CN115851704A - 一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供的提取外泌体microRNA的方法包括使用含有异硫氰酸胍和多种去垢剂的裂解液来裂解外泌体，促进microRNA与结合蛋白的解离，释放microRNA，随后利用DNA纯化柱清除裂解液中的蛋白质和DNA，并使用羟基修饰的磁珠来吸附microRNA，洗脱液洗脱后可以获得去除DNA和蛋白质的高纯度microRNA，能够用于测序、建库及RT‑QPCR等多种生物学实验。

Description

一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效提取外泌体microRNA的方法及试剂盒，尤其涉及一种高效提取高纯度外泌体microRNA的方法及试剂盒。

背景技术

外泌体是细胞分泌的一系列直径为30-150nm的小囊泡，富含蛋白质、DNA、mRNA以及microRNA等生物分子，广泛分布于血液、乳液、唾液、尿液等体液中，并随着体液的流动而运动，是细胞间物质转运和信号转导的重要载体。正常细胞与病变细胞(例如肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病等引起)分泌的外泌体在成分组成上存在很大差异，尤其是microRNA，其水平变化与肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病的发生与发展密切相关，因此针对外泌体中microRNA的提取和检测对这些疾病的诊断、治疗和预后评估均具有重要意义。另外，microRNA也称微小核糖核酸，是由19-25个碱基组成的非编码单链RNA，其作为外泌体的重要成分，可以通过调控基因的表达来发挥重要的生物学功能，在肿瘤等疾病的发展过程中具有重要调控作用，因此针对外泌体中microRNA的提取对于其调控基因的表达机理研究等也具有重要的意义。

目前市场上常采用提取RNA的方法来提取microRNA，其主要是通过TRIzol溶液裂解细胞/组织，再通过氯仿对溶液进行分层去除蛋白质和DNA，并使RNA分布在上层的有机相中，在该有机相中添加异丙醇，离心后可以沉淀RNA，完成RNA的提取。但对于此种方法，当样品量较少，或样品中的RNA含量较少时，离心后的RNA沉淀会很少，几乎观察不到，无法有效提取RNA，因此该方法并不适用于提取作为微量样品、且其中microRNA含量很低的外泌体中的microRNA。为了促进RNA的沉淀，常用糖原或tRNA作为助沉剂(例如专利文献CN106318931A)，然而效果并不明显，且会导致提取的RNA纯度下降，不利于后续的测序、建库等分子生物学实验。市售的TRIzol^TM plus纯化试剂盒将TRIzol试剂与RNA纯化柱结合，其利用RNA纯化柱作为载体，来吸附微量的RNA，但对microRNA的提取效果不理想，主要原因是microRNA常与蛋白结合，不能够有效结合RNA纯化柱，进而不利于microRNA的提取。

为了促进microRNA的提取，专利文献CN111004798A(以下称文献1)公开一种高效提取microRNA的方法，其通过胍盐裂解样品，并利用金属阳离子和水混溶性醇同时沉淀蛋白和长链核酸，随后用硅基质膜吸附柱吸附microRNA，同时利用低浓度胍盐和高浓度乙醇洗去杂质，可以大幅度提高microRNA的提取效率，然而在该文献1提供的microRNA分离步骤中，大量异丙醇的添加会导致纯化系统体积明显增大，使用RNA纯化柱(每次过柱液体的体积较小，一般为0.5-0.7ml)提取时，需要多次过柱，才能完成样品中microRNA的吸附，效率较低且操作繁琐，并且完成microRNA的吸附后，需要进行多次漂洗，会导致microRNA的流失。此外，使用裂解液裂解样品后，DNA也会随着microRNA一起释放到样品溶液中，添加异丙醇或无水乙醇后，都会吸附到RNA纯化柱上，并随着microRNA一起洗脱下来，因此会导致microRNA纯度降低。虽然在专利文献CN108949747A(以下称文献2)提供的方法中可使用DNase I降解DNA，但该方法的过程较为繁琐，会显著降低实验的可操作性。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种高效提取外泌体microRNA的方法，其包括以下步骤：

