JP2012508564A - ブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、生Ｂ．ヒオディセンテリア株を含むワクチンを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、一般にはブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株に関する。詳細には、本発明は、一以上の病原性因子を有しないＢ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株に関する。また、本発明は、ワクチン株を確認及び調製する方法にも関すると共に、下痢性疾患に対するワクチン組成物、及び該疾患を診断するための方法及びキットにも関する。
【選択図】図５
【解決手段】本発明は、一般にはブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株に関する。詳細には、本発明は、一以上の病原性因子を有しないＢ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株に関する。また、本発明は、ワクチン株を確認及び調製する方法にも関すると共に、下痢性疾患に対するワクチン組成物、及び該疾患を診断するための方法及びキットにも関する。
【選択図】図５
Description
本発明は、一般にブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株に関する。
ブラキスピラ・ヒオディセンテリアは、多くの哺乳類や鳥類に感染し、下痢性疾患を引き起こす嫌気性腸管スピロヘータである。よく研究された疾患例としてはブタ赤痢（ＳＤ）が挙げられるが、これは、ブタのＢ．ヒオディセンテリア感染に起因する、オーストラリア及び世界中におけるブタの重大な風土病の一種である。ＳＤは接触伝染性粘膜出血性下痢疾患であり、大腸上皮表面の広範囲の炎症や壊死を特徴とする。ＳＤによる経済的損失は、主に発育遅延や治療費用、死亡によるものである。ＳＤが養豚場で発症した場合、疾患の範囲は、軽度、一過性又は不明瞭なものから重篤、更には致死的なものにもなり得る。
各養豚場において戦略的投薬により臨床的徴候が顕在化しない場合もあり、また、一部の養豚場では、ＳＤが発見されないか又は疑われるに過ぎないこともあり得る。明白なＳＤが発症しようがしまいが、Ｂ．ヒオディセンテリアは、感染ブタや他の保有宿主（例えば、げっ歯動物）、又は環境に存続し得る。これら感染源は全て、非感染の群れにＢ．ヒオディセンテリアを伝染させる可能性を有する。
ＳＤの防除には数多くの方法が利用されており、抗菌剤を予防的に使用することから、感染した家畜の群れの完全移動、感染キャリアブタのリエントリーを防止することまで様々である。これらの選択肢は全て高い費用や時間が掛かるが、その理由として、十分な効果を達成するために経過をモニターする際に高度な診断試験を行う必要があるからである。
Ｂ．ヒオディセンテリアに起因する疾患を防除するための「黄金基準（gold standard）」は、ワクチンを用いて動物に免疫を付与し、Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成及び／又はＢ．ヒオディセンテリア症を予防することであろう。歴史的に、最も有効で効果的なワクチンは、微生物の病原性株の弱毒生ワクチンである。このようなワクチンは全段階の免疫応答を活性化し、耐久免疫をもたらす（即ち、追加免疫を必要としない）。
免疫原性タンパク質や弱毒株を用いてＢ．ヒオディセンテリアに対するワクチンを開発する試みが為されている。しかし、Ｂ．ヒオディセンテリアの全細胞又はサブユニットを死滅させ、実験において動物に筋肉内投与しても、防御的有用性は殆ど得られなかった。また、クローン化した組換え周辺鞭毛抗原は、ＳＤのマウスモデルでは防御をもたらすように思われたが、ブタにおいては防御をもたらすことができなかった。現在、Ｂ．ヒオディセンテリアに対する防御に関して有効なワクチンは得られていない。
本発明者らは、多数のＢ．ヒオディセンテリア病原性因子を同定した。これらの因子は、生Ｂ．ヒオディセンテリア株を含むワクチンの開発に利用することができる。
従って、本発明は、その第１の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株であって、一以上の病原性因子を有しない前記ワクチン株を提供する。
いくつかの実施形態においては、当該病原性因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
従って、本発明は、その第２の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる一以上の機能的病原性因子を有しないＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株を提供する。
いくつかの実施形態においては、Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株は弱毒病原性株であり、当該株は、病原性因子を弱毒化する改変を含み、防御的な免疫原性となるような免疫原性特性を保持しているが、もはや病原性ではない。
当業者であれば、Ｂ．ヒオディセンテリアの弱毒病原性株は、当該株が弱毒化されるか、又は非病原性となるいかなる方法によっても改変し得ることが理解されよう。例えば、当該改変によって、病原性に関連する核酸の機能を崩壊させることができる。いくつかの実施形態においては、前記改変によって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６、又はその組合せに記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列からのｍＲＮＡ発現が低下又は抑制される。いくつかの実施形態においては、前記改変は発現には影響を及ぼさないが、一以上の非機能的産物の翻訳をもたらす（ここで、「機能的産物」とは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリペプチド配列によってコードされるものをいう）。
いくつかの実施形態においては、病原性因子はプラスミド由来の核酸配列によってコードされる。従って、前記改変には、病原性因子の一以上を含む一以上のプラスミドをＢ．ヒオディセンテリア株から除去することが含まれ得る。
他の実施形態においては、Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株は天然の非病原性株であり、当該株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似するポリヌクレオチド配列によってコードされる病原性因子の一以上を有しない。
本発明は、その第３の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアのワクチン株を提供するものであって、当該ワクチン株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６、又はその組合せに記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列からのｍＲＮＡ発現がない生Ｂ．ヒオディセンテリア株である。又は一以上の非機能性産物を発現し、かつ、防御的な免疫原性となるような免疫原性特性を有するワクチン株（ここで「機能的産物」とは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリペプチド配列によってコードされるものをいう）である。
本発明は、その第４の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアの生ワクチン株を調製する方法を提供するものであって、当該方法は、（ａ）病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を選択することと、（ｂ）前記病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株において改変をもたらして生弱毒病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を得ることと、（ｃ）前記改変を含む生弱毒病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を単離することと、（ｄ）前記単離Ｂ．ヒオディセンテリア株を選択することとを含み、ここで前記選択されたＢ．ヒオディセンテリア株は、防御的な免疫原性であるような免疫原性特性を保持しているものである。
本発明は、その第５の形態において、本発明の第１、第２及び／又は第３の形態に係る少なくとも１種のＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株を薬学的に許容し得る賦形剤（媒体）内に含むワクチン組成物を提供する。
いくつかの実施形態においては、ワクチン組成物はアジュバントを更に含む。
本発明は、その第６の形態において、動物における下痢性疾患を予防する方法であって、本発明の第１、第２及び／又は第３の形態に係る少なくとも１種のワクチン株の有効量を前記動物に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、その第７の形態において、動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成を診断する方法を提供するものであって、当該方法は、（ａ）前記動物からサンプルを得る工程と、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列の有無、及び／又は対応するｍＲＮＡ又はコードされるタンパク質生成物の発現を確認する工程とを含み、ここで、前記核酸又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質生成物の存在は、前記動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成の存在を示すものである。
本発明は、その第８の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアの病原性を阻害することが可能な化合物をスクリーニングする方法を提供するものであって、当該方法は、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトすることと、（ｂ）前記トランスフェクトされた細胞を候補化合物に接触させることと、（ｃ）前記核酸分子の一以上からのｍＲＮＡ発現のレベル、又は前記ｍＲＮＡ発現によってコードされるタンパク質のレベルを比較することを含み、ここで前記タンパク質は、候補化合物の存在下及び非存在下で、細胞内に配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列の一以上と実質的に類似するポリペプチド配列を有し、更に（ｄ）候補化合物が存在しないときと比べて、存在するときにｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現が有意に低い場合には、候補化合物がＢ．ヒオディセンテリア病原性の阻害剤であることを推測することを含むものである。
本発明のスクリーニング方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列の転写制御配列又はプロモーターと作用的に連結された（operatively linked）レポーター遺伝子をコードするＤＮＡ構築物を二者択一的に含むことができ、候補化合物が存在しないときと比べて、存在するときにレポーター遺伝子生成物の生成が有意に低い場合には、候補化合物がＢ．ヒオディセンテリア病原性の阻害剤であることが理解されよう。
