CN101475987B - 废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法 - Google Patents

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废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法，①收集废水生物处理反应器中微生物样品进行预处理，利用苯酚-氯仿法提取基因组总DNA；②使用16S rDNAV3区引物对样品DNA进行PCR扩增；③利用变性梯度凝胶电泳分析PCR扩增产物；④得到的DGGE图谱利用软件分析，并根据切胶测序特征DGGE条带，对所代表的微生物进行鉴定；⑤根据条带所代表的微生物种类来设计构建变性梯度凝胶电泳数据库作为快速分子检测的对照标准；所述变性梯度凝胶电泳集合库是根据PCR产物经DGGE分离后的条带通过切胶克隆测序然后在Genbank中同源比对明确其代表的微生物种类来设计构建的；作为快速分子检测方法的对照标准。

Description

废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法
技术领域
本发明涉及到利用PCR-DGGE技术设计构建DGGE Marker对废水生物处理反应器中颗粒污泥、活性污泥、生物膜等样品中微生物群落组成从而进行快速分析检测的技术，属于环境微生物分子生态学领域。
背景技术
废水生物处理技术是目前世界上处理市政废水和有机工业废水的主要方法。为了提高废水处理性能和稳定性，人们对反应器的设计和操作条件进行了大量研究。废水处理过程中主要是依赖以活性污泥(包括颗粒污泥)和生物膜为核心的微生物群落来降解和转化污染物，但由于研究技术和手段的缺乏，人们只能把反应器中的微生物群落看作是一个“黑箱”，把整个废水处理过程当做一个物理化学过程，通过控制和监控生物反应器的物化参数来实现废水的无害化排放。但这些操作条件是否破坏微生物群落的正常结构，是否能够长期稳定地达到废水的高效处理，都是工程师们和微生物学家热衷的问题。因此需对参与废水处理的微生物群落中各个种群的组成、丰度、分布及其在环境中生理生化特性进行整理全面研究，并且以此为基础适当改变反应器设计或者操作条件，以适应废水生物处理中涉及的微生物的生长，才能更好的优化反应器的设计和性能，提高生物处理的效率。
目前自然界中只有极少部分微生物能够被分离和纯化，因此传统的微生物培养和鉴定方法不足以代表微环境中的真实情况。基于16S rDNA的免纯培养技术的分子生物学研究手段，例如末端限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性分析、荧光原位杂交技术等逐步被引入到环境微生物学研究中，已经将环境微生物领域研究带入一个革命性的新时代。变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)技术直接利用DNA及RNA对微生物遗传特性进行表征，不但避免了传统上耗时的菌种分离，更可进而鉴定出无法利用传统方法分离出来的菌种。
传统培养方法和构建克隆文库等微生物群落组成分析方法，效率较低。目前有利用DGGE技术分析城市污水厂污泥和工业废水处理中的微生物群落的专利申请，如同济大学提出的分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法(CN1584051)，上海交通大学发明的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法(CN1995389)，但未涉及如何进一步缩短利用DGGE技术检测时间更加快速检测废水生物处理中微生物群落。
发明内容
本发明的目的是提供一种缩短微生物群落组成的检测周期的检测技术，即微生物群落样品DNA的PCR再经DGGE分离获取条带所代表的微生物种类的信息来设计构建变性梯度凝胶电泳Marker作为对照标准，对废水生物处理反应器中颗粒污泥、活性污泥、生物膜等样品中微生物群落组成从而进行快速分析检测的技术。
本发明技术方案是：
废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法，
