CN102094003A - 一种活性炭生物膜dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环境工程活性炭工艺单元中微生物学的研究，是一种能够高质量地提取活性炭样品上附着生物膜中总DNA的提取方法。本发明成功解决因活性炭的吸附性导致被提取DNA的二次吸附所造成的无法提取，或产量小、纯度低等问题。具体如下：一、生物膜的解吸附和初步裂解细胞；二、再次裂解细胞；三、DNA纯化；即完成生物膜总DNA的提取。本发明采用生物膜解吸附溶液，可有效的洗脱附着在活性炭颗粒上的细胞，并成功阻止已释放出的DNA再次吸附。操作简便，成本低；DNA产量大，纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性炭生物膜DNA提取方法。
背景技术
活性炭因其易获得、吸附能力强而在污染物处理处置(水处理，废气处理)过程中受到极大重视。活性炭上附着的以微生物及其胞外多聚物为主体的生物膜是一些有害物质生物降解的主体部分。研究活性炭生物膜的微生物群落组成已成为深入了解环境工程中生物处理工艺内在生物学机制的关键。
由于现有技术对绝大多数的环境微生物都无法成功进行室内培养，或者不能反映微生物在工艺过程中的实际功能。因此，分子生物学技术就成为原位研究活性炭生物膜的微生物群落的主要手段。然而，活性炭发达的多孔结构和强吸附能力导致微生物细胞难以从其表面和孔道内洗脱，而且释放出的DNA会被活性炭再次吸附等原因，使得活性炭生物膜的DNA提取困难，产量小，质量低，从而直接抑制下游实验工作如PCR实验，酶切实验，DNA指纹分析(如：DGGE，TGGE和SSCP)等的顺利进行。而且，实际工程中的活性炭颗粒吸附的大量污染物和微生物代谢的有机物，也为DNA的纯化和下游技术造成困难。传统的DNA提取以及目前的市售DNA提取试剂盒产品都不能够理想地解决该问题。因此，如何成功的从活性炭生物膜获得高质量的基因组DNA成为制约深入探讨活性炭工艺中生物学机制的制约因素而亟待解决。
发明内容
本发明的目的是在于解决现有技术的缺陷，提供一种可以成功提取活性炭生物膜DNA的实验方法和试剂配方。以获得纯度和产量均达到适用于下游分子生物学操作的DNA。
本发明提取活性炭生物膜的具体方法如以下步骤：
一、生物膜的解吸附和初步裂解细胞
将活性炭样品盛于无菌离心管中，加入生物膜解吸附溶液。使用超声破碎探头，以200W功率，振荡3秒，停止10秒，进行40个循环。然后放入液氮中冷冻3min，充分冷冻后置于37℃水浴中融解3min。
二、再次裂解细胞
吸取上述粗提液，至新离心管中。加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K以及质量浓度为20％的十二烷基磺酸钠，于55℃水浴1h，期间来回颠倒离心管10-20次。
三、DNA纯化
之后向离心管中加入十六烷基三甲基溴化铵盐溶液，以及浓度为5M的NaCl溶液，65℃水浴10min；室温条件下10000rpm离心10min。之后可吸取清液至新的无菌离心管中，使用酚/氯仿/异戊醇方法或硅胶纯化柱等常用方法进行进一步纯化，即可获得高质量的基因组DNA。
本发明活性炭生物膜DNA提取的原理和优点：1.使用碱性的生物膜解吸附溶液配合超声振荡，可以高效的对附着在活性炭上的微生物细胞进行解吸附，其中浓度大于0.1g/ml的脱脂牛奶可以与核酸分子竞争性吸附，可有效防止释放后的DNA分子的重新吸附；2.采用冻融法这一物理裂解配合十二烷基磺酸钠+蛋白酶K法进行快速的细胞裂解和蛋白质杂质去除；3.采用十六烷基三甲基溴化铵盐溶液在高盐浓度环境下去除有机杂质如多糖，腐植酸等；4.综上所述，本发明克服传统DNA提取方法无法成功提取活性炭生物膜DNA模板，克服了碱洗脱生物膜方法对基因组DNA的严重剪切，获得高质量的DNA，不会对下游实验操作造成影响。
附图说明
图1为具体实施例三中5种方法所提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱，图2为具体实施例四中以6种样品中提取DNA作为模板，进行的16SrDNA的PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面通过具体实施来做进一步说明。
生物膜解吸附溶液的配置：称取蔗糖(分子量342.29)，Tris-Hcl(分子量121.14)，NaCl(分子量58.44)，EDTA(分子量372.24)，无菌脱脂牛奶粉于适量无菌蒸馏水中，使用NaOH调节pH值至≥9.0，121℃湿热灭菌。十六烷基三甲基溴化铵盐溶液的配置：称取NaCl(分子量58.44)溶于适量体积的无菌蒸馏水中，缓慢加入十六烷基三甲基溴化铵(分子量364.10)，加热至50-65℃并搅拌溶解。
实施例一：比较提取附着生物量不同的活性炭样品
样品来源为浙江省平湖市古横桥自来水厂活性炭滤池，滤池活性炭总深度1m，从滤池表层起至底层，共采集6层样品，分别是0cm，-10cm，-20cm，-40cm，-60cm和-80cm，其上所附着生物膜的生物量由上至下逐层递减。比较本发明方法对不同深度活性炭样品的DNA提取效果，具体实施过程如下：
