CN101528946A - 诊断虾病原体的序列 - Google Patents

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CN101528946A CNA2007800387351A CN200780038735A CN101528946A CN 101528946 A CN101528946 A CN 101528946A CN A2007800387351 A CNA2007800387351 A CN A2007800387351A CN 200780038735 A CN200780038735 A CN 200780038735A CN 101528946 A CN101528946 A CN 101528946A
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Abstract

分离了作为检测哈氏弧菌的诊断剂的引物。这些引物基于哈氏弧菌LuxR基因的一部分，并且可以用于引物指导的扩增或核酸杂交测定方法。

Description

诊断虾病原体的序列
本发明根据35U.S.C.§119要求2006年10月20日提交的美国临时申请系列No.60/853379的优先权，将该美国临时申请并入本文。
发明领域
本发明涉及诊断测试的领域。更具体地，已经开发了新的引物用于检测哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
发明背景
商业虾和水产养殖场会由于大量常见病原体的影响而遭受大量损失。哈氏弧菌，是一种革兰氏阴性棒状细菌，其被报道为全球虾水产业的最重要细菌病原体。该细菌的某些菌株对于虾是高度致病的，而其他的菌株可以被认为是机会病原体。
在孵化群体(hatchery broodstock)中和在幼虫后阶段中检测哈氏弧菌能够使其在被感染的虾进入商业生产体系之前被除去。因此，已经开发了多种方法用于检测虾中的哈氏弧菌，其包括基于核酸的方法和免疫方法(Lightner等人，Aquaculture 164(1)：201-220(1998))。聚合酶链式反应(PCR)方法是特别令人感兴趣的，因为他们简单、快速并且灵敏。已经描述了用于检测哈氏弧菌的PCR方法，其基于扩增基因组的不同诊断区域(参见例如Conejero等人，J.Gen.Appl.Microbiol.50(3)：137-142(2004)；Conejero等人，J.Appl.Microbiol.95(3)：602-611(2003)；和Oakey等人，J.Appl.Microbiol.95：1293-1303(2003))。
所有上述方法都可以用于检测哈氏弧菌；然而，它们通常会受到缺乏特异性、灵敏度或复杂和耗时的影响。另外，由于细菌中的基因突变率高，因此针对基因组不同区域的测试将是有用的。因此，需要高度灵敏的哈氏弧菌测定，其是快速、精确的并且容易用于野外。本文中解决了所指出的问题，这是通过发现基于哈氏弧菌LuxR基因的一部分的引物可以用于引物指导的扩增或者核酸杂交测定方法中，从而检测哈氏弧菌，而不存在与之前方法相关的问题。
发明概述
在一个实施方式中，本发明提供了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所列出的分离的哈氏弧菌诊断引物序列，或者与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2互补的分离的核酸分子。
在另一个实施方式中，本发明提供了SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所列出的哈氏弧菌诊断引物序列对。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于检测哈氏弧菌的试剂盒，其包含本文所公开的哈氏弧菌诊断引物序列对。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其包括：
(i)提供来自怀疑含有哈氏弧菌的样品的DNA；和
(ii)在适当的杂交条件下，使用探针对所述DNA进行探测，其中所述探针来源于SEQ ID NO：1～2中任一个的分离的哈氏弧菌诊断引物序列；
其中，可杂交的核酸片段的鉴定，确认存在哈氏弧菌。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其包括：
(i)提供来自怀疑含有哈氏弧菌的样品的DNA；和
(ii)使用本文所公开的哈氏弧菌诊断引物序列对扩增所述DNA，以便产生扩增产物；
其中，扩增产物的存在，确认存在哈氏弧菌。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于对样品中哈氏弧菌的量进行定量的方法，其包括：
(i)提供来自怀疑含有哈氏弧菌的样品的DNA；
(ii)使用本文所公开的哈氏弧菌诊断引物序列对扩增所述DNA，该扩增是通过在结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针存在下，至少在变性温度和延伸温度之间热循环而进行的；
(iii)测量在热循环过程中结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针所产生的荧光的量；
(iv)确定结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针所产生的荧光的量达到高于基线值的固定阈值的循环阈值数；以及
(v)通过比较对样品中哈氏弧菌所测定的循环阈值数与标准曲线，计算样品中哈氏弧菌的量，所述标准曲线是用循环阈值数对使用已知浓度的标准溶液所测定的模板浓度的对数进行作图得到的标准曲线。
附图简要说明和序列说明
通过形成本申请一部分的下面的详细描述、附图和所附的序列说明可以对本发明的各种实施方式进行更充分的理解。
图1A显示了如实施例5中所描述的，哈氏弧菌VHL1产物和肌动蛋白内部对照样品产物的解链曲线，所述哈氏弧菌VHL1产物和肌动蛋白内部对照样品产物是通过将哈氏弧菌DNA和肌动蛋白DNA进行同时PCR扩增而形成的。将哈氏弧菌和肌动蛋白产物的解链温度(Tm)值在它们相应的解链曲线上指出。
图1B显示如实施例5中所描述的样品的琼脂糖凝胶电泳分离的结果，所述样品含有通过同时PCR扩增哈氏弧菌DNA和肌动蛋白DNA而形成的哈氏弧菌VHL1产物和肌动蛋白内部对照样品产物。在每条泳道上显示哈氏弧菌和虾DNA的量；“M”是100-bp DNA梯。
下面的序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(“含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT(第5.2和49.5(a-bis)条和第208节以及管理说明的附件C)一致。核苷酸和氨基酸序列数据所使用的符号和格式遵循37 C.F.R.§1.822所列出的规则。
SEQ ID NO：1和2是可以用于检测哈氏弧菌的哈氏弧菌诊断引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是在实施例的通用方法部分中所描述的合成的哈氏弧菌模板的核苷酸序列。该序列还是使用如SEQ ID NO：1和2提供的哈氏弧菌诊断引物在引物指导扩增的反应中获得的扩增产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4～7是在实施例5中所描述的内部对照样品引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8和9是在实施例6和7中所描述的荧光标记的探针的核苷酸序列。
发明的详细描述
本文所公开的是在可以用于检测哈氏弧菌的测定中的引物。这些引物可以在核酸扩增方法以及在杂交测定中使用，用于有毒力的哈氏弧菌的有效检测和定量。
在本文中，使用多种术语和缩写。提供了下面的定义，并且应当用于解释权利要求书和说明书。
“聚合酶链式反应”被缩写为PCR。
术语“分离的哈氏弧菌诊断引物序列”是指对应哈氏弧菌基因组一部分的序列，其用于诊断哈氏弧菌的存在。
本文所使用的“分离的核酸片段”是RNA或DNA聚合物，其为单链或双链的，并且任选地含有合成的、非天然或者改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可以包括一个或者更多个cDNA、基因组DNA或合成DNA的区段。
术语“扩增产物”或“扩增子”是指在引物指导的扩增反应中产生的核酸片段。引物指导的扩增的典型方法包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或其他等温扩增处理。如果选择PCR方法，则复制组合物将典型地包括例如：三磷酸脱氧核苷酸、具有适当序列的两个引物、热稳定的DNA聚合酶和蛋白质。这些试剂和描述它们在扩增核酸中应用的程序的细节被提供在美国专利No.4,683,202(1987，Mullis，等人)和美国专利No.4,683,195(1986，Mullis，等人)中。如果选择LCR方法，则核酸复制组合物将包括例如：热稳定的连接酶(例如水生栖热菌连接酶)、两组邻近的寡核苷酸(其中，每组的一个成员与每条靶链互补)、Tris-HCl缓冲液、KCl、EDTA、NDA、二硫苏糖醇和鲑精DNA。参见，例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074-1078(1985)。
