y el ADN puede extraerse siguiendo métodos previamente notificados (véase, por ejemplo, Hidalgo, A. et al., Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865). La presencia de B. hyodysenteriae puede detectarse mediante métodos de PCR. La presencia de B. hyodysenteriae también puede confirmarse sembrando en hisopados bacteriológicos tomados de heces o de las paredes del colon de los cerdos en placas de agar selectivo. Después de la incubación de las placas en un ambiente anaerobio, puede registrarse la presencia de un crecimiento de espiroquetas en la placa de baja propagación plana y la hemólisis alrededor del crecimiento (La, T. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). Alternativamente, la presencia de B. hyodysenteriae puede realizarse suspendiendo las muestras en PBS y detectando la presencia de las bacterias con una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFT) (véase, por ejemplo, Diego, R. et al., Vaccine (1995), 13(7):663-667). Pueden emplearse otros métodos para detectar la presencia de B. hyodysenteriae conocidos en la técnica.

El término “región de interés” tal como se emplea en la presente invención se refiere a un área demarcada de la Tierra, es decir, a una región geográfica o un área geográfica en la que se evalúa la presencia de B. hyodysenteriae. No existe una limitación específica para la región geográfica de interés. Puede variar desde miles de kilómetros a nivel continental hasta unos pocos kilómetros a nivel local. Por ejemplo, la región de interés puede ser parte de un país, todo un país o más de un país. Preferiblemente, la región de interés es un país o un grupo de países. Por ejemplo, la región de interés puede ser Europa. Preferiblemente, la región de interés puede ser España, más preferiblemente el territorio español de la Península Ibérica, en particular Castilla y León, Andalucía y/o Extremadura. Otras regiones de interés preferidas son Italia, Países Bajos, Reino Unido, Australia, Canadá y/o Estados Unidos.

Además, las bacterias que comprenden la composición de la presente invención pueden inactivarse, es decir, pueden inactivarse química o físicamente. La inactivación comprende destruir las bacterias con productos químicos, calor y/o radiación. Las bacterias de la composición pueden inactivarse mediante cualquier procedimiento de inactivación conocido en la técnica. Preferiblemente, las bacterias de la composición de la invención se inactivan tratando las bacterias con formaldehído. Más preferiblemente, el formaldehído se inyecta en el cultivo de bacterias al 0,5% y luego se incuba durante la noche (18 horas, aproximadamente) a 37°C con ligera agitación.

Según la presente invención, las bacterias de la composición, preferiblemente inactivadas, pueden estar presentes en una concentración de al menos entre 107 y 1012 bacterias/ml, preferiblemente en una concentración de al menos 107, o 108, o 5 108, o 109, o 1010, o 1011 o 1012 bacterias/ml, preferiblemente en una concentración de entre 108 y 1010 bacterias/ml, más preferiblemente en una concentración de entre 108 y 109 bacterias/ml, incluso más preferiblemente en una concentración de 5 108 bacterias/ml.

Si la composición comprende bacterias que pertenecen a dos cepas, pueden estar presentes en la composición en una razón de 1:(0,5-2). Si la composición comprende bacterias que pertenecen a tres cepas, pueden estar presentes en la composición en una razón de 1:(0,5-2):(0,5-2). Si la composición comprende bacterias que pertenecen a cuatro cepas, pueden estar presentes en la composición en una razón de 1:(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2). Si la composición comprende bacterias que pertenecen a cinco cepas, pueden estar presentes en la composición en una razón de 1:(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2). Preferiblemente, la composición comprende bacterias en una mezcla igual de las cepas seleccionadas, es decir, en una razón de 1:1, 1:1:1, 1:1:1:1, 1:1:1:1:1, dependiendo de cuántas cepas diferentes comprende la composición. En este contexto, “razón” significa número de bacterias/ml.

La concentración de bacterias en la composición puede calcularse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede usarse recuento en la cámara de Neubauer para estimar el número de bacterias presentes en la composición de la invención.

La composición de la presente invención comprende preferiblemente una cantidad total de 108 a 109 bacterias inactivadas/ml en una mezcla igual de las cepas seleccionadas, en la que las bacterias pertenecen a tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae, en la que una de las cepas pertenece al complejo clonal I, una de las cepas pertenece al complejo clonal II y una de las cepas pertenece al complejo clonal V, y en la que preferiblemente las cepas genéticamente diversas son epidemiológicamente relevantes en una región de interés, es decir, están presentes en España en al menos una proporción del 1% con respecto al total de cepas detectadas.

Preferiblemente, las cepas genéticamente diversas que son epidemiológicamente relevantes en una región de interés están presentes cada una en una proporción de al menos el 9% con respecto al total de cepas detectadas. Preferiblemente, una de las cepas está presente en una proporción de al menos el 13% con respecto al total de cepas detectadas. Más preferiblemente, dos de las cepas están presentes en una proporción de al menos el 13% con respecto al total de cepas detectadas. Lo más preferiblemente, una de las cepas está presente en una proporción de al menos el 24% con respecto al total de cepas detectadas.

La composición de la presente invención puede comprender además un adyuvante. Un adyuvante es un componente que potencia la respuesta inmunitaria a un antígeno y/o la modula hacia las respuestas inmunitarias deseadas. Puede ser una sustancia química inorgánica u orgánica, una macromolécula o células completas de determinadas bacterias muertas que potencian la respuesta inmunitaria al antígeno dado. En el contexto de la presente invención, el adyuvante que puede estar presente en la composición de la invención puede ser cualquier adyuvante adecuado que, por ejemplo, potencia, acelera y prolonga la respuesta inmunitaria específica tal como se conoce en la técnica actual.

Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo:

• Sales minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio y geles de fosfato de aluminio o calcio.

• Emulsiones oleosas y formulaciones a base de tensioactivos, por ejemplo, MF59 (emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente microfluidizado), QS21 (saponina purificada), AS02 [SBAS2] (emulsión de aceite en agua MPL QS-21), Montanide™ ISA -51, ISA-720, iMs (emulsión estabilizada de agua en aceite).

• Adyuvantes particulados, por ejemplo, virosomas (vehículos liposomales unilaminares que incorporan hemaglutinina del virus de la gripe), AS04 ([SBAS4] sal de Al con Mp L), ISCOMS (complejo estructurado de saponinas y lípidos), poliláctido co-glicólido (p Lg ).

