CN113817721A - 从多孔吸附材料中提取微生物dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法,该试剂盒包括解吸液、裂解液、不同直径的混合珠体、蛋白质沉淀液、DNA吸附混合物、过滤套装、洗涤液和洗脱液。试剂盒中的解吸液使用了焦磷酸钠溶液,其以与微生物细胞或核酸竞争吸附位点,从而使细胞或核酸从吸附材料上解吸出来;蛋白质沉淀液中使用了尿素和醋酸缓冲液,通过变性和酸沉淀,使蛋白质从溶液中沉淀而去除;溶液中的DNA通过DNA吸附混合物进行吸附,之后经历洗涤去杂,洗脱分离,得到的DNA。本发明提供的提取方法简单、经济,可以从多孔吸附材料中提取高质量的微生物DNA,满足现代微生物分子生物学技术操作的需要。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
DNA提取是微生物分子生物学研究的基础,迅速高效的提取DNA是PCR扩增、测序等工作的前提。微生物种类繁多,在自然界中广泛存在,不同特性的微生物,存在于不同生境中,包括土壤、水体、动植物及各类多孔固体物质等。微生物的重要生活特征之一是吸附在固体表面或内部生长繁殖,为了研究其功能和进一步的开发应用,其DNA的提取是最关键的环节。
多孔吸附材料在自然界中广泛存在,同时许多学者合成了许多多孔吸附材料,用于生活或工业废水中污染物的微生物降解研究或高效处理。由于微生物的吸附特点和多孔吸附材料的吸附特征,在对多孔吸附材料表面或内部微生物DNA提取的过程中,吸附问题是一个公认的难题,导致无法迅速高效的提取其微生物DNA,大大限制了相关技术的研究或应用。
发明内容
本发明提供一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法,可以简单、经济、高效的从多孔吸附材料中提取高质量的微生物DNA,满足现代微生物分子生物学技术操作的需要。
本发明的技术方案是,一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒,试剂盒中包括以下成分:
1)解吸液:焦磷酸钠溶液;
2)裂解液:Tris-HCl,EDTA,GuHCl和Triton X-100;
3)直径在0.1-3mm的不同直径的氧化锆珠;
4)蛋白质沉淀液:尿素和醋酸缓冲液;
5)DNA吸附混合物:SiO2-HCl和醋酸缓冲液;
6)过滤套装:过滤柱和离心管;
7)洗涤液和洗脱液;其中洗涤液包括无水乙醇、NaCl、Tris和EDTA,洗脱液为Tris-HCl和EDTA。
进一步地,所述解吸液焦磷酸钠溶液为100-800μmol,pH为9.0-10.5。
进一步地,所述裂解液中Tris-HCl为20-50mM、EDTA 20-50mM、GuHCl 600-1000mM和Triton X-100质量浓度为0.2%-2%,pH为9.0-10.5;
进一步地,所述3)中球体为直径分别为0.1mm、0.5mm、1mm、2mm和3mm中的一种或几种组合。
进一步地,蛋白质沉淀液pH为4.0-5.0,其中尿素为3-8M。
进一步地,DNA吸附混合物中SiO2-HCl是用HCl处理过的SiO2,其状态为混悬液;混悬液的质量分数为20%-30%,混合物的pH为3.0-5.0。
进一步地,洗涤液中含乙醇质量分数为30%-80%、NaCl 80-150mM、Tris 8-15mM和EDTA 0.8-1.5mM;洗脱液中包含Tris-HCl 8-15mM和EDTA 0.8-1.5Mm,pH为8.0。
本发明还涉及采用所述试剂盒从多孔吸附材料中提取微生物DNA的方法,具体步骤为:
S1、将不同直径的球体混合,置于离心管内,加入待提取的多孔吸附材料,再加入解吸液,旋涡震荡处理后离心,弃上清液;
S2、向S1中加入裂解液,旋涡震荡后离心,取上清液备用;
S3、向S2所得上清液中加入蛋白质沉淀液,旋涡震荡处理后离心,收集上清液备用;
S4、向S3所得上清液中加入DNA吸附混合物,旋涡震荡后静置,丢弃上层上清液,剩下的溶液混匀后加入过滤柱中并离心,丢弃过滤液;
S5、取洗涤液加入到过滤柱中混匀,离心后丢弃过滤液,再离心去洗涤液残留,最后将过滤柱静置后加入洗脱液混匀,离心,所得清液为DNA样品。
