CN101818191B

CN101818191B - 一种哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用

Info

Publication number: CN101818191B
Application number: CN2009100145160A
Authority: CN
Inventors: 孙黎; 孙鲲
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2029-02-27
Also published as: CN101818191A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用。具体为所述哈氏弧菌遗传标记具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其应用为利用遗传标记可特异性的检测哈氏弧菌；本发明基于该标记可快速、准确检测哈氏弧菌，并且应用范围广泛，并且简单易行，无需细胞培养、DNA提取等步骤。

Description

一种哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用。

背景技术

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)广泛分布于海水环境中，能够感染脊椎与非脊椎动物，包括鱼、虾、贝等。如同其它感染，哈氏弧菌感染的早期诊断将有利于弧菌病的防控。然而，哈氏弧菌检测受到下列因素的制约：(1)在形态上不同菌株间存在较大的差异，(2)在遗传进化上该菌与数种其它弧菌，如溶藻弧菌和副溶血弧菌，非常相近。目前，已有几种利用分子生物学手段检测哈氏弧菌的方法，包括通过PCR分析溶血素基因vhh、调控蛋白基因toxR、促旋酶基因gyrB、以及16S rRNA基因。由于这些基因都不仅存在于哈氏弧菌中而且存在于其它弧菌中，因而其检测结果难免有假阳性和假阴性。另外，这些方法皆需要细胞培养以及DNA提取，在操作上有一定的时间要求和技术要求。

发明内容

本发明目的在于提供一种哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

哈氏弧菌特异性分子遗传标记：序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

特异性分子遗传标记的应用：所述遗传标记可特异性的检测哈氏弧菌。

1)根据序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示的哈氏弧菌特异性分子遗传标记，涉及的引物为：引物F6(5’-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3’)和R4(5’-CGTTACGATTATTTGATAG-3’)；

2)待测鱼血液与组织样品的制备：于无菌条件下取鱼尾静脉血和鱼肾、脾脏，将肾、脾脏加入1ml PBS进行匀浆，而后进行稀释，待用；

3)环境样品的制备：自环境中取10ml水体，用0.45uM滤膜过滤，将滤膜用无菌水冲洗，收集冲洗后的无菌水水样，于100℃煮沸5min。

4)取10uM的F6和R4为引物，以2ul步骤2)或3)中的样品为模板，进行PCR扩增，若得到159bp PCR产物，即可确定待测鱼血液与组织样品被哈氏弧菌感染。

所述步骤2)的血液和组织匀浆液用无菌水进行10x稀释，而后将稀释液于100℃煮沸5min。所述步骤3)的滤膜用0.5ml无菌水冲洗。所述步骤4)的PCR反应体系为15ul；PCR过程为：94℃4min预变性模板DNA，然后94℃40s，50℃60s，72℃40s，25-30个循环后再在72℃延伸反应5min。

本发明具有如下优点：

1.准确性较高。本发明所用的遗传标记广泛存在于哈氏弧菌中而且具有一定的属内保守性，因而与其它弧菌交叉反应的可能性很小。

2.快速简单。本发明的哈氏弧菌检测方法实施过程简单，毋需细胞培养、DNA提取等步骤，只需常规的PCR，3小时左右即可获得结果。

3.应用范围广。本发明的检测方法对样品无特殊要求，可以检测环境

及生物源性样品。

4.本发明通过哈氏弧菌基因vhhP2，该基因广泛存在于哈氏弧菌中，但不存在于其它弧菌中，包括上述与哈氏弧菌进化关系非常近的两种弧菌中，因而该基因是一种特异的哈氏弧菌遗传标记，用其作为PCR探针可以准确、快速地从多种生物和环境样品中检测哈氏弧菌。

附图说明

图1为本发明从鱼血液、组织中检测哈氏弧菌的电泳图谱(其中泳道1：分子量marker；泳道2，阳性对照；泳道3、4、5分别为以注射过T4的鱼血液、脾脏、肝脏为模板所得的PCR产物；泳道6、7、8分别为以注射过PBS的鱼血液、脾脏、肝脏为模板所得的PCR产物。)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.PCR反应各种组分皆购于“天根生化科技(北京)有限公司”。