术语“引物”是指一种寡核苷酸(合成的或者天然存在的)，其能够在被置于被聚合酶催化合成互补链的条件下时，作为沿着互补链的核酸合成或复制的起始点。
术语“热循环”是指在某些核酸扩增方法例如PCR和LCR中所使用的改变温度的整个模式。该过程是本领域中常见和公知的。参见，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：ColdSpring Harbor，NY(1989)；以及授予Mullis等人的美国专利No.4,683,202；授予Mullis等人的美国专利No.4,683,195。通常，PCR热循环包括高温下的起始变性步骤，接着是重复系列的温度循环，其被设计成能够使模板变性、引物退火以及通过聚合酶使所退火的引物延伸。
术语“循环阈值数”，在本文中也称作“CT”，是指在热循环过程中由于产物形成导致的荧光的量达到高于基线值的固定阈值的循环数目。
术语“探针”是指一种寡核苷酸(合成的或者天然存在的)，其与在本文中也被称作“片段”的靶序列(即待检测的序列，或者待检测的序列的一部分)显著互补，并且通过与靶序列的至少一条链杂交而形成双链结构。探针可以被标记以辅助检测，例如使用荧光标记或配体标记。
术语“复制抑制剂部分”是指任何下述原子、分子或化学基团：其结合到寡核苷酸的3’末端羟基上并且能够阻断用于核酸链复制的链延伸的起始。例子包括但不限于3’-脱氧核苷酸(例如蛹虫草菌素)、双脱氧核苷酸、磷酸、配体(例如生物素和二硝基苯酚)、报道分子(例如荧光素和罗丹明)、碳链(例如丙醇)、错配核苷酸或多核苷酸或肽核酸单元。
术语“非参与的”是指在扩增核酸分子的反应中，缺少探针或引物的参与。具体地，非参与的探针或引物将不作为DNA聚合酶的底物，或者不被DNA聚合酶所延伸。“非参与的探针”本质上不能够通过聚合酶进行链延伸。其可以具有或者可以不具有复制抑制剂部。
如果单链形式的核酸分子能够在适当的温度和溶液离子强度条件下与其他核酸分子退火，则该核酸分子“可杂交”于另一种核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA。杂交和洗涤条件是公知的，并且示例在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：ColdSpring Harbor，NY(1989)中，特别是第11章和其中的表11.1(通过引用将其整体并入本文)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。对于初步筛选同源核酸，可以使用低严格性杂交条件，其对应55℃的解链温度(Tm)，例如5X SSC、0.1％SDS、0.25％乳，并且没有甲酰胺；或者30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。中等严格性杂交条件对应更高的Tm，例如40％甲酰胺，具有5X或6X SSC。杂交需要两种含有互补序列的核酸，尽管可能其依赖于杂交的严格性、碱基之间的错配。核酸杂交的适当严格性依赖于核酸的长度和互补程度，它们是本领域中公知的变量。两种核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则具有这些序列的核酸杂交体的Tm值越大。核酸杂交体的相对稳定性(对应更高的Tm)以下列顺序降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同前，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同前，11.7-11.8)。在一个实施方式中，可杂交核酸的长度至少为大约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少大约15个核苷酸；更优选至少大约20个核苷酸；最优选，长度为至少30个核苷酸。此外，本领域技术人员能够理解，如果必要，可以根据多种因素例如探针长度对温度和洗涤溶液盐浓度进行调节。
“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，其包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指天然发现的具有其自身的调控序列的基因。“嵌合基因”是指所有不是天然基因的基因，其包括没有天然共同发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或者来自相同来源但以与其天然所发现不同的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体的基因组中其天然位置的天然基因。“外源基因”是指在宿主生物体中通常不存在，但能够通过基因转移引入到宿主生物体中的基因。外源基因能够包含插入到非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是指已经通过转化程序被引入到基因组中的基因。
术语“可操作性连接的”是指在单个核酸片段上核酸序列的缔合，以便一个核酸序列的功能受到其他核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子与编码序列可操作性连接(即编码序列是在启动子的转录控制之下)。编码序列可以在有义或反义的方向上与调控序列可操作性连接。
本文所使用的术语“表达”是指来源于本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还可以指mRNA翻译成多肽。
术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外元件，其通常携带不作为细胞中心代谢一部分的基因，并且通常是环状双链DNA分子的形式。这些元件可以是来自于任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状的自主复制的序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，其中已经将多个核苷酸序列连接或者重组成独特的构建体，所述构建体能够将启动子片段和选定基因产物的DNA序列连同适当的3’非翻译序列引入到细胞中。“转化盒”是指特异性的载体，其含有外源基因，并且除了外源基因还含有促进转化特定宿主细胞的元件。“表达盒”是指特异性的载体，其含有外源基因，并且除了外源基因外还含有允许该基因在外源宿主中增强表达的元件。
术语“序列分析软件”是指任何能够用于分析核苷酸或氨基酸序列的计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是商业上可以获得的或者独立开发的。典型的序列分析软件将包括但不限于GCG程序组(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)、DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及Vector
Figure A20078003873500101
软件7.0版本。在本申请的上下文中，可以理解，如果序列分析软件用于分析，除非以其他方式说明，则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。本文所使用的“默认值”表示软件在首次启动时最初加载的任何数值或参数组。
本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域中公知的，并且被Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：ColdSpring Harbor，NY(1989)(hereinafter“Maniatis”)；以及Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience(1987)出版的Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，所描述。
哈氏弧菌基因组
哈氏弧菌是主要的虾病原体，其具有高致死率以及广泛的宿主范围。哈氏弧菌的完整基因组已经被测序。
哈氏弧菌诊断引物序列
本文公开了诊断引物序列，其能够用于哈氏弧菌的高灵敏检测的多种测定形式。这些引物针对之前未用于检测哈氏弧菌的哈氏弧菌LuxR基因的区域(Showalter等人，J.Bacteriol.172(6)：2946-2954(1990)，GenBank：M55260)。
使用一系列“计算机模拟(in silica)”(即基于计算机)的序列分析工具根据经验鉴定引物序列。在该过程中，组装含有所有已知哈氏弧菌基因组序列的数据库。首先将这些序列比对，接着使用Vector软件(InforMax Inc.，Bethesda，MD)分析引物位点，所述分析基于与其他哈氏弧菌基因组序列的同源性、指定的扩增子长度、盐浓度、Tm(解链温度)、C+G含量以及发夹和二级结构参数的自由度。接着对GenBank序列筛选预期的引物。那些被建立成含有与其他非靶基因序列具有低于5个碱基的同源性的引物被选择用于PCR扩增效率和最少引物-二聚体形成的实验研究。选择同时显示高扩增效率和最少引物-二聚体形成的引物，用于采用一组从感染各种虾病原体的虾分离的DNA以及从被鉴定为无病的虾分离的DNA进行测试。扩增所有哈氏弧菌菌株并且对来自感染非哈氏弧菌病原体的虾的DNA以及从被鉴定为无病的虾的不同物种分离的DNA都没有反应的引物被选择为可以使用的引物。