进一步地,所述多孔吸附材料为bio-beads、活性炭颗粒、活性炭复合材料、硅藻土中的一种或几种形成的复合材料。
进一步地,所述旋涡震荡的时间为1~10min;离心时间为1~10min,离心转速为10000~14000rpm。
本发明具有以下有益效果:
本发明采用焦磷酸钠溶液为解吸液,与微生物细胞或核酸竞争吸附位点,从而使细胞或核酸从吸附材料上解吸出来。并通过焦磷酸钠和球体震荡的联合作用解吸吸附的细胞,不同直径的氧化锆珠对细胞的作用不同,大直径的主要作用是辅助解吸细胞,小直径的主要作用是破碎细胞。另外,多余焦磷酸通过离心及后期S4中的吸附去除。
裂解液中,Tris-HCl为缓冲液,维持pH的稳定;EDTA为二价金属离子的螯合剂,GuHCl为离液剂,通过破坏生物大分子结构中的氢键、盐桥、疏水作用等非共价键达到增溶效果;Triton X-100为非离子型表面活性剂,结合蛋白。蛋白质沉淀液中使用了尿素和醋酸缓冲液,通过变性和酸沉淀,使蛋白质从溶液中沉淀而去除。溶液中的DNA通过DNA吸附混合物而吸附,之后经历洗涤去杂,洗脱而分离出来。
本发明提供的试剂盒操作简单,提取量高,成本低,无有毒化学试剂。
附图说明
图1实施例5中的bio-beads样品,左侧为吸附之前照片,右侧为吸附之后照片。
图2不同试剂盒提取的bio-beads样品中微生物DNA的琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂)对比结果。对比1-3为经典国外进口试剂盒,对比4-5为国内常用试剂盒,M为DL2000。
图3本试剂盒提取的bio-beads样品中微生物DNA的PCR结果(25个循环),M为DL2000,CK为空白对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
实施例1:
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒,适合于bio-beads或活性炭复合材料等样品,试剂盒中包括以下成分:
1)解吸液:焦磷酸钠溶液,300μmol,pH为9.0;
2)裂解液:Tris-HCl 25mM、EDTA 25mM、GuHCl800mM和Triton X-100 1%,pH为9.0;
3)直径分别为0.1mm,0.6g;1mm,1.0g;3mm,0.2g的氧化锆珠;
4)蛋白质沉淀液:尿素5M,加醋酸缓冲液调整至pH为4.8;
5)DNA吸附混合物:SiO2-HCl 25%,加醋酸缓冲液调整至pH为4.0;
6)过滤套装:过滤柱和离心管;
7)洗涤液和洗脱液;其中洗涤液为乙醇50%、NaCl 125mM、Tris 10mM和EDTA 1mM,洗脱液为Tris-HCl 10mM和EDTA 1mM,pH为8.0。
实施例2:
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒,适用于颗粒活性炭等样品,试剂盒中包括以下成分:
1)解吸液:焦磷酸钠溶液,400μmol,pH为10;
2)裂解液:Tris-HCl 30mM、EDTA 30mM、GuHCl800mM和Triton X-100 1%,pH为10;
3)直径分别为0.1mm,0.5g;2mm,1.0g;3mm,0.2g的氧化锆珠;
4)蛋白质沉淀液:尿素5M,醋酸缓冲液调整至沉淀液pH为4.8;
5)DNA吸附混合物:SiO2-HCl 20%,醋酸缓冲液调整至pH为4.0;
6)过滤套装:过滤柱和离心管;
7)洗涤液和洗脱液;其中洗涤液为乙醇50%、NaCl 125mM、Tris 10mM和EDTA 1mM,洗脱液为Tris-HCl 10mM和EDTA 1mM,pH为8.0。
实施例3:
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒,适合于硅藻土或有机质少的土壤等样品,试剂盒中包括以下成分:
1)解吸液:焦磷酸钠溶液,800μmol,pH为10;
2)裂解液:Tris-HCl 30mM、EDTA 30mM、GuHCl900mM和Triton X-100 0.5%,pH为10;
3)直径分别为0.1mm,0.8g;0.5mm,0.5g,2mm,0.2g的氧化锆球体;
4)蛋白质沉淀液:尿素5M,加醋酸缓冲液调整至pH为4.8;