S1)使用裂解液裂解外泌体，得到第一混合液；

S2)将步骤S1)所得第一混合液转移至DNA纯化柱内，离心，得到滤液；

S3)向步骤S2)所得滤液中加入醇类，混匀，得到第二混合液；

S4)向步骤S3)所得第二混合液中加入表面修饰有羟基的磁珠，并孵育，得到吸附有microRNA的磁珠，富集所述吸附有microRNA的磁珠，得到第一磁珠；

S5)向步骤S4)所得第一磁珠中加入去蛋白液，洗涤第一磁珠，得到第二磁珠；

S6)向步骤S5)所得第二磁珠中加入洗涤液，洗涤第二磁珠，得到第三磁珠；和

S7)向步骤S6)所得第三磁珠中加入洗脱液，洗脱得到外泌体的microRNA。

在一些实施方式中，步骤S1)中所述外泌体来源于细胞培养上清、血清、血浆或其他生物样品。

在一些实施方式中，步骤S1)中所述裂解液包含2-5M，优选3-4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种。

在一些实施方式中，步骤S1)中所述裂解液与外泌体样品的混合体积比为(2-4)：1。

在一些实施方式中，步骤S3)中所述醇类选自异丙醇、乙醇中的一种或多种。

在一些实施方式中，步骤S3)中所述醇类的加入量为使其终浓度为50％以上。

在一些实施方式中，步骤S4)中所述孵育的条件为：2-8℃条件下旋转孵育30min以上。

在一些实施方式中，步骤S4)中富集所述吸附有microRNA的磁珠的操作包括：将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于磁力架上，使磁珠聚集，或将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于离心机中离心，使磁珠沉淀。

在一些实施方式中，步骤S5)中所述去蛋白液包含1-3M，优选1.5-2M的异硫氰酸胍和70％乙醇。

在一些实施方式中，步骤S6)中所述洗涤液包含10-30mM Tris-Hcl，pH范围是6.5-8.0。

在一些实施方式中，步骤S7)中所述洗脱液包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH范围是7.5-8.0。

本发明另一方面提供一种高效提取外泌体microRNA的试剂盒，其包括：

(1)裂解液，其包含2-5M，优选3-4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种；

(2)DNA纯化柱；

(3)表面修饰有羟基的磁珠；

(4)去蛋白液，其包含1-3M，优选1.5-2M的异硫氰酸胍和70％乙醇；

(5)洗涤液，其包含10-30mM Tris-Hcl，pH＝6.5-8.0，优选为pH＝7.0；和

(6)洗脱液，其包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH＝7.5-8.0。

基于以上技术方案，提供的提取外泌体microRNA的方法包括使用含有异硫氰酸胍和多种去垢剂的裂解液来裂解外泌体，并促进microRNA与结合蛋白的解离，释放出microRNA，随后利用DNA纯化柱清除裂解液中的蛋白质和DNA等杂质，并使用羟基修饰的磁珠来吸附microRNA，然后经去蛋白液进一步去除其中残留的杂蛋白，以及最后使用洗脱液将microRNA从磁珠上洗脱下来，以上这些操作共同作用可以使得最终提取的外泌体microRNA中基本上没有DNA和蛋白质的污染，得到一种高纯度外泌体microRNA，有利于测序、建库及RT-QPCR等生物学实验。

相对于现有技术，本发明方法具有以下多个方面的有益效果：

(1)本发明方法在提取microRNA过程中，在向裂解液中添加醇类(异丙醇和/或乙醇)之前，使用DNA纯化柱来清除DNA与蛋白质，有利于提高microRNA的纯度。外泌体中含有蛋白质、DNA、mRNA和microRNA等多种生物大分子，裂解后都会释放到裂解液中，在没有加入醇类的情况下，裂解液中的异硫氰酸胍能够促进DNA吸附到DNA纯化柱上，达到清除DNA的目的。但是，在不添加醇类的情况下，DNA纯化柱不会吸附microRNA，因此，DNA纯化柱的使用，只是清除DNA，不影响microRNA的提取。此外，DNA纯化柱也可以吸附裂解液中的部分蛋白质，从而清除裂解液中的蛋白质，进而有利于提高microRNA的纯度。因此相对于上述文献2使用DNase I降解DNA的方法，本发明方法在清除DNA时更具有实验的可操作性。

