KR20120130759A - Ｆｅｃｖ 및 ｆｉｐｖ를 구별하는 수단 및 방법 - Google Patents

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휘-웬 창
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Abstract

본 발명은 FECV와 FIPV를 구별하는 방법 및 수단, 및 FIPV가 샘플 중에 존재하는지 여부를 결정하는 방법 및 수단을 제공한다. 추가로 스파이크 단백질을 코딩하는 FIPV 특이적 핵산 서열을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, FIPV를 검출하기 위한 항체, 및 고양이 코로나바이러스, 바람직하게는, FIPV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물 및 그의 용도를 제공한다.

Description

ＦＥＣＶ 및 ＦＩＰＶ를 구별하는 수단 및 방법{MEANS AND METHODS FOR DISTINGUISHING FECV AND FIPV}
본 발명은 수의학적 진단 분야에 관한 것이며, 더욱 구체적으로 본 발명은 고양이 코로나바이러스, 및 그의 동정에 관한 분야에 관한 것이다.
고양이 코로나바이러스 (FCoV)는 고양이, 사자, 호랑이, 표범, 재규어, 스라소니, 카라칼, 치타, 쿠거 및 살쾡이를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 애완 및 야생 고양이과에서 흔한 병원체이다. 애완용 고양이가 1마리 초과로 존재하는 환경하에서는 양성인 FCoV 혈청 반응이 최대 90%에 이른다. FCoV는 개 코로나바이러스 (CCoV) 및 돼지의 전염성 위장염 바이러스 (TGEV)와 매우 밀접한 관련이 있다. FCoV에는 2가지 혈청형, I 및 II가 존재하는데, 이중 혈청형 I가 우세하며, 이것이 FCoV 감염의 80-95%를 이룬다. 아마도 II형 FCoV는 혈청형 I FCoV 및 CCoV에 의해 이중으로 감염된 동물에서 RNA 재조합으로부터 생성된 것으로서, 상기와 같은 이중 감염 동안 CCoV 스파이크 유전자 또는 그의 일부가 FCoV 게놈 내로 도입된 것이라고 추정되고 있으나, 분명한 것은 상기와 같은 이벤트가 흔히 발생하는 일은 아니라는 것이다. 고양이 장관 코로나바이러스 (FECV)가 혈청형 I 및 혈청형 II, 둘 모두에 있어 FCoV 중 가장 흔한 병원성 유형의 것이다. FECV는 주로 장에 국한되고, 경구-대변 경로를 통해 확산되며, 고전염성이다. 일반적으로 FECV 감염은 눈에 보일 정도로 뚜렷이 일어나는 것은 아니지만; 이는 종종 예를 들어, 경미한 장염과 같은 증상을 유발한다 (문헌 [Haijema et al., 2007]).
1970년대, (그 당시에는) 희귀하였지만 중증의 것인 고양이 질환, 고양이 전염성 복막염 (FIP)은 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)라 명명되었던, 고양이 코로나바이러스에 의해 유발되는 것으로 보고되었다. FECV와는 달리, FIPV는 병독성이 높다. FIPV 감염은 육아종성 (건성)이거나, 삼출성 (습성)일 수 있고, 이는 진행성이며, 일반적으로 치명적인 질환이다. FIP의 증상으로는 새끼 고양이의 경우 성장 장애, 절뚝거림, 요동성 발열, 식욕 부진 및 체중 감소를 포함하여, 이를 통해 결국에는 사망에 이르게 된다 (문헌 [Pedersen 2009]). 고감마글로불린혈증 및 림프성 및 말초 T 세포 고갈을 통해 입증되는 바, FIP가 진행되면 적응성 면역계의 극적인 조절 곤란이 따르게 된다 (문헌 [Haijema et al., 2007]). FECV는 장관으로 국한되는 반면, FIPV는 단핵구 및 대식세포를 감염시켜 그 안에서 복제될 수 있고, 이를 통해 전신성 질환을 유발함으로써 여러 기관을 다중으로 이환시킬 수 있다.
FIPV의 기원에 대해서는 2가지 이론이 지배적이다. "돌연변이설"에 따르면, FIPV는 감염된 고양잇과 동물에서 FECV로부터 기원하여 새로 생긴 돌연변이에 의한 것으로서, 이를 통해 고도로 병독성인 FIP 바이러스가 발생된다. FIPV를 발생시키는 돌연변이에 대해서는 동정된 바 없지만, 이는 기능이 알려지지 않은 단백질을 코딩하는 것인 비구조 3c, 7a 또는 7b 유전자 (도 1 참조)에서 일어나는 것으로 제안되고 있다 (문헌 ([Vennema et al., 1998], [Poland et al., 1996], [Kennedy et al., 2001], [Pedersen 2009])). 따라서, 3c, 7a 또는 7b 유전자에서의 돌연변이, 또는 이들 유전자에서의 돌연변이의 조합으로 인해 바이러스의 생물학적 특성은 변경되고, 이를 통해 장관 코로나바이러스는 단핵구 및 대식세포를 감염시킬 수 있게 됨으로써 감염이 기관으로 확산되고 FIP가 유발된다 (문헌 [Pedersen 2009]): FECV에서 FIPV로의 전이. 돌연변이설이 공식적으로 입증되지는 않았다.
또 다른 이론에 따르면, 천연 군집에서 2가지의 상이한 FECV 균주, 병독성 및 비병독성 균주가 순환을 하며, 병독성 균주에 의해 감염된 고양잇과 동물에서만 유일하게 FIP가 발병될 것이다 (문헌 [Brown et al., 2009]). FIP를 앓는 고양이로부터, 및 FECV로 감염은 되었지만, 증상은 없는 (건강한) 고양이로부터 바이러스 서열이 단리되었다 (문헌 [Brown et al., 2009]). 계통 발생적 분석을 사용함으로써, 병든 고양이와 건강한 고양이 사이에 상이한 바이러스 서열이 존재한다는 것이 밝혀졌다. FIP를 앓는 고양이의 공장으로부터, 및 간으로부터 단리된 고양이 코로나바이러스의 바이러스 서열을 비교하였다 (문헌 [Dye and Siddell (2007)]). 돌연변이설에 따르면, FECV는 소장으로 국한되는 반면, 대식세포 및 단핵구를 감염시킬 수 있는 FIPV는 간에 존재한다. 그러나, 뉴클레오티드가 100% 동일하다는 것이 밝혀졌고, 이에 돌연변이설에 따라 간 코로나바이러스가 돌연변이화된 공장 코로나바이러스라는 가설에 의문을 가지게 되었다 (문헌 [Dye and Siddell]). FIP를 앓는 고양이에서 간 및 공장, 둘 모두에 같은 병독성 고양이 코로나바이러스 균주가 존재한다고 제안되었다.
앞서, 본 발명자들은 조직 배양에 적응된 혈청형 II 고양이 코로나바이러스 FECV 79-1683과 FIPV 79-1146의 스파이크 단백질 사이에는 많은 차이가 존재한다는 것을 확인하게 되었다 (문헌 [Rottier et al., 2005]). FIPV 79-1146은 스파이크 단백질의 C-말단 도메인인 S2 도메인에 수개의 돌연변이를 함유하였다. 그러나, FECV 79-1683 및 FIPV 79-1146은 원형의 고양이 코로나바이러스가 아니며, 따라서, 이는 대부분의 고양이를 감염시키는 혈청형 I FECV 및 FIPV를 대표하는 것도 아니다 (문헌 [Pedersen 2009]). 첫째로, 혈청형 II 고양이 코로나바이러스는 개 및 고양이 코로나바이러스의 RNA 재조합으로부터 발생된 것이며, 개 코로나바이러스 스파이크 단백질을 함유한다. 고양이 및 개 코로나바이러스의 스파이크 단백질의 아미노산 서열은 단지 대략적으로 45% 정도 동일하다 (문헌 [Motokawa et al., 1996]). 두번째로, FECV 79-1683 및 FIPV 79-1146은 대식세포 이외의 다른 세포주에 대해 조직 배양 적응성을 띤다. FIPV가 생체내에서 단핵구 및 대식세포를 감염시키는 바, 이러한 실험실용 균주의 향성은 원형의 고양이 코로나바이러스와는 차이가 난다. 세번째로, 단핵구 및 대식세포를 감염시키는 혈청형 I FIPV와 달리, FIPV 79-1146은 이례적으로 모든 통상의 감염 경로에 의해 병독성을 띤다 (문헌 [Pedersen 2009]). 네번째로, 최근 피더슨(Pedersen)의 리뷰에서 광범위하게 논쟁된 바와 같이, FECV 79-1683은 진성의 FECV로서 자격을 얻지 못한다. 특히, FECV 79-1683에는 비조직 배양 적응성을 띠는 FECV 균주에 존재하는 7b 유전자 대부분이 존재하지 않으며, 그의 3c 유전자에는 유해한 돌연변이가 일어난 상태이며, 이는 FECV 79-1683이 FIPV로부터 기원된 것일 수 있다는 것을 시사한다.
