CN103060440B

CN103060440B - 一种细菌通用pcr检测方法

Info

Publication number: CN103060440B
Application number: CN201210536954.5A
Authority: CN
Inventors: 任常宝; 邵定勇; 陈瑞爱; 黄红亮; 谢小雨; 唐兆新
Original assignee: Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co Ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN103060440A

Abstract

本发明公开一种细菌通用的PCR检测方法，包括样品处理、核酸提取、PCR扩增、PCR产物克隆、测序等步骤，本发明的建立的细菌通用PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性；该方法可用于生产中疑似细菌污染产品及临床病料样本的快速检测，有利于提高生产效率以及疾病的快速准确诊断，本发明克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高，已广泛应用到菌种鉴定，群落对比分析等领域，是一种客观和可信度较高的鉴别方法。结果表明本发明的PCR检测方法具有良好的特异性和较高的敏感性，同时为细菌快速诊断试剂盒研发奠定了基础。

Description

一种细菌通用 PCR 检测方法

技术领域

本发明涉及细菌检测领域，具体涉及一种细菌通用的PCR检测方法，用于所有细菌的检测。

背景技术

疫苗等生物制品的生产需要遵从药品产生质量管理规范，并且在规范的质量检测体系经过严格的检测才能确保疫苗安全性和有效性，以求最大效率地提高接种后的效应作用，最大限度地降低免疫接种后的不良反应。微生物检验是医疗器械、生物药品等生产制造行业产品质量控制的重要内容，其内容主要包括以培养方法检测是否有细菌、支原体等微生物的污染；其中菌检是微生物检测的最基本也是最重要的组成部分，纯菌实验检测诸如减毒活菌苗自身菌体的活菌量、总菌量以及是否有其他杂菌的存在；以及以CHO细胞毒试验、HeLa细胞毒等试验检测细菌毒素的活力等。传统方法对检测场所和检测人员素质要求较高，且培养基的配制、质控标准的把握等繁琐，且需时较长，不利于快速做出判断。

原核生物的r RNA含有3种类型：23S、16S、5SrRNA，它们分别含有2,900、1540和120个核苷酸。16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，其编码基因是16SrDNA；16SrDNA长度适中信息量较大、易分析，且在有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出具有细菌高度特异性的片段，是生物的种属鉴定和系统的重要分子基础。以16SrDNA为目的现代分子生物学技术能精确的揭示微生物种类和遗传的多样性，从而16SrDNA序列分析成了微生物分类鉴定主要依据。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到了广泛的应用。

发明内容

鉴于传统检测方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种细菌通用的PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

一种细菌通用的PCR检测方法，包括以下步骤：

1）样品处理：

无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中，培养，获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35-40℃下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理；

2）核酸提取：

将处理后的样本，用总核酸试剂盒提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；

3）PCR扩增：

设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2加入到PCR反应体系中对细菌DNA模板进行PCR扩增；

4）PCR产物克隆、测序：

PCR产物纯化回收，使用分光光度计检测核酸浓度，回收产物16℃过夜连接PMD-18T克隆载体进行克隆；随机挑选克隆产物中的10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3～6小时，用上述引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本菌液送测序公司进行测序。

步骤1）中恒温培养箱的温度为35-40℃，培养时间为18-24h。

步骤1）中消化处理过程为1ml的细菌中分别加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃、5min终止消化。

步骤3）中所述PCR反应体系为细菌DNA模板1-10μl、10×PCR buffer5-20μl、dNTPs Mixture4-10μl、r Taq0.25μl、ddH2O补足50μl；引物的加入量为16SrDNA F1-μl、16SrDNA R1μl。

步骤3）中所述PCR扩增程序为96℃，预变性2min；96℃，30s； 55℃，30s；72℃，60s；35个循环，72℃，10min，4℃保存；扩增产物用1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。

步骤4）中克隆程序为将连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h；将培养液3000rpm离心3min，弃去400μl培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h。

本发明的有益效果在于：本发明的建立了一种细菌通用PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性；该方法可用于生产中疑似细菌污染产品及临床病料样本的快速检测，有利于提高生产效率以及疾病的快速准确诊断，本发明克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高，已广泛应用到菌种鉴定，群落对比分析等领域，是一种客观和可信度较高的鉴别方法。结果表明本发明的PCR检测方法具有良好的特异性和较高的敏感性，同时为细菌快速诊断试剂盒研发奠定了技术基础。