(2)本发明方法使用的DNA纯化柱可以一次过滤4ml纯化系统样品，过滤样品量较大，因此可以提高实验的可操作性和提取效率。

(3)本发明方法的裂解液中含有高浓度的异硫氰酸胍以及多种去垢剂，与外泌体溶液混合后，能够有效的裂解外泌体，释放外泌体中的生物大分子。尤其是多种去垢剂的存在，可以促进microRNA与结合蛋白的分离，利于后续microRNA的高效和高纯度提取。

(4)鉴于外泌体的样品用量较大，添加的裂解液较多，从而导致microRNA的纯化系统的体积较大，如果直接使用例如上述文献1中的RNA纯化柱来吸附microRNA，由于RNA纯化柱每次的过柱液体积较小，因此需要多轮次才能将裂解液进行过柱处理，极大的降低实验的可操作性，也导致了microRNA的大量损失。而本发明方法则利用表面修饰羟基的磁珠来吸附microRNA(对裂解液中微量的microRNA具有高度的富集和吸附作用，且磁珠与裂解液混合后孵育的时间充足，可以高效地吸附裂解液中的microRNA，减少microRNA的丢失)。裂解液中添加醇类(例如异丙醇和/或乙醇)后，可以促进microRNA与磁珠表面修饰的羟基的结合，该实验过程只需要将磁珠加入含有醇类的裂解液中，并在旋转混合仪中混合即可，极大提高了实验的可操作性，提高了microRNA的纯化效率。

附图说明

图1为利用DNA纯化柱清除裂解液中的DNA后的琼脂糖凝胶电泳图像；

图2为利用本发明方法(OMIGET)和以TRIzol为基础的两种试剂盒(TRIzol Plus和RNA mini Kit)提取获得的三种细胞外泌体(MSC-ome(a)、NK-ome(b)、CIK-ome(c))的RT-QPCR检测曲线；

图3为利用本发明方法(OMIGET)和以TRIzol为基础的两种试剂盒(TRIzol Plus和RNA mini Kit)提取获得的一种血清外泌体(Se-ome)的RT-QPCR检测曲线；

图4为利用本发明方法(OMIGET)和商业化microRNA提取试剂盒(BLOG和TAKEGENE)提取获得的三种细胞外泌体(MSC-ome(a)、NK-ome(b)、CIK-ome(c))的RT-QPCR检测曲线；

图5为利用本发明方法(OMIGET)和商业化microRNA提取试剂盒(BLOG和TAKEGENE)提取获得的一种血清外泌体(Se-ome)的RT-QPCR检测曲线。

具体实施方式

本发明旨在提供一种高效提取外泌体microRNA的方法，同时能够保证所提取的microRNA具有较高的纯度，并提供了用于提取外泌体microRNA的试剂盒。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：外泌体的提取

1.1、细胞外泌体的提取

将脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、细胞因子诱导杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)三种细胞分别正常培养后(分别利用Lonza公司提供的三种细胞的专用培养基，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养)，收集细胞培养上清，并利用磁珠型的外泌体纯化试剂盒(Ome-01，北京奥秘佳得医药科技有限公司)分别提取三种细胞培养上清中的外泌体，分别命名为MSC-ome、NK-ome、CIK-ome，备用。提取的外泌体经过电镜的形态学鉴定，并进行NTA检测分析，确定为外泌体。

1.2、血清外泌体的提取

利用血清外泌体纯化试剂盒提取(Ome-02，北京奥秘佳得医药科技有限公司)按照说明书操作步骤提取血清中的外泌体，命名为Se-ome，备用。提取的外泌体经过电镜的形态学鉴定，并进行NTA检测分析，确定为外泌体。