(1)采集5g活性炭样品盛于50ml无菌离心管中，加入5ml生物膜解吸附溶液。使用超声破碎探头，以200W功率，振荡3秒，停止10秒，进行40个循环。然后放入液氮中冷冻3min，充分冷冻后置于37℃水浴中融解3min。
(2)吸取上述粗提液1ml至2ml无菌离心管中。加入6μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K以及34μl质量浓度为20％的十二烷基磺酸钠，于55℃水浴1h，期间来回颠倒离心管10-20次。
(3)之后向离心管中加入140μl的十六烷基三甲基溴化铵盐溶液，以及170μl浓度为5M的NaCl溶液，65℃水浴10min；室温条件下10000rpm离心10min。吸取800μl上清液至新的无菌离心管中，加入800μl体积比为25∶24∶1的酚-氯仿-异戊醇，均匀混合后，在4℃条件下12000rpm离心5min；取上层水相部分加入800μl体积比为24∶1的氯仿-异戊醇，均匀混合后，在4℃条件下12000rpm离心5min。取上层水相部分加入70％体积的异丙醇，在-80℃条件下静置1h，在4℃条件下12000rpm离心20min，弃上清。使用体积浓度为75％的冷乙醇溶液润洗沉淀物2次后，充分干燥后加入40-60μl的TE缓冲液溶解沉淀DNA。
每层样品做3个重复，使用超微量紫外分光光度计ND-1000(V3.5.2)，检测DNA浓度以及纯度并取平均值(表一)。结果显示，由于不同深度活性炭上所附着的生物膜的生物量从表层向下逐层递减，因此通过本发明所述方法获得的DNA总量也呈现相同规律，而DNA纯度的结果显示本发明所述方法对不同生物量的样品均可达到较高的提取纯度。
表一：水厂活性炭滤池不同水层样品DNA提取总量以及纯度
实施例二：不同反应器活性炭生物膜DNA提取
与实施例一不同处在于，所使用的活性炭样品来源于本实验室自制活性炭生物滤池反应器，两个活性炭生物滤池样品，每组样品重复三次。获得DNA产量及质量如表二所示。因此，说明本发明所述方法在处理不同来源的活性炭样品也可以获得相同的DNA产量和质量。
表二：自制反应器中两组活性炭滤池中DNA的提取总量与纯度
实施例三：提取相同样品与传统方法、试剂盒方法，以及与碱液洗脱方法的比较
样品来源为浙江省平湖市古横桥自来水厂活性炭滤池，使用的样品是滤池-10cm层的活性炭，具体实施如下：
A.采用OMEGA公司生产柱式总土壤DNA提取试剂盒(批号D5625-01)，提取5g活性炭样品，具体操作按试剂盒说明书进行；B.使用传统细菌基因组提取方法，提取5g活性炭样品，具体操作按《精编分子生物学实验指南》(科学出版社，第四版，第55页)中“细菌基因组DNA的小量制备”所述实验步骤进行；C.使用pH值为9.0的碱液使用超声破碎探头以200W功率，振荡3秒，停止10秒，进行40个循环，洗涤5g活性炭样品，洗脱物使用OMEGA公司生产柱式总土壤DNA提取试剂盒(批号D5625-01)提取DNA，具体操作按试剂盒说明书进行；D.使用pH值为9.0的碱液使用超声破碎探头以200W功率，振荡3秒，停止10秒，进行40个循环，洗涤5g活性炭样品，洗脱物使用传统细菌基因组提取方法提取DNA，具体操作按《精编分子生物学实验指南》(科学出版社，第四版，第55页)中“细菌基因组DNA的小量制备”所述实验步骤进行；E.采用本发明具体实施例一所述方法提取5g活性炭样品。上述五种提取方法的产物进行电泳检验，结果如图一所示，除方法E以外的其他四种方法均不能获得清晰明显的基因组DNA电泳条带。说明本发明所述方法能够克服传统以及试剂盒DNA提取方法无法提取活性炭生物膜样品的缺憾。
实施例四：PCR实验验证所提取DNA可成功用于下游实验
使用实施例一中所提取的6组DNA样品，进行PCR实验。PCR试剂盒使用TaKaRarTaq PCR试剂盒(DR001A)，以细菌16S RNA编码基因为目标片段，使用细菌16SrDNA通用引物对27F：5’-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3’、1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’为扩增引物，每20μl体系中加入DNA模板50ng，每条引物50pmol，0.75个单位的Taq酶；使用Eppendorf-5333PCR仪，扩增循环为：95℃50秒，52℃45秒，72℃45秒，进行25个循环。产物使用1％琼脂糖凝胶电泳法检测，结果如图二所示。使用本发明所述方法所提取的6种不同生物量的样品DNA作为PCR模板，均能成功扩增出目标片段。说明使用本发明所述方法提取的活性炭生物膜样品DNA可成功作为下游实验的模板使用。
Claims (3)
1.一种活性炭生物膜DNA提取方法，该方法包括生物膜的解吸附和初步裂解细胞步骤，再次裂解细胞步骤，以及DNA纯化步骤，其特征在于：生物膜的解吸附和初步裂解细胞步骤中，采用含有无菌脱脂牛奶粉的生物膜解吸附溶液。
2.根据权利要求1所述的生物膜解吸附溶液，其特征在于溶液的pH值大于9.0。
3.根据权利要求1所述的一种活性炭生物膜DNA提取方法，其特征在于生物膜解吸附溶液主要成分包含Tris-Hcl，EDTA，NaCl，蔗糖以及无菌脱脂牛奶粉，其质量浓度不小于0.1g/ml。
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