表1中提供了发现可以用于检测哈氏弧菌的引物序列，以及它们在哈氏弧菌LuxR基因中的位置。可以使用标准的亚磷酰胺化学合成这些引物，或者可以从公司例如Sigma Genosys(The Woodlands，TX)购买这些引物。
表1
哈氏弧菌诊断引物序列
  引物，方向   SEQ ID NO：   在哈氏弧菌LuxR基因(GenBank M55260)中的位置
  VHL1F，正向   1   679-700
  VHL1R，反向   2   758-737
测定方法
本文所公开的引物序列可以以各种测定模式用于检测和定量哈氏弧菌。这两种最便利的模式依赖于核酸杂交方法或者引物指导的扩增方法例如PCR。
引物指导的扩增测定方法
在一个实施方式中，本发明的哈氏弧菌诊断引物序列可以用于引物指导的核酸扩增，以检测哈氏弧菌的存在。各种引物指导的核酸扩增方法是本领域中公知的，并且适于利用本文所公开的引物的应用。这些核酸扩增方法包括热循环方法(例如聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR))以及等温方法和链置换扩增(SDA)。
LCR方法是本领域中公知的(参见例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074-1078(1985))。典型地，LCR核酸复制组合物包括例如热稳定的连接酶(例如水生栖热菌连接酶)、两组邻近的寡核苷酸(其中，每组的一个成员与每条靶序列互补)、Tris-HCl缓冲液、KCl、EDTA、NDA、二硫苏糖醇和鲑精DNA。
SDA方法也是本领域中公知的。Walker等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))提供了关于SDA方法的深入讨论。典型地，在SDA中，使用两种寡核苷酸引物，每种引物都具有与靶中仅一条链互补的区域。在热变性后，单链靶片段结合到过量存在的各自的引物上。两种引物都含有定位在靶识别序列5’的不对称的限制酶识别序列。在限制酶、DNA聚合酶、三种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和一种α-硫代三磷酸脱氧核苷酸(dNTP[aS])存在下，每种引物-靶复合物循环经过切口和聚合/置换步骤。
使用本文公开的诊断引物序列检测哈氏弧菌的优选方法是PCR，其被Mullis等人在美国专利No.4,683,202和美国专利No.4,683,195中所描述，通过引用将二者明确地并入本文。在PCR方法中，本文所公开的哈氏弧菌诊断引物序列成对使用，其能够引导核酸扩增反应，这扩增了哈氏弧菌基因组中的区域。具体地，如SEQ ID NO：1所提供的VHL1F正向引物与如SEQ ID NO：2所提供的VHL1R反向引物共同使用。通常，在缓冲溶液中将两种引物与样品DNA，以及四种三磷酸脱氧核苷酸(即dATP、dCTP、dTTP和dGTP)的混合物、热稳定的DNA聚合酶例如Taq DNA聚合酶进行混合。接着将该混合物使用热循环仪设备进行热循环仪，以扩增期望的靶区域。可以从许多来源商业获得热循环仪(例如Applied Biosystems(Foster City，CA)；Brinkmann(Westbury，NY)；MJResearch(Waltham，MA)；和Stratagene(La Jolla，CA))。
通常，PCR热循环包括在高温下的起始变性步骤，接着是重复系列的温度循环，该温度循环被设计成能够使模板变性、引物退火以及通过聚合酶使退火的引物延伸。通常，在大约95℃的温度下对样品进行起始加热大约2～10分钟，使得双链DNA样品变性。接着，在每个循环的开始，将样品变性大约10～60秒，这依赖于所使用的样品和设备。在变性之后，在大约40℃～大约60℃的较低温度下使引物退火到靶DNA大约20～60秒。通常在大约60℃～大约72℃的温度下，进行通过聚合酶的引物的延伸。用于延伸的时间的量依赖于扩增子的大小和用于扩增的酶的类型，并且可以通过常规实验确定。另外，退火步骤可以与延伸步骤组合，这得到了两步循环。在PCR测定中，热循环还可以包括额外的温度变换。在测定中所使用的循环数目依赖于许多因素，包括所使用的引物、所存在的样品DNA的量以及热循环条件。在任何测定中使用的循环的数目都可以由本领域技术人员使用常规的实验而容易确定。任选地，可以在完成热循环之后加入最后的延伸步骤以确保所有扩增产物的合成。
在扩增之后，可以将扩增的核苷酸序列连接到适当的载体上，随后使用所述载体转化适当的宿主生物。从而，确保了更容易供给所扩增的序列。或者，正如下面所描述的，在扩增之后，可以化学合成所扩增的序列或其一部分，用作核苷酸探针，以用于杂交测定中。在上述任何一种情况中，都可以使用例如双脱氧法的方法，确定可变区域的DNA序列(Sanger，F.等人Proc.Natl.Acad.Sci.74：5463-5467(1977))。将所获得的序列用于指导用于生物体的探针的选择，并选择最适宜的序列。
为了使用引物指导的核酸扩增方法检测怀疑含有哈氏弧菌的样品(例如虾或其他甲壳类动物)中存在哈氏弧菌，来自样品的DNA必须要以能够被扩增的形式提供。
典型地，DNA必须不含细胞和样品材料，并且可以被处理以除去蛋白质和其他细胞组分。可以从来自任何适当组织、流体或样品材料包括但不限于虾组织(腮、腹肢、血林巴、肌肉、尾、眼柄、胃、足和结缔组织)、洗涤液和池塘水样品的细菌获得DNA。典型地，细菌细胞是从样品材料分离的。可以将这些样品培养在适当的培养基中，例如补充NaCl的胰蛋白酶消化的大豆培养液(tryptic soy broth)、补充NaCl的血琼脂、海生生物培养液(Marine broth)或硫代硫酸盐柠檬酸盐胆汁蔗糖(TCBS)培养液。或者，可以直接从样品提取DNA用于检验。可以根据许多理由怀疑样品含有哈氏弧菌，包括接近已知的污染物或者其他方式，或者可能仅仅通过在商业虾工业中共同存在哈氏弧菌而怀疑被污染。因此，怀疑含有哈氏弧菌的样品可以是任何上面所描述的DNA。
用于提供来自样品的适于扩增的DNA的方法是本领域公知的(Maniatis，同上)。可以直接从样品材料提取DNA。或者，可以从细菌样品提取DNA，例如正如Goarant等人(Appl.Environ.Microbiol.65(3)：1145-1151(1999))所描述的，通过利用离心收获细胞、使用十二烷基硫酸钠(SDS)裂解细胞，以及使用苯酚和氯仿-异戊醇提取DNA。此外，可以使用可以商业获得的DNA分离试剂盒提供适于扩增的形式的DNA，所述试剂盒例如QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Valencia CA)、QIAamp Tissue Kit(Qiagen)或者High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)。
接着根据上面所述的，使用本文所公开的诊断引物序列对利用核酸扩增方法扩增DNA。根据下面所描述检测到的扩增产物的存在，确认样品中存在哈氏弧菌。在一个实施方式中，使用PCR扩增DNA。
在核酸扩增方法中，可能由于试剂失灵、程序错误和仪器故障而错误解释测试结果。此外，由于在样品材料中存在抑制物质，或者在样品处理和核酸回收过程中存在样品DNA或RNA的降解，而产生问题。为了克服这些问题，可以结合哈氏弧菌测定进行内部对照测试，以提醒用户这些类型的错误并辅助测试结果的定量。
可以使用两种类型的内部对照测试。一种方法是基于共同扩增“内部模板对照”(ITC)，其在反应之前被加入到核酸扩增试剂混合物中。另一种方法是基于共同扩增样品中所包含的“内部样品对照”(ISC)。在两种情况中，内部对照DNA或RNA的序列都与哈氏弧菌DNA不同。
内部样品对照可以是保守的、或者在样品材料(例如虾组织和血淋巴)中持续存在的DNA或RNA基因序列。选择用于扩增ISC靶DNA或RNA的引物，使得它们不会扩增哈氏弧菌DNA，并且选择哈氏弧菌测试引物，使得它们不会扩增内部样品对照DNA或RNA靶。以这种方式，ISC和哈氏弧菌靶独立地扩增。在该测定中，ISC和哈氏弧菌靶都被使用相同的试剂和条件进行处理。而且，两种靶模板都被使用相同的试剂和反应条件而扩增。因为在测试样品中存在ISC模板和引物，因此应该在扩增过程中产生ISC产物。如果没有形成ISC产物，则这指示测试化学没有正确发挥功能并且哈氏弧菌测试结果不正确而不能被采用。形成正确的ISC，指示测试化学正确运行，哈氏弧菌样品处理和测试反应被假定正确发挥功能。在这些情况中，哈氏弧菌测试可以被更精确地解释。
ISC引物可以选自遭受哈氏弧菌感染的病原体宿主物种的编码结构蛋白、代谢酶或核糖体产物的基因的基因序列。例如，ISC引物可以是来自虾肌动蛋白基因、或虾的18S、23S或5S核糖体基因或测试生物中其他组成型基因的基因序列。ISC引物对的适当例子包括但不限于SEQID NO：4和5，以及SEQ ID NO：6和7，其来自斑节对虾(Penaeusmonodon)肌动蛋白1基因(GenBank AF100986)，如表2所示。
表2
内部样品对照(ISC)引物序列
  引物，方向   SEQ ID NO：   肌动蛋白1基因位置(GenBank AF100986)
  ActinF2，正向   4   391-411
  ActinR2，反向   5   608-629
  ActinF3，正向   6   326-346