本発明は、その第９の形態において、本発明の第１、第２及び／又は第３の形態に係る少なくとも１種のワクチン株を含む、Ｂ．ヒオディセンテリア感染を予防するのに用いる医薬の製造におけるＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株の使用を提供する。
本発明は、その第１０の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリア感染に対する動物のワクチン接種のためのキットであって、（ａ）本発明の第１、第２及び／又は第３の形態に係る少なくとも１種のワクチン株を薬学的に許容し得る賦形剤（媒体）内に含むワクチン組成物と、（ｂ）動物にワクチン接種するための説明書とを含むキットを提供する。
本発明は、その第１１の形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアの候補ワクチン株を確認する方法を提供するものであって、当該方法は、（ａ）Ｂ．ヒオディセンテリアのサンプルを得る工程と、（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のポリペプチド配列によってコードされる核酸配列の一以上の有無、及び／又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質生成物の発現を確認する工程とを含み、ここで前記核酸の欠如、又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の欠如は、Ｂ．ヒオディセンテリアのワクチン株であることを示すものである。
本発明は、その第１２の形態において、動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成を診断するためのキットであって、配列番号５５〜９０に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似するポリヌクレオチド配列を有する一以上のＰＣＲプライマーを含むキットを提供する。
本発明によれば、Ｂ．ヒオディセンテリアに対する防御に関して有効なワクチンを得ることができる。
本発明について詳細に説明する前に、本発明は特定の方法例に限定されず、当然のことながら本発明の変更も可能であることを理解されたい。また、本明細書における専門用語は本発明の特定の実施形態を説明する目的のみに用いており、添付した特許請求の範囲によってのみ限定される本発明が専門用語によって限定されることを意図していないことも理解されたい。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、上述のものであろうと後述のものであろうと、その全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。しかし、本明細書中に言及される各種刊行物は、該刊行物で報告され、且つ本発明に関連して用い得る手順や試薬、ベクターについて説明し且つ開示する目的で引用するものである。本明細書に掲載したいずれも、本発明に先行する発明であるということをもって本発明がこれら開示に先行する資格がないことを自認するものとして解釈すべきではない。
また、本発明の実施においては、特に明記しない限り、当該技術分野の技術範囲内の従来の免疫学的、分子生物学的技法や薬理学を用いる。このような技法は当業者にはよく知られており、文献内で十分に説明されている。例えば、コリガン（Coligan）、ダン（Dunn）、プロー（Ploegh）、シュパイヒャー（Speicher）及びウィングフィールド（Wingfield）、「タンパク質科学における最新手順」（１９９９）、Ｉ及びＩＩ巻（ジョン・ワイリー＆サンＩｎｃ.）；サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」（１９８９）、第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）；及びプレスコット（Prescott）、ハーレー（Harley）及びクライン（Klein）、「微生物学」（１９９９）、第４版（ＷＢＣマグローヒル）を参照のこと。
特に文脈にて明確に定められない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる単数形「a」、「an」及び「the」は、複数形の言及も包含することに留意する必要がある。従って、例えば「a gene」の場合は複数の遺伝子を包含することを意味し、また、「an animal」は一以上の動物を意味する等である。特に明記しない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する当該技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は等価な材料や方法のいずれを用いても本発明を実施又は試験することができるが、好ましい材料及び方法については以下に記載する。
本発明は、その最も広い形態において、Ｂ．ヒオディセンテリアのワクチン株を提供する。Ｂ．ヒオディセンテリアは、スピロヘータ綱に属する嫌気性でグラム陰性の化学合成細菌であり、その長く、細いらせん形状を特徴とする。Ｂ．ヒオディセンテリアに感染した動物は下痢性疾患を発症する。Ｂ．ヒオディセンテリアに感染したブタ類は、大腸上皮表面の広範囲の炎症や壊死を特徴とするブタ赤痢を発症する。従って、本発明のワクチン、化合物及び方法は、ブタ類（子ブタや雄ブタ）に対して好適に用いることを特に意図しているが、他の哺乳動物種や鳥類、例えば、ヒトやペット動物（イヌやネコ等）、家畜（ニワトリやガチョウ、ウマ、ウシ、ヒツジ等）、動物園の哺乳動物（非ヒト霊長類やネコ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物等）にも使用することができる。
本発明のワクチン株は生Ｂ．ヒオディセンテリア株である。本明細書における「株」とは、ある細菌種の変異体であって、一以上の特性（例えば、リボソームＲＮＡ配列変異やＤＮＡ多型、血清型分類、毒素産生等）によって当該細菌種内の他の株から区別され得るものを示す。本発明においては、Ｂ．ヒオディセンテリア株はその病原性状態によって区別される（すなわち、株は病原性又は非病原性に分類される）。病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株の例としては、ＷＡ１やＢ２０４、Ｖｉｃ２、ＢＷ１、ＮＳＷ５、Ｑ１７、ＮＳＷ１５が挙げられ、非病原性株の例としては、Ｂ７８TやＳＡ２２０６、ＶＳ１、Ｂ２３４、Ｒ３０１、Ｂ６９３３、ＦＭ８８．９０、Ａ１が挙げられる。
いくつかの実施形態においては、ワクチン株は弱毒病原性株である。本明細書において、「病原性」又はその文法的に等価な用語は、下痢性疾患に関連する臨床症状を引き起こし得るＢ．ヒオディセンテリア株の説明に用いる。
病原性株の病原特性はその病原性因子の生産に起因する。本明細書における「病原性因子」は、Ｂ．ヒオディセンテリアの病原性又はＢ．ヒオディセンテリアの疾患を引き起こす能力に寄与する産物に関連する。病原性因子はタンパク質であっても炭水化物であってもよく、その例としては、コアグラーゼやコラゲナーゼ、ヘモリジン（溶血素）、リポ多糖が挙げられる。例えば、ラムノース生合成に伴う産物も病原性因子になり得る。リポ多糖（ＬＰＳ）は３種の異なる構造ドメイン、すなわち、脂質Ａ、コア及びＯ抗原から成る。脂質Ａは疎水性膜アンカーとして機能し、分子の生理活性成分を構成する。コア領域は複合オリゴ糖から成り、Ｏ抗原と比べて限られた構造的変異しか示さない。Ｏ抗原はＬＰＳの中で最も可変的な部分を含み、細菌に血清型特異性を与える。Ｏ抗原は１〜８個の糖から成る糖サブユニットの繰り返しで構成されている。各Ｏ鎖はこのサブユニットを最大５０個まで含み得る。ラムノースは、細胞壁を含むＬＰＳのＯ特異的抗原及び多くの病原菌の莢膜において重要な部分である。細胞壁と莢膜は感染時に宿主と相互作用し、細菌の生存には極めて重要である。ＬＰＳにおいて炭水化物部分が欠如すると、株はラフ型コロニー形態を有するようになる。通常、ラフ型株の病原性は大きく低下し、その抗生物質や血清成分に対する感受性は増大する。従って、いくつかの実施形態においては、本発明の病原性因子はラムノース生合成に伴う産物をコードする。
いくつかの実施形態においては、病原性因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列、又はその機能的変異体によってコードされる。本明細書における「核酸」、「ポリ核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、全ての形態のデオキシリボ核酸及びリボ核酸（すなわち、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等）を意味する。
本明細書における「実質的に類似する」とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列と等価なヌクレオチド配列であるが、一以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失によって異なっている核酸配列（例えば、対立遺伝子多型）を意味し、さらには遺伝暗号の縮重に起因して異なる配列も含まれる。また、等価物には「実質的に相同的な」ヌクレオチド配列（すなわち、ヌクレオチド配列の所定の長さに亘ってヌクレオチドが少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％一致しているヌクレオチド配列）も含まれる。実質的に類似する配列は、サザンハイブリダイゼーション試験（例えば、特定の系において定められた高、中又は低ストリンジェンシー条件下での試験）によって確認することができる。
本明細書において種々の文法形態で用いる「コードする」には、転写的及び／又は翻訳的な意味において、他のヌクレオチド又はアミノ酸に対応するヌクレオチド及び／又はアミノ酸が包含される。
「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）の通常の二重鎖らせんにおけるポリマー形態を意味する。この用語は分子の一次及び二次構造のみを意味し、いかなる特定の三次形状をも限定しない。従って、この用語は、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限酵素断片）、ウイルス、プラスミド及び染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する際、本明細書においては、配列の説明は、非転写ＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同の配列を有する鎖）に沿う５’−３’方向における配列のみを示す通常の慣習に従って行い得る。
遺伝暗号に従ったＤＮＡ配列の翻訳によってアミノ酸配列が得られる場合、当該ＤＮＡ配列は当該アミノ酸配列に「対応する」（すなわち、当該ＤＮＡ配列は当該アミノ酸配列を「コードする」）。２種のＤＮＡ配列が同一のアミノ酸配列をコードする場合、一方のＤＮＡ配列は他方のＤＮＡ配列に「対応する」。２種のＤＮＡ配列の所定の長さに亘ってヌクレオチドが少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％一致しており、前記ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の対応する活性が等価である場合には、一方のＤＮＡ配列は他方のＤＮＡ配列の「機能的変異体」である。あるタンパク質をコードする所定長のＤＮＡ配列を「遺伝子」と称することができる。
本明細書における「弱毒」は、もはや疾患を生じ得ないように改変された病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を説明するのに用いる（すなわち、改変された株は非病原性である）。