• Derivados microbianos (naturales y sintéticos), por ejemplo, monofosforil lípido A (MPL), Detox (MPL esqueleto de la pared celular de M. phlei), AGP [RC-529] (monosacárido acilado sintético), DC_Chol (inmunoestimuladores lipoidales capaces de autoorganizarse en liposomas), OM-174 (derivado del lípido A), motivos CpG (oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG inmunoestimuladores), LT y CT modificados (toxinas bacterianas modificadas genéticamente para proporcionar efectos adyuvantes no tóxicos).

• Inmunomoduladores humanos endógenos, por ejemplo, hGM-CSF o hIL-12 (citocinas que pueden administrarse como proteínas o plásmidos codificados), Immudaptin (matriz en tándem C3d).

• Vehículos inertes, tales como partículas de oro hacia la respuesta deseada a los antígenos de la vacuna.

Los adyuvantes más preferidos son las sales de aluminio (hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio) y aceites minerales. Cuando se inoculan producen un pequeño granuloma que permite la liberación retardada del antígeno (estimulación antigénica de larga duración) y la atracción de las células presentadoras de antígeno. Esto aumenta la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el adyuvante puede ser HAVLOGEN™ o Montanide™. Lo más preferiblemente, el adyuvante puede ser un adyuvante oleoso comercial como Montanide™ IMS 251 C VG (SEPPIC).

El adyuvante está presente preferiblemente en la composición final en una concentración en la fórmula final del 5 al 50% v/v con respecto al volumen de inyección final, preferiblemente el 5%, el 10%, el 20%, el 25%, el 30%, el 40%, el 50% o más (v/v, es decir, volumen con respecto al volumen de inyección final). Más preferiblemente, la concentración de adyuvante en la fórmula final es del 20% v/v (es decir, volumen con respecto al volumen de inyección final).

La composición de la invención puede comprender adicionalmente otros componentes. Por ejemplo, la composición puede comprender agentes antisépticos y/o antifúngicos. Por ejemplo, la composición puede comprender además timerosal (Sigma), también conocido como tiomersal. Preferiblemente, el timerosal está comprendido en una cantidad de 0,005 a 1 g por 100 ml, preferiblemente en una cantidad de 0,5, o 0,3 o 0,1, o 0,05, o 0,03, o 0,02, o 0,01 o 0,005 g por 100 ml. Más preferiblemente, el timerosal está comprendido en una cantidad de 0,01 g por 100 ml. Además, la composición de la invención también puede comprender disoluciones tampón tales como sales. Preferiblemente, la composición de la invención puede comprender un tampón en una concentración de 0,01 a 0,5 M, preferiblemente en una concentración de 0,5 M, o 0,4 M, o 0,3 M, o 0,2 M, o 0,1 M, o 0,05 M o 0,01 M. El tampón puede ser cualquier tampón adecuado descrito en la técnica. Por ejemplo, el tampón puede ser solución salina tamponada con fosfato (PBS) o acetato de sodio. Preferiblemente, el tampón es acetato de sodio 0,1 M.

Vacuna de la invención

La composición de la presente invención puede usarse preferiblemente como vacuna. Una vacuna es una preparación biológica que mejora la inmunidad a una enfermedad en particular. Según la presente invención, la vacuna es una vacuna contra la disentería porcina (DP). La disentería porcina está provocada por Brachyspira hyodysenteriae.

La composición de la invención para su uso como vacuna (en adelante, la vacuna de la invención) puede ser adecuada para su administración a cerdos en una región geográfica particular de interés. Tal como se describió anteriormente, la región de interés no está particularmente limitada y puede comprender uno o más países. Por ejemplo, la región de interés puede ser Europa. Preferiblemente, la región de interés puede ser España, más preferiblemente territorio español de la Península Ibérica, en particular Castilla y León, Andalucía y/o Extremadura. Otras regiones de interés preferidas son Italia, Países Bajos, Reino Unido, Australia, Canadá y/o Estados Unidos.

La vacuna de la invención puede administrarse antes de la infección y/o poco después. Por ejemplo, la vacuna de la invención puede administrarse de 1 a 20 días después del brote de la enfermedad, preferiblemente 1, o 2, o 3, o 4, o 5, o 6, o 7, u 8, o 9, o 10, o 15 o 20 días después del brote de la infección. La vacuna también puede administrarse 1­ 4 semanas después del brote de la enfermedad, preferiblemente 1,2, 3 o 4 semanas después del brote de la infección. La vacuna de la invención puede administrarse mediante administración parenteral y/o administración oral. Preferiblemente, la vacuna de la invención se administra mediante administración parenteral, más preferiblemente mediante administración subcutánea y/o intramuscular y/o intradérmica, e incluso más preferiblemente mediante administración intramuscular. Por ejemplo, la vacuna de la invención puede inyectarse por vía intramuscular en los músculos del cuello de los cerdos.

La dosificación administrada de la vacuna de la invención puede oscilar de desde 1 ml hasta 5 ml. Por ejemplo, una dosificación de la vacuna de la invención puede ser de 1 ml. Por ejemplo, una dosificación de la vacuna de la invención puede ser de 2 ml.

La dosificación administrada de la vacuna de la invención puede comprender entre 107 y 1012 bacterias/dosis, preferiblemente entre 108y 1010 bacterias/dosis, más preferiblemente 109 bacterias/dosis. La dosificación administrada de la vacuna de la invención puede comprender entre 108 y 109 bacterias/ml. La dosificación administrada de la vacuna de la invención puede comprender 109 bacterias/ml. La dosificación administrada de la vacuna de la invención puede comprender 5 -Í08 bacterias/ml en 2 ml/dosis.

Por consiguiente, el número total preferido de bacterias por dosis que puede administrarse a los cerdos es de 109 bacterias.

La vacuna de la presente invención es preferiblemente una vacuna inyectable.