下面结合附图及具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为敏感性试验电泳图；泳道1：阴性对照，泳道2：细菌稀释度10-8，泳道3：细菌稀释度10-7，泳道4：细菌稀释度10-6，泳道5：细菌稀释度10-5，泳道6：细菌稀释度10-4，泳道7：细菌稀释度10-3；泳道8：细菌稀释度10-2；泳道9：细菌稀释度10-1；泳道10：阳性对照；

图2为特异性试验电泳图；M为DL 2000 MARK；泳道1大肠杆菌；泳道2副猪嗜血杆菌；泳道3绿脓杆菌；泳道4巴氏杆菌；泳道5沙门氏菌；泳道6为阴性对照；

图3为大肠杆菌16S rDNA PCR检测；M为DL 2000 MARK；泳道1大肠杆菌；

图4为未知样品16S rDNA PCR结果；M：DL2000；1,2为检测样本；

图5为未知样品16S rDNA PCR测序结果BLAST；

图6为单菌落照片。

具体实施方式

实施例1：细菌通用 PCR 方法敏感性试验

取大肠杆菌作已知检测，溶解于PBS（pH值7.4）缓冲液中，取500μL处理的菌液按1：10倍连续稀释，之后按上述实验步骤进行DNA抽提、PCR及序列分析，确定该方法敏感性。

1）实验材料

菌株：DH5α菌株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存；

试剂：麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂、Dunham氏蛋白胨水溶液、葡萄糖蛋白胨水溶液、LB均购自广州齐云生物药品有限公司；吲哚（靛基质）试剂、M.R（甲基红）试剂、VP试剂等常规生化试剂购自广州建阳生物；微量生化发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司；Tris-HCl、EDTA、NaAc、乙醇、NaCl、 LiCl等试剂购自鼎国生物药品有限公司；DNA胶回收试剂盒为omega公司产品；常规分子生物学实验试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；

引物：16SrDNA F：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGGA-3’

16SrDNA R：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAG-3’

2）实验方法

细菌分离、纯化以及预处理：取大肠杆菌作已知检测，溶解在PBS（pH值7.4）缓冲液中，取500mL处理的菌液按1：10倍连续稀释；无菌操作从样本中分离细菌, 划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上, 置于37℃恒温培养箱中,培养18-24h,观察单个菌落形态；挑取单菌落接种液体培养基，200rpm、37℃培养24h；收集菌液，液氮或-80℃中，37℃反复冻融三次裂解细菌（超声波破碎亦可），1ml的菌液中分别加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；

细菌核酸提取：将处理后的样本，按常规方法提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；

PCR扩增：反应体系（50μl）：10×PCR buffer与dNTPs Mixture总量为25μl，细菌DNA模板10μl，引物16SrDNA F与16SrDNA R 各1ul（10μM），ddH2O补足50μl反应体系；反应条件：96℃，预变性2min，96℃，30s， 55℃，30s，72℃，60s， 35个循环，72℃，10min。4℃保存，取5μLPCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，并观测结果；

PCR产物克隆测序：对扩增结果为阳性的PCR产物纯化回收，回收试剂盒为TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0.并使用分光光度计测核酸浓度；回收产物连接于PMD^®18-T Vector，连接体系为PMD^®18-T Vector*1 1μl，insert DNA 0.3pmol，SolutionⅠ5μl，ddH2O补足10μl，16℃过夜连接，连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3~5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，将培养液3000rpm离心3min，弃去200μl培养基。剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于AIX LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12~16h；随机挑选10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3～6小时，使用上述引物PCR进行鉴定。电泳观测结果，PCR结果阳性的样本送测序公司进行测序。测序结果通过BLAST与Gen Bank公布的序列进行比对分析；

3）实验结果

电泳结果：用细菌通用PCR方法检测：取大肠杆菌作已知检测，溶解在PBS（pH值7.4）缓冲液中，取1mL处理的菌液按1：10倍连续稀释，敏感性试验表明，细菌通用PCR方法检测大肠杆菌最高稀释度为10-6，如图1示。

测序结果：测序结果为大肠杆菌基因序列，NCBI BLAST结果如图1。

本实施例中，以取大肠杆菌作已知检测，进行了细菌通用PCR方法的敏感性试验，细菌通用PCR方法检测大肠杆菌最高稀释度为10-8。表明该方法具有较高的敏感性。

实施例2、细菌通用PCR方法特异性试验

1）实验材料

毒株、细胞：特异性试验检测细菌（如表1所示）毒株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心研发并保存。