本明細書において「生」は、成長及び再生が可能なＢ．ヒオディセンテリアを説明するのに用いる。従って、本発明の生Ｂ．ヒオディセンテリア株は動物の結腸でコロニー形成し得るが、Ｂ．ヒオディセンテリア感染に起因する下痢性疾患に関連する臨床症状を引き起こし得ない。また、本発明の生株は、ワクチン接種した動物において限定的に複製することができ、病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株に対して防御的な防御的免疫応答を誘導することができる。
本明細書に記載の病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株は、臨床的に公知の病原性株であってもよく、病原性因子を含むことが確認されている株であってもよい。従って、本発明は、病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を確認する方法も提供する。例えば、あるＢ．ヒオディセンテリア株が病原性株であるかどうか確認する第１の工程は、当該株内で病原性因子の有無を確認することである。幾つかの実施形態においては、このような病原性因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列、又はその機能的等価物によってコードされる。このような病原性因子をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子の存在は、当該ポリヌクレオチド又は遺伝子の転写及び／又は翻訳に関連するか、又はそれを示すいかなる因子（例えば、ＲＮＡ発現レベルやタンパク質発現レベルが挙げられるが、これらに限定されない）の解析によって確認することができるが、染色体又は細胞質内のＤＮＡ配列の存在によっても確認することができる。サンプル内でのポリヌクレオチドや遺伝子又はその産物の存在を確認するための技法は当業者にはよく知られており、本明細書の他の箇所に記載する。いくつかの実施形態においては、未知の株内に一以上の病原性因子が存在することは、当該株が病原性株であることを示す。
病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株は一旦得られれば、当該技術分野で公知の数多くの方法（例えば、多重連続継代や温度感受性弱毒化、変異等が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかによって改変し、当該株を弱毒化する（すなわち、非病原性であり、動物において疾患を生じさせ得ない）ことができる。
いくつかの実施形態においては、病原性株に対する改変によって、病原性因子をコードするポリヌクレオチドや遺伝子の発現が低下又は抑制されるか、或いは、非機能的病原性因子の発現がもたらされる。
ポリヌクレオチドの発現を低下又は無効にするための数多くの技法が当該技術分野ではよく知られている。例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて、所定の部位（例えば、プロモーター領域やナンセンス変異をもたらすコード配列内）に変異を導入することができる。組換えＤＮＡ技法には、対象遺伝子のクローニング、部位特異的突然変異誘発による遺伝子配列の改変、制限酵素消化とそれに続く再連結、及びその後の野生型遺伝子の変異体遺伝子による置換が含まれる。
標準的な組換えＤＮＡ技法（例えば、病原性因子のプラスミドへのクローニングや、制限酵素を用いたポリヌクレオチド配列の消化、それに続くエンドヌクレアーゼ処理、再連結、及び宿主株内での相同組換え）は全て当該技術分野で知られており、特に、サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」（１９８９）、第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されている。部位特異的変異は、例えば、クロンテック社で販売のＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ（登録商標）キットを用いたインビトロ部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。ＰＣＲ技法は、ディエッフェンバッハ（Dieffenbach）＆ドレクスラー（Dreksler）（１９９５）「ＰＣＲプライマー−実験室マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）及び本明細書の他の箇所に広く記載されている。
いくつかの実施形態においては、１個のヌクレオチドを挿入、欠失、又は他のヌクレオチドと置換することによって変異（例えば、点変異）を染色体ＤＮＡ又は染色体外ＤＮＡ（例えば、プラスミド）の所定部位に導入することができ、これによって、発現の低下した又は発現のない変異遺伝子が得られる。この変異によって、下痢性疾患（例えば、ブタ赤痢）を引き起こす能力が低下したＢ．ヒオディセンテリア株が得られる。この変異は、欠失変異（すなわち、核酸の切除によって遺伝子の破壊が生じる）であることが好ましい。このような変異は、例えば、隣接するスパンの塩基対を欠失することによって行うことができる。ごく僅かな欠失（例えば、１０個の塩基対の配列）によっても、遺伝子がタンパク質をコードしないように、又は非機能的タンパク質をコードするようにすることができる。単一の塩基対の欠失によっても、タンパク質が産生しないか、又は非機能的タンパク質が産生するようになり得るが、それは、このような変異の結果、他の塩基対がもはや正しい読み枠内に存在しなくなるか、あるいは、転写の阻害や減少が生じるためである。より長い配列（例えば、１００個の塩基対）を除去することがより好ましい。遺伝子全体を欠失させることが更に好ましい。
遺伝子断片又は遺伝子全体の欠失、あるいはその組合せの欠失を伴う、明確で、慎重に為される変異は、古典的に誘導される変異と比べて、野生型に復帰しない点で有利である。従って、本発明のいくつかの実施形態においては、ワクチン株は生弱毒病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を含み、病原性因子をコードする遺伝子の変異は、病原性因子をコードするポリヌクレオチド配列を破壊する欠失又は挿入を含み、対応するタンパク質が産生されないか、又は産生されるタンパク質が非機能的であるようにする。
また、当業者であれば、Ｂ．ヒオディセンテリアの病原性因子を確認することによって、本明細書に記載の技法だけを用いて、天然のＢ．ヒオディセンテリア株が非病原性であることや、又は病原性因子をコードするポリヌクレオチドや遺伝子に一以上の変異が既存することを確認し、生ワクチン株として用いることができることも理解するであろう。このような天然のＢ．ヒオディセンテリアは、一旦標準的な技法によって単離すれば、必要に応じて、更なる突然変異誘発や組換えＤＮＡ技法に付して二重又は多重変異株を構築することができる。また、Ｂ．ヒオディセンテリア株は、病原性因子をコードする全遺伝子の欠失を含むことができる。いくつかの実施形態においては、Ｂ．ヒオディセンテリア株は、全ての病原性遺伝子において欠失変異が既存している野生型非病原性株である。
病原性因子をコードする遺伝子において一以上の変異を有する細菌を確認するための技法は、当業者には公知である。従って、上述の技法によって変異したＢ．ヒオディセンテリア株を検出するための常法としては、本明細書の他の箇所に記載のノーザンブロッティングやウェスタンブロッティング、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、細胞毒性アッセイが挙げられる。病原性因子をコードする機能的遺伝子を有しない変異株は、本明細書の他の箇所に記載のように容易に選択することができる。
本発明の病原性因子をコードする遺伝子はプラスミド由来であり得る。従って、いくつかの実施形態においては、病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株に対する改変には、当該株から一以上のプラスミドを除去することが含まれる。本明細書における「プラスミド」とは、細菌染色体とは関係なく複製する細胞質ＤＮＡを意味する。細菌株からプラスミドを排除又は「除去」するために、化学剤や物理的要因を用いた種々の方法が開発されている。細菌株からプラスミドを除去する場合、プラスミドを直接物理的に除去するのではなく、プラスミドの複製及び／又は分割を妨害して、プラスミドフリーの分割が生じる割合を増加させるようにする。
プラスミドを除去するための標準的なプロトコール（例えば、抑制濃度以下の化学剤（アクリジンオレンジやアクリフラビン、ドデシル硫酸ナトリウム等）又は最適温度より高い温度に細菌培養物を曝露した後に、誘導体を除去する）は、全て当該技術分野で知られており、特に、サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」（１９８９）、第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されている。プラスミドの株からの除去は、例えば、培養物を臭化エチジウムに曝露することによって行うことができる。一例においては、Ｂ．ヒオディセンテリア細胞は、嫌気性トリプチケースソイブロス培地中で対数期の中間部まで増殖することができる。次に、例えば、約３０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む嫌気性トリプチケースソイブロス中で細胞を段階的に希釈し、嫌気性条件下、振盪させながら約３７℃で約３日間維持する。最も高い希釈段階から得た生存可能な培養物を３０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む嫌気性トリプチケースソイブロス培地で段階的に希釈し、同一条件下、３７℃で３日間維持する。このプロセスを少なくともあと９回繰り返し、最終継代後、細菌細胞を洗浄して臭化エチジウムを除去し、寒天培地（例えば、偏好性嫌気性寒天（ＬａｂＭ）プレート）上に蒔いて単一コロニーを得る。
除去した誘導体を確認するための技法は当業者に知られている。それを検出するための常法（例えば、ノーザンブロッティングやウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、細胞毒性アッセイ）は当該技術分野で知られている。一例においては、ＰＣＲによって単一コロニーをプラスミドの欠如に関してスクリーニングする。野生型Ｂ．ヒオディセンテリア株では病原性因子全てについてＰＣＲ産物が存在するのに対し、このＰＣＲ産物が存在しなければ、プラスミドの除去が成功したことを示す。
病原性遺伝子を含む一以上のプラスミドが欠如した天然の非病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を確認するのに上述のものと同じ技法が適用し得ることは、当業者には明らかであろう。
本明細書における「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、一般に、所望のヌクレオチド配列をインビトロで増幅するための方法を意味する。一般に、ＰＣＲ法においては、鋳型核酸に対して選択的にハイブリダイズすることが可能な２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲ試薬の存在下でプライマー伸長合成サイクルを繰り返す。通常、ＰＣＲ法に用いるプライマーは、鋳型内で増幅対象のヌクレオチド配列の両端にあるヌクレオチド配列又は増幅対象のヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に対して相補的であるが、増幅対象のヌクレオチド配列に相補的なプライマーを用いることもできる。いくつかの実施形態においては、病原性因子をコードする遺伝子の存在を確認するのに用いるＰＣＲプライマーは図３に記載のものである。
また、増幅産物の存在によって特定の結合複合体が生成したことが示される場合には、所望の配列に特異的に結合するプライマーを用い、ＰＣＲによって特定の配列が存在するかどうか確認することもできる。あるいは、増幅サンプルを電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動やゲル電気泳動）によって分画し、好適な支持体（例えば、ニトロセルロース）に移した後、鋳型配列の断片で精査することができる。