  ActinR3，反向   7   553-574
在一个实施方式中，在核酸扩增试剂混合物中包含至少一对ISC引物以在扩增反应中产生内部样品对照产物。在一个实施方式中，从SEQID NO：4和5，以及SEQ ID NO：6和7中选择至少一对ISC引物。
另外，可以将内部模板对照(ITC)用于使用哈氏弧菌测试引物来获益，以辅助对测试反应的定量。ITC对引物的要求与ISC引物的要求类似，除了要将ITC模板和引物都加入到扩增试剂混合物中之外。选择ITC引物，使得它们不从遭受哈氏弧菌感染的测试物种例如虾扩增基因组DNA或RNA。以已知的浓度加入ITC模板，以便每次反应的拷贝数目是已知的。因为在扩增试剂混合物中包含ITC模板，所以在扩增过程中产生ITC产物。ITC产物的量在反应与反应之间会有变化，这依赖于反应的扩增效率和其他变量。因为这些相同的变量也会影响哈氏弧菌DNA扩增，所以所产生的哈氏弧菌产物的量将与反应中所产生的ITC产物的量成比例地相关。因此，可以从原始加入的ITC、所形成的ITC产物以及所产生的哈氏弧菌产物之间的比例推断测定中哈氏弧菌模板的拷贝数。在使用被标记的内部探针时可以以CT单位或者通过在产物各自解链温度下解链曲线的导数(derivative)确定相对产物形成。
可以合理地设计ITC引物序列，或者从来自非测试物种例如其他病毒的基因序列或者来自不存在于测试样品中的植物或动物的基因得到ITC引物序列。以这种方式，样品材料不含可能被ITC引物扩增的其他DNA或RNA。
在一个实施方式中，在核酸扩增试剂混合物中含有至少一个内部模板对照和至少一对ITC引物，以在扩增反应中产生至少一种ITC产物。
可以在本文所公开的方法中使用本领域公知的各种检测方法。这些检测方法包括但不限于标准的非变性凝胶电泳(例如丙烯酰胺或琼脂糖)、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、毛细管电泳和荧光检测。
荧光检测方法提供了扩增产物的快速和灵敏检测。荧光检测还提供了实时检测的能力，其中在热循环处理中，监控扩增产物的形成。另外，可以使用荧光检测对起始靶的量进行定量。可以通过在热循环处理之前或之后，将结合核酸的荧光剂加入到反应混合物而完成荧光检测。优选地，结合核酸的荧光剂是嵌入型染料，其能够非共价插入核酸双螺旋中堆叠的碱基对之间。然而，非嵌入型结合核酸的荧光剂也是适当的。可以用于本发明方法的结合核酸的荧光剂的非限制性例子是溴化乙锭和
Figure A20078003873500161
Green I(可以从Molecular Probes；Eugene，OR获得)。正如Higuchi(美国专利No.5,994,056)所述，在热循环之前向反应混合物中加入结合核酸的荧光剂使得能够监控扩增产物的形成。能够实时荧光测量的热循环仪可以从诸如Applied Biosystems(Foster City，CA)、MJResearch(Waltham，MA)和Stratagene(La Jolla，CA)的公司商业获得。在扩增之后，可以通过使用本领域已知的方法例如通过使用荧光测量产生解链曲线而测定产物的解链温度，进而对扩增产物的确认进行评估。
还可以使用本领域已知的其他方法完成对扩增产物的荧光检测，例如使用荧光标记的探针。探针包括与扩增产物的至少一部分互补的序列。这些探针的非限制性例子包括
Figure A20078003873500162
探针(Applied Biosystems)和Molecular Beacons(Goel等人，J.Appl.Microbiol.99(3)：435-442(2005))。例如，正如在实施例6和7中所描述的，可以通过使用商业上可获得的软件例如Primer
Figure A20078003873500163
v2.0(Applied BioSystems Inc.，Foster CityCalifornia)分析哈氏弧菌基因和测试扩增子而选择基因序列，所述基因序列用于构建与本文所公开的哈氏弧菌引物一起使用的荧光标记的探针。选择探针序列，使其落入特定哈氏弧菌测试扩增子的近端。适当的探针序列包括但不限于在SEQ ID NO：8和9中所列出的序列。可以使用本领域中已知的方法对探针进行荧光标记，例如下面描述的用于标记杂交探针的方法。对于实时荧光检测，探针可以被双标记。例如，探针的5’末端可以被荧光团例如6FAMTM(Applied BioSystems)标记，而3’末端可以被淬灭染料例如6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记。在结合小沟的探针的情况中，3’末端可以被淬灭染料和小沟结合剂复合物标记。可以从商业来源例如Applied BioSystems获得荧光标记的探针。
在一个实施方式中，本发明提供了对样品中哈氏弧菌的量进行定量的方法。在该实施方式中，如上所述，从怀疑含有哈氏弧菌的样品提供DNA。使用本文所公开的寡核苷酸引物对扩增DNA，所述扩增是通过在结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针存在下，至少在变性温度和延伸温度之间热循环而进行的。在热循环的过程中测量结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针所产生的荧光的量。通过荧光测量，确定结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针所产生的荧光的量达到高于基线值的固定阈值的循环阈值数。在本文中循环阈值数被称作CT数或值。可以人工测定或者通过设备自动测定CT数。为了测定CT数，在起始扩增循环的过程中测定每个样品的基线荧光。接着采用数学算法来确定需要何种统计学显著的荧光变化来达到高于背景的荧光信号。荧光超过该阈值的循环数被称作CT数。典型地，在热循环开始时，样品中存在的DNA越多，则达到阈值所需要的循环数越少。因此，CT数与样品中哈氏弧菌的起始量反向相关。正如本领域中公知的，在确定哈氏弧菌样品的CT数之后，可以计算样品中原始存在的哈氏弧菌的量，这是通过比较对样品中的哈氏弧菌所测定的循环阈值数与标准曲线而进行的，所述标准曲线是用循环阈值数对使用已知浓度的标准溶液所测定的模板浓度的对数进行作图得到的标准曲线。
核酸杂交方法
哈氏弧菌的核酸杂交测试的基本组分包括DNA探针、怀疑含有哈氏弧菌的样品以及特异性的杂交方法。本发明的探针是单链核酸序列，其与待检测的核酸序列互补并且可以与其杂交。典型地，在杂交方法中，探针长度可以在短至5个碱基与数千个碱基之间变化，并且依赖于需要进行的具体测试。仅需要探针分子的一部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间的互补性不需要是完全的。在不完全互补的分子之间也能发生杂交，这导致所杂交的区域中某部分碱基不与正确的互补碱基配对。
本发明所公开的DNA探针来源于上面所描述的哈氏弧菌诊断引物序列。本文所使用的短语“来源于哈氏弧菌诊断引物序列”表示DNA探针可以是哈氏弧菌诊断引物序列、使用核酸扩增方法从其获得的扩增产物序列、哈氏弧菌诊断引物序列的部分或扩增产物序列，或者任何前述序列的完全互补序列。上面所使用的术语“部分”是指哈氏弧菌诊断引物序列或从其获得的扩增产物的任何比完整序列小的部分。优选地，用作探针的部分的长度为至少大约15个碱基，更优选至少大约20个碱基。DNA探针的非限制性例子来源于WSSV诊断引物序列，包括SEQ IDNO：1和2所给出的哈氏弧菌诊断引物序列，SEQ ID NO：3所给出的扩增产物序列，及其完全互补序列。
可以对探针进行标记以促进检测。将标记连接到核酸探针的方法是本领域中公知的。例如，可以在合成过程中通过掺入被标记的核苷酸来对探针进行标记。或者，可以通过切口平移或末端标记来进行探针标记。标记可以包括用于荧光检测的荧光团，或配体例如生物素，可以在杂交后使用与配体结合的酶标记的结合分子(例如酶标记的链霉素)对其进行检测。
如上所述，为了检测怀疑含有哈氏弧菌的样品中存在哈氏弧菌，从样品提供DNA。在探针和靶分子发生任何杂交之前，使样品DNA可以与探针接触。这样，DNA必须游离于细胞，并在发生杂交之前被置于正确的条件下。此外，在某些实施方式中，可能期望对DNA进行纯化以除去蛋白质、脂类和其他细胞组分。本领域技术人员已知各种核酸纯化方法例如苯酚-氯仿提取(Maniatis，同上)。另外，如上所述，可以从商业来源获得试剂盒用于DNA提取和纯化。杂交前纯化对于标准的滤膜杂交测定是特别有用的。
在一个实施方式中，可以直接对细胞裂解物进行杂交测定，而不需要提取核酸。这从样品操作处理中去除了一些步骤，并且加速了测定。为了对细胞粗裂解物进行这些测定，典型地将离液剂加入到上述所制备的细胞裂解物中。离液剂通过抑制核酸酶活性而稳定核酸。而且，离液剂允许在室温下短寡核苷酸探针与DNA灵敏地和严格地杂交(Van Nessand Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。其中，适当的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯。典型地，离液剂以大约3M的终浓度存在。如果期望，可以将甲酰胺加入到杂交混合物中，典型地为30～50体积％。