고양이 코로나바이러스 감염은 일반적으로 혈중 항체의 존재에 의해 입증된다. FIPV 감염에 대해 효과적인 치료법 또는 백신은 존재하지 않는다. FIP가 발병한 고양이는 수일 또는 수주 이내에 (삼출성 FIP인 경우), 또는 수개월 이내 (건성 또는 육아종성 FIP인 경우)에 사망하게 된다. FIPV 균주의 온도 감수성 돌연변이체로 구성되어 있는, 상업적으로 이용가능한 백신은 다수의 면역화 연구에서 그의 보호적 효능과 관련하여 설득력 있게 입증되지 못했다 (문헌 ([McArdle et al., 1995]; [Fehr et al., 1997])). 추가로, 현재까지 FECV와 FIPV를 구별하는 진단 시험도 없다. 추가의 복합 요인은 FIP의 임상적 양상이 매우 가변적이라는 점이며, 그 결과, 상기 질환은 쉽게 명백히 확립되지 못했다. 종종 진단은 기왕의, 임상적, 및 구체적인 실험상의 파라미터에 기초한 추정적인 것이다. FIPV를 진단하는 구체적 시험이 없기 때문에, 종종 FIP와, 중복 증상을 가진 다른 질환을 구별하지 못하는 경우 또한 있다. FIP의 진행성이고 쇠약화시키는 과정에 기인하여 FIPV를 진단하는 진단 시험, 및 FIPV에 대한 백신, 이 둘 모두가 크게 요구되고 있다.
본 발명의 목표는 FIPV와 FECV를 구별하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, FECV와 비교하여 FIPV가 도 2b에 도시되어 있는 바의 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1049에서 특이적인 변경을 보유하고 있다는 것을 발견하게 되었다.
따라서, 본 발명은 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 결정된 아미노산의 정체가 메티오닌이 아닌 경우, 고양이 코로나바이러스를 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)로 동정하는 단계를 포함하는, FIPV를 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 상기 방법에 따라, 결정된 아미노산의 정체가 메티오닌인 경우, FECV로 동정된다.
FIPV 또는 FECV를 동정한다는 것은 병독성 (FIPV) 또는 비병독성 (FECV) 유형의 고양이 코로나바이러스를 동정한다는 것이다. 동정은 상기 고양이 코로나바이러스의 아미노산 및/또는 핵산 서열의 정체를 결정함으로써 이루어진다.
고양이 코로나바이러스 핵산 서열은 고양이 코로나바이러스의 일부이거나, 또는 직접적으로, 또는 예를 들어, 역전사효소 PCR 및/또는 증폭을 사용함으로써 이루어지는 프로세싱 이후에 고양이 코로나바이러스로부터 수득된 것인 뉴클레오티드 쇄, 바람직하게는 (c)DNA 또는 RNA를 포함한다.
고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질은 엑토도메인(ectodomain)을 포함하는 고양이 코로나바이러스 막 단백질이다. 스파이크 단백질은 코로나바이러스를 이루는 4개의 정준 구조 단백질 중 하나이며, 이는 감염 동안 바이러스가 세포에 부착하여 그 안으로 진입하는 것을 담당한다.
병리학적으로 확인된 FIP를 앓는 고양이의 병변으로부터의 FIPV를 증상이 없는 고양이로부터 얻은 FECV와 유전학적으로 비교하였다. FIP의 전형적인 병변은 상이한 내부 기관, 주로 비장, 간, 폐, 신장, 또는 장간막 림프절에서 나타나는 (화농성)육아종 병변이었다. RNA 바이러스의 돌연변이율이 높기 때문에 개별 FECV와 FIPV 서열 사이에는 많은 차이가 있는 것으로 관찰되었다. 그러나, 47개의 FECV 대변 또는 혈장 단리물 모두에서는, 도 2b에 도시되어 있는 바의 스파이크 단백질 중의 위치 1049에 있는 아미노산이 메티오닌인 반면, 54개의 FIPV 병변 단리물 중 52개에서는, 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1049에 있는 아미노산이 변경된 것으로 나타났고, 이로써, 상기 위치의 아미노산은 메티오닌이 아니었다. 건강한 고양이로부터 유래된 것으로 분류된 5개의 서열이 실제로는 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 혈액 샘플로부터 유래된 것이라는 것이 추후에 밝혀졌으며 (Q093501030_326B_4546.scf, Q093501032_327B_4546.scf, Q093501036_321S_4546.scf, Q093501038_321A_4546.scf 및 Q093501046_K11_019.ab1), 이는 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1049에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체가 FECV 대변으로부터의 샘플 또는 건강한 고양이로부터 유래된 혈장 단리물 47개가 아닌 42개에서 메티오닌인 것으로 밝혀지고 입증되었다는 것을 의미한다.
FECV의 스파이크 단백질 중의 위치 1049에 있는 메티오닌을 코딩하는 핵산 서열은 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147을 포함하는 코돈에 상응한다. 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 FECV 스파이크 단백질 중의 위치 1049에 있는 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아데닌-티민-구아닌 (a-t-g)이며, 이는 바이러스 게놈 RNA 중의 서열 아데닌-우리딘-구아닌 (a-u-g)과 일치하는 것이다. 상기 뉴클레오티드 코돈 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 임의의 치환을 통해 도 2b에 도시되어 있는 바의 FECV 스파이크 단백질 중의 위치 1049에는 메티오닌이 아닌 다른 아미노산이 존재하게 된다. 본 발명에 따라, 도 2aa 및 2ab 및 도 2b에 도시되어 있는 바, 각각 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및 아미노산 위치 1049에 있는 동정된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 사용하여 FIPV와 FECV를 구별한다. 본 발명을 통해 최초로 FECV와 FIPV를 구별할 수 있는 고양이 코로나바이러스의 다형태가 원형 혈청형 I FECV와 FIPV에서 동정되었다.
본 발명자들에 의해 FECV와 비교하여 도 2b에 도시되어 있는 바의 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1049에 특이적인 변경을 보유하고 있지 않은 적은 비율의 FIPV 중 상당부는 FECV와 비교하여 도 2b에 도시되어 있는 바의 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1051에 특이적인 변경을 보유하고 있다는 것도 추가적으로 밝혀졌다. 이러한 경우에는, 상기 위치에 세린이 치환된 것으로 보였다. 따라서, 아미노산 위치 1051에서의 특이적인 변경이 또한 FIPV를 동정할 수 있도록 하는 접근법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 결정된 아미노산의 정체가 세린이 아닌 경우, 고양이 코로나바이러스를 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)로 동정하는 단계를 포함하는, FIPV를 동정하는 방법을 제공한다. 또한, 샘플이 고양이 코로나바이러스를 포함하는지 여부를 결정하는 단계, 및 고양이 코로나바이러스가 존재하는 경우, 도 2b에 도시되어 있는 바의 상기 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 상기 아미노산의 정체가 세린이 아닌 경우, 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)가 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, FIPV가 샘플 중에 존재하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
한 세트를 이루는 97마리의 병리학적으로 확인된 FIP를 앓는 고양이에 있어서, 97개의 FIPV 병변 단리물 중 87개에서 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1049에 있는 아미노산이 변경된 것으로 나타났고, 이로써, 상기 위치의 아미노산은 메티오닌이 아니게 되었다. 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1049에 메티오닌이 있는 10개의 FIPV 병변 단리물 중 5개에서는 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1051에 있는 아미노산이 변경된 것으로 나타났고, 이로써, 상기 위치의 아미노산은 세린이 아니게 되었다. FECV의 스파이크 단백질 중의 위치 1051에 있는 세린을 코딩하는 핵산 서열은 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153을 포함하는 코돈에 상응한다. 세린은 뉴클레오티드 코돈 t/u-c-t/u, t/u-c-c, t/u-c-a, t/u-c-g, c-g-t/u 및 c-g-c에 의해 코딩된다. 상기 뉴클레오티드 코돈 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 임의의 치환을 통해 도 2b에 도시되어 있는 바의 FECV 스파이크 단백질 중의 위치 1051에서 세린이 아닌 다른 아미노산이 존재하게 된다. 본 발명에 따라, 각각 도 2aa 및 2ab 및 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153, 및/또는 스파이크 단백질의 아미노산 위치 1051에 있는 동정된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 사용하여서도 또한 FIPV와 FECV를 구별할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1051에 상응하는 아미노산 위치에 존재하는 세린이 변경된 것은 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치의 핵염기 티민이 핵염기 구아닌으로 치환됨으로써 나타난 결과이다.
한 실시양태에서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스의 스파이크 단백질 중 아미노산 위치 1049 및 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산 둘 모두의 정체를 결정한다. 상기 두 아미노산 모두의 정체가 결정되면, FIPV와 FECV를 고도로 정확하게 구별할 수 있다. 한 실시양태에서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1049 및 1051에 있는 아미노산의 정체를 한 시험으로 결정한다. 그러나, 또한 상기 아미노산의 정체를 순차적으로 결정할 수도 있다. 예를 들어, 먼저, 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1049에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정한다. 상기 위치에 메티오닌이 존재하는 것으로 검출되었다면, 이어서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 것이 바람직하다. 상기 위치에 메티오닌이 아닌 다른 아미노산이 존재하는 것으로 검출되었다면, 도 2b에 도시되어 있는 바의 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 것을 생략할 수 있다. 그러나, 또한 그러한 경우에 상기 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정할 수도 있다.
유전자 기탁 번호 NC_012955 (고양이 코로나바이러스 UU10, 전체 게놈)의 서열에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 20395-24801 및 유전자 기탁 번호 NC_012952 (고양이 코로나바이러스 UU8, 전체 게놈)의 서열에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 20382-24788을 포함하는 고양이 코로나바이러스의 스파이크 유전자의 핵산 서열 (뉴클레오티드 1-4407)이 도 2aa 및 2ab에 제시되어 있다. NC_012955의 뉴클레오티드 20395-24801은 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 (YP__003038574)을 코딩한다. NC_012952의 뉴클레오티드 20382-24788은 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 (YP__003038543)을 코딩한다. 따라서, 명세서 전역에서 사용된 것과 같고, 도 2aa 및 2ab에 도시된 것과 같은, 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 3145, 3146 및 3147의 뉴클레오티드는 NC_012955의 서열에서 정의된 것과 같은 전체 게놈 중 23539, 23540 및 23541의 뉴클레오티드, 및/또는 NC_012952의 서열에서 정의된 것과 같은 전체 게놈 중 23526, 23527 및 23528의 뉴클레오티드에 상응한다. 명세서 전역에서 사용된 것과 같고, 도 2aa 및 2ab에 도시된 것과 같은, 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 3151, 3152 및 3153의 뉴클레오티드는 NC_012955의 서열에서 정의된 것과 같은 전체 게놈 중 23545, 23546 및 23547의 뉴클레오티드, 및/또는 NC_012952의 서열에서 정의된 것과 같은 전체 게놈 중 23532, 23533 및 23534의 뉴클레오티드에 상응한다.