Protocolo de vacunación

Según la presente invención, la vacuna de la invención puede administrarse preferiblemente a los cerdos después del destete, lo más preferiblemente dos semanas después del destete. Por ejemplo, los cerdos pueden vacunarse desde la cuarta semana de vida. Según la presente invención, los cerdos pueden vacunarse dos veces (volver a vacunarse). Los cerdos vuelven a vacunarse preferiblemente dos semanas después de la primera vacunación. Por ejemplo, los cerdos pueden vacunarse dos semanas después del destete, por ejemplo, a la edad de cuatro semanas. Entonces, la segunda vacuna (revacunación) puede tener lugar a la edad de seis semanas (es decir, dos semanas después de la administración de la primera vacuna). Por ejemplo, los cerdos pueden vacunarse dos semanas después del destete, por ejemplo, a la edad de cinco semanas. Entonces, la segunda vacuna (revacunación) puede tener lugar a la edad de siete semanas. Por ejemplo, los cerdos pueden vacunarse dos semanas después del destete, por ejemplo, a la edad de seis semanas. Entonces, la segunda vacuna (revacunación) puede tener lugar a la edad de ocho semanas. Se prefiere la vacunación por primera vez a la edad de cuatro semanas.

El destete puede producirse a los 21 días de edad (La, T. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). El destete también puede producirse a los 15 días de edad, o a cualquier otra edad, según la piara.

Por tanto, la presente divulgación proporciona los siguientes puntos:

1. Una composición que comprende bacterias de al menos dos cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae.

2. La composición según el punto 1, en la que las bacterias están inactivadas.

3. La composición según los puntos 1 y/o 2, en la que las bacterias están presentes en una concentración de al menos entre 108 y 109 de bacterias totales/ml.

4. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que la diversidad genética se confiere seleccionando las al menos dos cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae de diferentes complejos clonales.

5. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que al menos una cepa pertenece al complejo clonal II.

6. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que al menos una cepa pertenece al complejo clonal V.

7. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que al menos una cepa pertenece al complejo clonal I.

8. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que las cepas genéticamente diversas se detectan en una proporción de al menos el 1% en una región de interés con respecto al total de cepas detectadas.

9. La composición según el punto 8, en la que la región de interés es España.

10. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que las cepas genéticamente diversas pertenecen al tipo ancestral de cada complejo clonal.

11. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que la composición comprende además una cepa que pertenece a un tercer complejo clonal.

12. La composición según el punto 11, en la que el tercer complejo clonal se selecciona del grupo que comprende el complejo clonal I, el complejo clonal II y el complejo clonal V.

13. La composición según uno o más de los puntos anteriores, en la que al menos una de las cepas pertenece al complejo clonal I, al menos una de las cepas pertenece al complejo clonal II y/o al menos una de las cepas pertenece al complejo clonal V.

14. La composición según el punto 13, en la que al menos una de las cepas es la cepa con número de depósito CNCM I-4720, al menos una de las cepas es la cepa con número de depósito CNCM I-4721 y/o al menos una de las cepas es la cepa con número de depósito CNCM I-4722.

15. La composición según uno o más de los puntos anteriores comprende además un adyuvante.

16. La composición según el punto 15, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en sales de aluminio (preferiblemente hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio) y aceites minerales.

17. La composición según el punto 16, en la que el adyuvante es un adyuvante oleoso, preferiblemente Montanide™ 251 C VG.

18. Una composición según uno o más de los puntos anteriores, para su uso como vacuna.

19. La composición según el punto 18, en la que la vacuna es una vacuna contra la disentería porcina.

20. La composición según el punto 19, en la que la disentería porcina está provocada por Brachyspira hyodysenteriae.

21. La composición según uno o más de los puntos 18 a 20, en la que la vacuna es adecuada para su administración a cerdos en una región de interés.

22. La composición según el punto 21, donde la región de interés es España.

23. La composición según uno o más de los puntos 18 a 22, en la que las cepas genéticamente diversas se detectan en una proporción de al menos el 1% con respecto al total de cepas detectadas en una región de interés.

24. La composición según uno o más de los puntos 18 a 23, en la que la vacuna se administra por administración parenteral.

25. La composición según el punto 24, en la que la vacuna se administra por vía intramuscular.

26. La composición según uno o más de los puntos 18 a 25, en la que los cerdos se vacunan dos semanas después del destete.

27. La composición según el punto 26, en la que los cerdos vuelven a vacunarse dos semanas después de la primera vacunación.

28. Un método para producir una composición según uno o más de los puntos 1 a 27, que comprende seleccionar al menos dos cepas genéticamente diferentes y mezclarlas en igual cantidad para lograr una concentración de al menos entre 108 y 109 de bacterias totales/ml.

29. El método según el punto 28, en el que las al menos dos cepas genéticamente diferentes también son epidemiológicamente relevantes.

30. El método según uno o más de los puntos 28 a 29, que comprende además la inactivación de las bacterias. 31. El método según uno o más de los puntos 28 a 30, en el que la diversidad genética se confiere seleccionando cada cepa de diferentes complejos clonales.

32. El método según uno o más de los puntos 29 a 31, en el que la relevancia epidemiológica se confiere seleccionando cepas que se detectan en una proporción de al menos el 1% con respecto al total de cepas detectadas en una región de interés.

33. El método según el punto 32, en el que la región de interés es España.

Ejemplos

Ejemplo 1. Análisis de repetición en tándem de número variable de múltiples locus de Brachvspira hvodvsenteriae

Análisis de MVLA

Se usó un conjunto de 172 aislados y cepas porcinos de B. hyodysenteriae en este estudio, incluyendo las tres cepas de referencia B204R (ATCC 31212), B234R (ATCC 31287) y WA1R (ATCC 49526) y la cepa tipo B78T (ATCC 27164).