杂交方法被充分定义并且包括溶液(即均质)和固相(即异质)杂交方法。典型地，使用来源于本文公开的哈氏弧菌诊断引物序列的探针对样品DNA进行探测(即在允许核酸杂交的条件下进行接触)。这包括在无机盐或有机盐存在下在适当浓度和温度条件下使探针与样品DNA进行接触。所述探针和样品核酸必须要接触足够长的时间，以便可以发生探针和样品核酸之间任何可能的杂交。混合物中探针或靶的浓度将决定发生杂交所必需的时间。探针或靶浓度越高，则所需的杂交孵育时间越短。
可以采用各种杂交溶液。典型地，这些可以包括大约20～60体积％，优选30％的极性有机溶剂。常见的杂交溶液采用大约30～50体积％的甲酰胺，大约0.15～1M的氯化钠，大约0.05～0.1M的缓冲液例如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH在大约6～9的范围内)，大约0.05～0.2％的去污剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5～20mM的EDTA，FICOLL(Amersham Bioscience Inc.，Piscataway，NJ)(分子量为大约300-500千道尔顿)，聚乙烯吡咯烷酮(分子量为大约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。在典型的杂交溶液中还可以包括大约0.1～5mg/mL未标记的载体核酸，断裂的细胞核DNA(例如胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选大约单位体积0.5～2重量％的甘氨酸。还可以包含其他添加剂例如体积排除剂(volume exclusion agent)，其包括各种极性水溶性或可膨胀试剂(例如聚乙二醇)、阴离子聚合物(例如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖聚合物(例如硫酸葡聚糖)。
核酸杂交适于多种测定形式。最适当的之一是夹心测定模式。夹心测定特别适于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要组分是固体支持物。固体支持物已经吸附或者共价偶联到固定化的核酸捕获探针，该核酸捕获探针是未标记的并且与样品DNA序列的一部分互补。如上所述，在本发明中特别有用的探针是来源于本发明的哈氏弧菌诊断序列的那些。如上所述，使用被标记的并且与样品DNA序列的不同部分互补的第二探针对被捕获的DNA进行检测。可以使用本领域中已知的方法对标记进行检测(例如荧光、化学发光、结合对酶测定等)。
杂交方法还可以与核酸扩增方法例如PCR组合使用。例如，本发明的哈氏弧菌诊断序列可以以均质或异质测定形式用作3′封端的检测探针。例如，从本发明序列产生的探针可以被3′封端或非参与的，并且不能被核酸扩增反应所延伸或不参与核酸扩增反应。此外，掺入标记的探针可以作为反应性配体，其作为固定探针/分析物杂交体的附着点，或者作为产生可检测信号的报道物。因此，在存在过量3’封端的检测探针时，通过标准的引物指导的扩增规程，对从怀疑具有哈氏弧菌的样品分离的基因组DNA进行扩增。因为探针是3’封端的，因此，其不参与或者不干扰靶的扩增。最终的扩增循环之后，检测探针退火于所扩增DNA的相关部分，并接着将所退火的复合物通过反应性配体捕获在支持物上。
本发明的探针是通用的，并且可以设计成许多替换的形式。可以通过掺入或者链接抑制复制的部分(moiety)，阻断探针的3′末端参与引物延伸反应。典型的复制抑制剂部分包括但不限于双脱氧核苷酸、3’脱氧核苷酸、错配的核苷或核苷酸的序列、3′磷酸基团和化学试剂例如生物素、二硝基苯酚、荧光素、罗丹明和碳链。在化学合成过程中利用标准的氰乙基亚磷酰胺化学将复制抑制剂共价连接到非参与探针的3’末端核苷酸的3’羟基。该处理使用固相合成化学，其中3′末端共价结合到不溶支持物(控制孔度的玻璃或“CPG”)上，而新合成的链则在5’末端上生长。在本发明的上下文中，3-脱氧核糖核苷酸是优选的复制抑制剂。蛹虫草菌素(3-脱氧腺苷)是最优选的。因为蛹虫草菌素会连接到探针序列的3’末端，因此从共价连接到CPG的蛹虫草菌素，5-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰-3-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)，2-琥珀酰-长链烷基氨基-CPG(Glen Research，Sterling，VA)开始合成。除去二甲氧三苯甲基，并在固相蛹虫草菌素的去保护的5′羟基处开始链合成。完成合成之后，将寡核苷酸探针从固体支持物切下，留下3’末端连接的蛹虫草菌素上的游离2’羟基。在合成非参与探针的过程中，还可以将其他试剂连接到3’末端，以作为复制抑制剂。这些包括但不限于其他3-脱氧核糖核苷酸、生物素、二硝基苯酚、荧光素和地高辛配基。使用这些试剂的每一种衍生的CPG支持物可以从商业来源获得(例如Glen Research，Sterling，VA；和CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)。
或者，可以使用不对称扩增以产生与检测探针互补的链。用于产生单链DNA的不对称PCR条件与上面对PCR所描述的条件类似；然而，可以调节引物浓度以便一种引物过量，而另一种引物是有限的。预计该程序会提高方法的灵敏度。通过提高用于与检测探针结合的可利用的单链的数目能够达到灵敏度的提高。
评估哈氏弧菌灭活
本文所公开的用于检测样品中哈氏弧菌的存在以及对样品中哈氏弧菌的量进行定量的方法可以用于评估哈氏弧菌灭活的程度。例如，本文所公开的方法可以与化学处理组合，用于改进虾的健康和生长(grow-out)。具体地，在生产和生长过程中，可以对取自生产设备的样品或者取自虾的环境的样品进行取样，并使用本文所公开的方法测试哈氏弧菌的存在。如果发现哈氏弧菌，则可以对设备和/或虾进行处理以杀死或控制细菌。由于测试的高灵敏度，因此可以在使产量被破坏和损失之前，早期检测到哈氏弧菌。因此，使用本文所公开的方法组合化学干预，能够提高生产效率和产量。化学处理的例子包括但不限于氧化消毒剂例如
Figure A20078003873500211
S消毒剂(E.I.Du Pont de Nemours and Co.的注册商标)、过氧乙酸、过氧化氢、高锰酸盐、单过硫酸钾、次氯酸、次氯酸盐、碘等；益生菌剂、免疫刺激剂和饲料补充物。在化学处理后，可以对虾进行取样并重新测试，以确定该处理是否成功地根除了细菌。
检测试剂盒
在另一个实施方式中，本发明提供了试剂盒，用于基于核酸扩增方法检测哈氏弧菌。该试剂盒包括上述的哈氏弧菌诊断引物序列对。此外，该试剂盒还包括下列试剂的至少一种：热稳定的DNA聚合酶、四种不同的三磷酸脱氧核苷酸的混合物、结合核酸的荧光剂、至少一对内部样品对照引物、至少一个内部模板对照和至少一对内部模板对照引物、探针，所述探针包含与哈氏弧菌基因组内的核酸的至少一个区域的一部分互补的序列，所述核酸能够用试剂盒中包含的所述哈氏弧菌诊断引物序列进行扩增。试剂盒的引物和其他试剂可以是各种形式的，例如液体、干燥的、或片状，并可以存在于任何适当的容器或多个容器中，例如管形瓶、试管等。
在另一个实施方式中，本发明提供了试剂盒，用于基于夹心测定杂交方法检测哈氏弧菌。该试剂盒包括用于从怀疑已经接触哈氏弧菌的虾或其他甲壳类动物收集样品的第一组分，和用于分配和裂解样品的缓冲液。第二组分包括干燥或液体形式的介质，用于靶和探针核酸的杂交，以及用于通过洗涤除去不期望的和未杂交的形式。第三组分包括固体支持物(例如测量尺(dipstick)、珠等)，将未标记的核酸探针固定在其上(或者偶联在其上)，其中所述未标记的核酸来源于本文所公开的分离的哈氏弧菌诊断引物序列。第四组分含有标记的探针，其与杂交于第三组分的固定的、未标记核酸探针的相同DNA链上的第二和不同的区域互补。被标记的探针还可以来源于本文所公开的分离的哈氏弧菌诊断引物序列。
实施例
在下面的实施例中对本发明进行进一步详细说明。需要理解这些实施例尽管描述了本发明的优选实施方式，但仅以说明的方式提供。通过上述讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种应用和条件，而不离开本发明的主旨和范围。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“hr”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“nM”表示纳摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmol”表示微摩尔，“ng”表示纳克，“fg”表示毫微微克，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“g”表示克，“nm”表示纳米，“mU”表示毫单位，“U”表示单位，“rxn”表示反应，“PCR”表示聚合酶链式反应，“OD”表示光学密度，“OD260”表示在260nm波长处测量的光密度，“OD280”表示在280nm波长处测量的光密度，“OD280/260“表示OD280值与OD260值的比例，“rpm”表示每分钟的转数，“CT”表示反应中荧光累积超过检测阈值的循环数，以及“SPF”表示认定为无特异性的病原体。
通用方法
在实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域中公知的，并描述在下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，by T.J.Silhavy，M.L.Bennan，andL. W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984，and by Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，N.Y.，1987。