각각 NC_012955 및 NC_012952의 부분적 번역물인 YP_003038574 및 YP_003038543의 서열에서 정의된 아미노산 번호매김을 참조한, 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질의 아미노산 서열은 도 2b에 제시되어 있다. 명세서 전역에서 사용된 것과 같은 아미노산 위치에 대한 번호매김은 YP_003038574 및/또는 YP_003038543에서 정의된 것과 같은 아미노산 위치를 참조한다. 당업자는 예를 들어, "얼라인(Align) 2" 또는 "바이오컨덕터(Bioconductor)"와 같은 정렬 소프트웨어를 사용하여 임의의 주어진 고양이 코로나바이러스 서열 중의, 도 2aa 및 2ab 또는 도 2b에 도시된 바의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및 아미노산 위치 1049 및 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153 및 아미노산 위치 1051에 상응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 위치를 동정할 수 있다.
FIP의 증상으로는 예를 들어, 복부내 복수액 축적 (오직 삼출성 FIP인 경우에만), 성장 지연, 식욕 부진, 발열, 체중 감소 및 설사를 포함한다. 본원 상기에서 명시된 바와 같이, 유사 증상이 또한 다른 질환을 앓는 고양이에서도 관찰되는 바, 이로 인해 FIP를 명백하게 진단한다는 것이 어느 정도는 불가능하다. 샘플 중 FIPV의 존재 여부 결정을 가능하게 하는 다형태가 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질에서 동정되었는 바, 고양잇과 동물, 예를 들어, 고양이가 FIP를 앓는지 여부를 결정할 수 있다. 현재는 FIP에 대한 어떤 치료법도 없고, 상기 질환의 진행 과정은 진행성이고 쇠약화시키는 과정으로서, 이를 통해 결국에는 사망에 이르게 되는 바, 상기 고양이가 FIPV를 보유한다고 입증된 경우에는 상기 동물을 안락사시키는 쪽으로 결정될 수 있다. 또한, 고양이 주인 또는 고양이 사육장 소유주는 가능한 감염 확산을 막고/거나, 예를 들어, 스트레스와 같은 소인이 되는 상태를 감소시키기 위해 적절한 조치를 취할 수 있다. 그러나, 고양이에 FIPV가 없는 것으로 입증된 경우에는, 고양이 전염성 복막염은 상기 질환에 대한 가능한 발병 원인으로서 제거될 수 있다. 따라서, 그와 같은 경우에는 고양이를 안락사시키지 않아야 하지만, 진단학적 접근법은 계속할 수 있고, 증상이 FIP의 것과 유사한 가능한 대체 질환(들)용 치료법을 동물에게 제공할 수 있다. 그러한 치료법은 예를 들어, 상기 질환의 가능한 박테리아성 발병 원인을 해소시켜 주는 추가의 대증 요법 또는 항생제 적용일 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 샘플, 바람직하게는 고양잇과 동물로부터, 또는 고양잇과 동물과 접촉한 물질로부터의 샘플이 고양이 코로나바이러스를 포함하는지 여부를 결정하는 단계, 및 고양이 코로나바이러스가 존재하는 경우, 도 2b에 도시되어 있는 바의 상기 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1049 및/또는 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 아미노산 위치 1049에 있는 상기 아미노산이 메티오닌이 아니고/거나, 아미노산 위치 1051에 있는 상기 아미노산이 세린이 아닌 경우, 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)가 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, FIPV가 샘플 중에 존재하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
고양이 장관 코로나바이러스, 고양이 전염성 복막염 바이러스, 고양이 코로나바이러스 (스파이크) 단백질 또는 고양이 코로나바이러스 핵산을 포함하는 샘플은 임의의 고양잇과 동물로부터 직접 또는 간접적으로 수득할 수 있다. 그러한 샘플은 예를 들어, 임의의 고양잇과 동물의 조직 또는 체액 또는 분비 생성물로부터 수득할 수 있다. 상기 샘플을 수득할 수 있는 고양잇과 동물의 조직, 체액 또는 분비 생성물로는 FIP 병변, 혈액, 백혈구, 혈액 혈장, 혈액 혈청, 타액, 복수, 소변, 대변, 피부, 근육, 림프절 및 간을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고양잇과 동물로부터 간접적으로 수득된 본 발명에 따른 샘플은 고양잇과 동물의 조직, 체액 또는 분비 생성물을 함유하는 임의의 물질, 예를 들어, 토양 또는 고양이 배설용 상자에 까는 점토를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FIP 병변, 대변, 혈액 및/또는 복수로부터 수득된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 샘플은 백혈구로부터 수득된다. 혈액 샘플은 동물로부터 수득하기가 비교적 쉽고, 이어서 백혈구는 혈액 샘플로부터 쉽게 단리될 수 있다. 본 발명자들은 FIP 병변 샘플에서 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 변경이 검출된 고양이로부터 수득된 31개의 백혈구 샘플 중 29개에서, 상기 아미노산 변경은 또한 백혈구 샘플에도 존재한다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 아미노산 변경 검출은 고양잇과 동물의 백혈구 샘플에서 정확하게 검출된다.
고양잇과 동물이 고양이 코로나바이러스 감염을 앓는 것으로 의심되는 경우에는, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153을 포함하는 스파이크 단백질 코딩 고양이 코로나바이러스 핵산을 상기 고양잇과 동물로부터 유래된 샘플 중에서 검출할 수 있다. 상기 고양잇과 동물로부터 유래된 샘플은 고양이 코로나바이러스 핵산, 또는 단리된 고양이 코로나바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 임의로, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산을 증폭시킨 후에 검출한다. 본 발명에 따른 샘플은 추가로 고양이 코로나바이러스, 또는 스파이크 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 고양이 코로나바이러스 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에 메티오닌이 존재한다면, 이는 FECV임을 시사하는 것이며, 상기 위치에 메티오닌 이외의 다른 임의의 아미노산이 존재한다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이다. 따라서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및/또는 발린이 존재한다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 메티오닌이 아닌 아미노산은 류신이다. 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 세린 이외의 다른 임의의 아미노산이 존재한다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이다. 따라서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및/또는 발린이 존재한다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 세린이 아닌 아미노산은 알라닌이다.
도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에 핵염기 아데닌 (a), 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3146에 상응하는 위치에 핵염기 티민 (t), 및 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3147에 상응하는 위치에 핵염기 구아닌 (g)이 존재한다면, 이는 FECV임을 시사하는 것이며, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에 아데닌 (a) 이외의 다른 임의의 핵염기, 및/또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 뉴클레오티드 위치 3146에 상응하는 위치에 티민 (t) 이외의 다른 임의의 핵염기, 및/또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 뉴클레오티드 위치 3147에 상응하는 위치에 구아닌 (g) 이외의 다른 임의의 핵염기가 존재한다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이다. 따라서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에 핵염기 티민 (t), 및/또는 시토신 (c), 및/또는 구아닌 (g), 및/또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 뉴클레오티드 위치 3146에 상응하는 위치에 핵염기 아데닌 (a), 및/또는 시토신 (c), 및/또는 구아닌 (g), 및/또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중 뉴클레오티드 위치 3147에 상응하는 위치에 핵염기 아데닌 (a), 및/또는 티민 (t), 및/또는 시토신 (c)이 존재한다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이다. 고양이 코로나바이러스는 RNA 바이러스이다. 따라서, 당업자가 알고 있는 바와 같이, 본원에서 뉴클레오티드가 티민으로서 동정된 경우, 상기 용어에는 우라실이 또한 포함된다.
따라서, 본 발명은, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산의 핵산 서열을 결정함으로써 위치 1049에 있는 아미노산의 정체를 결정하며, 여기서 상기 핵산이 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 위치 3145, 3146 및/또는 3147에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에 시토신 또는 티민 또는 구아닌이 있다면, 이는 FIPV임을 시사하는 것이고, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에 아데닌이 있다면, 이는 FECV임을 시사하는 것이다. 본 발명은 또한, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산의 핵산 서열을 결정함으로써 위치 1051에 있는 아미노산의 정체를 결정하며, 여기서 상기 핵산이 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
코로나바이러스는 RNA 바이러스이다. 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 바이러스 RNA를 단리시키고 프로세싱할 수 있다. 예를 들어, 수거시에 세포 또는 조직으로부터 RNA 샘플을 새로 제조할 수 있거나, 또는 샘플 제조를 위해 프로세싱할 때까지 -70℃에서 보관된 샘플로부터 제조될 수 있다. 별법으로, 조직 또는 세포 샘플을 RNA의 품질을 보존할 수 있는 조건하에서 보관할 수 있다. 이러한 보존 조건의 예로는 예를 들어, 포르말린, RNase 억제제, 예를 들어, RNAsin (파르민겐(Pharmingen)) 또는 RNasecure (앰비온(Ambion)), 수용액, 예를 들어, RNAlater (아슈라겐(Assuragen)), Hepes-글루탐산 완충제 매개된 오르가닉 솔벤트 프로텍트 이펙트(Organic solvent Protection Effect) (HOPE), 및 RCL2 (알펠리스(Alphelys)), 및 비수용액, 예를 들어, 유니버살 몰레큘라 픽서티브(Universal Molecular Fixative: 사쿠라 파인테크 USA 인크.(Sakura Finetek USA Inc.))를 사용하는 고정이 있다. 예를 들어, RNA는 문헌 [Chomczynski and Sacchi (1987)]의 방법, 또는 문헌 [Boom et al. (1990)]의 방법에 따라 단리될 수 있거나, 상업적으로 입수가능한 시스템 (예를 들어, 퀴아젠(QIAGEN)으로부터의 알엔이지(RNeasy) 전체 RNA 단리용 키트, 또는 로슈 다이어그노스틱스(Roche Diagnostics: 스위스 바젤)로부터의 하이-퓨어-RNA-아이설레이션-키트(High-Pure-RNA-Isolation-Kit)®)를 이용하여 단리될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, RNA는 cDNA로 역전사된다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 RNA 서열과 혼성화되는 특이적인 프라이머 및 역전사효소 효소를 사용하여 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 수행한다. 추가로, RNA를 따라 무작위적으로 혼성화되는 랜덤 프라이머, 예를 들어, 랜덤 헥사머 또는 데카머, 또는 mRNA의 폴리(A) 테일과 혼성화되는 올리고 d(T), 및 역전사효소 효소를 사용하여 RT-PCR을 수행할 수 있다.