实施例2：外泌体microRNA的提取与检测

2.1、外泌体microRNA的提取

在该实施例中，利用本发明提供的方法(本文中称本发明方法，简称为OMIGET)分别对上述实施例1提取获得的外泌体MSC-ome、NK-ome、CIK-ome和Se-ome中的microRNA进行提取，另外还利用多种商业化试剂盒来提取这些外泌体中的microRNA，作为对照。这些商业化试剂盒包括：2个以TRIzol为基础的试剂盒，分别是TRIzol Plus RNA purification kit(12183555，ThermoFisher，本文中简称为TRIzol Plus)和微量RNA提取试剂盒(Omn-12，北京奥秘佳得医药科技有限公司，本文中也称为RNA mini Kit)，以及百代生物的外泌体RNA提取试剂盒(51081，常州百代生物科技股份有限公司，本文中简称为BLOG)，和重鼎生物的microRNA提取试剂盒(ZD-TG-A1-50，宁波重鼎生物技术有限公司，本文中简称为TAKEGENE)，利用这些试剂盒的具体提取操作均按照各自的说明书进行。在所有的microRNA提取实验中，外泌体样品的用量均为1ml。本发明提供的外泌体microRNA的提取方法的具体操作如下所示：

1)外泌体裂解。按照外泌体溶液：裂解液＝1：3的比例，在1mL外泌体溶液中加入3mL裂解液，混匀，室温静置3-5min，得到第一混合液；其中裂解液的成分可包括2-5M(优选为3-4M)的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中去垢剂可包括Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS及脱氧胆酸钠中的多种(两种以上)；在该实施例中使用的裂解液具体为：3M的异硫氰酸胍，2％的CHAPS和3％的Triton X-100。该步骤可利用含有异硫氰酸胍和多种去垢剂的裂解液来裂解外泌体，促进microRNA与蛋白的解离，释放microRNA。经试验证明，如果该步骤中的裂解液中仅含有一种去垢剂，其促进microRNA与蛋白的解离作用较弱，进而影响最终获得的microRNA浓度。

2)将步骤1)得到的第一混合液转移至DNA纯化柱(质粒DNA提取时用的DNA吸附柱(购自逗点生物的质粒中提纯化柱)，中提，可以一次过滤4ml液体)内，12,000g，4℃离心2min，保留滤液，弃DNA纯化柱(由于裂解液中没有异丙醇和/或无水乙醇，因此，DNA纯化柱不会吸附microRNA，进而在清除DNA的同时不影响microRNA的提取；此外，DNA纯化柱也可以吸附裂解液中的部分蛋白质，从而还可以清除裂解液中的部分蛋白质，进而有利于提高microRNA的纯度)。在另一对照(Control)方法中，省略该步骤2)，而直接对步骤1)得到的第一混合液进行以下步骤3)-11)处理。

3)向步骤2)所得滤液中加入等体积的异丙醇(4ml，使异丙醇的终浓度达到50％，也可以使用70％乙醇代替异丙醇)，颠倒混匀，得到第二混合液。该步骤中异丙醇和/或乙醇的加入可以促进microRNA吸附到磁珠上，以便纯化。

4)向第二混合液中加入50μL磁珠(吸取磁珠前先震荡混匀，该磁珠为核酸提取时常用的磁珠，其表面修饰高密度羟基，用于吸附microRNA)，置于静音混合器中4℃旋转孵育30min。

5)取出步骤4)孵育后的离心管，置于磁力架上，使磁珠聚集；或置于离心机中，3,000g，4℃离心2min，沉淀磁珠，弃上清。

6)向步骤5)富集的磁珠中加入0.5-1ml去蛋白液，轻微震荡(Vortex，1,000rpm)30sec，洗涤磁珠，离心法或磁力法沉淀磁珠，弃上清。其中去蛋白液的成份可包括：1-3M(优选为1.5-2M)的异硫氰酸胍和70％(终浓度)乙醇，该步骤中使用的去蛋白液具体为2M的异硫氰酸胍和70％乙醇。

7)向步骤6)获得的磁珠中加入0.5-1ml洗涤液,轻微震荡(Vortex，1,000rpm)30sec，洗涤磁珠，离心法或磁力法沉淀磁珠，弃上清。其中洗涤液为25mM Tris-Hcl，pH＝7。

8)步骤7)中弃上清后，3,000g，4℃离心2min，沉淀磁珠，用移液枪移除残液。

9)向步骤8)的沉淀磁珠中加入100μL洗脱液，震荡(Vortex，2,000rpm)，30sec，洗脱microRNA。其中洗脱液的成份包含：10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH＝7.5。