使用可以从InforMax Inc.(Bethesda，MD)获得的Vector
Figure A20078003873500231
软件组完成基因组序列的分析和引物指定。
本文所使用的酶和试剂是从下列销售商购买的：
Applied Biosystems，Foster City，CA：AmpliTaq(目录号N808-0160)；
New England Biolabs，Beverly，MA：脱氧核苷酸溶液混合物(目录号N0447S)；
Sigma Genosys，The Woodlands，TX：寡核苷酸；
Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA：4％琼脂糖E-凝胶(目录号G6018-02)；
Qiagen，Valencia，CA：蛋白酶K(目录号19131)；以及RNA酶A，不含DNA酶(目录号19101)。
此外，试剂盒和试剂是从下列销售商购买的：
Figure A20078003873500232
Green PCR主混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4309155)；和QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA；目录号51304)。
从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA获得下列细菌菌株：
哈氏弧菌ATCC 25919
哈氏弧菌ATCC 14126
灿烂弧菌(Vibrio splendidus)ATCC 33871
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)ATCC 43312
解藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)ATCC 33839
杀对虾弧菌(Vibrio penaeicida)ATCC 51842
解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)ATCC 53559
大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922
大肠杆菌ATCC 11229
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 82
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens Migula)ATCC 700830
在30℃下振荡或者不振荡，弧菌菌株生长在琼脂中或海洋生物培养液2216(DIFCO，Detroit，MI，目录号279110)中。
从Donald V.Lightner，兽医科学和微生物学系，Arizona大学，Tucson，AZ 85721，USA获得虾DNA样品。这些包括来自以下虾的DNA样品：确认无疾病的虾(SPF)和含有斑节对虾(Penaeus monodon)型杆状病毒(MBV)、Taura综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、斑节对虾的黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的感染的虾。另外，DNA样品是从商业培养的虾获得的，以及从ATCC购买的细菌菌株获得的。使用Qiagen QIAampDNA Mini试剂盒利用制造商的规程制备这些DNA样品。
模板和引物
用于合成的哈氏弧菌模板的的合成的DNA寡核苷酸序列是从哈氏弧菌生物发光调节蛋白(LuxR)基因(GenBank索取号M55260；Showalter等人，J.Bacteriol.172(6)：2946-2954(1990))制备的，并且使用标准的亚磷酰胺化学合成或者商业购得(Sigma Genosys Company，TheWoodlands，TX)。在260nm(OD260)处利用分光光度计测量合成的模板靶和样品的DNA浓度和拷贝数。将模板在纯净水中稀释成具体的拷贝数，并用作测定定量的阳性对照和标准。表3展示了模板靶在LuxR基因中的位置、序列鉴定和长度。SEQ ID NO：1和2给出了可以用于哈氏弧菌检测的引物序列。
表3
模板序列
  模板   大小(bp)  SEQ ID NO：   在哈氏弧菌LuxR基因(GenBank M55260)中的位置
  VHLT   80  3   679-758
分离DNA
使用QIAamp DNA Mini试剂盒从虾组织回收DNA。使用试剂盒试剂和制造商的程序回收总DNA。通常，这包括将200μL试剂盒提取缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5，10mM EDTA，100mM NaCl，0.5％十二烷基硫酸钠和250μg/mL蛋白酶K)加入到1.5mL微型离心管内的20mg虾组织中。从腮或足提取虾组织。在提取缓冲液中通过使用制造商提供的棒研磨而使组织破碎。接着将管的内含物在56℃下孵育至少30分钟，直到样品溶解。涡旋样品20sec。接着，将4μL RNA酶A(100mg/mL)加入到管中，并在室温下将反应混合物孵育2min。加入试剂盒裂解缓冲液(200μL)，并将管在70℃下孵育10min。接着加入乙醇(200μL)，并涡旋溶液。接着将溶液转移到离心柱上，并在8000rpm下离心1min。接着，加入500μL洗涤缓冲液，再将离心柱在8000rpm下离心1min。在将离心柱置于干净的收集管中后，将500μL洗涤缓冲液加入到离心柱中，并将其在13,000rpm下离心4min。在将离心柱置于干净的1.5mL微型离心管中后，将100μL试剂盒洗脱缓冲液加入到离心柱。在室温下孵育1min之后，将管在8000rpm下离心1min。将含有DNA的洗脱液收集在1.5mL微型离心管中。在所回收的材料中，通过传统的OD280/260比例测量值测定DNA的纯度，并从OD260测量值测定DNA的量。在某些情况中，使用无DNA酶的水稀释样品用于测试。
实施例1
使用合成的靶证明哈氏弧菌的PCR
本实施例的目的是证明使用本发明所公开的引物，利用PCR扩增检测哈氏弧菌合成的模板。
通过在无DNA酶的水中对合成的哈氏弧菌模板(上述)进行10倍系列稀释而制备模板标准。通常，标准的模板浓度在105～0个拷贝/5μL的范围内。通过加入25μL
Figure A20078003873500251
Green PCR主混合物(AppliedBiosystems，Foster City，CA；目录号4309155)、足以提供终浓度为125nM正向引物和62.5nM反向引物的体积的引物储液，以及足以补足到45μL/反应的终体积的无DNA酶的水，而得到主混合物。将主混合物保持在冰上直到使用。
对于每个反应，首先将5μL模板标准加入到PCR反应孔中，接着加入45μL主混合物。接着对反应热循环40个循环，其使用95℃15sec和60℃1分钟以及95℃10min的起始变性步骤的温度程序。使用ABIPRISM 7900热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp optical 96-孔反应板中进行扩增。在每个循环的过程中，通过监控由于
Figure A20078003873500252
Green报道染料与DNA扩增产物相互作用而产生的荧光的增加而检测PCR产物的形成。在完成PCR后，在60℃～95℃的范围内产生解离曲线(解链曲线)。使用ABI PRISM 7900 SDS软件对数据进行分析。此外，使用4％琼脂糖E凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)以及凝胶制造商规程，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物形成进行分析。
总结在表4中的结果证明当存在哈氏弧菌模板时，产生了适当尺寸的扩增子产物。最低可检测模板水平是1～10个拷贝/rxn。不含模板的样品不产生可检测的产物。
扩增(CT)和扩增子产物形成分别与起始模板浓度的对数成反比和正比。
表4
使用合成的靶的PCR扩增的结果
  正向引物SEQ ID NO：   反向引物SEQ IDNO：   模板SEQ IDNO：   产物尺寸(bp)   最少可检测模板(个拷贝/rxn)
  1   2   3   80   1～10
实施例2和3
对来自细菌培养物的哈氏弧菌的检测和定量
这些实施例的目的是证明使用本文所公开的引物，利用PCR测定对哈氏弧菌进行检测和定量。
在这些实施例中，使用实施例1中所述的条件对每个反应105～100个拷贝的适当的合成的模板哈氏弧菌DNA(上述)的系列稀释液进行扩增。使用从每种合成模板浓度测定的CT值，通过用CT值对标准中起始模板拷贝数目的对数以95％的置信区间进行作图而产生标准曲线(未显示)。接着将该曲线的斜率(即CT比log浓度)用于对未知样品中哈氏弧菌的拷贝数根据其各自CT值进行评估。