임의의 핵산 증폭 방법, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR; 문헌 [Mullis and Faloona, 1987])을 사용하여, 또는 증폭 반응, 예를 들어, 리가제 연쇄 반응 (LCR; 문헌 [Barany, 1991]), 자립형 서열 복제 (3SR; 문헌 [Guatelli et al., 1990]), 가닥 치환 증폭 (SDA; 문헌 [Walker et al., 1992]), 전사 증폭 시스템 (TAS; 문헌 [Kwoh et al., 1989]), Q-베타 레플리카제 (문헌 [Lizardi et al., 1988]), 회전환 증폭 (RCA; 미국 특허 번호 5,871,921), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA; 문헌 [Compton, 1991]), 클리바제 단편 길이 다형태(Cleavase Fragment Length Polymorphism) (미국 특허 번호 5,719,028), 핵산의 등온 및 키메라 프라이머-개시 증폭 (ICAN), 분지형성-신장 증폭 방법 (RAM; 미국 특허 번호 5,719,028 및 5,942,391) 또는 핵산 증폭에 적합한 다른 방법을 사용하여, 바로 직접 또는 RT-PCR 이후에 고양이 코로나바이러스로부터 유래된 뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "핵산" 또는 "핵산 분자"라는 용어는 뉴클레오티드 쇄, 바람직하게는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "프라이머"라는 용어는 증폭 표적에 어닐링할 수 있고, 이로써 DNA 폴리머라제가 부착될 수 있게 함으로써 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓여졌을 때에, 즉, 뉴클레오티드 및 중합을 위한 작용제, 예를 들어, DNA 폴리머라제의 존재하에 적합한 온도에서는 DNA 합성의 개시점으로서의 역할을 하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 증폭 프라이머는 증폭률을 최대로 하기 위해서는 단일 가닥인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 중합화를 위한 제제의 존재하에 신장 생성물의 합성을 프라이밍시키는 데 있어 충분할 정도로 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도 및 프라이머 조성 (A/T 및 G/C 함량)을 비롯한, 다수의 인자에 따라 달라질 수 있다. 프라이머 쌍은 DNA 증폭 분야, 예를 들어, PCR 증폭에 통상적으로 사용되는 바와 같이, 하나의 전방향 프라이머와 하나의 역방향 프라이머로 이루어진다.
"프로브"라는 용어는 표적 핵산 서열 분석물 또는 그의 cDNA 유도체 중 상보적인 서열을 인식하고, 그와 함께 수소 결합형 이중체를 형성하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 결합 검출을 촉진시키기 위해 증폭 반응의 반응 생성물에의 프로브의 결합 모니터링을 촉진시키고자 하는 목적으로 특이적인 앰플린콘 검출 프로브는 표지 부분, 예를 들어, 형광단, 발색단, 효소 또는 방사성 표지를 포함할 수 있다. 상기와 같은 표지는 당업자에게 주지되어 있고, 그 예로는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), β-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 스트렙타비딘, 비오틴, 디곡시게닌, 35S, 14C, 32P 및 125I를 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브는 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 핵산 서열은 또한 다른 종류의 핵산 구조, 예를 들어, DNA/RNA 나선, 펩티드 핵산 (PNA), 및/또는 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다. 따라서, "핵산 서열"이라는 용어는 또한 천연 뉴클레오티드와 동일한 기능을 보이는 비-천연 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-뉴클레오티드 빌딩 블록을 포함하는 쇄를 포함한다.
혼성화는 당업계에 알려져 있으며, 이는 바람직하게는 엄격한 조건하에서 일어나는 상보적인 단일 가닥 핵산들 간의 결합을 의미한다. "상보적인," 또는 "서열 상보성"이라는 용어 또한 당업계에 알려져 있으며, 이는 염기쌍 형성을 통해 비-공유적으로 연결될 수 있는 두 핵산 가닥을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "상보적인" 또는 "실질적으로 상보적인"이라는 것은 두 핵산 서열의 서로에 대한 서열 상보성이 적어도 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 및 가장 바람직하게는 약 95%인 것을 의미한다. 이는 프라이머 및 프로브가 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있도록 각각 그의 주형 및 표적 핵산에 대해 충분한 상보성을 나타내어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 프라이머 및 프로브 서열이 주형 상의 결합 영역 중 정확한 상보적인 서열을 반영할 필요는 없으며, 축퇴성 프라이머가 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-상보적인 뉴클레오티드 단편이 프라이머의 5'-말단에 부착될 수 있으며, 프라이머 서열의 나머지 부분은 상기 가닥에 상보적일 수 있다.
"엄격한 조건"이라는 용어는 혼성체의 안정성에 영향을 주는 혼성화 조건, 예를 들어, 온도, 염 농도, pH, 포름아미드 농도 등을 의미한다. 이러한 조건은 프라이머 또는 프로브의 그의 표적 핵산 서열에의 특이적인 결합은 최대화시키고, 비-특이 결합은 최소화시킬 수 있도록 실험적으로 최적화된다. 사용되는 상기 용어는 프로브 또는 프라이머가 다른 서열에 비하여 그의 표적 서열에 대하여 검출가능할 정도로 더 크게 (예를 들어, 배경에 비하여 2배 이상으로) 혼성화되는 조건을 언급하는 것을 포함한다. 엄격한 조건은 서열에 의존적이며, 이는 상이한 환경하에서 상이할 것이다.
본원에서 "서열 동일성(%)"이라는 용어는, 후보 아미노산 서열 또는 후보 핵산 서열과 참조 서열, 이 두 서열을 정렬시키고, 필요한 경우에는 동일성(%)이 최대가 되도록 갭을 도입한 후, 참조 서열의 잔기와 동일한 후보 아미노산 서열 또는 후보 핵산 서열의 잔기의 백분율(%)로서 정의된다. 정렬 방법 및 정렬을 위한 컴퓨터 프로그램은 당업계에 주지되어 있다. 후보 서열이 이러한 정의에 포함되는지 여부를 결정하기 위한 목적으로 사용되거나, 적합화될 수 있는 한 컴퓨터 프로그램은 "얼라인 2" (그 입안자는 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)이며, 1991년 12월 10일자로 미국 저작권청(United States Copyright Office: 미국 워싱턴 D.C. 20559)에 사용자 문서로 제출되어 있다), 또는 BESTFIT 프로그램을 제공하는 UWGCG 패키지 (문헌 [Devereux et al., 1984])이다.
도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 또는 3153에 상응하는 위치에 있는 뉴클레오티드를 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산은 상기 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부와 혼성화할 수 있는 프라이머를 사용함으로써 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 프라이머는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3055에 상응하는 위치와 뉴클레오티드 위치 3669에 상응하는 위치 사이의 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열과 혼성화된다. 상기 프라이머는 9 내지 50개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31개 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 프라이머를 사용하는 증폭 방법을 통해 수득된 핵산 생성물은 35개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 40개의 뉴클레오티드, 더욱더 바람직하게는 적어도 50개의 뉴클레오티드를 포함한다.
따라서, 본 발명은 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3055에 상응하는 위치와 뉴클레오티드 위치 3669에 상응하는 위치 사이의 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부와 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153을 포함하거나, 그에 상응하는 영역을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 바람직한 프라이머 쌍은 핵산 서열 5'-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는, 더욱 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 가장 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 프라이머, 및 핵산 서열 5'-CAATATTACAATGGCATAATGG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는, 더욱 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 가장 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 프라이머를 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 또 다른 바람직한 프라이머 쌍은 핵산 서열 5'-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는, 더욱 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 가장 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 프라이머, 및 핵산 서열 5'- TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는, 더욱 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 가장 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 프라이머를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 프라이머 쌍은 핵산 서열 5'-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3'과 핵산 서열 5'-CAATATTACAATGGCATAATGG-3'의 조합, 또는 핵산 서열 5'-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3'과 핵산 서열 5'-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3'의 조합을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 명시된 프라이머 쌍은 네스티드(nested) PCR 반응에 사용된다. 네스티드 폴리머라제 연쇄 반응에서, 2개의 프라이머 쌍이 연속 PCR 반응에 사용된다. 제2 프라이머 쌍은 제1 프라이머 쌍을 사용하는 증폭 반응에서 수득된 핵산 생성물 또는 그의 일부를 증폭시키는 데 사용된다. 따라서, 한 실시양태에서, 제1 프라이머 쌍을 사용하여 증폭된 것인, 증폭된 핵산의 적어도 일부를 제2 프라이머 쌍을 사용하여 추가로 증폭시킨다. 본 발명에 따른 제1 프라이머 쌍으로는 예를 들어, 핵산 서열 5'-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 프라이머, 및 핵산 서열 5'- CAATATTACAATGGCATAATGG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 프라이머를 포함하고, 본 발명에 따른 제2 프라이머 쌍으로는 예를 들어, 핵산 서열 5'-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 프라이머, 및 핵산 서열 5'-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 프라이머를 포함한다.