Se obtuvieron duplicados de las cepas B204R y B78T a partir de las colecciones bacterianas de la Universidad de León y la Universidad Murdoch. Las cepas y los aislados de campo fueron de España (n = 115), Australia (n = 36), Canadá (n = 3), Estados Unidos (n = 7), Reino Unido (n = 4) y Países Bajos (n = 7) y se habían recuperado desde la década de 1970 hasta 2009. Se recuperaron veintitrés aislados de cerdos ibéricos, una raza local española. Estos cerdos contribuyen a la conservación de la “dehesa”, un ecosistema mediterráneo específico ubicado en las regiones occidentales del país (Castilla y León, Extremadura y Andalucía), donde tradicionalmente se crían en unidades extensivas. Los aislados de campo se recuperaron de diferentes piaras, a excepción de 26 aislados españoles que se aislaron adicionalmente de 11 piaras en diferentes ocasiones de muestreo. Se identificaron y se cultivaron aislados de B. hyodysenteriae de las colecciones bacterianas de la Universidad de León y la Universidad de Murdoch, y se extrajo ADN en cada laboratorio proveedor mediante métodos previamente notificados. Se prepararon diluciones de trabajo de ADN extraído ajustándolas de 1 a 20 ng/|il usando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 UV-Vis (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Identificación de repeticiones en tándem y diseño de cebadores

Se recuperó la secuencia de ADN cromosómico de B. hyodysenteriae WA1R de GenBank (número de registro NC_012225) y se investigó en busca de posibles repeticiones en tándem usando los parámetros predeterminados del programa Tandem Repeat Finder, disponible como un servicio web (http://tandem.bu.edu/). Los loci de repetición en tándem seleccionados se clasificaron por longitud de consenso, y aquellos con longitudes entre 25 y 300 pb se usaron para diseñar cebadores dentro de las regiones flanqueantes. Los loci se denominaron Bhyo, seguidos del número de clasificación de longitud de repetición (de 1 a 23), separados por un guion bajo.

Detección de repetición en tándem y configuración de MLVA

En una etapa preliminar, se usó el ADN extraído de la cepa de B. hyodysenteriae B204R para estimar la temperatura de hibridación empírica de los 23 pares de cebadores seleccionados en una PCR en gradiente. La PCR se ejecutó en un dispositivo Mastercycler Gradient (Eppendorf Scientific Inc., Westbury, NY) con una etapa inicial de 95°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de un protocolo de ciclo de tres etapas que consiste en 94°C durante 30 s, 56 ± 8°C durante 30 s y 72°C durante 1 min y una etapa de extensión final de 72°C durante 10 min. Para detectar la utilidad de los 23 loci seleccionados como marcadores epidemiológicos, se usaron muestras de ADN de cepas de B. hyodysenteriae B204R y B78T y los aislados 3, 19, 23, 53, 64, H9 y H72, que han demostrado tener diferencias genéticas por PFGE y RAPD en una investigación previa (Hidalgo, Á. etal., Epidemiology & Infection (2010), 138:76-85). Además, se tuvieron en cuenta los datos de repetición en tándem generados para la cepa de B. hyodysenteriae WA1R. Cada locus se amplificó individualmente y se analizó la longitud del producto mediante electroforesis en gel de agarosa convencional usando un marcador de tamaño molecular de ADN de 100 pb (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los loci se seleccionaron según su polimorfismo de longitud y su capacidad para generar amplicones para la mayoría de las muestras de ADN analizadas. Para confirmar la longitud del producto de PCR, así como el número de repeticiones, los patrones de consenso y los tamaños de las regiones flanqueantes, los amplicones se purificaron usando el kit AxyPrep PCR Cleanup (Axygen Biosciences, Union City, CA) y se secuenciaron usando tecnología de didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia según las recomendaciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Basándose en esto, se seleccionaron ocho loci de VNTR que van a usarse en la herramienta de tipado final.

Amplificaciones por PCR para MLVA

Se analizaron los aislados obtenidos con la colección bacteriana seleccionada para este estudio amplificando de manera independiente los ocho loci de VNTR seleccionados en un aparato Mastercycler (Eppendorf). Los cebadores para PCR y condiciones de termociclado usados se describen en la tabla 1. Se prepararon mezclas de PCR usando tubos estériles de 0,2 ml que contenían tampón de PCR 1x (Tris HCl 20 mM [pH 8,4], KCl 50 mM), MgCh 5 mM, 1 U de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen), mezcla de desoxinucleósido trifosfato 200 |iM (Invitrogen), cebadores directos e inversos de 0,2 pM, 2 |il de dilución de trabajo de ADN y agua destilada estéril hasta un volumen final de 50 |il. Se resolvieron los productos de la PCR en geles de agarosa y se estimaron sus tamaños alélicos usando un marcador de tamaño molecular de ADN de 100 pb (Invitrogen). Los amplicones de los alelos no detectados en la etapa de configuración se secuenciaron tal como se describió anteriormente. Además, para garantizar la repetibilidad de la técnica, se seleccionaron al azar 28 muestras de ADN y se volvieron a analizar. La reproducibilidad entre laboratorios se evaluó mediante la determinación independiente de los tipos VNTR de 14 aislados en la Universidad de León y la Universidad de Murdoch.

Tabla 1: Cebadores para PCR y condiciones de termociclado

Se agruparon los ocho pares de cebadores usados en las PCR individuales en dos conjuntos (conjunto 1 y conjunto 2); se marcaron de manera fluorescente con 6-carboxifluoresceína (6-FAM™), VIC®, PET® o NED™ (Applied Biosystems) en el extremo 5' de los cebadores directos; y se agruparon antes de realizar una PCR multiplex usando el kit de PCR Qiagen Multiplex según las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Germantown, MD).

Tablas 2 y 3: Conjuntos de cebadores

Conjunto de cebador 1

Conjunto de cebador 2

Se usó un volumen de 25 |il para la amplificación por PCR multiplex con un protocolo de ciclos térmicos de 95°C durante 15 min; 30 ciclos de tres etapas de 94°C durante 30 s, 55/53°C (conjunto 1/conjunto 2) durante 90 s y 72°C durante 90 s; y una etapa de extensión final de 72°C durante 10 min. Se diluyeron los productos de PCR multiplex 1:10 en agua destilada antes de mezclar 1 |il de esta dilución con 0,5 |il de 1200 LIZ Size Standard (Applied Biosystems) y 10,5 |il de formamida. Después de calentar la mezcla durante 3 min a 96°C y enfriarse rápidamente en hielo, se realizó el análisis GeneScan usando un analizador de ADN ABI 3730 (Applied Biosystems). Se usó el programa disponible gratuitamente Peak Scanner Software v 1.0 (Applied Biosystems) para dimensionar los fragmentos de PCR para cada locus.

Análisis de los datos

El número de repeticiones se calculó según la siguiente fórmula:

Número de repeticiones = [Tamaño de fragmento (pb) x regiones flanqueantes (pb)]/Tamaño de repetición (pb).