①收集废水生物处理反应器中微生物样品进行预处理，利用苯酚-氯仿法提取基因组总DNA；
②设计16S rDNA V3区引物[341F-GC和518R(细菌)；344F-GC和518R(古菌)]对样品DNA进行PCR扩增；
③利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物；
④得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析，并根据切胶测序特征DGGE条带，对所代表的微生物进行鉴定；
⑤根据条带所代表的微生物种类来设计构建变性梯度凝胶电泳集合库DGGEMarker作为快速分子检测的对照标准。所述变性梯度凝胶电泳集合库DGGE Marker是根据PCR产物经DGGE分离后的条带通过切胶克隆测序然后在Genbank中同源比对明确其代表的微生物种类来设计构建的；直接采用已知条带的PCR产物混合或者将已知条带所对应的纯培养物DNA进行PCR扩增产物混合，从而作为快速分子检测方法的对照标准。
根据DGGE分离后的条带经测序并在Genbank中比对，判断其代表的微生物种类来设计构建DGGE Marker作为分子检测的对照标准，从而对废水生物处理反应器中颗粒污泥、活性污泥、生物膜等样品中微生物群落组成进行快速分析。
其中步骤①、②中，收集废水生物处理反应器中微生物样品，提取基因组总DNA；使用16S rDNA V3区引物对所述DNA进行PCR扩增的条件是；所述DNA由细菌和古菌的16S rDNA V3区片段设计正向引物5′连接至GC-夹板进行PCR扩增；所述16S rDNA V3区片段进行PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸1min共30个循环，最后72℃延伸10min；
所述生物样品为废水生物处理反应器中活性污泥；包括厌氧颗粒污泥、好氧颗粒污泥和生物膜样品，且经过冷冻干燥和液氮研磨的预处理，再提取基因组总DNA。
步骤③中，利用DGGE分析所述PCR扩增产物的条件为：制备随变性剂尿素浓度梯度45％-70％，同时增加丙烯酰胺凝胶浓度梯度8％-10％形成双梯度-变性梯度凝胶电泳(DG-DGGE)，电泳电压80V，电泳时间15h，二溴乙锭染色20min，脱色20min；
步骤①中，DNA提取的步骤是：溶菌酶处理和SDS裂解：将50mg研钵加入液氮研磨直至粉末状沉淀悬浮在1.5ml 0.1M Tris-HCl，0.1M Na2EDTA，0.1M NaCl，pH8构成的DNA提取液，并加入10mg/ml的150μL溶菌酶溶液；37℃温浴1h后，向菌液中加入0.5ml 10％SDS溶液，并漩涡振荡摇匀，65℃温浴30min，每间隔几分钟摇匀，待菌液变清后离心10min(12000×g，4℃)，得到DNA上清液并取DNA上清液置于冰上留用；收集两步的DNA上清液；用等体积的苯酚+氯仿+异戊醇(体积比为25∶24∶1)和氯仿+异戊醇(体积比为24∶1)各抽提1次，离心并空气干燥至DNA沉淀干燥后，溶于100μL TE缓冲液中。
DNA分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果。温度、有机溶剂和pH等因素可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。变性梯度凝胶电泳的原理是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，部分发生解链引起发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。在引物的3’端加上40个碱基左右的G-C夹板可使DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异，可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。
本发明的有益效果：本发明为了进一步缩短微生物群落组成的检测周期，根据废水生物处理反应器中颗粒污泥、活性污泥、生物膜等样品总DNA的特异性扩增PCR产物经DGGE分离获取条带所代表的微生物种类的信息来设计构建变性梯度凝胶电泳Marker作为对照标准。当其它样品以相同条件进行DGGE分析时，出现与Marker位置相同的条带则初步认为样品中含有此条带所代表的微生物种类，如果出现与Marker位置不同的条带则可以进行切胶测序，初步判定其种属，从而快速准确地进行废水生物处理中微生物群落组成分析。