「オリゴヌクレオチドプライマー」、「オリゴヌクレオチドプローブ」又は「ＰＣＲプライマー」とは、公知の方法（例えば、トリエステルやホスホラミダイト、ホスホン酸化学を含む）によって化学的に合成される長さの短い、一本鎖又は二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。通常、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。本発明のプライマー及びプローブは、病原性因子をコードする遺伝子核酸内の隣接する核酸残基の領域に（好ましくは、高緊縮条件下で）ハイブリダイズするのに十分に相補的であるＤＮＡ分子である。適切なハイブリダイゼーション条件を定めるのは当業者の技能範囲内である。しかし、簡潔に言えば、核酸分子のハイブリダイゼーション又はアニーリングのための「緊縮条件」とは、（１）洗浄用に低イオン強度及び高温を用いる（例えば、０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０℃）、又は（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアミド等の変性剤を用いる（例えば、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） ホルムアミド、０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ フィコール／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、４２℃）。他の例においては、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５× デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ ＳＤＳ、及び１０％ デキストラン硫酸を４２℃で用い、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳにて４２℃で洗浄する。
プライマー及びプローブの例としては、少なくとも約１５核酸残基長であり、いずれかの１５以上の隣接ＤＮＡ残基から選択されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において用いるオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、少なくとも約２０核酸残基長であることが好ましい。また、本発明は、１５０核酸残基長又はそれよりも長いオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブも意図する。当業者であれば、特定の長さのプライマー又はプローブを本発明の核酸分子にハイブリダイズするための核酸ハイブリダイゼーション条件を容易に決定し得ることが理解されよう。種々の長さのプローブに対して最適なハイブリダイゼーション条件を得るための操作は、当該技術分野ではよく知られている。いくつかの実施形態においては、病原性因子をコードする遺伝子の存在を確認するのに用いるオリゴヌクレオチドプライマーは図３に記載されている。
本明細書における「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲプロセスを行うのに必要な、鋳型核酸配列とは別の化学薬品を意味する。このような化学薬品は一般に５種類の成分、すなわち、（ｉ）水性緩衝液、（ｉｉ）水溶性マグネシウム塩、（ｉｉｉ）少なくとも４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、（ｉｖ）オリゴヌクレオチドプライマー（通常、鋳型配列に対して２個のプライマー、すなわち、二本鎖鋳型配列の２個の相補的な鎖の５’末端を定める配列）、及び（ｖ）ポリヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、活性の約半分以上を失うことなく、９０℃〜１００℃の温度に少なくとも合計１０分間耐え得るＤＮＡポリメラーゼ）からなる。好適なポリヌクレオチドポリメラーゼの例としては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）が挙げられる。
従来の４種類のｄＮＴＰとは、チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）及びデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）である。このような従来のデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、従来の４種類の塩基（例えば、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ））様のワトソン−クリック塩基対の塩基類似体を含むｄＮＴＰで補充又は置換することができる。
検出可能な標識を増幅反応に含めることができる。ニックトランスレーションや化学的手段、酵素的手段等の技法によって、ビオチン標識ヌクレオチドをＤＮＡ又はＲＮＡに組み込むことができる。ビオチン標識プライマーやプローブは、ハイブリダイゼーション後、アビジン／ストレプトアビジンや蛍光標識剤、酵素、金コロイドコンジュゲート等の表示手段を用いて検出する。また、核酸を他の蛍光化合物や免疫検出可能な蛍光誘導体、ビオチン類似体等で標識することもできる。タンパク質への付着によって核酸を標識することもできる。また、放射性又は蛍光性のヒストン一本鎖結合タンパク質に架橋した核酸を用いることもできる。当業者であれば、本発明の実施において、オリゴヌクレオチドプライマーやプローブを検出するための他の好適な方法や他の好適な検出可能標識が用い得ることが理解されよう。また、蛍光残基を化学合成時にオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、標識化されて容易に検出可能とすることが好ましい。検出可能な標識は、視覚的に又は機器を用いて検出し得るいかなる種や部分であってもよい。
好適な標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ））や放射性標識（例えば、32Ｐや35Ｓ、3Ｈ）、その他が挙げられる。他の蛍光化合物としては、α位又はβ位にアミノ基を有するナフチルアミン類が挙げられる。このようなナフチルアミノ化合物としては、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネートや１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の色素としては、３−フェニル−７−イソシアナートクマリンや９−イソチオシアナートアクリジンアクリジンオレンジ等のアクリジン類、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾキサジアゾール類、スチルベン類、ピレン類等が挙げられる。蛍光化合物は、ＶＩＣ、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０及びＣｙ５から成る群から選択されることが最も好ましい。
標識は２段階システムであってもよい（すなわち、高親和性結合パートナー（例えば、アビジンや特定の抗体等）を有するビオチンやハプテン類等に増幅ＤＮＡを接合させ、該結合パートナーを検出可能な標識に接合させることができる）。標識はプライマーの一方又は両方に接合させることができる。あるいは、増幅に用いるヌクレオチドのプールを標識して、増幅産物に標識を組み込むようにする。
本発明のワクチン株はその免疫原性特性を保持し、防御的に免疫原性である。本明細書における「免疫原性特性」とは、当該ワクチン株が動物において抗原に対する体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を生じさせる能力を意味する。本発明の目的に関し、「体液性免疫応答」とは、抗体分子が仲介する免疫応答を意味し、「細胞性免疫応答」とは、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球が仲介する免疫応答を意味する。
細胞性免疫の重要な一様相は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬｓ」）による抗原特異的応答を伴う。ＣＴＬｓは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）でコードされ、細胞表面上に発現するタンパク質に伴って存在するペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬｓは、細胞内微生物の破壊又は該微生物に感染した細胞の溶解を誘導し、促進するのに役立つ。細胞性免疫の他の様相は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣ分子に伴うペプチド抗原を表面に表示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせるのに役立つように作用する。また、「細胞性免疫応答」とは、サイトカインやケモカイン、また、活性化Ｔ細胞及び／又は他の白血球によって産生する他の分子（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する分子等）の産生をも意味する。
細胞性免疫応答を誘発する組成物やワクチンは、細胞表面でのＭＨＣ分子に関連する抗原の提示によって被験体を感作する役割を果たし得る。細胞仲介免疫応答は、抗原を提示する細胞の表面又はその近くを指向する。また、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の今後の防御を可能にするように生成し得る。
特定の免疫原が細胞仲介免疫応答を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイやＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ等の数多くのアッセイによって、あるいは、感作被験体において抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイすることによって確認することができる。このようなアッセイは当該技術分野ではよく知られている。細胞仲介免疫応答を測定する方法としては、細胞内サイトカイン又はＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定や、エピトープ特異的Ｔ細胞の測定が挙げられる。
従って、本明細書における「免疫原性特性」とは、抗体の産生を刺激する特性又はＣＴＬｓの産生を誘発する特性であり得る。よって、本発明のワクチン株の免疫原性特性は、次の作用、すなわち、Ｂ細胞による抗体の産生、及び／又は、本発明のワクチン組成物に存在する抗原を特異的に指向するサプレッサーＴ細胞の活性化の一以上を開始し得る。このような応答は、感染性を中和し、腸内での細菌のコロニー形成を防止する、及び／又は免疫された宿主を防御する抗体−補体又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を仲介する役割を果たし得る。従って、本発明のワクチン株の免疫原性は「防御的な免疫原性」である。
いくつかの実施形態においては、ワクチン株を調製する方法は、病原性株を選択する工程と当該病原性株内で改変をもたらす工程とを含むだけでなく、当該改変を含む生弱毒病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を単離し、選択する工程をも含む。改変されたＢ．ヒオディセンテリア株を単離し、選択する方法は当該技術分野で知られており、本明細書の他の箇所に記載されている。