Los resultados se aproximaron al número entero inferior más cercano y se puntuaron secuencialmente (Bhyo_6, Bhyo_7, Bhyo_12, Bhyo_17, Bhyo_21, Bhyo_22, Bhyo_10 y Bhyo_23) para crear un perfil numérico que definiera cada cepa. Cuando la amplificación por PCR fue indetectable, el número asignado de repeticiones fue 99. Los perfiles de MLVA se atribuyeron a los tipos de MLVA mediante la asignación de un número entero. Los aislados se consideraron genéticamente idénticos cuando coincidían los perfiles numéricos de los ocho loci. El índice de diversidad de Hunter-Gaston se usó para medir el polimorfismo de los loci individuales y el índice de discriminación del método de tipado de MLVA para los ocho loci de VNTR combinados (Hunter, P. R. y M. A. Gaston, Journal of Clinical Microbiology (1988), 26:2465-2466). Se calcularon intervalos de confianza (IC) aproximados del 95% tal como describen Grundmann et al. (Journal of Clinical Microbiology (2001), 39:4190-4192). Los aislados redundantes (n = 26) se retiraron antes de calcular los índices anteriores. El programa Sequence Type Analysis and Recombinational Tests (START2), disponible gratuitamente en http://pubmlst.org/software/analysis/start2/, se usó para analizar los perfiles de MLVA y los tipos de espiroquetas sometidas a prueba. Se construyó un árbol filogenético de los tipos de MLVA basándose en el método de grupo de pares no ponderados usando la estrategia de agrupación de uniones promedio (UPGMA). Se realizó un análisis de muestreo con reposición para 1.000 réplicas usando FreeTree en http://web.natur.cuni.cz/flegr/programs/freetree.htm. Se usó el algoritmo goeBURST, disponible en http://goeburst.phyloviz.net/#Software, una implementación global del algoritmo eBURST (Feil, E. J. et al., Journal of Bacteriology (2004), 186:1518-1530) para identificar grupos de genotipos relacionados de B. hyodysenteriae a niveles de variante de locus simple, doble y triple. La estructura de la población se sometió a prueba tal como proponen Smith et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. (1993), 90:4384-4388), teniendo en cuenta las modificaciones propuestas por Haubold et al. (Genetics (1998), 150:1341-1348) para el cálculo del valor crítico (LMC) de la distribución de la varianza de las diferencias por pares (VD), y expresado como un índice de asociación estandarizado (ISA).

Resultados

Identificación de marcadores de VNTR

La investigación de la secuencia cromosómica de B. hyodysenteriae WA1R con el programa Tandem Repeat Finder identificó 404 repeticiones en tándem en todo el cromosoma, con 135 repeticiones/Mpb. La selección posterior de los marcadores de repetición en tándem más adecuados redujo el número que va a incluirse en el MLVA a 23, que se denominaron consecutivamente Bhyo_1 a Bhyo_23 y se usaron para diseñar cebadores dentro de las regiones flanqueantes. Se descartaron quince loci que eran monomórficos o que no lograron amplificar todos o la mayoría de los nueve aislados seleccionados con los cebadores específicos. Los ocho loci restantes eran polimórficos, con diferentes tamaños de alelos. La secuenciación de los productos de PCR confirmó que el polimorfismo de longitud se debía a diferencias en el número de copias de repeticiones en tándem y que el patrón de consenso, el tamaño del periodo y las regiones flanqueantes eran estables (tabla 4). Por tanto, ocho loci (Bhyo_6, Bhyo_7, Bhyo_12, Bhyo_17, Bhyo_21, Bhyo_22, Bhyo_10 y Bhyo_23) se incluyeron en el esquema de MLVA para B. hyodysenteriae. Estos loci se distribuyeron desde la posición 1236667 hasta la posición 2949421 del genoma de WA1R (tabla 4). Cuatro loci, Bhyo_6, Bhyo_10, Bhyo_21 y Bhyo_22, se colocaron en marcos de lectura abiertos que codifican para proteínas hipotéticas, mientras que los otros cuatro se ubicaron en regiones intergénicas. Bhyo_7 se colocó entre los genes para la proteína de quimiotaxis que acepta metilo McpA y una proteína hipotética. Bhyo_12 estaba entre los genes para una supuesta proteína de la familia 2 de las glicosiltransferasas y una proteína hipotética. Bhyo_17 estaba entre los genes de la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa y la ferredoxina. Bhyo_23 estaba entre los genes de una proteína hipotética y el supuesto RarR, que se predice que es una permeasa.

Tabla 4: Características de los loci incluidos en MLVA

Tipado de MLVA

Se usó el conjunto de ocho marcadores de VNTR para tipar la colección completa de 174 cepas y aislados de B. hyodysenteriae de cerdos en varios países (incluyendo los duplicados de B78T y B204R). Las cepas y los aislados se amplificaron de manera eficaz y las longitudes de los productos de la PCR se convirtieron en números de repeticiones. La secuenciación de nuevos alelos que se identificaron en esta etapa confirmó que las diferencias de longitud representaban variaciones en el número de motivos de repetición detectados previamente. El marcador Bhyo_10 fue el VNTR más diverso, con ocho números diferentes de repeticiones (99, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 10), con un número asignado de repeticiones de 99 debido a la falta de amplificación. Se detectaron siete números de repeticiones para el locus Bhyo_17, mientras que los marcadores Bhyo_6, Bhyo_7 y Bhyo_21 presentaron cada uno seis números de repeticiones. Los loci Bhyo_12 y Bhyo_22 mostraron una distribución discontinua de cuatro números de repeticiones. El marcador de VNTR Bhyo_23 mostró menos diversidad, con sólo dos números diferentes de repeticiones, 1 y 2, detectados. Se logró una estimación precisa del grado de polimorfismo de los loci mediante el índice de diversidad de Hunter-Gaston, oscilando los poderes de discriminación de los loci de desde 0,141 hasta 0,764. El locus Bhyo_10 fue el más discriminatorio, con un valor de 0,764, seguido de los loci Bhyo_7, Bhyo_6, Bhyo_17 y Bhyo_21, con valores de 0,761, 0,718, 0,71 y 0,699, respectivamente. Los loci Bhyo_12 y Bhyo_23 tuvieron índices de diversidad de 0,472 y 0,318, respectivamente, mientras que el locus más conservado fue Bhyo_22, con un índice de polimorfismo de 0,141.