10)将步骤9)的离心管置于磁力架上使磁珠聚集，或7,000g，4℃离心2min，沉淀磁珠。转移上清液至新的EP管中，即为microRNA溶液。

11)利用nanodrop仪器，测定microRNA的浓度和纯度(OD260/OD280)，用于后续反转录或其它实验，或保存于-80℃冰箱。

2.2、外泌体microRNA的含量检测

该实验中，分别对上述2.1根据不同的试剂盒和方法提取获得的microRNA进行尾部加A和反转录，并利用实时荧光定量PCR(Real-Time quantitative PCR)方法检测所得microRNA溶液的含量。具体操作如下所示：

利用碧云天生物的E.coli Poly(A)Polymerase(R7070S，碧云天生物技术有限公司)对提取的microRNA进行3’尾部的加A反应，并利用统一的反转录引物(Universalreverse transcription primers，如下表1所示)和Fermentas的反转录试剂盒(K1622，Thermofisher)按照说明书操作对加A后的microRNA进行反转录，得到的cDNA作为模板，利用碧云天的QPCR试剂盒(BeyoFast^TM SYBR Green qPCR Mix(2X)，D7260，碧云天生物技术有限公司)进行扩增，检测microRNA的含量。反转录及PCR检测实验中用到的引物序列如下表1所示，其中miR-Let-7i forward primer、miR-Let-7a forward primer、miR-16-1forwardprimer和miR-150forward primer为分别针对miR-Let-7i、miR-Let-7a、miR-16-1和miR-150的正向扩增引物，Generic reverse primer为通用的microRNA反向扩增引物。

表1：反转录及PCR检测实验中用到的引物序列

2.3、本发明方法(OMIGET)和对照(Control)方法提取的外泌体microRNA的浓度和纯度检测结果比较

如下表2所示，示出了利用本发明方法(在提取外泌体microRNA过程中使用DNA纯化柱(上述2.1中步骤2)))和对照(Control)方法(在提取外泌体microRNA过程中不使用DNA纯化柱)提取上述实施例1获得的MSC-ome、NK-ome、CIK-ome中的microRNA的浓度和纯度结果。由该表2记载的结果可知，对照(Control)方法在提取外泌体microRNA的过程中没有使用DNA纯化柱，其提取的microRNA的OD260/OD280在1.6左右，而本发明方法在提取外泌体microRNA的过程中使用了DNA纯化柱，其提取的microRNA的OD260/OD280在2.0左右。已有研究表明，检测RNA吸光度时，260nm、320nm、230nm和280nm处吸光度值(OD值)分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等物质的吸光度值。OD260/OD280(R)体现了RNA的纯度，质量较好的RNA的R值通常在2.0-2.2之间。当1.8<R<2.0时，说明RNA溶液中可能存在DNA污染，但不存在蛋白质污染，当R<1.8时，说明RNA溶液中的蛋白质污染比较明显，也可能混有DNA污染。当R>2.2时，说明RNA已经被降解成了单核苷酸。结合这一结论，可说明在对照(Control)方法提取外泌体microRNA过程中存在明显的蛋白质污染，也可能混有DNA污染，而本发明方法提取获得的外泌体microRNA的纯度很高，其OD260/OD280(R)在2.0左右。

同时，该试验中还利用琼脂糖凝胶检测了利用两种方法分别提取的三种细胞外泌体microRNA，结果如图1所示，可见在利用对照(Control)方法提取的microRNA样品中存在弥散的核酸条带，分析应为DNA条带，而利用本发明方法提取的microRNA样品中不存在弥散的核酸条带，表明DNA纯化柱可以有效吸附外泌体裂解液中的DNA，进而提高microRNA的纯度。

表2：本发明方法和对照(Control)方法提取的外泌体microRNA的浓度和纯度

2.4、本发明方法和以TRIzol为基础的试剂盒提取的外泌体microRNA的浓度和纯度检测结果比较

对利用本发明方法(OMIGET)和以TRIzol为基础的试剂盒(TRIzol Plus和RNAmini Kit)从实施例1获得的三种细胞外泌体(MSC-ome、NK-ome、CIK-ome)和一种血清外泌体(Se-ome)中提取的microRNA进行浓度和纯度(OD260/OD280)的测定结果如下表3所示。