본 발명은 또한 바람직하게는 고양이 장관 코로나바이러스 (FECV) 또는 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)를 동정하기 위한, 및/또는 고양이 코로나바이러스 감염을 앓는 것으로 의심되는 동물에서 FIPV 또는 고양이 전염성 복막염 (FIP)의 존재를 결정하기 위한, 본 발명에 따른 프라이머 쌍의 용도를 제공한다.
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 위치 3145, 3146 및/또는 3147에 있는 뉴클레오티드 및/또는 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 있는 뉴클레오티드의 정체를 결정할 수 있다. 이러한 방법으로는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO), 핵산 서열의 서열분석 (예를 들어, 태그-어레이 미니서열분석 (문헌 [Fan et al., 2000]) 또는 파이로서열분석(pyrosequencing) (문헌 [Fakhrai-Rad et al., 2002])), 차단 시약을 사용하는 대립유전자 특이적 PCR (ASB-PCR, 문헌 [Morlan et al., 2009]), 올리고뉴클레오티드 결찰 검정 (OLA, 문헌 [Baron et al., 1996]), 질량 분광측정법 (MS, 예를 들어, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 (MALDI-TOF) MS, 문헌 [Crain and McCloskey 1998]), 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR), 전자식 혼성화, 형광성 단일 가닥형 입체형태 다형태 (F-SSCP) 분석 (문헌 [Makino et al., 1992]), 변성 고성능 액체 크로마토그래피 (DHPLC), 겔 전기영동 (예를 들어, 마이크로플레이트 어레이 대각 겔 전기영동 (MADGE, 문헌 [Day et al., 1998]) 및 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE, 문헌 [Fischer and Lerman 1980])), 및 마이크로어레이 분석을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO)는, 단쇄이고 특정의 RNA 또는 DNA 서열에 대해 특이적인 형광단-, 발색단-, 효소- 또는 방사성 표지된 뉴클레오티드 프로브이다. 예를 들어, ASO는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며, 오직 상기 돌연변이를 포함하는 핵산 서열과만 혼성화한다. 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 스파이크 단백질 코딩 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 핵산 서열은 예를 들어 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146, 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 상기 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 사용함으로써 검출된다. 상기 프로브는 바람직하게는 14개 내지 100개 뉴클레오티드 길이 사이, 바람직하게는 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 따라서, 한 실시양태에서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 위치 3145, 3146 및 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열은 상기 핵산의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화할 수 있으며 길이가 적어도 14개의 뉴클레오티드인 프로브를 사용함으로써 검출된다. 바람직한 실시양태에서, 프로브는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 시토신 또는 티민을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 프로브는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146, 및 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열에 상보적이다. 코로나바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에, 당업자가 알고 있는 바와 같이, 그의 돌연변이율은 비교적 높다. 따라서, 고양이 코로나바이러스의 서열은 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146, 및 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153 주변의 일부 뉴클레오티드에서 차이를 보일 수 있다. 당업자는 본 발명에 따른 프로브를 예를 들어, 핵산 치환에 의해 변형시켜 상기 프로브가 특이적인 고양이 코로나바이러스의 핵산 서열에 혼성화하여 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 위치 3145, 3146, 또는 3147 및/또는 위치 3151, 3152 또는 3153에 있는 뉴클레오티드, 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 검출할 수 있도록 하는 방법에 관해 알고 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한 것으로서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146, 및 3147에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 바람직한 프로브는 핵산 서열 5'-CCCARRGCCATAGG-3'(여기서, R은 A 또는 G이다)에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 가진, 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 가진, 더욱 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진, 가장 바람직하게는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 상기 프로브가 서열 CCCARRGCCATAGG를 포함하는 것인, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 바람직하게는 고양이 장관 코로나바이러스 (FECV) 및/또는 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)를 동정하기 위한, 및/또는 고양이 코로나바이러스 감염을 앓는 것으로 의심되는 동물에서 고양이 전염성 복막염 (FIP)의 존재를 결정하기 위한, 본 발명에 따른 프로브의 용도를 제공한다.
고양이 코로나바이러스 핵산 서열은 바람직하게는 관련 핵산의 증폭 직후에 당업자에게 공지되어 있는 서열분석 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법으로는 예를 들어, 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드 종결인자를 사용한 직접적인 이중 가닥 뉴클레오티드 서열분석 (문헌 [Smith et al., 1986]), 태그-어레이 미니서열분석 또는 파이로서열분석을 포함한다. 일반적으로, 그러한 서열분석 방법은 핵산 단리 절차에 의해 바이러스 게놈 핵산을 단리시키고, 임의로는 RNA를 DNA로 역전사시킨 후에 단리된 핵산의 뉴클레오티드 서열을 예를 들어, 디데옥시 연쇄 종결 방법 (문헌 [Sanger et al., 1977])에 의해 결정하고/거나, 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부를 서열분석한다.
올리고뉴클레오티드 결찰 검정 (OLA)은 공지된 단일 뉴클레오티드 다형태의 검출 방법이다. 상기 방법은 2개의 인접한 올리고뉴클레오티드 프로브가 상보적인 DNA 표적에 어닐링되는 동안, DNA 리가제를 사용하여 상기 두 프로브에서 일어나는 결찰에 기초한다. 상기 프로브 중 하나는 예를 들어, 형광 표지된 것이며, 대립유전자 특이적이다. 전형적으로, 각 대립유전자에 대해 하나씩 서로 다르게 표지된 2개의 프로브가 존재한다. 이러한 두 프로브는 3' 말단에 있는 마지막 염기에서만, 따라서, 다형태 부위에서 서열 차이를 보인다. 제2 프로브는 다형태를 함유하는 부위의 하류쪽 (3')으로 바로 가까운 곳의 표적 DNA 서열에 상보적이며, 따라서, 두 대립유전자 모두에 대해 상보적인 공통 프로브이다. 이 프로브는 형광 표지될 필요는 없다. DNA 리가제가 완전하게 매칭된 프로브에 결합할 수 있는 능력에 의해 대립유전자의 구별이 이루어지는데; 포획 프로브에 3' 미스매치가 있을 경우, 결찰은 일어나지 않을 것이다. 본 발명의 방법에서는 예를 들어, 프로브 중 하나가, FECV임을 시사하는 것인, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 아데닌을 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 것인 올리고뉴클레오티드 결찰 검정이 사용된다. 따라서, 우측 프로브의 첫번째 뉴클레오티드 또는 좌측 프로브의 마지막 뉴클레오티드는 티민이다. 제2 프로브는 공통 프로브로서, 이는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 위치 3145 옆에서 출발하는, 예를 들어, 상기 제2 프로브가 우측 프로브라면 위치 3146에서 출발하는 FECV와 FIPV 핵산 서열 둘 모두에 혼성화할 수 있다. FECV의 존재하에서는 상기 두 프로브의 결찰이 이루어질 수 있는 반면, FIPV의 존재하에서 상기 두 프로브의 결찰은 불가능하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147을 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드 결찰 검정 (OLA)을 사용하여 결정된다.
차단 시약이 사용될 경우, 실시간 PCR 기술을 사용하여 유전자의 한 특이적인 대립유전자를 검출할 수 있다. 이러한 기술은 차단 시약을 사용하는 대립유전자 특이적 PCR (ASB-PCR, 문헌 [Morlan et al., 2009])이라 불린다. PCR 반응 동안, 차단 시약을 반응 혼합물에 첨가함으로써 한 대립유전자의 증폭은 일어나지 못하도록 막는다. 프라이머 중 하나, 예를 들어, 전방향 프라이머를 돌연변이체 대립유전자 특이적 프라이머로서 디자인한다. 나머지 한 프라이머는 공통 프라이머로서, 이는 두 대립유전자 모두에 혼성화할 수 있다. 이어서, 증폭이 일어나지 못하도록 방지하기 위해 3' 말단에서 인산화된 차단 시약을 야생형 대립유전자에 특이적으로 결합하도록 디자인한다. PCR 반응 동안, 차단 시약은 돌연변이체 특이 프라이머가 야생형 대립유전자에 혼성화하지 못하도록 막는다. 오직 야생형 대립유전자만이 존재할 경우에는 어떤 증폭 생성물도 수득할 수 없는 반면, 오직 돌연변이체 대립유전자만이 존재할 경우에는 증폭 생성물을 수득할 수 있다. ASB-PCR을 사용함으로써, 예를 들어, FECV임을 시사하는 것인, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 아데닌을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열과, FIPV임을 시사하는 것인 상기 위치에 시토신 또는 티민을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열을 구별할 수 있다. 예를 들어, 공통 역방향 프라이머, 및 3' 말단 뉴클레오티드가 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상보적인 것인 두 FIPV 핵산 특이 프라이머로 이루어진 프라이머 세트가 사용된다. 이러한 FIPV 특이 프라이머 중 하나는 그의 3' 말단에 아데닌을 가지며, 나머지 한 프라이머는 그의 3' 말단에 구아닌을 갖는데, 이를 통해 상기 프라이머는 뉴클레오티드 위치 3145에 각각 티민 또는 시토신을 함유하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열에 혼성화할 수 있다. 뉴클레오티드 위치 3145의 아데닌에 혼성화할 수 있는 것인, 3' 말단에 티민을 포함하는 차단 시약이 사용될 수 있다. 상기 프라이머 세트를 사용하면, FIPV 핵산이 존재할 경우에는 증폭이 일어나지만, 반면 오직 FECV 핵산만이 존재할 경우에는 증폭이 일어나지 않을 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153을 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열은 차단 시약을 사용하는 대립유전자 특이적 PCR (ASB-PCR)을 사용하여 결정된다.