实施例1

哈氏弧菌特异性分子遗传标记由序列表SEQ ID No.1中的vhhP2碱基序列组成。

序列表SEQ ID No.1为：

ATGAAGAGAAGGAATCCTCAAGGCCTTACCCTACTAGAACTTATCATTGCGATAGTCATTCTCGGCATCCTAGCTGTTGT

TGCAGCTCCCCGTTTTTTAAACCTCCAAGACGATGCGTATCAAGCAAAAATGGAATCCATCGCTGACCAATTCGAAACAG

GCGTGCGATTTACCCAAAGCCAATGGTTAGTCAATGGTGGAACACAGGAAGCTCAAACAGATATCGATGGATATGGTGGT

GGCGAACTGGATGTAAATGAGTTTGGCTTTCCGCTTGGCACTAACAAGGGCAACAGAAATGGCGTGATTGGCAACCCGTA

TAACATAGGACAAGGGAATGCTGGTTGTATTGCCGTGTGGCAAGCTTTACTCGGCAACGAATACTCTCTATCAAATAATC

GTAACGCGAACGATAGGTTTGATTTTATTACCCGACGAGTCCAAGACAAAGAATCCCACCAATCTGTTTGTTATTATACC

TTTACTAAAAAAGGTTACGATCGCAATCCTGATAACTCTAGCTTCGTCATATGGTATGACTCAAAAACAGGCAGCGTCAC

GACATCAAAACCAACTAGATTGAAATAA

(a)序列特征：

●长度：588bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：哈氏弧菌T4

(f)特异性名称：vhhP2

哈氏弧菌特异性分子遗传标记的应用，其遗传标记可特异性的检测哈氏弧菌。

鱼血液与组织中哈氏弧菌的检测：

1)牙鲆的人工感染

在液体LB培养基中培养哈氏弧菌T4(保存于CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.1985)至OD₆₀₀为0.6，离心(5000g，4℃)10min，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5×10⁶cfu/ml。将10条牙鲆(每条重约12g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述哈氏弧菌悬浮液。将B组的每条鱼分别腹腔注射100ulPBS。

其中LB液体培养基组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母膏，1.0％NaCl，97.5％H2O；PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na₂HPO₄.12H₂O，0.024％NaH₂PO₄；

2)牙鲆血和组织样品制备

在上述步骤1)牙鲆感染48h时，于无菌条件下取鱼尾静脉血，置于1.5ml离心管。同时取鱼肾、脾脏，置于玻璃匀浆器中，加入1ml PBS进行匀浆。将血液和组织匀浆液用无菌水进行10x稀释。将稀释液于100℃煮沸5min。

3)PCR检测

在0.5ml PCR管中，加入下列成分：2ul上述步骤2)高温处理后的血液或组织稀释液，10uM引物F6(5’-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3’)，10uM引物R4(5’-CGTTACGATTATTTGATAG-3’)，1.5μl PCR buffer(200mM Tris-NCl(pH 8.4)，200mM KCl，15mM MgCl₂)，1.5μl 10mM dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，加水至总体积为15ul。

其中引物F6和R4为vhhP2特异性引物，其PCR产物大小为159bp。

按下列条件进行PCR：94℃4min预变性模板DNA，然后94℃40s，50℃60s，72℃40s，25-30个循环后再在72℃延伸反应5min。取10ul PCR产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳后凝胶用溴化乙锭染色观察。结果表明(见附图1)，只有用注射哈氏弧菌的牙鲆血液和组织做模版的PCR扩增出一条159bp的阳性条带，而用注射PBS的牙鲆血液和组织做模版的PCR则无任何条带。

实施例2

养殖虾池中哈氏弧菌的检测

1)水样采集和处理

自两个不同对虾养殖池(命名为A和B)中分别取10ml水体，分别用0.45uM滤膜过滤，去掉过滤后的水体。将滤膜用0.5ml无菌水冲洗，分别收集冲洗后的无菌水水样，即为A和B冲洗液。将A和B冲洗液于100℃煮沸5min。