由下表3记载的microRNA的纯度结果可知，利用本发明方法提取的细胞和血清外泌体microRNA的OD260/OD280值均在2.0左右，表明提取获得的microRNA纯度很高，而利用TRIzol Plus提取的细胞和血清外泌体microRNA的OD260/OD280值均小于1.29(提取的细胞外泌体microRNA的OD260/OD280值甚至均小于1.05)，利用RNA mini Kit提取的细胞和血清外泌体microRNA的OD260/OD280值均小于1.48(提取的细胞外泌体microRNA的OD260/OD280值甚至均小于1.32)，表明利用这两种以TRIzol为基础的试剂盒(其中利用RNA纯化柱来分离microRNA)提取细胞和血清外泌体中的microRNA时，会导致最终提取获得的microRNA的纯度非常低，可能存在明显的蛋白质和/或DNA等杂质的污染，表明现有技术中以TRIzol为基础的试剂盒并不适用于提取外泌体中的microRNA。

表3：本发明方法和以TRIzol为基础的试剂盒提取的外泌体microRNA的浓度和纯度

2.5、本发明方法和以TRIzol为基础的试剂盒提取的外泌体microRNA的RT-QPCR检测结果比较

按照上述2.2的方法，分别以利用本发明方法(OMIGET)和以TRIzol为基础的试剂盒(TRIzol Plus和RNA mini Kit)从实施例1获得的三种细胞外泌体(MSC-ome、NK-ome、CIK-ome)和一种血清外泌体(Se-ome)中提取的microRNA作为模板，进行RT-QPCR(反转录-QPCR)，以检测提取的各microRNA中Let-7i、Let-7a、miR-16-1和miR-150的表达情况，其中提取自三种细胞外泌体(MSC-ome、NK-ome、CIK-ome)的microRNA中Let-7i、miR-16-1和miR-150的RT-QPCR检测结果(CT值)如下表4和图2中a-c幅所示，提取自血清外泌体(Se-ome)的microRNA中Let-7i、Let-7a和miR-150的RT-QPCR检测结果(CT值)如下表5和图3所示，在图2的a-c幅和图3中，A表示本发明方法(OMIGET)，B表示TRIzol Plus，C表示RNA mini Kit。

由表4-5以及图2-3所示，可见相对于利用以TRIzol为基础的试剂盒提取的细胞和血清外泌体microRNA经RT-QPCR检测后普遍具有较高的CT值，和扩增过程中较低的熔解峰和/或出现多个峰值，利用本发明方法(OMIGET)提取的细胞和血清外泌体microRNA经RT-QPCR检测后的CT值普遍偏低，在扩增过程中的熔解峰较高，且峰值单一、锐利，表明利用本发明方法提取的细胞和血清外泌体microRNA的含量相对更高，且在扩增过程中发生了特异性扩增，提取的microRNA纯度更高，不含DNA等污染。

表4：细胞外泌体microRNA中Let-7i、miR-16-1和miR-150的RT-QPCR检测结果

表5：血清外泌体microRNA中Let-7i、Let-7a和miR-150的RT-QPCR检测结果

2.6、本发明方法和商业化microRNA提取试剂盒提取的外泌体microRNA的浓度和纯度检测结果比较

对利用本发明方法(OMIGET)和商业化microRNA提取试剂盒(BLOG和TAKEGENE)从实施例1获得的三种细胞外泌体(MSC-ome、NK-ome、CIK-ome)和一种血清外泌体(Se-ome)中提取的microRNA进行浓度和纯度(OD260/OD280)的测定结果如下表6所示。