El índice discriminatorio de Hunter-Gaston del método de tipado de MLVA en ocho loci para 146 cepas y aislados de diferentes piaras fue de 0,938 (IC del 95%, de 0,9175 a 0,9584). El análisis de la combinación de los ocho loci de VNTR para todos los aislados y cepas de B. hyodysenteriae mostraron 44 tipos de MLVA, que diferían en al menos una repetición para uno de los ocho loci entre dos tipos diferentes. Los tipos de MLVA de las cepas de referencia fueron el tipo 35 para WA1R, tipo 23 para B204R y tipo 10 para B234R, mientras que la cepa tipo B78T se asignó al tipo 28 de MLVA. El análisis de los diferentes tipos de MLVA en cada país mostró la existencia de una diversidad considerable. Se encontraron 15 tipos (1, 2, 3, 5, 9, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 22, 24 y 37) entre los 89 aislados españoles de diferentes piaras, 16 tipos (15 , 16, 17, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 42, 43 y 44) entre los 36 aislados australianos, 2 tipos (21 y 27) para los tres aislados canadienses, 3 tipos (3, 6 y 41) para las siete de Países Bajos, 4 tipos (3, 8, 29 y 30) para las cuatro cepas del Reino Unido, y 6 tipos (4, 7, 10, 23, 28 y 40) para los siete aislados y cepas de Estados Unidos. El tipo 3 de MLVA se compartió por aislados de España, Reino Unido y Países Bajos. Los tipos de MLVA fueron estables para las piaras en las que se recuperó más de un aislado en diferentes ocasiones de muestreo. La cepa de B. hyodysenteriae WA1R mostró un desajuste para el locus Bhyo_6 entre la longitud del producto de PCR, 780 pb (cuatro números de repeticiones), y los datos derivados del genoma secuenciado, 1.092 pb (seis números de repeticiones). Los aislados y cepas incluidos en las pruebas de repetibilidad y reproducibilidad tenían los mismos tipos de MLVA en los diferentes tiempos de prueba. Además, cada uno de los duplicados del tipo y cepas de referencia de B. hyodysenteriae, B78T y B204R, de las colecciones de la Universidad de León y de la Universidad Murdoch, generaron los mismos patrones de MLVA.

Tipos de MLVA y análisis de poblaciones bacterianas

Se muestra un árbol evolutivo basado en perfiles de MLVA y construido según la estrategia de agrupamiento UPGMA para los 44 tipos de MLVA de B. hyodysenteriae determinados en este estudio en la figura 1. Las relaciones de tipo de MLVA en los niveles de variante de locus simple, doble y triple representados con el algoritmo goeBURST se muestran en la figura 2. Se establecieron seis complejos clonales (I a VI) en el nivel de variante de locus único. Aparecieron tres nuevos grupos al investigar variantes de locus doble, mientras que se agruparon tres grupos de variantes de locus único (II, III y IV) en este nivel. Cuando se presentaron los bordes de alto nivel para estudiar las relaciones en el nivel de variante de triple locus, apareció una gran agrupación que incluía los grupos I a IV, y el grupo V se expandió en dos tipos más. Los tipos 4, 5, 10 y 15 de MLVA no se relacionaron con ninguno de los otros tipos detectados en ninguno de los niveles estudiados. Se detectó desequilibrio de ligamiento poblacional para los 146 aislados de diferentes piaras (ISA = 0,1359; P <0,001) y para los diferentes tipos de MLVA (ISA = 0,0336; P = 0,005).

Ejemplo 2: Selección y cultivo de las cepas de vacunas universales

Se seleccionaron tres cepas de Brachyspira hyodysenteriae, cada una de las cuales pertenece a diferentes complejos clonales (complejos clonales I, II y V). Cada cepa seleccionada genéticamente diversa pertenece al tipo ancestral de cada complejo clonal. Además, cada cepa seleccionada se detecta en al menos un 1% con respecto al total de cepas detectadas en España (figura 3). Las cepas son las depositadas dentro de la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), Instituto Pasteur, el 14 de marzo de 2013, con los números de registro CNCM I-4720, CNCM I-4721 y CNCM I-4722.

La cepa con número de registro CNCM I-4720 pertenece al complejo clonal II. La cepa con número de registro CNCM I-4721 pertenece al complejo clonal V. La cepa con número de registro CNCM I-4722 pertenece al complejo clonal I.

CNCM I-4720 se detecta en un 24,7% con respecto al total de cepas detectadas en territorio español de la Península Ibérica. CNCM I-4721 se detecta en un 13,5% con respecto al total de cepas detectadas en territorio español de la Península Ibérica. CNCM I-4722 se detecta en un 9% con respecto al total de cepas detectadas en territorio español de la Península Ibérica.

Las bacterias aisladas (libres de contaminantes) se inoculan en placas de agar-sangre. Las placas se mantienen en condiciones anaerobias a 39,5°C durante 4-5 días, hasta que se observa hemólisis en toda la placa. El agar se fragmenta en los bordes de hemólisis y se inoculan en una nueva placa de agar-sangre, incubada en las mismas condiciones. Las bacterias se pasan a una nueva placa de agar-sangre y, en paralelo, a una placa de Fastidious Anaerobe Agar (FAA), y las bacterias se cultivan en las mismas condiciones durante 3-4 días. Las bacterias pueden transferirse entonces a un medio de crecimiento líquido y cultivarse.

Para la fermentación, las bacterias se incuban en aprox. 4 l de medio de cultivo adecuado (tal como medios de infusión de cerebro-corazón de Merck) a 38,5°C con ligera agitación (50 rpm) en una atmósfera libre de oxígeno. La fermentación se produce hasta que la densidad óptica es de aprox. 1,6 (o hasta que queden alrededor de 109 UFC/ml (generalmente entre 15 y 30 horas)).