5)DNA吸附混合物:SiO2-HCl 30%,加醋酸缓冲液调整至pH为4.0;
6)过滤套装:过滤柱和离心管;
7)洗涤液和洗脱液;其中洗涤液为乙醇80%、NaCl 100mM、Tris 8mM和EDTA0.8mM,洗脱液为Tris-HCl 15mM和EDTA 1.5mM,pH为8.0。
实施例4:
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒,适合于有机质多的土壤等样品,试剂盒中包括以下成分:
1)解吸液:焦磷酸钠溶液,100μmol,pH为9.5;
2)裂解液:Tris-HCl 30mM、EDTA 30mM、GuHCl600mM和Triton X-100 1.5%,pH为9.5;
3)直径分别为0.1mm,0.8g;0.5mm,0.5g;2mm,0.2g的氧化锆珠;
4)蛋白质沉淀液:尿素7M、加醋酸缓冲液调整至pH为4.0;
5)DNA吸附混合物:SiO2-HCl20%,加醋酸缓冲液调整至pH为4.5;
6)过滤套装:过滤柱和离心管;
7)洗涤液和洗脱液;其中洗涤液为乙醇30%、NaCl 80mM、Tris 15mM和EDTA1.2mM,洗脱液为Tris-HCl 8mM和EDTA 0.8mM,pH为8.0。
实施例5:
采用上述试剂盒,从多孔吸附材料中提取微生物DNA的应用。
除了试剂盒外,还需要用到的主要仪器设备为涡旋震荡仪和离心机。
待处理样品:
(1)样品类型:bio-beads
(2)样品特点:多孔吸附材料,呈球形,内部为多孔结构,主要化学成分是活性炭,来自污水处理厂,用于污水高级生物处理或微生物生态学研究,如图1所示。
具体的提取方法为:
(1)将三种不同直径的氧化锆珠(0.1mm,0.6g;1mm,1.0g;3mm,0.2g),放入2mL离心管中;
(2)取0.5gbio-beads,加入上述离心管中,然后加入850μL解吸液,将离心管放到旋涡振荡器上,中速震荡10min,然后离心(12000rpm、10min),弃上清;
(3)在上述离心管中加入800μL裂解液;
(4)将上述离心管放到旋涡振荡器上,以最大的速率震荡5min,然后离心(12000rpm、10min),吸取上清液到新的2mL离心管中;
(5)取250μL蛋白质沉淀液,加入到上述离心管中,旋涡震荡2min,然后离心(12000rpm、5min),转移上清液到10mL的离心管中;
(6)取DNA吸附混合物1mL,加入到上述离心管中,旋涡震荡2min,然后静置3min;
(7)小心吸取上述离心管中的最上层的上清液500μL并丢弃,然后将剩下的溶液混匀后,取700μL到过滤柱(过滤套装)中并离心(12000rpm、2min),丢弃过滤液。再重复上述过滤操作,直至混合液全部过滤完;
(8)取500μL洗涤液,加入到上述过滤柱中混匀,离心(12000rpm、1min),丢弃过滤液,再离心(12000rpm、2min),然后将过滤柱放入新的2mL离心管中,室温静置5min;
(9)取100μL洗脱液,加入到过滤柱中混匀,离心(12000rpm、1min),获得DNA样品,-20℃下保存。
得到的DNA样品的琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂)对比结果如图2所示。用超微量分光光度计测定DNA样品的浓度和纯度见表1(各试剂盒抽取的DNA总体积均为100μL),其中对比1-3为经典国外进口试剂盒,具体1.Spin Kit for Soil(MP Bio);2.DNeasyPowerBiofilm Kit(QIAGEN);3.PowerSoil DNA Isolation Kit(MOBIO)。对比4-5为国内常用试剂盒,具体4.SoilPure土壤基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱);5.Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒(上海生工)。M为DL2000。
结论:与其他试剂盒相比,本试剂盒抽取的DNA样品的质量较高,浓度明显高于对比的所有试剂盒,纯度满足PCR的要求。
表1各试剂盒抽取的DNA样品质量情况