由下表6记载的microRNA的纯度结果可知，利用本发明方法提取的细胞和血清外泌体microRNA的OD260/OD280值均在2.0左右，表明提取获得的microRNA纯度很高，而利用BLOG试剂盒提取的细胞外泌体microRNA的OD260/OD280值均小于1.72，提取的血清外泌体microRNA的OD260/OD280值为2.25±0.06(R>2.2)，利用TAKEGENE试剂盒提取的细胞和血清外泌体microRNA的OD260/OD280值均小于1.31，表明利用这两种商业化microRNA提取试剂盒(其中均未利用DNA纯化柱清除DNA)提取细胞和血清外泌体中的microRNA时，会导致最终提取获得的microRNA的纯度非常低，可能存在明显的蛋白质和/或DNA等杂质的污染，或者可能会使得提取的microRNA被降解成单核苷酸，表明这些现有的商业化microRNA提取试剂盒在提取细胞和血清外泌体microRNA均存在明显不足，不适合用来提取外泌体中的microRNA。

表6：本发明方法和商业化microRNA提取试剂盒提取的外泌体microRNA的浓度和纯度

2.7、本发明方法和商业化microRNA提取试剂盒提取的外泌体microRNA的RT-QPCR检测结果比较

按照上述2.2的方法，分别以利用本发明方法(OMIGET)和商业化microRNA提取试剂盒(BLOG和TAKEGENE)从实施例1获得的三种细胞外泌体(MSC-ome、NK-ome、CIK-ome)和一种血清外泌体(Se-ome)中提取的microRNA作为模板，进行RT-QPCR(反转录-QPCR)，以检测提取的各microRNA中Let-7i、Let-7a、miR-16-1和miR-150的表达情况，其中提取自三种细胞外泌体(MSC-ome、NK-ome、CIK-ome)的microRNA中Let-7i、miR-16-1和miR-150的RT-QPCR检测结果(CT值)如下表7和图4中a-c幅所示，提取自血清外泌体(Se-ome)的microRNA中Let-7i、Let-7a和miR-150的RT-QPCR检测结果(CT值)如下表8和图5所示，在图4的a-c幅和图5中，A表示本发明方法(OMIGET)，B表示BLOG，C表示TAKEGENE。

由表7-8以及图4-5所示，可见相对于利用商业化microRNA提取试剂盒提取的细胞和血清外泌体microRNA(Let-7i、Let-7a、miR-16-1和miR-150)经RT-QPCR检测后普遍具有较高的CT值，和扩增过程中较低的熔解峰和/或出现多个峰值，利用本发明方法(OMIGET)提取的细胞和血清外泌体microRNA经RT-QPCR检测后的CT值普遍偏低，在扩增过程中的熔解峰较高，且峰值单一、锐利，表明利用本发明方法提取的细胞和血清外泌体microRNA的含量相对更高，且在扩增过程中发生了特异性扩增，提取的microRNA纯度更高，不含DNA等污染。

表7：细胞外泌体microRNA中Let-7i、miR-16-1和miR-150的RT-QPCR检测结果

表8：血清外泌体microRNA中Let-7i、Let-7a和miR-150的RT-QPCR检测结果

综上实施例2的结果可知，相对于现有技术中以TRIzol为基础的试剂盒、商业化microRNA提取试剂盒以及未使用DNA纯化柱清除DNA的Control方法，本发明方法在提取细胞和血清外泌体microRNA方面具有显著更好的效果，其是一种针对外泌体样品特点(样品多为液体、纯化系统体积较大、microRNA含量较低、存在DNA、mRNA等多种核酸、存在大量的蛋白质污染)而专门设计的方法，该方法可包括以下步骤：

S1)使用裂解液裂解外泌体样品(其可包括细胞外泌体和血清外泌体等)，得到第一混合液；可选地，其中所述裂解液可包含2-5 M，优选3-4 M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中所述去垢剂可为选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种；所述裂解液与外泌体样品的混合体积比可为(2-4)：1；

S2)将步骤S1)所得第一混合液转移至DNA纯化柱内，离心，得到滤液；

S3)向步骤S2)所得滤液中加入醇类，混匀，得到第二混合液；可选地，其中所述醇类选自异丙醇、乙醇中的一种或多种，该醇类的加入量为使其终浓度为50％以上；

S4)向步骤S3)所得第二混合液中加入表面修饰有羟基的磁珠，并孵育，得到吸附有microRNA的磁珠，富集所述吸附有microRNA的磁珠，得到第一磁珠；可选地，其中所述孵育的条件可为：2-8℃条件下旋转孵育30min以上；富集所述吸附有mi roRNA的磁珠的操作可包括：将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于磁力架上，使磁珠聚集，或将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于离心机中离心，使磁珠沉淀；