本発明のワクチン株は、一旦作出すれば、動物に投与してＢ．ヒオディセンテリアのコロニー形成に起因する赤痢を予防することができる。いくつかの実施形態においては、少なくとも１種のＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株の有効量を動物に投与する。
本発明のワクチン株は、レシピエント動物の年齢や性別、重量、種、病態等の因子や投与経路を考慮に入れ、医学又は獣医学分野の当業者によく知られた技法によって種々の用量で投与することができる。投与経路は、経皮投与、粘膜投与（例えば、経口や経鼻、肛門、膣）又は非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、静脈内又は腹腔内）とすることができる。ワクチン株は単独で投与してもよく、他の処置や治療と併用して又は逐次的に投与してもよい。投与形態としては、懸濁剤やシロップ剤、エリキシル剤、非経口、皮下、皮内、筋肉内又は静脈内投与（例えば、注射投与）用製剤（例えば、滅菌懸濁剤や乳剤）を挙げることができる。
ワクチン株は噴霧剤として投与してもよく、食品及び／又は水と混合してもよく、適切な担体、希釈剤、アジュバント又は賦形剤（例えば、滅菌水や生理食塩水、グルコース等）との混合物として与えられてもよい。ワクチン株には、投与経路や所望の製剤に応じて、湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化添加剤、増粘添加剤、保存剤、矯味剤、着色剤等の補助物質を含めることができる。標準的な薬学テキスト（例えば、「レミントン薬学」（１９９０）第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．））を参考にして、必要以上に実験を行うことなく適切な製剤を調製することができる。
また、本発明のワクチン株はワクチン組成物の調製に用いることもできる。いくつかの実施形態においては、当該ワクチン組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種のＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株を薬学的に許容し得る媒体内に含む。また、本発明は、いくつかの実施形態において、Ｂ．ヒオディセンテリア感染を予防するのに用いる医薬の製造におけるＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株の使用も提供する。医薬組成物や医薬を調製するための医薬担体は、「レミントン薬学」（１９９０）第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）等のテキストに記載のように当該技術分野ではよく知られている。ワクチン組成物を投与する方法も当該技術分野で知られており、上述の通りである。
また、本発明は、いくつかの実施形態において、前記ワクチン組成物の有効量を投与することによってＢ．ヒオディセンテリア感染に対するワクチン接種を行う方法も提供する。論理的には、本発明は、上述のワクチン組成物の有効量をブタ等の動物に投与することによって、当該動物にＢ．ヒオディセンテリア感染に対する免疫を付与する方法も提供する。
本発明の実施形態に開示の組成物はキットの一部となり得る。通常、キットには使用説明書も含まれよう。
また、本発明は、動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成を診断する方法にも関する。いくつかの実施形態においては、当該方法は、Ｂ．ヒオディセンテリア感染症を有する疑いのある動物からサンプルを得ることを含む。
「サンプル」とは、Ｂ．ヒオディセンテリア、そのポリヌクレオチド又はそのポリペプチドを含む疑いのある動物組織、生体液又は他の物質を意味する。このような組織、体液又は物質の例としては、血漿や血清、糞便、尿、胃や腸のサンプルを含む生検物質等が挙げられるが、これらに限定されない。該サンプルにはインビトロ細胞培養成分も含まれ得る。
動物に病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株がコロニー形成しているかどうかは、上述の病原性因子をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子の有無を評価することによって確認することができる。遺伝子の存在は、遺伝子の転写や翻訳に伴う又はそれを示すいずれかの因子（例えば、ＲＮＡ発現レベルやタンパク質発現レベルが挙げられるが、これらに限定されない）の解析によって確認することができるが、染色体内又は染色体外のＤＮＡ配列の存在によっても確認することができる。
サンプル内での遺伝子又はその産物の存在を確認するための技法は、当業者には公知である。ノーザンブロッティングやウェスタンブロッティング、ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ等の常法は当該技術分野で知られており、本明細書の他の箇所に記載されている。一実施形態においては、株内の病原性因子をコードする遺伝子の存在は、ＥＬＩＳＡによって確認することができる。ＥＬＩＳＡアッセイが基礎付けられたプロトコールは、例えば、競合アッセイや直接反応アッセイ、サンドイッチ型アッセイ等を含める。ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、サンプル（例えば、生体液や組織サンプル）を、例えば、マイクロタイタートレーのペプチドコーティングウェルに添加することができるが、当該サンプル内に抗体が存在する場合には、免疫複合体が生成する。シグナル発生手段を添加して複合体の生成を検出することができる。前記サンプル内に特定の抗体が存在する場合には、検出可能なシグナルが発生する。
例えば、マイクロタイタープレートを病原性因子に対応するＢ．ヒオディセンテリアペプチド（例えば、炭酸バッファー中）でコーティングすることができる。コーティングは加湿チャンバーにて約４℃で一晩行うことができる。プレートはＰＢＳ−ＢＳＡで混合しながらブロックし、ＰＢＳＴで洗浄することができる。希釈したブタ血清をプレートに添加し、インキュベートする。次に、プレートを洗浄した後、例えば、ヤギ抗ブタＩｇＧ−ＨＲＰを添加することができる。次に、Ｋ−Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質を添加して発色させた後、硫酸を添加して発色を停止させる。次に、各ウェルの吸光度を読み取ることができる。この例の場合、発色が見られれば、Ｂ．ヒオディセンテリア病原性因子に特異的な抗体がサンプル内に存在し、よって、動物に病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株がコロニー形成していることを示すことになろう。
また、フロースルー試験の形をとって、ポイントオブケアデバイスは、動物が病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株によってコロニー形成されているか否かの診断に使用される。フロースルー試験においては、病原性因子に対する抗体が固定化されたニトロセルロース膜に生体サンプルを添加し、サンプルが膜を通過すると、固定化抗体にポリペプチドが結合して免疫複合体を生成する。標識二次抗体を含む溶液が膜を通過すると、免疫複合体に結合する。ストリップ試験においては、一旦生体サンプルを添加すれば、生体サンプルは標識抗体を含む領域を通過し、標識抗体にポリペプチドが結合して免疫複合体を生成する。
生体サンプルが固相抗体を含む領域を通過すると、ポリペプチドは免疫複合体に結合する。固定化抗体を有する領域において検出される二次抗体の量によって、サンプル内の病原性因子の有無が分かる。
また、本発明は、Ｂ．ヒオディセンテリア株の病原性を調節することが可能な化合物をスクリーニングする方法にも関する。いくつかの実施形態においては、スクリーニング方法によって、Ｂ．ヒオディセンテリア病原性因子の発現を調節するか、又は当該病原性因子の活性を標的にする化合物の潜在能力を評価する。
「化合物」には、病原性因子又はその標的の活性や発現が阻害又は抑制されるように、病原性因子をコードするポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドに結合する抗体やポリペプチド、ペプチド、有機小分子が包含されるのが好ましいが、これらに限定されない。潜在的な化合物は、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド（例えば、近縁タンパク質）、又は結合分子上の同一部位に結合する抗体であり得る。
また、「化合物」には、病原性因子ポリペプチドの結合部位に結合し、当該部位を占有して細胞結合分子への結合を防止し、通常の生物学的活性を妨げる小分子も潜在的に包含される。小分子の例としては、有機小分子やペプチド、ペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。潜在的なポリペプチドアンタゴニストの他の例としては、場合によっては、ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素等（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素等の断片）に密接に関連する抗体、場合によってはオリゴヌクレオチドやタンパク質が挙げられ、また、本発明のポリペプチドに結合するが応答を誘発せず、ポリペプチドの活性を妨げる小分子が挙げられる。他の潜在的な化合物としてはアンチセンス分子が挙げられる（このような分子の説明には、例えば、「遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド」（１９８８）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
いくつかの実施形態においては、病原性因子をコードするポリペプチド又はその標的分子やリガンドを固定化して、アッセイを自動化することが望ましい場合もある。病原性因子をコードするタンパク質（又はその断片や変異体）に試験化合物を結合させることや、当該タンパク質を標的分子やリガンドと候補化合物の存在下又は非存在下で相互作用させることは、このような反応物を含有させるのに適したいかなる容器内でも行うことができる。
このような容器の例としては、マイクロタイタープレートや試験管、マイクロ遠心管が挙げられる。
いくつかの実施形態においては、タンパク質の一方又は両方をマトリックスに結合させることが可能なドメインをもたらす融合タンパク質を提供することができる。タンパク質をマトリックスに固定化するための技法は当該技術分野ではよく知られている。
本発明の方法は、そのいくつかの実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子のプロモーター、又は転写制御配列の制御下でレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ構築物の使用を含む。当該構築物を含む細胞を試験対象化合物に接触させ、レポーター遺伝子によって発生するシグナルの量を測定する。産生するレポーター遺伝子産物の量が試験対象化合物に曝露しない対照細胞によって産生する量よりも少ない場合には、当該化合物はＢ．ヒオディセンテリア病原性を阻害することが可能である。
以下、次の非限定的な実施例によって本発明を更に説明するが、これら実施例は単に参照例として記載するものである。よって、以下の実施例は単に説明のために過ぎず、上述の本発明の普遍性はこれらによって何ら制限されないことを理解されたい。
[実施例１]
ゲノム配列決定