MALDI-TOF MS를 사용함으로써 소량 (펨토몰)의 DNA를 검출할 수 있다. 2 내지 2,000개 뉴클레오티드 범위의 핵산은 MALDI-TOF MS를 사용함으로써 검출할 수 있다. 핵염기의 질량이 차이가 나기 때문에 임의의 표지를 사용하지 않고도 MS를 사용함으로써 상이한 핵산 단편으로 이루어진 혼합물을 분석할 수 있다. 따라서, 대개의 경우, MS 측정 이전에 핵산 단편을 분리시킬 필요가 없다. MALDI-TOF MS를 사용함으로써, 예를 들어, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열 중 뉴클레오티드 위치 3145의 뉴클레오티드가 아데닌인지 (이는 FECV임을 시사함), 또는 시토신 또는 티민인지 (이는 FIPV임을 시사함) 여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146, 및/또는 3147 및/또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부의 질량을 결정한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산 서열의 질량은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 질량 분광측정법 (MALDI-TOF MS)을 사용하여 결정된다.
도 2b에 도시되어 있는 바의 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 아미노산 서열 중 아미노산 위치 1049 및/또는 아미노산 위치 1051에 있는 아미노산의 정체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용함으로써 검출될 수 있다. 그러한 아미노산은 예를 들어, 항체 또는 그의 기능적 등가물, 질량 분광측정법 또는 에드만(Edman) 분해 반응을 사용함으로써 검출된다. 임의로, 코로나바이러스 단백질을 당업계에 공지된 방법으로 정제시킬 수 있다. 예를 들어, 코로나바이러스 단백질은 겔 전기영동 또는 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피를 사용함으로써 정제될 수 있다.
항체의 기능적 등가물이란 그 양에 있어서는 반드시 그러할 필요는 없지만, 그 유형에 있어서 상기 항체와 동일한 특성을 하나 이상 갖는 화합물로서 정의된다. 상기 기능적 등가물은 비록 그 정도에 있어서 같을 필요는 없지만, 상기 항체와 같은 항원에 결합할 수 있다. 항체의 기능적 등가물은 바람직하게는 단일 도메인 항체, 단일 쇄 항체, 나노바디, 유니바디 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 항체의 기능적 등가물은 예를 들어, 생성된 화합물의 하나 이상의 특성-바람직하게는 항원-결합 특성-이 그 양에 있어서는 반드시 그러할 필요는 없지만, 그 유형에 있어서 동일하도록 항체를 변경시킴으로써 제조된다. 여러 방식으로, 예를 들어, 아미노산 잔기를 일반적으로 유사한 특성 (크기, 소수성 등)을 가진 또 다른 잔기로 치환하여 전반적 기능이 크게 영향을 받을 가능성은 없도록 하는 보존적 아미노산 치환을 통해 변경을 수행할 수 있다.
고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 고양이 코로나바이러스의 면역원성 부분은 비록 그 양에 있어서는 반드시 그러할 필요는 없지만, 그 유형에 있어서는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 고양이 코로나바이러스와 공통이 되는 특성을 하나 이상 갖는 부분으로서 정의된다. 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질의 면역원성 부분은 비록 그 양에 있어서는 반드시 그러할 필요는 없지만, 그 유형에 있어서는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질과 동일한 특성을 하나 이상이 갖는 부분으로서 정의된다. 바람직하게는, 상기 면역원성 부분은 동물에서 고양이 코로나바이러스, 바람직하게는 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049 및/또는 아미노산 위치 1051에 상응하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 아미노산 서열의 아미노산은 예를 들어, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049 및/또는 아미노산 위치 1051을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질의 에피토프에 대해 특이적으로 유도되는 항체 또는 기능적 등가물의 사용을 통해 검출된다. 도 2b에 도시되어 있는 바의 상기 아미노산 위치 1049 및/또는 아미노산 위치 1051은 FECV와 FIPV 사이의 구별을 가능하게 한다. 아미노산 위치 1049에 메티오닌이 있다면, 이는 FECV를 시사하는 것인 반면, 상기 위치에 메티오닌이 아닌 다른 임의의 아미노산, 바람직하게는 류신이 있다면, 이는 FIPV를 시사하는 것이고, 아미노산 위치 1051에 세린이 아닌 다른 임의의 아미노산, 바람직하게는 알라닌이 있다면, 이는 FIPV를 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명은 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049 및/또는 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질의 아미노산이 아미노산 1049 및/또는 아미노산 1051을 포함하는 FIPV 스파이크 단백질의 에피토프에 대해 특이적으로 유도되는 항체 또는 그의 기능적 등가물의 사용으로 통해 검출되는 것인, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 에피토프는 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하고/거나, 상기 에피토프가 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함한다.
에피토프가 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049 및/또는 아미노산 위치 1051에 상응하는 아미노산을 포함하는 것인, FIPV 스파이크 단백질의 에피토프에 대해 특이적으로 유도되는 항체 또는 그의 기능적 등가물은 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 또는 그의 기능적 등가물은 형광단-, 발색단- 또는 효소-표지되고, 따라서, 이는 예를 들어, 형광 현미경 또는 분광광도법으로 검출될 수 있다. 항체 또는 기능적 등가물은 또한 예를 들어, 형광단-, 발색단- 또는 효소-표지된 제2 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다. 그러한 표지는 당업자에게 주지되어 있고, 그 예로는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), β-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 스트렙타비딘, 비오틴, 또는 디곡시게닌을 포함한다.
본 발명은 또한 에피토프가 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하는 것인, FIPV 스파이크 단백질의 에피토프에 대해 특이적으로 유도되는 항체 또는 기능적 등가물, 및 본 발명에 따른 항체, 및 상기 항체를 검출하는 수단을 포함하는 부분들로 된 키트를 제공한다.
MALDI-TOF MS를 사용함으로써 소량의 아미노산 서열을 검출할 수 있다. 아미노산 서열의 질량이 차이가 나기 때문에 임의의 표지를 사용하지 않고도 MS를 사용함으로써 상이한 아미노산 서열로 이루어진 혼합물을 분석할 수 있다. 따라서, 대개의 경우, MS 측정 이전에 아미노산 서열을 분리시킬 필요가 없다. MALDI-TOF MS를 사용함으로써, 예를 들어, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 메티오닌을 포함하는 고양이 코로나바이러스 아미노산 서열과, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 아미노산 서열을 구별할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 아미노산 서열의 적어도 일부의 질량을 결정한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 아미노산 서열의 질량은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 질량 분광측정법 (MALDI-TOF MS)을 사용하여 결정된다.
FIPV에 대한 백신 개발에 있어서 현재까지는 성공을 거두지 못하였다. FIPV에 대한 보호를 유도하는 백신을 제공하고자 하였던 다양한 접근법들은 실패하였다. 이러한 접근법으로는 밀접한 관련이 있는 이종성의 살아있는 코로나바이러스, 치사량 이하의 병독성을 가진 FIPV, 병독성이 낮은 FIPV, 및 (재조합) 고양이 코로나바이러스 서브유닛 또는 단백질을 사용한 백신화가 포함된다. 이러한 접근법들 중 일부는 어느 정도 보호를 제공하였지만, 그 결과는 일관성이 없었다. 심지어 백신화로 인해 질환 진행이 증강되어 사망에 이르게 되는 경우도 종종 있었다. 현재 유일하게 이용할 수 있는 백신은 FIPV의 온도 감수성 균주에 기초한 것으로서, 그 효능은 의심스럽다 (문헌 ([McArdle et al., 1995]; [Fehr et al., 1997])).
FECV와 FIPV의 구별을 가능하게 하는 다형태가 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질에서 동정되었는 바, FECV임을 시사하는 동정된 핵산 또는 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 개발할 수 있다. FECV를 나타내는 핵산 또는 아미노산을 갖는 고양이 코로나바이러스를 포함하는 면역원성 조성물은 병독성 FIPV 또는 그의 일부를 포함하지 않기 때문에, 상기 면역원성 조성물을 사용하면 질환 및/또는 사망의 위험이 없다. 이제는 또한 FIPV임을 시사하는 동정된 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 개발할 수도 있다. FIPV 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부부을 포함하는 면역원성 조성물을 사용하면, 단지 단리된 바이러스 단백질만이 사용되었기 때문에 질환 진행이 증강되고/거나, 사망에 이르게 되는 위험없이, FIPV에 대해 보다 우수한 면역 반응을 유도할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 시토신 또는 티민을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 아데닌을, 및/또는 위치 3151에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 면역원성 조성물 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 백신으로서 사용된다.
고양잇과 동물에서 고양이 코로나바이러스, 바람직하게는 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 시토신 또는 티민을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함하는 스파이크 단백질 코딩 고양이 코로나바이러스 핵산, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 아데닌을, 및/또는 위치 3151에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 제공한다.
한 실시양태는 고양잇과 동물에서 고양이 코로나바이러스, 바람직하게는 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)에 대한 면역 반응 유도용의 면역원성 조성물 또는 예방제의 제조를 위한, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 시토신 또는 티민을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함하는 스파이크 단백질 코딩 고양이 코로나바이러스 핵산, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 중의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 아데닌을, 및/또는 위치 3151에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는 그의 임의의 조합의 용도를 제공한다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니며, 단지 본 발명을 명확하게 하는 역할을 한다.