S5)向步骤S4)所得第一磁珠中加入去蛋白液，洗涤第一磁珠，得到第二磁珠；可选地，其中所述去蛋白液可包含1-3M，优选1.5-2M的异硫氰酸胍和70％乙醇；

S6)向步骤S5)所得第二磁珠中加入洗涤液，洗涤第二磁珠，得到第三磁珠；可选地，其中所述洗涤液可包含10-30mM Tris-Hcl，pH范围是6.5-8.0；和

S7)向步骤S6)所得第三磁珠中加入洗脱液，洗脱得到microRNA；可选地，其中所述洗脱液可包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH范围是7.5-8.0。

实施例3：高效提取外泌体microRNA的试剂盒

基于以上实施例2的结果，本发明还提供一种高效提取外泌体microRNA的试剂盒，其可包括：

(1)裂解液，其包含2-5M，优选3-4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种(两种以上)；

(2)DNA纯化柱；

(3)表面修饰有羟基的磁珠；

(4)去蛋白液，其包含1-3M，优选1.5-2M的异硫氰酸胍和70％乙醇；

(5)洗涤液，其包含10-30mM Tris-Hcl，pH＝6.5-8.0，优选为pH＝7.0；和

(6)洗脱液，其包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH＝7.5-8.0。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的内容。

Claims (10)

1.一种高效提取外泌体microRNA的方法，其包括以下步骤：

S1)使用裂解液裂解外泌体，得到第一混合液；

S2)将步骤S1)所得第一混合液转移至DNA纯化柱内，离心，得到滤液；

S3)向步骤S2)所得滤液中加入醇类，混匀，得到第二混合液；

S4)向步骤S3)所得第二混合液中加入表面修饰有羟基的磁珠，并孵育，得到吸附有microRNA的磁珠，富集所述吸附有microRNA的磁珠，得到第一磁珠；

S5)向步骤S4)所得第一磁珠中加入去蛋白液，洗涤第一磁珠，得到第二磁珠；

S6)向步骤S5)所得第二磁珠中加入洗涤液，洗涤第二磁珠，得到第三磁珠；和

S7)向步骤S6)所得第三磁珠中加入洗脱液，洗脱得到外泌体的microRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤S1)中所述外泌体来源于细胞培养上清、血清、血浆或其他生物样品。

3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤S1)中所述裂解液包含2-5M，优选3-4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，步骤S1)中所述裂解液与外泌体样品的混合体积比为(2-4)：1。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，步骤S3)中所述醇类选自异丙醇、乙醇中的一种或多种；和/或

步骤S3)中所述醇类的加入量为使其终浓度为50％以上。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，步骤S4)中所述孵育的条件为：2-8℃条件下旋转孵育30min以上；和/或

步骤S4)中富集所述吸附有microRNA的磁珠的操作包括：将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于磁力架上，使磁珠聚集，或将含有所述吸附有microRNA的磁珠的离心管置于离心机中离心，使磁珠沉淀。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，步骤S5)中所述去蛋白液包含1-3M，优选1.5-2M的异硫氰酸胍和70％乙醇。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，步骤S6)中所述洗涤液包含10-30mM Tris-Hcl，pH范围是6.5-8.0。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，步骤S7)中所述洗脱液包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH范围是7.5-8.0。

10.一种高效提取外泌体microRNA的试剂盒，其包括：

(1)裂解液，其包含2-5M，优选3-4M的异硫氰酸胍溶液和体积百分比为1-5％的去垢剂，其中所述去垢剂为选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、SDS、CHAPS和脱氧胆酸钠中的多种；

(2)DNA纯化柱；

(3)表面修饰有羟基的磁珠；

(4)去蛋白液，其包含1-3M，优选1.5-2M的异硫氰酸胍和70％乙醇；

(5)洗涤液，其包含10-30mM Tris-Hcl，pH＝6.5-8.0，优选为pH＝7.0；和

(6)洗脱液，其包含10mM柠檬酸钠和10mM EDTA.Na₂，pH＝7.5-8.0。

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