从两种哈氏弧菌菌株(ATCC 25919和ATCC 14126)分离基因组DNA。在纯净水中对所提取的DNA进行系列稀释，并用于提供DNA浓度在10ng/μL～1pg/μL总DNA范围内的一系列样品。阴性对照包括水对照，其不含模板并且含有来自两株未感染的(SPF)虾(凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和斑节对虾(Penaeus monodon))的两种DNA虾样品(50ng/rxn)。
接着使用引物SEQ ID NO：1和2以及实施例1中所述的扩增、主混合物、热循环条件和设备对稀释的样品进行扩增。接着从PCR扩增反应评估每种稀释的DNA样品的CT值。接着从CT值和标准CT对log模板浓度作图的斜率评估样品中哈氏弧菌的拷贝。正如实施例1所述的，同样通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。
结果总结在表5中。在表中，以三次重复的平均值给出每个反应的哈氏弧菌拷贝数。结果显示该引物组从哈氏弧菌DNA产生了正确的扩增子产物大小，并在样品中检测到了DNA。检测限度为大约2个拷贝/rxn～大约25个拷贝/rxn哈氏弧菌基因组。在水对照样品或SPF虾样品中没有检测到扩增产物。
表5
从哈氏弧菌菌株检测DNA的结果
Figure A20078003873500281
实施例4
哈氏弧菌引物的特异性
该实施例的目的是证明本发明所公开的引物不能扩增从其他细菌分离的DNA或感染其他虾病原体的虾的DNA和RNA。
使用实施例2和3中所描述的引物和PCR方法测试从感染MBV、WSSV、YHV、TSV、IHHNV、IMNV和SPF的虾分离的DNA和RNA样品。此外，使用实施例2和3中所描述的引物和PCR方法测试从其他弧菌菌株(灿烂弧菌，鳗弧菌解藻酸弧菌，杀对虾弧菌和解蛋白弧菌)和其他非弧菌细菌菌株(大肠杆菌(ATCC 25922)，大肠杆菌(ATCC11229)，枯草芽孢杆菌(ATCC 82)，和荧光假单胞菌(ATCC 700830))分离的DNA样品。
在测试来自感染各种虾病原体的虾的虾DNA或RNA样品时，以及在测试其他弧菌物种或非弧菌细菌菌株时都没有观察到PCR扩增。这些发现共同证明了本文所公开的哈氏弧菌PCR引物和方法对于哈氏弧菌是选择性的，并且支持引物不与虾DNA或者来自虾病毒、其他弧菌物种以及其他细菌的DNA或RNA反应。
实施例5
利用PCR，使用内部样品对照检测哈氏弧菌
该实施例的目的是证明本文所公开的哈氏弧菌引物能够与内部样品对照(ISC)引物组合使用以除了哈氏弧菌产物外产生ISC产物。下面提供的结果证明ISC引物独立地扩增样品DNA，而且不会干扰哈氏弧菌DNA的扩增。ISC产物的存在提供了标志物，其可以用作已经从样品回收了充分数量和质量的样品DNA进行测试的指示。
ISC引物来源于斑节对虾肌动蛋白1基因序列(GenBank：AF100986)。为了促进哈氏弧菌扩增子的优先扩增，ISC引物被设计用于扩增比靶哈氏弧菌测试扩增子大的DNA片段。SEQ ID NO：4和5以及SEQ ID NO：6和7(参见表2)给出了ISC引物序列。
通过将从哈氏弧菌(ATCC 25919)的细菌培养物获得的DNA制备物进行10倍系列稀释，制备含有哈氏弧菌和虾肌动蛋白DNA的样品。样品的DNA含量在每个反应0.1ng～0.1pg的范围内。接着将来自未感染虾的基因组斑节对虾(Penaeus monodon)虾DNA(10ng/rxn)加入到每个哈氏弧菌样品中，以及加入到不含哈氏弧菌DNA的阴性对照中。
通过将15μL/反应的
Figure A20078003873500291
Green PCR主混合物(AppliedBiosystems，Foster City，CA；目录号4309155)与足以使每种哈氏弧菌正向和反向引物(分别为SEQ ID NO：1和2)的终浓度均为125nM，分别为SEQ ID NO：6和7的肌动蛋白正向(ActinF3)和肌动蛋白反向引物(ActinR3)的终浓度均为32nm的体积的引物储液(对于每种哈氏弧菌引物，为20μM，对于每种肌动蛋白引物，为10μM)混合，制备主混合物。加入无DNA酶水以补足到最终体积为25μL/反应。将主混合物保持在冰上直到使用。
对于每个反应，首先将5μL样品加入到PCR反应孔中，接着加入25μL主混合物。接着对反应热循环40个循环，其使用95℃15sec和60℃1分钟以及95℃5min的起始变性步骤的温度程序。使用ABIPRISM 7900热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp optical 96-孔反应板中进行扩增。
如上所述，在每个循环的过程中，通过从由于Green报道染料与DNA扩增产物相互作用而产生的荧光的增加而确定的CT值，监测PCR产物的形成。在40个循环之后，在60℃～95℃的范围内产生解离曲线(解链曲线)。使用ABI PRISM 7900SDS软件对数据进行分析。此外，使用4％琼脂糖E凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)以及凝胶制造商规程，利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物形成进行分析。
图1A和1B显示了使用ISC引物ActinF3(SEQ ID NO：6)和ActinR3(SEQ ID NO：7)所获得的结果。这些图证明了同时扩增了哈氏弧菌和对照模板靶。特异性的哈氏弧菌DNA产生了解链温度为77℃的80bp产物。肌动蛋白ISC产生了249bp产物(Tm＝83.4℃)。通过解链曲线分析(图1A)和凝胶电泳(图1B)二者，根据大小和解链温度的差异对哈氏弧菌产物和肌动蛋白内部对照产物进行检测。在不存在哈氏弧菌靶和以各种哈氏弧菌DNA靶浓度时，根据在83.4℃的单个解链温度峰(如图1A所示)以及通过电泳(如图1B所示)都检测到了ISC产物。在所有含有哈氏弧菌模板的样品中，通过解链温度(Tm＝77℃)和通过凝胶电泳都检测到了特异性的哈氏弧菌扩增子。这些结果证明肌动蛋白ISC模板与哈氏弧菌模板共同扩增，并且ISC的存在并不影响PCR扩增和限制PCR测定的检测(1pg哈氏弧菌DNA)。
实施例6和7
使用荧光标记的探针实时检测哈氏弧菌
这些实施例证明本文所公开的哈氏弧菌引物可以与荧光标记的探针用于实时检测哈氏弧菌。
通过使用从Applied BioSystems Inc.(Foster City，CA 94404)购买的Primer Express
Figure A20078003873500311
v2.0软件分析哈氏弧菌基因和测试扩增子，选择用于构建荧光标记的探针的基因序列。探针序列被选择为落入特异性哈氏弧菌测试扩增子的近端内，并且长度为20～110个碱基，这依赖于扩增子的尺寸和序列。G/C含量为30％～80％并且C含量比G高，且没有5’G的区域被优先作为探针序列。通常，选择Tm比测试引物各自的Tm高8～10℃的探针序列。不选择使用与其他物种交叉杂交的探针序列。所选择符合这些标准的探针序列列于表6中。
对于实时检测，探针序列是双标记的。采用两种不同的标记途径。探针的5’末端被荧光团(6FAMTM，Applied Biosystems)标记。3’末端被淬灭染料标记，或者在结合小沟的探针(MGB)中，3’末端被淬灭染料和小沟结合剂复合物标记。制备以及从Applied BioSystems.购买经标记的探针。
表6
哈氏弧菌探针序列
  探针   SEQ ID NO：   GenBank No：   位置   5’标记   3’标记
  VHLPM   8   M55260   703-729   FAM1   MGB2
  VHLPT   9   M55260   703-729   FAM   TAMRA3
1FAM是6FAMTM试剂，Applied Biosystems
2MGB是MGBTM Applied Biosystems
3TAMRA是6-羧基四甲基罗丹明
通过在无DNA酶的水中对合成的哈氏弧菌模板(SEQ ID NO：3)进行10倍系列稀释而制备模板标准。通常，标准的模板浓度在107～0个拷贝μL的范围内。通过将25μL/反应的通用主混合物(AppliedBiosystems，Foster City，CA；目录号4326708)与足以使每种适当的哈氏弧菌正向和反向引物(如表7中所示)的终浓度为250nM的体积的引物储液(对于每种哈氏弧菌引物，均为20μM)、提供100nM的终浓度的体积的探针储液，以及补齐到45μL/反应的终体积的足够的无DNA酶的水混合，制备主混合物。将主混合物保持在冰上直到使用。
对于每个反应，首先将5μL样品加入到PCR反应孔中，接着加入45μL主混合物。接着对反应热循环40个循环，其使用95℃15sec和60℃1分钟以及95℃5min的起始变性步骤的温度程序。使用商业热循环仪(Idaho Technologies Inc.，Salt Lake，UT or Applied Biosystems，FosterCity，CA)在MicroAmp optical 96-孔反应板中进行扩增。在每个循环的过程中，通过监控荧光标记的探针所产生荧光的变化而检测PCR产物的形成。
使用热循环仪的软件对数据进行分析。此外使用4％琼脂糖E凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)以及利用制造商规程，利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物形成进行分析。