Ｂ．ヒオディセンテリアのオーストラリアブタ野外単離株（ＷＡ１株）に対してショットガン配列決定を行った。この株は十分に特性化されており、ブタに対して実験的投与の結果、病原性であることが判明している。このスピロヘータを嫌気性トリプチケースソイブロス培地中で生育させ、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法を用いて１００μｇのＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡライブラリーの調製に適した高品質で高分子量のＤＮＡを調製した。ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ（登録商標） Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ（登録商標）を用いてゲノムＤＮＡを剪断し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＭＡＲＴベクターシステム（ルシジェン）の供給元が推奨するプロトコール通りに処理してクローニングを行った。小型挿入（２〜３ｋｂ）ライブラリー及び中型挿入（３〜１０ｋｂ）ライブラリーを構築し、低コピー型のｐＳＭＡＲＴベクターとし、ＡＢ ３７３０ＤＮＡシークエンサーを用いてランダムクローンの配列決定を行い、少なくとも８倍のゲノム被覆率を得る。更にゲノム配列決定を終了させるため、ゲノムＤＮＡから平均挿入サイズが５００ｂｐのＲｏｃｈｅ ＧＳ−ＦＬＸ用ショットガンライブラリーを調製した。Ｒｏｃｈｅ ＧＳ−ＦＬＸ ＤＮＡシークエンサーを用いて、このライブラリーから得たランダムクローンの配列決定を行った。最後に、連結されていない隣接配列間を移動するプライマーを用いてゲノム配列決定を終了させた。
[実施例２]
ゲノム配列決定
Ｂ．ヒオディセンテリアのオーストラリアブタ野外単離株（ＷＡ１株）に対してショットガン配列決定を行った。この株は十分に特性化されており、ブタに対して実験的投与の結果、病原性であることが判明している。このスピロヘータを嫌気性トリプチケースソイブロス培地中で生育させ、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法を用いて１００μｇのＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡライブラリーの調製に適した高品質で高分子量のＤＮＡを調製した。ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ（登録商標） Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ（登録商標）を用いてゲノムＤＮＡを剪断し、得られたＤＮＡ断片をｐＳＭＡＲＴベクターシステム（ルシジェン）の供給元が推奨するプロトコール通りに処理してクローニングを行った。小型挿入（２〜３ｋｂ）ライブラリー及び中型挿入（３〜１０ｋｂ）ライブラリーを構築し、低コピー型のｐＳＭＡＲＴベクターとし、ＡＢ ３７３０ＤＮＡシークエンサーを用いてランダムクローンの配列決定を行い、少なくとも８倍のゲノム被覆率を得る。更にゲノム配列決定を終了させるため、ゲノムＤＮＡから平均挿入サイズが５００ｂｐのＲｏｃｈｅ ＧＳ−ＦＬＸ用ショットガンライブラリーを調製した。Ｒｏｃｈｅ ＧＳ−ＦＬＸ ＤＮＡシークエンサーを用いて、このライブラリーから得たランダムクローンの配列決定を行った。最後に、連結されていない隣接配列間を移動するプライマーを用いてゲノム配列決定を終了させた。
[実施例２]
アノテーション
オーストラリアゲノム研究施設（ＡＧＲＦ）（クイーンズランド州）及び比較ゲノム解析センター（ＣＣＧ）（マードック大学）によってＢ．ヒオディセンテリアの全ゲノム配列が整理され注釈付けられた。種々の公有のバイオインフォマティクスツールを用いて、データ解析上の品質保証手続きの一部として当該配列を解析及び再解析した。読み取り枠（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ））は、ＧｅｎｅＭａｒｋやＧＬＩＭＭＥＲ、ＯＲＰＨＥＵＳ、ＳＥＬＦＩＤ、ＧｅｔＯＲＦ等の種々のプログラムを用いて予測した。推定ＯＲＦｓは、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のサーチを用いて既存の国際データベースとの相同性（ＤＮＡ及びタンパク質）について調べる。系統発生や他の分子進化解析は同定された遺伝子及び他の種を用いて行い、機能の割り当てを補助した。部分配列決定ゲノムのインシリコ解析によって、入手し得る配列データに存在する予測ＯＲＦｓ全ての包括的リストが得られた。
オーストラリアゲノム研究施設（ＡＧＲＦ）（クイーンズランド州）及び比較ゲノム解析センター（ＣＣＧ）（マードック大学）によってＢ．ヒオディセンテリアの全ゲノム配列が整理され注釈付けられた。種々の公有のバイオインフォマティクスツールを用いて、データ解析上の品質保証手続きの一部として当該配列を解析及び再解析した。読み取り枠（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ））は、ＧｅｎｅＭａｒｋやＧＬＩＭＭＥＲ、ＯＲＰＨＥＵＳ、ＳＥＬＦＩＤ、ＧｅｔＯＲＦ等の種々のプログラムを用いて予測した。推定ＯＲＦｓは、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のサーチを用いて既存の国際データベースとの相同性（ＤＮＡ及びタンパク質）について調べる。系統発生や他の分子進化解析は同定された遺伝子及び他の種を用いて行い、機能の割り当てを補助した。部分配列決定ゲノムのインシリコ解析によって、入手し得る配列データに存在する予測ＯＲＦｓ全ての包括的リストが得られた。
Ｂ．ヒオディセンテリアゲノムの異なる配列決定プラットフォームから得たデータの組合せによって、３，０００，６９４ｂｐのゲノム及び３５，９４０ｂｐの環状染色体外プラスミドが同定される。当該ゲノムは２５５１個のＯＲＦｓをコードすることが予測されたが、当該プラスミドは３２個のＯＲＦｓをコードする。予測ＯＲＦｓと核酸及びタンパク質データベースに存在する遺伝子とを比較することによって、予測ＯＲＦｓの約７０％がデータベースに含まれる遺伝子と相同性を有することが分かる。予測ＯＲＦｓの残り３０％は既知の同一性を有しない。前記プラスミド上に存在する３２個の予測遺伝子の推定機能を図２に示す。これらの遺伝子の大部分は、細胞エンベロープ生合成（具体的には、リポ多糖（ＬＰＳ）生合成）に関連する機能を有する。
[実施例３]
[実施例３]
マイクロアレイ解析及びＰＣＲ解析
本解析に用いた特注のジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）は、Ｂ．ヒオディセンテリアゲノム及びプラスミド配列から得た予測ＯＲＦｓを用いてアフィメトリクス社によって設計、製造されている。当該ゲノム上にコードされている２５５１個のＯＲＦｓの内、１７１８個の遺伝子がジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）に示され、プラスミド上にコードされている３２個のＯＲＦｓの内、２５個が当該チップに示される。マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）解析を用い、６種の高病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株（Ｂ２０４、ＢＷ１、Ｖｉｃ２、ＮＳＷ５、ＮＳＷ１５及びＱ１７）及び８種の低病原性株（Ｂ２３４、ＳＡ２２０６、ＶＳ１、Ａ１、Ｂ７８T、Ｒ３０１、Ｂ６９３３及びＦＭ８８．９０）の遺伝子量とＢ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１（すなわち、高病原性株）の遺伝子量とを比較した。上述の病原性株は、実験的に感染させたブタや自然感染したブタにおいて重篤なＳＤの臨床徴候を引き起こすことが報告されている。上述の非病原性株は、有意なＳＤの臨床徴候を引き起こすことなくブタにコロニー形成することが報告されている。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、製造業者の指示に従ってＢ．ヒオディセンテリア細胞から高分子量ＤＮＡを抽出した。精製した高分子量ＤＮＡを制限酵素Ｒｓａｌで切断し、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用い、製造業者の指示に従って、得られた制限断片を蛍光シアニン色素（Ｃｙ３）で標識した。標識したゲノム断片をＢ．ヒオディセンテリアＧｅｎｅＣｈｉｐにＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ ６４５（アフィメトリクス社）にて中程度にストリンジェントな条件（３７℃）下で１６時間ハイブリダイズした。ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）を洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（アフィメトリクス社）を用い、製造業者の指示に従って標識した。Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（アフィメトリクス社）を用い、ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）の洗浄及び染色を行った。最後に、ハイブリダイズしたジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）をＳｃａｎｎｅｒ ３０００（アフィメトリクス社）を用いてスキャンし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ、アフィメトリクス社）を用いて合成画像を解析した。
本解析に用いた特注のジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）は、Ｂ．ヒオディセンテリアゲノム及びプラスミド配列から得た予測ＯＲＦｓを用いてアフィメトリクス社によって設計、製造されている。当該ゲノム上にコードされている２５５１個のＯＲＦｓの内、１７１８個の遺伝子がジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）に示され、プラスミド上にコードされている３２個のＯＲＦｓの内、２５個が当該チップに示される。マイクロアレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）解析を用い、６種の高病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株（Ｂ２０４、ＢＷ１、Ｖｉｃ２、ＮＳＷ５、ＮＳＷ１５及びＱ１７）及び８種の低病原性株（Ｂ２３４、ＳＡ２２０６、ＶＳ１、Ａ１、Ｂ７８T、Ｒ３０１、Ｂ６９３３及びＦＭ８８．９０）の遺伝子量とＢ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１（すなわち、高病原性株）の遺伝子量とを比較した。上述の病原性株は、実験的に感染させたブタや自然感染したブタにおいて重篤なＳＤの臨床徴候を引き起こすことが報告されている。上述の非病原性株は、有意なＳＤの臨床徴候を引き起こすことなくブタにコロニー形成することが報告されている。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、製造業者の指示に従ってＢ．ヒオディセンテリア細胞から高分子量ＤＮＡを抽出した。精製した高分子量ＤＮＡを制限酵素Ｒｓａｌで切断し、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用い、製造業者の指示に従って、得られた制限断片を蛍光シアニン色素（Ｃｙ３）で標識した。標識したゲノム断片をＢ．ヒオディセンテリアＧｅｎｅＣｈｉｐにＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ ６４５（アフィメトリクス社）にて中程度にストリンジェントな条件（３７℃）下で１６時間ハイブリダイズした。ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）を洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（アフィメトリクス社）を用い、製造業者の指示に従って標識した。Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（アフィメトリクス社）を用い、ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）の洗浄及び染色を行った。最後に、ハイブリダイズしたジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）をＳｃａｎｎｅｒ ３０００（アフィメトリクス社）を用いてスキャンし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ、アフィメトリクス社）を用いて合成画像を解析した。
ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）で示されない７個のプラスミドＯＲＦｓに関しては、３種類の独自のプライマー対が各ＯＲＦｓのＰＣＲ増幅用に設計された（表１）。ＣＧＨマイクロアレイ解析に用いた全ての株に由来する高分子量ＤＮＡを、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社）を用い、製造業者の指示に従ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付した。各プライマーに用いたアニーリング温度は最適アニーリング温度よりも５℃低く設定し、マイクロアレイハイブリダイゼーションの場合と同様に中程度のストリンジェンシーとした。増幅産物はアガロースゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色し、紫外光で観察した。あるＯＲＦについて一以上の産物が存在する場合、そのＯＲＦはプラスミド上に存在することを示した。
病原性株と非病原性株のプラスミド遺伝子量の比較を図４に示す。この結果から、解析した全ての株（非病原性株Ａ１及びＦＭ８８．９０を除く）がプラスミドを保有することが分かる。プラスミドを保有する株に関し、ＯＲＦｓ１〜１０、１７〜２４及び２６〜３２は全てのプラスミド上に存在する。ＯＲＦ２５の分布は株間で異なり、株の病原性とは相関しない。ＯＲＦｓ１１〜１６は病原性株のプラスミド上には存在したが、非病原性株のプラスミド上には存在しなかった。この結果から、ＯＲＦｓ１１〜１６が病原性因子をコードすることが分かる。
従って、確認された機能的病原性因子を有しない株は生ワクチン株として有用であろう。更に、未知の病原性株においてＯＲＦｓ１１〜１６を検出することは、当該株が病原性であるかどうか確認する有用な手段をもたらすであろう。同様に、確認された病原性因子の存在を評価することによって、被験体が病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株に感染しているか否かを診断することができるであろう。
[実施例４]
[実施例４]
プラスミドの排除（「除去」）
Ｂ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１細胞を、嫌気性トリプチケースソイブロス培地中で対数期の中間部まで増殖させた。３０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む嫌気性トリプチケースソイブロスで細胞を段階的に希釈し、嫌気性条件下、振盪させながら３７℃で３日間維持した。最も高い段階希釈から得た生存可能な培養物を３０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む嫌気性トリプチケースソイブロス培地で段階的に希釈し、同一条件下、３７℃で３日間維持した。このプロセスをあと９回繰り返し、最終継代後、スピロヘータを洗浄して臭化エチジウムを除去し、偏好性嫌気性寒天（ＬａｂＭ）プレート上に蒔いて単一コロニーを得た。
[実施例５]
Ｂ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１細胞を、嫌気性トリプチケースソイブロス培地中で対数期の中間部まで増殖させた。３０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む嫌気性トリプチケースソイブロスで細胞を段階的に希釈し、嫌気性条件下、振盪させながら３７℃で３日間維持した。最も高い段階希釈から得た生存可能な培養物を３０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む嫌気性トリプチケースソイブロス培地で段階的に希釈し、同一条件下、３７℃で３日間維持した。このプロセスをあと９回繰り返し、最終継代後、スピロヘータを洗浄して臭化エチジウムを除去し、偏好性嫌気性寒天（ＬａｂＭ）プレート上に蒔いて単一コロニーを得た。
[実施例５]
プラスミドを除去したクローンのスクリーニング
臭化エチジウム含有液体培地中の継代によって得た単一コロニーをＰＣＲでスクリーニングしてプラスミドの欠如を確認した。ＯＲＦｓ１１〜１６を標的とする３種類のプライマー対をスクリーニングプロセス用に設計する（図３）。計４８個のコロニーをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー中に細胞採取し、６個のプライマーセットの各々を用いたＰＣＲ反応において鋳型として添加した。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社）を用い、製造業者の指示に従ってＰＣＲ反応を行った。野生型Ｂ．ヒオディセンテリアＷＡ１株においては全てのＰＣＲ産物が存在したのに対し、プライマーセット全てにおいてはＰＣＲ産物が存在しなかったことから、プラスミドの除去が成功したことが分かった。
[実施例６]
臭化エチジウム含有液体培地中の継代によって得た単一コロニーをＰＣＲでスクリーニングしてプラスミドの欠如を確認した。ＯＲＦｓ１１〜１６を標的とする３種類のプライマー対をスクリーニングプロセス用に設計する（図３）。計４８個のコロニーをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー中に細胞採取し、６個のプライマーセットの各々を用いたＰＣＲ反応において鋳型として添加した。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社）を用い、製造業者の指示に従ってＰＣＲ反応を行った。野生型Ｂ．ヒオディセンテリアＷＡ１株においては全てのＰＣＲ産物が存在したのに対し、プライマーセット全てにおいてはＰＣＲ産物が存在しなかったことから、プラスミドの除去が成功したことが分かった。
[実施例６]
病原性因子（ＯＲＦｓ１１〜１６）を含まないＢ．ヒオディセンテリア野外株によるブタの実験的感染
体重が約１８ｋｇの３６匹の去勢した雄ブタ（ラージホワイト×ランドレース×デュロック）をブタ赤痢のない商業養豚場から購入した。各ブタについて計量を行い、耳にタグを付け、糞便サンプルを採取し、培養してブラキスピラ・ヒオディセンテリアの存在可能性を排除した。これらのブタをランダムに次の２グループに割り当てた。
ｉ）グループＡ：病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１、すなわち、上述の実施例３で確認された病原性因子（ＯＲＦｓ１１〜１６）を含む株で攻撃感染させられた１２匹のブタ、及び
ｉｉ）グループＢ：上述の実施例３で確認された病原性因子（ＯＲＦｓ１１〜１６）を含まず、まだ特性化されていないＢ．ヒオディセンテリアの野外株（すなわち、非病原性であると予測される株）で攻撃感染させられた２４匹のブタ。
体重が約１８ｋｇの３６匹の去勢した雄ブタ（ラージホワイト×ランドレース×デュロック）をブタ赤痢のない商業養豚場から購入した。各ブタについて計量を行い、耳にタグを付け、糞便サンプルを採取し、培養してブラキスピラ・ヒオディセンテリアの存在可能性を排除した。これらのブタをランダムに次の２グループに割り当てた。
ｉ）グループＡ：病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１、すなわち、上述の実施例３で確認された病原性因子（ＯＲＦｓ１１〜１６）を含む株で攻撃感染させられた１２匹のブタ、及び
ｉｉ）グループＢ：上述の実施例３で確認された病原性因子（ＯＲＦｓ１１〜１６）を含まず、まだ特性化されていないＢ．ヒオディセンテリアの野外株（すなわち、非病原性であると予測される株）で攻撃感染させられた２４匹のブタ。
各グループを隔離動物舎の別々の部屋の単一の檻に収容した。厳しいバイオセキュリティープロトコールを維持して各部屋間の感染伝播を防止した。ブタには抗生物質を含まない離乳食を自由摂取させた。
到着の２週間後、指数関数的対数期（〜１０8／ｍＬ）まで増殖したＢ．ヒオディセンテリア株ＷＡ１を含むブロス（１００ｍＬ）でグループＡのブタを胃管経由にて攻撃感染させた。同様に、指数関数的対数期（〜１０8／ｍＬ）まで増殖した特性化されていないＢ．ヒオディセンテリアの野外株を含むブロス（１００ｍＬ）でグループＢのブタを攻撃感染させた。両方のグループについて、攻撃感染を連続３日間繰り返した。
攻撃感染後、ブタを毎日観察し、ブタ赤痢に合致する臨床徴候（特に、鮮血及び粘液を含む下痢の有無）について確認した。ブタ赤痢の臨床徴候を示したブタは排除した。細菌試験用綿棒で全てのブタの直腸糞便から週２回試料採取し、該綿棒試料を選択寒天上で嫌気的に培養した。実験的攻撃感染の４週間後に実験を終了した。頸静脈からの採血を攻撃感染の初日前と死後又は実験終了時に行った。血清を取り出し、ＥＬＩＳＡにおける血清学的解析に用いた。
[実施例７]
[実施例７]
スピロヘータ培養
５％（ｖ／ｖ）の脱繊維素ヒツジ血液、４００ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、２５ｕｇ／ｍＬのコリスチン及び２５ｕｇ／ｍＬのバンコマイシンを含有するトリプチケースソイ寒天プレート上に細菌試験用綿棒で画線した。このプレートを好気環境下、３９℃で７日間インキュベートした。強いβ溶血及び微視的形態に基づき、スピロヘータはＢ．ヒオディセンテリアとして同定された。分離株の一部は継代培養し、種特異的ＰＣＲによってＢ．ヒオディセンテリアであることを確認した。
５％（ｖ／ｖ）の脱繊維素ヒツジ血液、４００ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、２５ｕｇ／ｍＬのコリスチン及び２５ｕｇ／ｍＬのバンコマイシンを含有するトリプチケースソイ寒天プレート上に細菌試験用綿棒で画線した。このプレートを好気環境下、３９℃で７日間インキュベートした。強いβ溶血及び微視的形態に基づき、スピロヘータはＢ．ヒオディセンテリアとして同定された。分離株の一部は継代培養し、種特異的ＰＣＲによってＢ．ヒオディセンテリアであることを確認した。
グループＡの１２匹のブタの内１１匹（９２％）は、実験期間中に糞便にＢ．ヒオディセンテリアを排出し、ブタ赤痢の徴候を示した。グループＢにおいては、２４匹のブタの内１３匹（５４％）がＢ．ヒオディセンテリアを排出し、ブタ赤痢を発症した（図５参照）。この２グループ間の排出パターン及び疾患の差は統計的に有意であった（Ｐ＝０．０３１、フィッシャー直接検定）。この２グループにおいては、赤痢に罹患したブタの大腸における肉眼所見の程度には差がなかった。
このように、実施例３で確認された病原性因子（ＯＲＦｓ１１〜１６）を含まず、特性化されていないＢ．ヒオディセンテリアの野外株の場合、当該病原性因子を有する株の場合に比べて、コロニー形成したブタの数は有意に少なく、攻撃感染後に疾患を発症したブタの数も有意に少なかった。この知見から、コロニー形成を促進し、疾患を発症させる上でＯＲＦｓ１１〜１６が重要であることが分かるが、これは、ＯＲＦｓ１１〜１６が病原性因子をコードするという主張を支持する。これらの結果から、Ｂ．ヒオディセンテリア株が病原性か非病原性かを確認する上でＯＲＦｓ１１〜１６が有用であることも分かる。