도면 범례
도 1. 고양이 코로나바이러스 RNA 게놈의 개략도. 5' 부분 (좌측)은 오픈 리딩 프레임 (ORF) 1a 및 1b로부터 유도되는 복제 및 전사 기능을 코딩하는 전구체를 명시한다. 그의 하류에 3' 말단쪽으로 구조 단백질 S (스파이크 단백질), E (외피 단백질), M (막 단백질) 및 N (뉴클레오시드 단백질)에 대한 유전자, 및 보조 단백질 3a, 3b, 3c, 7a 및 7b에 대한 유전자가 위치한다.
도 2. aa 및 ab) NC_012955 (고양이 코로나바이러스 UU10, 전체 게놈)의 뉴클레오티드 서열에서 정의된 바와 같은 고양이 코로나바이러스의 뉴클레오티드 20395-24801 및 NC_012952 (고양이 코로나바이러스 UU8, 전체 게놈)의 뉴클레오티드 서열에서 정의된 바와 같은 고양이 코로나바이러스의 뉴클레오티드 20382-24788에 상응하는, 고양이 코로나바이러스 스파이크 유전자의 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 1-4407). b) YP_003038574 및 YP_003038543의 아미노산 서열에서 정의된 것과 같은, 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질의 아미노산 서열.
도 3. 감염된 고양이의 대변으로부터 수득한 6개의 임상 샘플로부터의 증폭된 RNA의 아가로스 겔 전기영동. 레인 M은 분자 크기 표준이고, 레인 1-6은 임상 샘플이며, 레인 7은 음성 대조군이다.
도 4. aa 및 ab) 42마리의 건강한 고양이로부터 단리된 대변 또는 혈장 유래의 FCoV RNA의 부분 서열과, FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 샘플로부터 유래된 5개의 부분 서열, 즉, Q093501030_326B_4546.scf (백혈구 유래), Q093501032_327B_4546.scf (백혈구 유래), Q093501036_321S_4546.scf (혈청 유래), Q093501038_321A_4546.scf (복수 유래) 및 Q093501046_K11_019.ab1 (백혈구 유래)을 정렬한 것; ba 내지 bc) FIP를 앓는 것으로 확인된 54마리의 고양이로부터 단리된 병변 유래의 FCoV RNA의 부분 서열을 정렬한 것; c) FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터 단리된 대변 유래의 FCoV RNA의 부분 서열을 정렬한 것. 분석된 고양이 코로나바이러스의 정체 코드가 도 4aa, 4ab, 4ba 내지 4bc 및 4c의 우측에 표시되어 있다. 표적화된 뉴클레오티드 및 예측되는 아미노산은 화살표로 표시되어 있다.
실시예
실시예 1
본 실시예에서는 6개의 임삼 샘플 (대변)을 분석하였다. 임삼 샘플로부터 RNA를 추출하고, 추출된 RNA에 RT-PCR을 적용시키고, 제1 PCR (1회차) 후에, 및 네스티드 PCR (2회차) 후에 아가로스 겔 전기영동에 의해 생성물을 분석하였다 (도 3 참조).
물질 및 방법
네스티드 RT-PCR을 사용하여 표적 점돌연변이를 함유하는 FCoV 스파이크 유전자 영역을 증폭시켰다. QIAamp 바이랄 RNA 미니 키트(Viral RNA Mini Kit) 및 퀴아젠 알엔이지 미니 키트(Qiagen RNeasy Mini Kit) (퀴아젠, 인크.(Qiagen, Inc.))를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 6마리의 건강한 고양이의 대변으로부터 게놈 RNA를 추출하였다. M-MLV 역전사효소 (RT)를 사용하여 cDNA를 합성한 후, Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 수행하였다. 제조사의 설명서 (프로메가 코포레이션(Promega Corp.: 미국 위스콘신주 매디슨))에 따라 모든 효소를 사용하였다. 특이 프라이머 (하기 표 1의 프라이머 참조)를 사용하여 두 반응 모두를 프라이밍하였다. 프라이머는 기탁 번호 NC_012955 및 NC_012952의 FCoV 게놈 서열을 사용하여 디자인하였다. 94℃에서 60 s 동안, 50℃에서 30 s 동안, 및 72℃에서 1 min 동안의 30회 사이클을 사용하여 증폭을 수행한 후, 증폭 종결시 72℃에서 7 min 동안 추가 신장을 수행하였다. PCR 단편을 단리시키고, 퀴아젠 겔 추출용 키트 (퀴아젠 베네룩스 비.브이.((Qiagen Benelux B.V.: 네덜란드 벤로))를 사용하여 전기영동을 수행한 후, 아가로스 겔로부터 정제하였다. 베이스클리어 홀딩 비.브이.(BaseClear Holding B.V.: 네덜란드 레이던)에서 서열분석을 수행하였다.
결과
제1 PCR 후, 도 3의 레인 2에서 관찰되는 바와 같이, 오직 하나의 임삼 샘플에서만 601-bp 단편이 수득되었다. 2회차 PCR 후, 네스티드 프라이머를 1회차 RT-PCR의 생성물에 적용시켰을 때, 139-bp 단편이 증폭되었다. 이제, 생성물은 레인 2에서 뿐만 아니라, 레인 3, 5, 및 6에서 제시된 증폭된 RNA에서도 나타났다.
실시예 2
본 실시예에서는, 47마리의 건강한 고양이의 대변 또는 혈장 샘플, FIP를 앓는 것으로 확인된 54마리의 고양이의 임상 샘플 및 FIP를 앓는 것으로 확인된 14마리의 고양이의 대변 샘플을 분석하였다.
물질 및 방법
실시예 1의 물질 및 방법에 따라 게놈 RNA 추출, cDNA 합성, 증폭 및 서열분석을 수행하였다.
결과
건강한 고양이로부터의 모든 대변 또는 혈장 유래의 FCoV (47/47)에서 아미노산 위치 1049의 메티오닌을 코딩하는 핵산 서열이 검출되었다 (도 4aa 및 4ab). 도 4aa 및 4ab가 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 샘플로부터 유래된 5개 서열 (Q093501030_326B_4546.scf, Q093501032_327B_4546.scf, Q093501036_321S_4546.scf, Q093501038_321A_4546.scf 및 Q093501046_K11_019.ab1)을 함유하고 있다는 것이 추후에 밝혀졌으며, 이는 건강한 고양이로부터의 대변 또는 혈장 유래의 FCoV 42개 중 42개 전부에서 아미노산 위치 1049에 메티오닌이 존재한다는 것을 의미하였다. 상기 서열은 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터 증폭된 병변 유래의 RNA 54개 중 2개 (도 4ba 내지 4bc), 및 대변 유래의 RNA 14개 중 12개 (도 4c)에서도 관찰되었다. 중요하게는, FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 병변 유래의 RNA 54개 중 52개 (96%)에서 위치 3145의 A가 C 또는 T로 변경됨으로써 위치 1049의 아미노산이 메티오닌으로부터 류신으로 변경되게 되었다 (도 4ba 내지 4bc).
실시예 3
본 발명자들은 네덜란드 내의 수의사 및 소유주를 통해 샘플과 고양이를 계속하여 수집하였다. 본 실시예에서는 하기 샘플을 분석하였다:
- 352마리의 건강한 고양이의 대변 샘플,
- 89마리의 건강하거나 또는 FIP로 의심되지 않는 고양이의 백혈구 샘플,
- 89마리의 건강하거나 또는 FIP로 의심되지 않는 고양이의 혈장 샘플,
- 56마리의 건강하거나 또는 FIP로 의심되지 않는 고양이의 혈청 샘플,
- 97마리의 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 FIP 병변 샘플 (장간막 림프절 (LN) 및/또는 신장 및/또는 비장 및/또는 장막 및/또는 폐 및/또는 LN 및/또는 간 및/또는 복수),
- 34마리의 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 백혈구 샘플,
- 34마리의 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 혈장 샘플, 및
- 15마리의 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이의 혈청 샘플.
물질 및 방법
실시예 1의 물질 및 방법에 따라 게놈 RNA 추출, cDNA 합성, 증폭 및 서열분석을 수행하였다.
결과
건강한 고양이로부터의 샘플
352개의 대변 샘플 중 137개 (39%)가 FCoV 양성이었다. 건강한 고양이로부터의 대변 유래의 FCoV 모두 (137개)에서 아미노산 위치 1049의 메티오닌 및 아미노산 위치 1051의 세린을 코딩하는 핵산 서열이 검출되었다.
건강하거나 또는 FIP 로 의심되지 않는 고양이로부터의 샘플
89마리의 건강하거나 또는 FIP로 의심되지 않는 고양이로부터의 EDTA-혈액 샘플을 수득하고, 백혈구 (WBC) 및 혈장으로 분리하였다. 56마리의 건강하거나 또는 FIP로 의심되지 않는 고양이로부터의 혈청 샘플을 수득하였다.
89개의 백혈구 샘플 중 20개, 89개의 혈장 샘플 중 4개, 및 56개의 혈청 샘플 중 8개가 FCoV 양성이었다. 혈장 양성 샘플 4개 모두 WBC 분획에서도 또한 양성이었고, 각 동물에서 혈장 중의 서열은 WBC 중의 서열과 100% 동일하였다. 시험 결과 FCoV에 대해 양성인 샘플들 모두에서 아미노산 위치 1049의 메티오닌 및 아미노산 위치 1051의 세린을 코딩하는 핵산 서열이 검출되었다.