总结在表7中的结果证明在存在适当的哈氏弧菌模板时，每种引物/探针组都产生了适当大小的扩增子产物。最低可检测最低可检测模板水平是100-5,000个拷贝/rxn，这依赖于所使用的引物和探针。不含模板的样品不产生可检测的产物。
扩增(CT)和扩增子产物形成分别与起始模板浓度的对数成反比和正比。
表7
使用合成的靶的PCR扩增结果
  实施例   正向引物，SEQ ID NO：   反向引物，SEQ ID NO：   模板SEQ IDNO：   探针SEQ ID NO：   产物大小(bp)   最少可检测模板(个拷贝/rxn)
  6   1   2   3   8   80   5000
  7   1   2   3   9   80   100
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
     Ebersole，Richard
<120>诊断虾病原体的序列
<130>CL3543
<160>9
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物VHL1F
<400>1
cacgtgatga agtatggcca tt                                             22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物VHL1R
<400>2
ggctttgatg aacatgtttt gc                                             22
<210>3
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>模板VHLT
<400>3
cacgtgatga agtatggcca ttattcgtga ccacaaaccg cactaaccaa cttctagtgc    60
aaaacatgtt catcaaagcc                                                80
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cgaaaccttc aacacacccg c                                        21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
cggtggtggt gaaggagtag cc                                       22
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gtcctcctta ctgaggctcc c                                        21
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
gaggtcacga ccagccaagt cg                                       22
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA探针
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(1)
<223>用FAM标记
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>用MGB标记
<400>8
tcgtgaccac aaaccgcact aaccaac                                    27
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA探针
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(1)
<223>用FAM标记
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>用TAMRA标记
<400>9
tcgtgaccac aaaccgcact aaccaac                                     27

Claims (19)

1.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2列出的哈氏弧菌诊断引物序列对。
2.用于检测哈氏弧菌的试剂盒，其包括权利要求1的哈氏弧菌诊断引物序列对。
3.根据权利要求2的用于检测哈氏弧菌的试剂盒，其中所述试剂盒还包括至少一种选自下列的试剂：热稳定的聚合酶、四种不同的三磷酸脱氧核苷酸的混合物、结合核酸的荧光分子、至少一对内部样品对照引物、至少一个内部模板对照和至少一对内部模板对照引物，以及探针，所述探针包含与哈氏弧菌基因组内的核酸的至少一个区域的一部分互补的序列，所述核酸能够用所述哈氏弧菌诊断引物序列对进行扩增。
4.检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其包括：
(i)提供来自怀疑含有哈氏弧菌的样品的DNA；和
(ii)在适当的杂交条件下，使用探针对所述DNA进行探测，其中所述探针来源于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所列出的分离的哈氏弧菌诊断引物序列；
其中可杂交的核酸片段的鉴定，确认存在哈氏弧菌。
5.根据权利要求4的检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其中所述来源于分离的哈氏弧菌诊断引物序列的探针选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3及其完全互补的序列。
6.根据权利要求4的方法，其中所述探针在3’末端含有抑制复制的部分。
7.根据权利要求6的方法，其中所述抑制复制的部分选自双脱氧核苷酸、3’脱氧核苷酸、错配的核苷或核苷酸的序列、3′磷酸基团和化学试剂。
8.根据权利要求7的方法，其中所述3’脱氧核苷酸是蛹虫草菌素。
9.检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其包括：
(i)提供来自怀疑含有哈氏弧菌的样品的DNA；和
(ii)使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所列出的哈氏弧菌诊断引物序列对扩增所述DNA，以便产生扩增产物；
其中扩增产物的存在，确认存在哈氏弧菌。
10.根据权利要求9的检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其中(ii)的扩增是使用聚合酶链式反应进行的。
11.根据权利要求9的检测样品中存在哈氏弧菌的方法，其中(ii)的扩增是在结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针存在下进行的，并且使用荧光检测来确认扩增产物的存在。
12.根据权利要求11的方法，其中所述荧光标记的探针选自SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9。
13.根据权利要求9的方法，其中在(ii)的扩增中包括至少一对内部样品对照引物以产生内部样品对照产物。
14.根据权利要求13的方法，其中所述至少一对内部样品对照引物选自SEQ ID NO：4和5，以及SEQ ID NO：6和7。
15.根据权利要求9的方法，其中在(ii)的扩增中包括至少一对内部模板对照引物和至少一个内部模板对照，以产生内部模板对照产物。
16.对样品中哈氏弧菌的量进行定量的方法，其包括：
(i)提供来自怀疑含有哈氏弧菌的样品的DNA；
(ii)使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所列出的哈氏弧菌诊断引物序列对扩增所述DNA，所述扩增是通过在结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针存在下，至少在变性温度和延伸温度之间热循环而进行的；
(iii)测量在热循环过程中结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针所产生的荧光的量；
(iv)确定结合核酸的荧光剂或荧光标记的探针所产生的荧光的量达到高于基线值的固定阈值的循环阈值数；以及
(v)通过比较对样品中哈氏弧菌所测定的循环阈值数与标准曲线，计算样品中哈氏弧菌的量，所述标准曲线是用循环阈值数对使用已知浓度的标准溶液所测定的模板浓度的对数进行作图得到的标准曲线。
17.根据权利要求16的方法，其中所述荧光标记的探针选自SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9。
18.根据权利要求4、9或16任一项的方法，其中所述方法用于评估哈氏弧菌灭活。
19.根据权利要求4、9或16任一项的方法，其中所述方法与化学处理组合使用以改进虾的健康和生长。
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