[実施例８]
[実施例８]
血清学的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１ウェルあたり１００μＬの超音波処理が施され、かつ清澄されたＢ．ヒオディセンテリア全細胞を（１μｇ／ｍＬ）でコーティングした。細胞は上述の各々の感染に用いた同一株から得た。コーティングは４℃で一晩行った。プレートは、ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）を１５０μＬ添加し、室温（ＲＴ）で１時間混合した後、１５０μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ｖ／ｖ）で３回洗浄してブロックされた。ブタ血清を１００μＬのＰＢＳＴ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）にて４００倍に希釈し、混合しながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した（上述の通り）後、ＰＢＳＴ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）にて５０，０００倍に希釈したヤギ抗ブタＩｇＧ（全分子）−ＨＲＰ（１００μＬ）を添加した。室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質を添加した。室温（ＲＴ）で１０分間発色を行った後、１００μＬの５００ｍＭ硫酸を添加して発色を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
マイクロタイタープレートを、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１ウェルあたり１００μＬの超音波処理が施され、かつ清澄されたＢ．ヒオディセンテリア全細胞を（１μｇ／ｍＬ）でコーティングした。細胞は上述の各々の感染に用いた同一株から得た。コーティングは４℃で一晩行った。プレートは、ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％ｗ／ｖ）を１５０μＬ添加し、室温（ＲＴ）で１時間混合した後、１５０μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ｖ／ｖ）で３回洗浄してブロックされた。ブタ血清を１００μＬのＰＢＳＴ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）にて４００倍に希釈し、混合しながら室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した（上述の通り）後、ＰＢＳＴ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）にて５０，０００倍に希釈したヤギ抗ブタＩｇＧ（全分子）−ＨＲＰ（１００μＬ）を添加した。室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質を添加した。室温（ＲＴ）で１０分間発色を行った後、１００μＬの５００ｍＭ硫酸を添加して発色を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
両方のグループのブタにおいては、実験的攻撃感染前のＢ．ヒオディセンテリア全細胞調製物に対する抗体のベースラインレベルが同様であった。グループＡの１２匹のブタの内８匹においては、実験的攻撃感染時と実験終了時との間で抗体レベルの上昇が見られたが、グループ全体においては抗体レベルの上昇は有意ではなかった。グループＢの２４匹のブタの内２１匹においては、抗体レベルの上昇が見られ、グループ内での抗体レベルの上昇は有意であった（ｐ＜０．００１）（図６参照）。
このように、病原性因子を含まないＢ．ヒオディセンテリアの野外株に曝露した場合、Ｂ．ヒオディセンテリア感染後の有意な抗体レベル上昇によって証明される全身性免疫応答がもたらされる。これらの結果から、ＯＲＦｓ１１〜１６を含まないＢ．ヒオディセンテリア株は、ブタにコロニー形成し疾患を引き起こす能力は低下しても、免疫原性特性を有し、Ｂ．ヒオディセンテリア感染症に対する防御的免疫を誘導し得る（すなわち、防御的免疫原性である）ことが分かる。従って、これらの結果から、機能的ＯＲＦｓを有しないＢ．ヒオディセンテリア株が生ワクチン株として有用であろうという主張が支持される。
Ｂ．ヒオディセンテリアの病原性を阻害できるので、Ｂ．ヒオディセンテリア症を予防するためのワクチンとして有効である。
Claims (19)
- Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株であって、一以上の病原性因子を有しない前記ワクチン株。
- 前記病原性因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の株。
- Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる一以上の機能的病原性因子を有しないＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株。
- Ｂ．ヒオディセンテリアの単離生ワクチン株は弱毒病原性株であり、当該株は、病原性因子を弱毒化する改変を含み、防御的な免疫原性であるような免疫原性特性を保持しているが、もはや病原性ではない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の株。
- 前記改変によって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６、又はその組合せに記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列からのｍＲＮＡ発現が低下又は抑制される、請求項４に記載の株。
- 前記改変によって一以上の非機能的産物が翻訳される（「機能的産物」とは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリペプチド配列によってコードされるものである）、請求項４に記載の株。
- 一以上のポリヌクレオチド配列はプラスミド由来である、請求項２〜６のいずれか１項に記載のワクチン株。
- 前記改変は、Ｂ．ヒオディセンテリアから前記プラスミドを除去することによって生じる、請求項８に記載のワクチン株。
- Ｂ．ヒオディセンテリアの生ワクチン株を調製する方法であって、
（ａ）病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を選択することと、
（ｂ）前記病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株において改変をもたらして生弱毒病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を得ることと、
（ｃ）前記改変を含む生弱毒病原性Ｂ．ヒオディセンテリア株を単離することと、
（ｄ）前記単離Ｂ．ヒオディセンテリア株を選択することを含み、ここで、前記選択されたＢ．ヒオディセンテリア株は、防御的な免疫原性であるような免疫原性特性を保持している方法。 - 請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株を薬学的に許容し得る媒体内に含むワクチン組成物。
- アジュバントを更に含む、請求項１０に記載のワクチン組成物。
- 動物における下痢性疾患を予防する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株、又は請求項１０又は１１に記載のワクチン組成物の有効量を前記動物に投与することを含む方法。
- 動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成を診断する方法であって、
（ａ）前記動物からサンプルを得る工程と、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列の有無、及び／又は対応するｍＲＮＡ又はコードされるタンパク質産物の発現を確認する工程とを含み、ここで、前記核酸又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質産物の存在は、前記動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成の存在を示す方法。 - 動物内での病原性Ｂ．ヒオディセンテリアのコロニー形成を診断するためのキットであって、配列番号５５〜９０に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似するポリヌクレオチド配列を有する一以上のＰＣＲプライマーを含むキット。
- Ｂ．ヒオディセンテリアの病原性を阻害することが可能な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトすることと、
（ｂ）前記トランスフェクトされた細胞を候補化合物に接触させることと、
（ｃ）前記核酸分子の一以上からのｍＲＮＡ発現のレベル、又は前記ｍＲＮＡ発現によってコードされるタンパク質のレベルを比較することを含み、ここで、前記タンパク質は、候補化合物の存在下及び非存在下で、細胞内に配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列の一以上と実質的に類似するポリペプチド配列を有し、（ｄ）候補化合物が存在しないときと比べて、存在するときにｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現が有意に低い場合には、候補化合物がＢ．ヒオディセンテリア病原性の阻害剤であることを推測することを含む方法。 - Ｂ．ヒオディセンテリアの病原性を阻害することが可能な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載の核酸配列の一以上と実質的に類似する一以上のポリヌクレオチド配列の転写制御配列又はプロモーターと作用的に連結されたレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトすることと、
（ｂ）前記トランスフェクトされた細胞を候補化合物に接触させることと、
（ｃ）候補化合物の存在下及び非存在下で細胞におけるレポーター遺伝子発現のレベルを比較すること、
（ｄ）候補化合物が存在しないときと比べて、存在するときにレポーター遺伝子の発現が有意に低い場合には、候補化合物がＢ．ヒオディセンテリア病原性の阻害剤であることを推測することを含む方法。 - 請求項１に記載の少なくとも１種のワクチン株を含む、Ｂ．ヒオディセンテリア感染を予防するのに用いる医薬の製造におけるＢ．ヒオディセンテリアのワクチン株の使用。
- Ｂ．ヒオディセンテリア感染に対する動物のワクチン接種のためのキットであって、
（ａ）請求項１に記載の少なくとも１種のワクチン株を薬学的に許容し得る媒体内に含むワクチン組成物と、
（ｂ）動物にワクチン接種するための説明書とを含むキット。 - Ｂ．ヒオディセンテリアの候補ワクチン株を確認する方法であって、
（ａ）Ｂ．ヒオディセンテリアのサンプルを得る工程と、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に記載のポリペプチド配列によってコードされる核酸配列の一以上の有無、及び／又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質産物の発現を確認する工程を含み、ここで、前記核酸の欠如、又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の欠如は、Ｂ．ヒオディセンテリアのワクチン株であることを示す方法。
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