表1

编号	1	2	3	4	5
						菌种	大肠杆菌	副猪嗜血杆菌	绿脓杆菌	巴氏杆菌	沙门氏菌

菌株：大肠杆菌等菌株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存；

试剂：麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂、Dunham氏蛋白胨水溶液、葡萄糖蛋白胨水溶液、LB均购自广州齐云生物药品有限公司；吲哚（靛基质）试剂、M.R（甲基红）试剂、VP试剂等常规生化试剂购自广东环凯生物科技有限公司； Tris-HCl、EDTA、NaAc、乙醇、NaCl、LiCl等试剂购自鼎国生物药品有限公司；DNA胶回收试剂盒为omega公司产品；常规分子生物学实验试剂及试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

引物：16SrDNA F：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGGA-3’

16SrDNA R：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAG-3’；

2）实验方法

细菌分离、纯化以及预处理：无菌操作从各个样本中分离细菌, 划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上, 置于37℃恒温培养箱中,培养18-24h,观察单个菌落形态。挑取单菌落接种液体培养基，200rpm、37℃培养24h；收集菌液，液氮或-80℃中反复冻融三次裂解细菌，1ml的浓缩细菌液中分别加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；

细菌核酸提取：处理好的细胞液，将处理后的样本，按常规方法提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；

PCR扩增：反应体系（50μl）：10×PCR buffer与dNTPs Mixture总量为25μl，细菌DNA模板10μl，引物16SrDNA F与16SrDNA R 各1ul（10μM），ddH2O补足50μl反应体系；反应条件：96℃，预变性2min。96℃，30s； 55℃，30s；72℃，60s； 35个循环。72℃，10min。4℃保存。取5μLPCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，并观测结果；

PCR产物克隆测序：对扩增结果为阳性的PCR产物纯化回收，回收试剂盒为TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0.并使用分光光度计测核酸浓度，回收产物连接于PMD^®18-T Vector，连接体系为PMD^®18-T Vector*1 1μl，insert DNA 0.3pmol,SolutionⅠ5μl,ddH2O补足10μl，16℃过夜连接，连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3~5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，将培养液3000rpm离心3min，弃去200μl培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于AIX LB固体培基。充分吸收后，于37℃倒置培养12~16h；随机挑选10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3～6小时，使用上述引物PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本送测序公司进行测序，测序结果通过BLAST与Gen Bank公布的序列进行比对分析。

3）实验结果

电泳结果：本试验以大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌混合样品为材料进行了细菌通用PCR方法的特异性试验，电泳观察结果显示（图2）PCR检测大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌，均可得到单一的目的条带，检测对照组结果为阴性。测序结果与已知各种细菌序列一致。

该实施例以大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌混合样品为材料进行了细菌通用PCR方法的特异性试验。用该方法对已知样本进行检测，均可得到各自的目的条带，而对照组的检测结果均为阴性。对PCR产物克隆后测序，测序结果显示，各PCR检测到的序列与已知各细菌序列一致，表明该方法具有较好的特异性。

实施例 3 ：未知微生物鉴定

1）材料与方法

样本来源：大肠杆菌DH5a以及将生产中怀疑污染或已经污染的细菌的产品样本由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存。

培养基及试剂：麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂、Dunham氏蛋白胨水溶液、葡萄糖蛋白胨水溶液、LB均购自广州齐云生物药品有限公司；吲哚（靛基质）试剂、M.R（甲基红）试剂、VP试剂等常规生化试剂购自广州建阳生物；微量生化发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司；Tris-HCl、EDTA、NaAc、乙醇、NaCl、LiCl等试剂购自鼎国生物药品有限公司；DNA胶回收试剂盒为omega公司产品；常规分子生物学实验试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；

引物设计：根据NCBI上已有的细菌的16SrDNA的序列分析，设计扩增16SrDNA序列的通用引物：

16SrDNA F：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

16SrDNA R：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

送北京六合华大进行引物合成，扩增1800bp左右的特异性DNA片段；

细菌的培养与细菌DNA抽提：将生产中怀疑污染或已经污染的细菌的产品进行分类培养基划线培养，等到菌落形成后，挑菌于相应的液体培养基，37℃，200转/分；等到细菌OD值达到0.6时，使用细菌DNA抽提试剂抽提细菌的DNA；