Ejemplo 3: Inactivacion de las bacterias

Después de la fermentación, se bombean 4 l (aprox.) de cultivo a un matraz estéril y se centrifugan (2 x 7000 rpm, 10 minutos). Los gránulos resultantes se suspenden en 1 l de tampón acetato de sodio 0,1 M. La inactivación del cultivo se realiza con una inyección de formaldehído al 0,5% e incubación durante 24 horas a 37°C con ligera agitación (50 rpm). Al día siguiente, la suspensión se centrifuga y se resuspende en acetato de sodio estéril 0,1 M. El antígeno (109­ 1010 bacterias/ml, aprox.) se mantiene a 4°C hasta que se mezcla con el adyuvante y excipientes para la fabricación de la vacuna.

Ejemplo 4: Fórmula de vacuna (vacuna universal de la invención)

La vacuna comprende los siguientes componentes. El término antígeno se refiere a las cepas de Brachyspira hyodysenteriae seleccionadas mencionadas anteriormente, y la concentración final de antígeno es de 109 bacterias/ml en una mezcla igual de las tres cepas seleccionadas.

Los componentes se mezclaron mediante agitación a 4°C durante la noche.

Ejemplo 5: Comparación entre una autovacuna eficaz y la vacuna universal de la invención

Se usaron las siguientes condiciones:

1. -Los cerdos usados en este ejemplo procedían de una granja libre de infecciones por espiroquetas y con bajo estado sanitario, debido a la dificultad de lograr una buena exposición en cerdos con alto estado sanitario.

2. -La dieta se manipuló para inducir una disbiosis muy alta en el intestino. También se conoce bien la importancia de la dieta en la disentería porcina. En este experimento el alimento se mezcló con un 50% de harina de soja que tenía un 46% de proteína. Los cerdos recibieron esta dieta a partir del día de la exposición (10 días en total).

3. -La cepa usada para la exposición fue la cepa de referencia B204 (número de ATCC: 31212). La cepa se pasó previamente tres veces en cerdos para mantener completamente su patogenicidad y verificar que la infección experimental sería apropiada. Esto garantiza que la cepa usada tenga una alta patogenicidad y provoque una enfermedad grave en los cerdos infectados.

Se usaron los siguientes tres grupos de seis cerdos cada uno:

• Grupo 1 (autovacuna): los lechones se vacunaron por vía intramuscular (i.m.) con la autovacuna (B204 inactivado y adyuvante, mismo protocolo que el anterior, pero con B204 inactivado como antígeno) a las 6 semanas de vida y volvieron a vacunarse a las 8 semanas de vida. Cada dosis contenía 109 bacterias.

• Grupo 2 (vacuna universal): los lechones se vacunaron por vía i.m. con la vacuna universal (la vacuna polivalente inactivada y con adyuvante, que comprende las tres cepas de campo seleccionadas). El protocolo de vacunación fue el mismo que el anterior (los lechones se vacunaron a las 6 semanas de vida y volvieron a vacunarse a las 8 semanas). La dosis también fue de 109 bacterias en una mezcla igual de las tres cepas seleccionadas.

• Grupo 3 (grupo de control, no vacunado): se inyectó el mismo adyuvante (sin antígeno bacteriano) por vía i.m. a lechones a las 6 y 8 semanas de vida (mismo protocolo que el anterior).

La vacunación y revacunación se realizaron en la granja. Los lechones se mantuvieron en la granja hasta la 10a semana de edad y luego se trasladaron a las instalaciones experimentales de la Universidad de León. En estas instalaciones se mezclaron lechones pertenecientes a los tres grupos experimentales.

La infección experimental se realizó 3 semanas después de la segunda dosis, cuando los lechones tenían 11 semanas de edad. Cada cerdo de cada grupo recibió 100 ml de un cultivo nuevo de cepa tipo B204 que contenía 109 bacterias/ml por vía oral durante 3 días consecutivos. La dieta se modificó el primer día de exposición, tal como se mencionó anteriormente.

Desde el primer día de exposición (PID 1), los cerdos se muestrearon diariamente mediante la recogida de hisopados rectales y se monitorizó la excreción fecal de B. hyodysenteriae mediante cultivo microbiológico. A partir de la PID 1, también se registró el estado general de salud y la presencia de diarrea y las características de las heces.

Resultados:

1.-Mortalidad

En el grupo de cerdos vacunados con la vacuna universal, un lechón murió en el 17a día después de la infección experimental. En este caso, la muerte fue provocada por neumonía. El cerdo muerto no había eliminado Brachyspira hyodysenteriae en las heces antes de su muerte.

La mortalidad por disentería porcina fue la misma en el grupo de cerdos vacunados con la vacuna universal y los vacunados con la autovacuna (1 cerdo en cada grupo) y tres veces menor que en los cerdos no vacunados del grupo control (3 cerdos murieron).

Dada la razón de probabilidades, el riesgo de mortalidad fue 6 veces mayor en los animales del grupo control en comparación con los vacunados con la vacuna universal o con la autovacuna (OR = 6; IC del 95% 0,28-246,02). En ambos grupos de cerdos vacunados (los vacunados con la vacuna universal y los vacunados con la autovacuna) la muerte del cerdo se produjo el día 29 tras la exposición, mientras que en el grupo control los tres cerdos fallecieron los días 7, 9 y 13 tras la exposición (figura 4).

Tal como se esperaba, no se observaron diferencias entre las curvas de supervivencia de los animales vacunados con la vacuna universal y los animales autovacunados (p = 0,9372).

2. -Periodo de incubación

El periodo de incubación, definido como el número de días entre la exposición y la aparición de diarrea o excreción fecal de las bacterias, fue significativamente más largo en los cerdos del grupo control en comparación con los animales autovacunados (F = 7,36; p = 0,024). Este periodo de incubación también fue mayor para los cerdos vacunados en comparación con los controles. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos de cerdos vacunados y autovacunados (F = 1,7; p = 0,228) (figura 6).

3.-Diarrea y diarrea sanguinolenta

La proporción de días con diarrea fue significativamente mayor en el grupo control en comparación con los cerdos vacunados con la vacuna universal (Chi2 = 8,37; p = 0,004) y con cerdos autovacunados (Chi2 = 4,27; p = 0,038). Se obtuvo un resultado similar en cuanto a la proporción de días con diarrea sanguinolenta. El valor fue significativamente mayor en el grupo control en comparación con el grupo vacunado con la vacuna universal (Chi2 = 7,25; p = 0,007) y grupo autovacunado (Chi2 = 16,6; p <0,001).