FIP 를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 샘플
FIP를 앓는 것으로 확인된 총 97마리의 고양이를 연구하였다. 전형적인 FIP 병변을 가진 97개의 기관 (장간막 LN 및/또는 신장 및/또는 비장 및/또는 장막 및/또는 폐 및/또는 LN 및/또는 간 및/또는 복수 포함) 중 97개가 시험 결과 FCoV에 대해 양성이었다. FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 병변 유래의 RNA 97개 중 87개 (90%)에서 위치 1049의 아미노산이 메티오닌으로부터 류신으로 변경되었다. FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 병변 유래의 RNA 97개 중 5개 (5%)에서 위치 1051의 아미노산이 세린으로부터 알라닌으로 변경되었다. 위치 1051에 알라닌이 존재하는 5개 샘플 모두에서, 위치 1049에는 메티오닌이 존재하였다. 따라서, FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 병변 유래의 RNA 97개 중 92개 (95%)에서는 FIP임을 시사하는 아미노산 변경이 일어난 반면, 97개 중 5개 (5%)에서는 FIP임을 시사하는 아미노산 변경이 일어나지 않았다.
FIP를 앓는 것으로 확인된 97마리의 고양이 중 34마리로부터 혈액을 수득한 후, 동물을 안락사시켰다. 혈액 샘플을 백혈구 (백혈구 연층) 및 혈장으로 분리하였다. 15마리의 FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터 혈청 샘플을 수득하고, 그의 EDTA-혈액도 또한 수득하였다.
WBC:
34개의 WBC 샘플 중 34개 (100%)가 FCoV 양성이었다. FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 WBC 유래의 RNA 34개 중 29개 (85%)에서 위치 1049에 류신이 존재하고, 위치 1051에 세린이 존재하였으며; 29개 모두 기관 샘플 중 위치 1049에도 또한 류신이 존재하였다. WBC 샘플 중 위치 1049에 메티오닌이 존재하는 고양이 5마리 중, 2마리는 FIP-병변을 함유하는 기관(들) 중 상기 위치에 류신을 포함하였고, 나머지 3마리는 FIPV임을 시사하는 어떤 아미노산 변경도 포함하지 않았다. 따라서, 기관 물질에서 위치 1049에서 류신이 검출된, 34마리의 FIP 고양이 중 31마리 (90%)로부터, 31개의 사례 중 29개 (94%)에서 WBC 중 상기 위치에서도 류신이 또한 검출되었다.
혈장:
34개의 혈장 샘플 중 14개 (41%)가 FCoV 양성이었다. FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 혈장 유래의 RNA 34개 중 11개 (32%)에서 위치 1049에 류신이 존재하고, 위치 1051에 세린이 존재하였다. 혈장 중 위치 1049에 메티오닌이 존재하는 FCoV 양성 고양이 3마리 중, 1마리는 FIP-병변을 함유하는 기관(들)의 FCoV RNA 중 상기 위치에 류신을 포함하였고, 나머지 2마리는 FIPV임을 시사하는 어떤 아미노산 변경도 포함하지 않았다. 따라서, 기관 물질에서 위치 1049에서 류신이 검출된 34마리의 FIP 고양이 중 31마리 (90%)로부터, 31개의 사례 중 11개 (35%)에서 혈장 중 상기 위치에서 류신이 또한 검출되었다.
혈청:
15개의 혈청 샘플 중 4개 (27%)가 FCoV 양성이었다. FIP를 앓는 것으로 확인된 고양이로부터의 혈청 유래의 RNA 15개 중 2개 (13%)에서 1049 위치에 류신이 존재하고, 1051 위치에 세린이 존재하였다. 상기 고양이 15마리 중 15마리 (100%)가 기관 유래의 FCoV RNA 중 1049 위치에 류신을 포함하였다.
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참고 문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Feline coronavirus <220> <221> CDS <222> (1)..(66) <400> 233 atg gct atg ggt tct att acc tca gct gtt gcc gtg cct ttt gct atg 48 Met Ala Met Gly Ser Ile Thr Ser Ala Val Ala Val Pro Phe Ala Met 1 5 10 15 caa gtt cag gct aga ctt 66 Gln Val Gln Ala Arg Leu 20 <210> 234 <211> 22 <212> PRT <213> Feline coronavirus <400> 234 Met Ala Met Gly Ser Ile Thr Ser Ala Val Ala Val Pro Phe Ala Met 1 5 10 15 Gln Val Gln Ala Arg Leu 20 <210> 235 <211> 66 <212> DNA <213> Feline coronavirus <220> <221> CDS <222> (1)..(66) <400> 235 atg gct atg ggc tct att acg tct gca gtg gct gtc cct ttt gcc atg 48 Met Ala Met Gly Ser Ile Thr Ser Ala Val Ala Val Pro Phe Ala Met 1 5 10 15 caa gta caa gct agg ctt 66 Gln Val Gln Ala Arg Leu 20 <210> 236 <211> 22 <212> PRT <213> Feline coronavirus <400> 236 Met Ala Met Gly Ser Ile Thr Ser Ala Val Ala Val Pro Phe Ala Met 1 5 10 15 Gln Val Gln Ala Arg Leu 20 <210> 237 <211> 66 <212> DNA <213> Feline coronavirus <220> <221> CDS <222> (1)..(66) <400> 237 atg gct atg ggt tct att aca 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Claims (19)

  1. 샘플이 고양이 코로나바이러스를 포함하는지 여부를 결정하는 단계, 및 고양이 코로나바이러스가 존재하는 경우, 도 2b에 도시되어 있는 바의 상기 고양이 코로나바이러스의 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 상기 아미노산이 메티오닌이 아닌 경우, 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)가 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, FIPV가 샘플 중에 존재하는지 여부를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 위치 1049에 있는 아미노산의 정체가 스파이크 단백질을 코딩하는 상기 고양이 코로나바이러스 핵산의 핵산 서열을 결정함으로써 결정되고, 여기서 상기 핵산은 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 위치 3145, 3146 및/또는 3147에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 메티오닌이 아닌 아미노산이 류신인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3055에 상응하는 위치와 뉴클레오티드 위치 3669에 상응하는 위치 사이의 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부와 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146 및 3147을 포함하거나 그에 상응하는 영역을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 샘플이 고양이 코로나바이러스를 포함하는지 여부를 결정하는 단계, 및 고양이 코로나바이러스가 존재하는 경우, 도 2b에 도시되어 있는 바의 상기 고양이 코로나바이러스의 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 상기 아미노산이 세린이 아닌 경우, 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)가 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, FIPV가 샘플 중에 존재하는지 여부를 결정하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 상기 고양이 코로나바이러스의 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산의 정체를 결정하는 단계, 및 상기 아미노산이 세린이 아닌 경우, FIPV가 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 위치 1051에 있는 아미노산의 정체가 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산의 핵산 서열을 결정함으로써 결정되고, 여기서 상기 핵산이 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 있거나 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세린이 아닌 아미노산이 알라닌인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3055에 상응하는 위치와 뉴클레오티드 위치 3669에 상응하는 위치 사이의 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부와 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머를 사용하여, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및 3153을 포함하거나 그에 상응하는 영역을 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제4항 또는 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 프라이머가 표 1에 열거되어 있는 프라이머로부터 선택된 것인 방법.
  11. 서열 5'-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 또는 재조합 핵산 서열, 및 서열 5'-CAATATTACAATGGCATAATGG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 포함하는 프라이머 쌍.
  12. 서열 5'-GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 또는 재조합 핵산 서열, 및 서열 5'-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 포함하는 프라이머 쌍.
  13. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이, 길이가 적어도 14개의 뉴클레오티드이며, 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 위치 3145, 3146 및 3147에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화할 수 있거나, 또는 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 위치 3151, 3152 및 3153에 있거나 또는 그에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 고양이 코로나바이러스 핵산의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 사용하여 검출되며, 여기서 상기 고양이 코로나바이러스 핵산의 적어도 일부는 길이가 적어도 14개의 뉴클레오티드인 방법.
  14. 길이가 14개 내지 100개의 뉴클레오티드이고, 서열 5'-CCCARRGCCATAGG-3'에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로브.
  15. 제2항 내지 제10항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 고양이 코로나바이러스 핵산 서열의 적어도 일부가 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145, 3146, 및/또는 3147에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 위치 3151, 3152 및/또는 3153에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항, 또는 제8항에 있어서, 도 2b에 도시되어 있는 바의 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 중의 아미노산 위치 1049 또는 1051에 상응하는 위치에 있는 아미노산이, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하거나, 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 FIPV 스파이크 단백질의 에피토프에 대해 특이적으로 유도되는 항체 또는 그의 기능적 등가물을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  17. 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하거나, 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 FIPV 스파이크 단백질의 에피토프에 대해 특이적으로 유도되는 항체 또는 기능적 등가물.
  18. - 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분, 또는
    - 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 시토신 또는 티민을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산, 또는
    - 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 아데닌을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는
    - 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는
    그의 임의의 조합을 포함하는 면역원성 조성물.
  19. 고양잇과 동물에서 고양이 코로나바이러스, 바람직하게는 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물 또는 예방제의 제조를 위한,
    - 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌이 아닌 아미노산을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 아미노산을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분, 또는
    - 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 시토신 또는 티민을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 구아닌을 포함하는, 스파이크 단백질을 코딩하는 고양이 코로나바이러스 핵산, 또는
    - 도 2aa 및 2ab에 도시되어 있는 바의 뉴클레오티드 위치 3145에 상응하는 위치에서 아데닌을 포함하고/하거나 뉴클레오티드 위치 3151에 상응하는 위치에서 티민을 포함하는 핵산을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는
    - 도 2b에 도시되어 있는 바의 아미노산 위치 1049에 상응하는 위치에서 메티오닌을 포함하고/하거나 아미노산 위치 1051에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 고양이 코로나바이러스 스파이크 단백질 또는 그의 면역원성 부분을 포함하는 고양이 코로나바이러스, 또는
    그의 임의의 조합의 용도.
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