试剂盒 | 浓度(ng/μL) | 纯度(260/280) |
本试剂盒 | 356ng/μL | 1.85 |
对比1 | 172ng/μL | 1.90 |
对比2 | 51ng/μL | 1.80 |
对比3 | 227ng/μL | 1.78 |
对比4 | 83ng/μL | 1.68 |
对比5 | 68ng/μL | 1.82 |
本试剂盒提取的bio-beads样品中微生物DNA的PCR结果(25个循环)如图3所示,其中M为DL2000,CK为空白对照。
采用本发明提供的试剂盒抽取的DNA样品,不需要纯化,可直接用于PCR扩增。
Claims (10)
1.一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒,其特征在于,试剂盒中包括以下成分:
1)解吸液:焦磷酸钠溶液;
2)裂解液:Tris-HCl,EDTA,GuHCl和Triton X-100;
3)直径在0.1-3mm的不同直径的氧化锆珠;
4)蛋白质沉淀液:尿素和醋酸缓冲液;
5)DNA吸附混合物:SiO2-HCl和醋酸缓冲液;
6)过滤套装:过滤柱和离心管;
7)洗涤液和洗脱液;其中洗涤液包括无水乙醇、NaCl、Tris和EDTA,洗脱液为Tris-HCl和EDTA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述解吸液焦磷酸钠溶液为100-800μmol, pH为9.0-10.5。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述裂解液中Tris-HCl为20-50mM、EDTA20-50mM、GuHCl 600-1000mM和Triton X-100质量浓度为 0.2%-2%,pH为9.0-10.5。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述3)中球体为直径分别为0.1mm、0.5mm、1mm、2mm和3mm中的一种或几种组合。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:蛋白质沉淀液pH为4.0-5.0,其中尿素为3-8M。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:DNA吸附混合物中SiO2-HCl是用HCl处理过的SiO2,其状态为混悬液;混悬液的质量分数为20%-30%,混合物的pH为3.0-5.0。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:洗涤液中含乙醇质量分数为30%-80%、NaCl 80-150mM、Tris 8-15mM和EDTA 0.8-1.5mM;洗脱液中包含Tris-HCl 8-15mM和EDTA0.8-1.5Mm,pH为8.0。
8.采用权利要求1~7任意一项所述试剂盒从多孔吸附材料中提取微生物DNA的方法,其特征在于,具体步骤为:
S1、将不同直径的球体混合,置于离心管内,加入待提取的多孔吸附材料,再加入解吸液,旋涡震荡处理后离心,弃上清液;
S2、向S1中加入裂解液,旋涡震荡后离心,取上清液备用;
S3、向S2所得上清液中加入蛋白质沉淀液,旋涡震荡处理后离心,收集上清液备用;
S4、向S3所得上清液中加入DNA吸附混合物,旋涡震荡后静置,丢弃上层上清液,剩下的溶液混匀后加入过滤柱中并将过滤柱直接进行离心,丢弃过滤液;
S5、取洗涤液加入到过滤柱中混匀,离心后丢弃过滤液,再离心去洗涤液残留,最后将过滤柱静置后加入洗脱液混匀,离心,所得清液为DNA样品。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述多孔吸附材料为bio-beads、活性炭颗粒、活性炭复合材料、硅藻土中的一种或几种形成的复合材料。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述旋涡震荡的时间为1~10min;离心时间为1~10min,离心转速为10000~14000rpm。
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