①可快速简便的监控微生物群落组成的时间和空间变化。DNA提取大约4h，PCR扩增大约2.5h、凝胶准备1h，电泳15h、染色30min，此项分析仅需24h就可以初步判断样品的微生物群落组成。
②相对简单的可获知微生物样品中优势菌。
③可对废水生物处理过程中微生物种群多样性和动态性变化、以及样品之间群落相似性进行分析。
④适用于多种废水处理过程中微生物样品，包括好氧颗粒污泥、厌氧颗粒污泥、活性污泥、生物膜等样品。
附图说明
图1DNA琼脂糖电泳图谱照片
图2PCR产物琼脂糖电泳图谱
图3PCR产物DGGE电泳图谱
图4DGGE图谱样品种群多样性分析和部分微生物种类示例
具体实施方式
微生物样品收集、预处理和DNA提取
微生物样品收集和预处理无菌瓶收集以上装置厌氧反应器UASB上、中、下层颗粒污泥、缺氧池活性、二级好氧池颗粒污泥五个样品50ml，收集后在-20℃冷冻。三角瓶收集连同填料一起的生物流化床MBBR生物膜样品5克，加入10ml无菌PBS缓冲液，剧烈震荡将生物膜从填料洗脱至生物膜全部洗脱。并用PBS缓冲液清洗两次，收集沉淀。一共六个样品进行冷冻干燥，倒入研钵加入液氮研磨直至粉末状，-20℃保存。
溶菌酶处理和SDS裂解将50mg沉淀悬浮在1.5ml DNA提取液(0.1M Tris-HCl，0.1M Na2EDTA，0.1M NaCl，pH8)，并加入150μL溶菌酶溶液(配制100mg/ml的母液，-20℃保存)，使终浓度为10mg/ml。37℃温浴1h后，向菌液中加入0.5ml 10％SDS溶液(0.1M NaCl，0.5M Tris-HCl，10％SDS，pH 8)，并漩涡振荡摇匀，65℃温浴30min，每间隔几分钟摇匀，待菌液变清后离心10min(12000×g，4℃)，取上清置于冰上留用。
DNA提取和纯化重复以上步骤一次，收集两步的DNA上清液。用等体积的苯酚+氯仿+异戊醇(体积比为25∶24∶1)和氯仿+异戊醇(体积比为24∶1)各抽提1次，氯仿和异戊醇两相应清楚分离，12000×g离心5min收集上清液。以0.6倍体积的异丙醇于4℃沉淀1小时，4℃下10000×g离心20min。用1ml的70％乙醇洗涤沉淀，用枪头吸打均匀，离心10min(10000×g，4℃)。空气干燥至DNA沉淀干燥后，溶于100μL TE缓冲液中，加RnaseA 3μL(10mg/ml)，37℃温浴15～20min消化RNA，样品在-20℃保存备用。
3.总DNA中16S rDNA的PCR扩增；
使用带GC夹板的正向引物341F-GC(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGCGGG GCG GGG GCA CGG GGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和反向引物518R5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′对样品进行细菌16S rDNA V3区片段进行PCR扩增(344F-GC和518R(古菌)]对样品DNA进行PCR扩增)。50μl PCR反应体系为：10xPCRbuffer 5μl，MgCl2(25mM)3μl，dNTP(2.5mM)各4μl，引物(25mM)各1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，模板DNA(稀释十倍)1μl。PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸1min共30个循环，最后72℃延伸10min。见图2。
4.DGGE电泳分析，即利用DGGE分析PCR扩增产物；制备随变性剂尿素浓度梯度45％-70％，同时增加丙烯酰胺凝胶浓度梯度8％-10％形成双梯度-变性梯度凝胶电泳(DG-DGGE)，电泳电压80V，电泳时间15h，二溴乙锭染色20min，脱色20min。见图3PCR产物DGGE电泳图谱。