Además, la diarrea sanguinolenta comenzó antes en el grupo de control (dos días después de la exposición). En este grupo, todos los cerdos tuvieron diarrea sanguinolenta el día 6 posterior a la exposición y durante 5 días la diarrea sanguinolenta afectó a más del 50% de los cerdos (figura 7).

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre cerdos vacunados con la vacuna universal y autovacunados en la proporción de días con diarrea (Chi2= 0,57; p = 0,45) ni con diarrea sanguinolenta (Chi2= 1,92; p = 0,165).

4.-Aumento diario promedio

En los primeros 9 días después de la exposición, casi no se observó aumento de peso en los cerdos del grupo vacunado con la vacuna universal y se determinó un aumento diario medio de 0,27 kg en los animales del grupo autovacunado. Sin embargo, no se demostraron diferencias significativas al comparar ambos grupos. Estos grupos no mostraron pérdida de peso en ningún momento durante todo el ensayo.

Los animales del grupo de control mostraron una clara pérdida de peso durante los primeros 9 días después de la exposición. La pérdida de peso promedio fue de 0,29 kg/día. Pasados estos 9 días, no se encontraron diferencias significativas en el aumento diario promedio (ADG) de los cerdos supervivientes del grupo de control en comparación con la de los cerdos de los grupos vacunados con la vacuna universal y autovacunados (figuras 8 y 9).

Los animales del grupo autovacunado mostraron el aumento diario promedio más bajo cuando se analizaron a los 24 días tras la exposición, probablemente como consecuencia del periodo de incubación más largo de la enfermedad en estos animales. Por otro lado, los animales de los grupos vacunados con la vacuna universal y control mostraron una clara recuperación del aumento diario de peso en este momento ya que estaban afectados previamente por la enfermedad clínica.

Conclusiones

El objetivo del estudio fue comparar la efectividad de una vacuna universal (en este caso compuesta por tres cepas seleccionadas, ninguna de las cuales fue la cepa causante de la infección) con la de una autovacuna en condiciones muy estrictas.

• La infección de cerdos con la cepa B204 usando tres dosis diarias de 109 bacterias y la inducción de una alta disbiosis en el intestino provoca disentería porcina grave y una mortalidad del 50% de los cerdos no tratados en el grupo de control.

• No existen diferencias en la efectividad de la vacuna universal y la autovacuna en la reducción de la mortalidad provocada por disentería porcina.

• No existen diferencias estadísticamente significativas en la efectividad de la vacuna universal y la autovacuna en la reducción de los signos clínicos de disentería porcina (diarrea y diarrea sanguinolenta).

• No hubo pérdida de peso en los cerdos vacunados con la vacuna universal ni en los vacunados con la autovacuna.

La efectividad de la vacuna universal es comparable con la efectividad de una autovacuna eficaz. La vacuna universal tiene una buena relación coste/beneficio para el control de la disentería porcina en condiciones de campo, considerando la efectividad probada de las autovacunas.

Ejemplo 6. Estudio ELISA de lipopolisacáridos (LPS) en conejos hiperinmunizados

El objetivo del siguiente estudio fue mostrar las diferencias cualitativas encontradas entre la respuesta inmunitaria serológica de cada una de las tres cepas (A, B y C, véase a continuación para la referencia exacta) contenidas en la fórmula de vacuna de Brachyspira hyodysenteriae trivalente (vacuna universal).

Material y métodos

Para el experimento, se separaron nueve conejos en tres grupos de tres animales y cada grupo se inoculó por vía intravenosa con una de las cepas durante seis días (D1, D2, D3, D4, D5 y D10 del estudio) con 0,5 ml de la suspensión bacteriana. Así, para cada bacteria fue necesaria la preparación de 0,5 ml x 3 animales por cepa x 6 días = 9 ml de 1010 bacterias/ml de cultivo.

El inóculo se preparó a partir de un cultivo líquido puro de cada cepa en 100 ml de BHI (infusión de cerebro-corazón) con BFS (suero fetal bovino) al 6%. El cultivo líquido se centrifugó y se lavó tres veces con tampón PBS; se concentró la suspensión inicial (crecimiento hasta 109 bacterias/ml aprox.) diez veces hasta una suspensión final de 1010 bacterias/ml.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   i. Composición que comprende bacterias de al menos tres cepas genéticamente diversas de Brachyspira hyodysenteriae, en la que al menos una de las cepas es la cepa con el número de depósito CNCM I-4720, al menos una de las cepas es la cepa con el número de depósito CNCM I-4721 y al menos una de las cepas es la cepa con el número de depósito CNCM I-4722.
2. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que las bacterias están inactivadas.
3. 3. Composición según las reivindicaciones 1 y/o 2, en la que las bacterias están presentes en una concentración de entre 108 y 109 de bacterias totales/ml.
4. 4. Composición según una o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en sales de aluminio y aceites minerales.
5. 5. Composición según la reivindicación 4, en la que el adyuvante es un adyuvante oleoso.
6. 6. Composición según una o más de las reivindicaciones anteriores, para su uso como vacuna contra la disentería porcina, en la que la disentería porcina está provocada por Brachyspira hyodysenteriae.
7. 7. Composición para su uso según la reivindicación 6, en la que las cepas genéticamente diversas de la composición se detectan en una proporción de al menos el 1% con respecto al total de cepas detectadas en una región de interés.
8. 8. Composición para su uso según la reivindicación 7, en la que la región de interés es España.
9. 9. Composición para su uso según una o más de las reivindicaciones 6-8, en la que la vacuna se administra mediante administración parenteral.
10. 10. Composición para su uso según una o más de las reivindicaciones 6 a 9, en la que los cerdos se vacunan dos semanas después del destete.
11. 11. Composición para su uso según la reivindicación 10, en la que los cerdos vuelven a vacunarse dos semanas después de la primera vacunación.
12. 12. Composición para su uso según una o más de las reivindicaciones 6 a 11, en la que el número total de bacterias por dosis administrada a los cerdos está entre 108y 109 bacterias.
13. 13. Cepa bacteriana depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), Instituto Pasteur con número de registro CNCM I-4720.