2)PCR检测

在0.5ml PCR管中，加入下列成分：2μl上述步骤1)高温处理过的A或B冲洗液，10uM引物F6(5’-TGGATGTAAATGAGTTTGG-3’)，10uM引物R4(5’-CGTTACGATTATTTGATAG-3’)，1.5μl PCR buffer(200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，15mM MgCl₂)，1.5μl 10mM dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，加水至总体积为15ul。

PCR条件同实施例1步骤3)。结果表明，只有虾池A的水样扩增出一条159bp的阳性条带，虾池B的水样无任何PCR条带，说明虾池A含有哈氏弧菌，虾池B不含有哈氏弧菌。

3)上述步骤2)PCR结果的分子验证

为了检验上述步骤2)PCR结果的正确性，将100ul上述步骤1)没有经过高温处理的冲洗液A和B涂布于TCBS平板(购于“海博生物技术有限公司”)，28℃培养24-32h后，每个平板挑取20个菌落，于LB液体培养基中过夜培养。在0.5ml PCR管中，加入下列成分：1μl细菌培养液，10uM引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，10uM引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，1.5μl PCR buffer(200mM Tris-HCl(pH 8.4)，200mM KCl，15mM MgCl₂)，1.5μl 10mM dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，加水至总体积为15ul。PCR条件同实施例1步骤3)。

其中8F和1492R为16SrRNA基因特异性引物。

将PCR产物测序，结果表明来自虾池A水样的菌落中有15％为哈氏弧菌，而来自虾池B水样的菌落皆非哈氏弧菌。由此证明上述步骤2)的PCR结果正确。

以上结果表明，本发明的哈氏弧菌检测方法可以快速准确地检测血液、组织以及环境样品中的哈氏弧菌。

序列表.txt

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种哈氏弧菌特异性分子遗传标记及其应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>588

<212>DNA

<213>哈氏弧菌T4

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(588)

<223>

<400>1

atg aag aga agg aat cct caa ggc ctt acc cta cta gaa ctt atc att 48

Met Lys Arg Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Ile

1 5 10 15

gcg ata gtc att ctc ggc atc cta gct gtt gtt gca gct ccc cgt ttt 96

Ala Ile Val Ile Leu Gly Ile Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe

20 25 30

tta aac ctc caa gac gat gcg tat caa gca aaa atg gaa tcc atc gct 144

Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser Ile Ala

35 40 45

gac caa ttc gaa aca ggc gtg cga ttt acc caa agc caa tgg tta gtc 192

Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val

50 55 60

aat ggt gga aca cag gaa gct caa aca gat atc gat gga tat ggt ggt 240

Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp Ile Asp Gly Tyr Gly Gly

65 70 75 80

ggc gaa ctg gat gta aat gag ttt ggc ttt ccg ctt ggc act aac aag 288

Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys

85 90 95

ggc aac aga aat ggc gtg att ggc aac ccg tat aac ata gga caa ggg 336

Gly Asn Arg Asn Gly Val Ile Gly Asn Pro Tyr Asn Ile Gly Gln Gly

100 105 110

aat gct ggt tgt att gcc gtg tgg caa gct tta ctc ggc aac gaa tac 384

Asn Ala Gly Cys Ile Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr

115 120 125

tct cta tca aat aat cgt aac gcg aac gat agg ttt gat ttt att acc 432

Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asn Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe Ile Thr

130 135 140

cga cga gtc caa gac aaa gaa tcc cac caa tct gtt tgt tat tat acc 480

Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr

145 150 155 160

ttt act aaa aaa ggt tac gat cgc aat cct gat aac tct agc ttc gtc 528

Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val

165 170 175

ata tgg tat gac tca aaa aca ggc agc gtc acg aca tca aaa cca act 576

Ile Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr

180 185 190

aga ttg aaa taa 588

Arg Leu Lys

195

<210>2

<211>195

<212>PRT