5.凝胶中DNA回收、切胶测序特征DGGE条带，对所代表的微生物进行鉴定；用洁净刀片将条带切下，放入1.5mlEP管，捣碎，加入10μl无菌水溶解，4℃静止24h，离心取上清液做为DNA模板进行PCR扩增，正向引物去除5′GC夹板。PCR产物纯化后送测序公司。得到DNA序列登录NCBI Genbank利用blastn程序进行同源比对。
6.根据条带所代表的微生物种类来设计构建DGGE Marker作为快速分子检测的对照标准。根据测序已知微生物种类的条带的PCR产物混合，或者将其所对应的纯培养物DNA进行16S rDNA V3区PCR扩增的产物混合构建每条带均已知其所代表的微生物种类的DGGE Marker，从而作为快速分子检测方法的对照标准。样品以相同条件进行DGGE分析时，出现与Marker位置相同的条带则初步认为样品中含有此条带所代表的微生物种类，如果出现与Marker位置不同的条带则可以进行切胶测序，初步判定其种属。图4中DGGE图谱样品种群多样性分析和部分微生物种类示例，其中条带1-布尔开纳博厌氧弧菌Anaerovibrio burkinabensis；条带2-脱硫弧菌Desulfovibrio sp.；条带15-古字状菌属细菌Runella limosa；条带16-丛毛单胞菌Comamonas sp.条带17-土芽孢杆菌属细菌Geobacillus sp.条带18-腐螺旋菌科细菌Saprospiraceae bacterium。

Claims (1)

1.一种废水生物处理反应器中微生物群落组成的快速分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
①收集废水生物处理反应器中微生物样品进行预处理，利用苯酚-氯仿法提取基因组总DNA；
②使用16S rDNAV3区引物341F-GC和518R、344F-GC和518R对样品DNA进行PCR扩增；
③利用变性梯度凝胶电泳即DGGE技术分析PCR扩增产物；
④得到的DGGE图谱利用Quantity one软件分析，并根据切胶测序特征DGGE条带，对所代表的微生物进行鉴定；
⑤根据条带所代表的微生物种类来设计构建变性梯度凝胶电泳数据库DGGEMarker作为快速分子检测的对照标准；所述变性梯度凝胶电泳集合库DGGE Marker是根据PCR产物经变性梯度凝胶电泳DGGE分离后的条带通过切胶克隆测序然后在Genbank中同源比对明确其代表的微生物种类来设计构建的；直接采用已知条带的PCR产物混合或者将已知条带所对应的纯培养物DNA进行PCR扩增产物混合，从而作为快速分子检测方法的对照标准；所述生物样品为废水生物处理反应器中活性污泥；包括厌氧颗粒污泥、好氧颗粒污泥和生物膜样品，且经过冷冻干燥和液氮研磨的预处理，再提取基因组总DNA；上述步骤①、②中，所述DNA由细菌和古菌的16S rDNA V3区片段设计正向引物5′连接至GC-夹板进行PCR扩增；所述16S rDNA V3区片段进行PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30S，65℃退火30S，72℃延伸1min共30个循环，最后72℃延伸10min；利用变性梯度凝胶电泳DGGE分析所述PCR扩增产物的条件为：制备随变性剂尿素浓度梯度45%-70%，同时增加丙烯酰胺凝胶浓度梯度8%-10%形成双梯度-变性梯度凝胶电泳DG-DGGE，电泳电压80V，电泳时间15h，二溴乙锭染色20min，脱色20min；
步骤①中，DNA提取的步骤是：微生物样品经溶菌酶处理和SDS裂解：将50mg研钵加入液氮研磨直至粉末状沉淀悬浮在1.5ml 0.1M Tris-HCl，0.1M Na2EDTA，0.1MNaCl构成的DNA提取液、pH8，并加入10mg/ml的150μL溶菌酶溶液；37℃温浴1h后，向菌液中加入0.5ml 10%SDS溶液，并漩涡振荡摇匀，65℃温浴30min，每间隔几分钟摇匀，待菌液变清后离心10min，得到DNA上清液并取DNA上清液置于冰上留用；重复以上步骤一次，收集所述两步骤得到的DNA上清液；用等体积的苯酚+氯仿+异戊醇、体积比为25:24:1和氯仿+异戊醇、体积比为24:1各抽提1次，离心并空气干燥至DNA沉淀干燥后，溶于100μL TE缓冲液中。
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