PCR扩增及序列测定、分析：依次加入体系中各组分，离心混匀。PCR执行如下程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。4℃保存。取5μlPCR产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。PCR产物纯化后与pMD-18T载体连接送北京六合华大基因公司测序，测序结果通过BLAST与Gen Bank公布的序列进行比对分析，PCR反应体系见表2。

表2：PCR反应体系

Figure 2012105369545100002DEST_PATH_IMAGE004

2）建立方法的检测

敏感性检验：取大肠杆菌作已知检测，溶解在PBS（pH值7.4）缓冲液中，取1mL处理的菌液按1：100倍连续稀释，之后按上述实验步骤进行DNA抽提、PCR及序列分析，确定该方法敏感性。

特异性检验：分别取已知微生物使用上述实验步骤进行DNA抽提、PCR及序列分析，观测结果是否与已知相符。

重复性试验：对同一样品上述实验步骤进行重复测定，批内重复：同批样品置于4℃保存，每隔1周进行检测；批间重复：5批样本不同时间用同一方法进行检测，观察其稳定性。

初步应用：取生产中怀疑或已经污染的细菌的产品样本，使用已建立的方法对样本进行鉴定。

3）结果

16S rDNA基因PCR：提取样本DNA，进行PCR扩增16S r DNA基因用于鉴定。采用PCR方法，以特异性引物分别扩增PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定均符合预期设计的大小，结果见图3，第一孔为DL2000 DNA MAKER，第二孔为扩增得到的1800bp的细菌DNA PCR产物；

序列测定：测序结果与Gen Bank所发布的细菌16 S r DNA序列进行同源性比较分析，结果表明样本与大肠杆菌的16S r DNA同源性高达99%。由此判断，样本为大肠杆菌污染。

微生物学检测：

表3：微生物学检测结果

样本

葡萄糖

乳糖

麦芽糖

甘露醇

蔗糖

硫化氢

尿素

MR

I

VP

c

1

+

-

+

-

试验结果如表1，与序列测定结果相符合。

上述实验结果表明，本发明的检测方法敏感性检验、特异性检验、重复性试验证明该实验方法良好。

应用实施例1

使用已建立的方法对疑似未知微生物污染的产品样本进行鉴定：提取样本DNA，进行PCR扩增16 S rDNA基因用于鉴定；采用PCR方法，以特异性引物分别扩增PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定均符合预期设计的大小，结果见图2。之后进行序列测定，测序结果经NCBIBLAST后，结果见如图5所示。经传统培养对样品进行测定，结果如表4所示，符合建立方法的测定结果。

表4：微生物学检测结果

样本

葡萄糖

乳糖

麦芽糖

甘露醇

蔗糖

硫化氢

尿素

MR

I

VP

c

1

+

-

+

-

+

-

综上所述，通过对疑似细菌污染样品的处理条件、PCR反应条件的摸索建立一种敏感性和重复性好的方法，用于扩增细菌的16SrDNA序列，建立了应用于所有细菌核酸的通用PCR方法。通过克隆，测序，与NCBI中序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而确定样本中可能存在的微生物种类，建立快速、精确的细菌检测诊断方法。可用于快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法。建立的通用PCR方法可用于鉴别诊断产品的外源细菌污染情况，可作为生产、临床中未知细菌污染产品的快速检测。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

〈110〉广东现代农业集团研究院有限公司

〈120〉一种细菌通用的PCR检测方法

〈130〉

〈160〉 2

〈170〉 PatentIn version 3.5

〈210〉 1

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 artificial

〈400〉 1

GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGGA 26

〈210〉 2

〈211〉 24

〈212〉 DNA

〈213〉 artificial

〈400〉 2

CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24

Claims

1.一种细菌通用的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品处理：

无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中培养，恒温培养箱的温度为35-40℃，培养时间为18-24h；获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35-40℃下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理；

2）核酸提取：

3）PCR扩增：

4）PCR产物克隆、测序：

2. 根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤1）中消化处理过程为1ml的细菌中分别加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃、5min终止消化。

3. 根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中所述PCR反应体系为细菌DNA模板1-10μl、10×PCR buffer5-20μl、dNTPs Mixture4-10μl、r Taq0.25μl、ddH2O补足50μl；引物的加入量为16SrDNA F1-μl、16SrDNA R1μl。

4. 根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中PCR扩增程序为96℃，预变性2min；96℃，30s； 55℃，30s；72℃，60s；35个循环，72℃，10min，4℃保存；扩增产物用1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。

5. 根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤4）中克隆程序为将连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h；将培养液3000rpm离心3min，弃去400μl培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h。