CN110819624A - 一种用于粪便中细菌dna快速提取的裂解液及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液及方法。该裂解液包含金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。使用本发明的裂解液提取粪便中细菌DNA，可以降低核酸的丢失并且大大减少交叉污染的产生，以获得高浓度的核酸，所获得的DNA可直接应用于核酸扩增反应。本发明所述的用于提取粪便中细菌DNA的方法操作简单方便、快速、成本低，可以为核酸扩增检测提供基础，为快速诊断胃肠道相关疾病提供支持，也减少了在确诊过程中的时间成本、经济成本，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液及方法
技术领域
本发明属于核酸提取领域，具体涉及一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，本发明还属于分子生物学和医学检测领域，其采用较为简便可靠的方法提取临床粪便样本中的细菌DNA，再采用核酸扩增技术对其进行检测。
背景技术
从生物样本中分离纯化得到高质量的核酸是分子生物学实验非常关键的步骤。目前已报道了许多从生物样本中分离纯化核酸的方法，例如从血液、血浆、血清、培养细胞、植物、动物及人体组织等样本中分离提纯核酸的方法。而与血液或其他临床样本相比，粪便中复杂的微生物菌群、变化的一致性以及变化的内源性和膳食成分导致DNA提取特别困难。
目前提取核酸的方法主要分为机械法、物理法和化学法；对于细菌中核酸的提取则主要是机械法中的研磨法，物理法中的冷热交替法以及化学法中的有机溶剂法、酶解法。
一般情况下DNA的提取所用到的有机溶剂主要是强力变性剂如异硫氰胍或尿素-氯化锂等来溶解蛋白质，从而破坏细胞、病毒，并使核蛋白从核酸上解离下来，并灭活可能存在的RNA酶。并且在此基础上可采用硅藻、玻璃珠吸附和解吸附或有机溶剂抽提、乙醇(异丙醇)沉淀法提取核酸。这一方法是目前临床实验室常规应用的方法。有机溶剂法的原理是强力变性剂与硫基乙醇联合作用溶解蛋白灭活RNA酶，再加入乙酸钠、饱和酚、氯仿-异戊醇抽取以变性蛋白，经高速离心后得到上清，再以乙醇或异丙醇沉淀浓缩核酸再以75％乙醇洗涤沉淀和容器去除残余盐份，再经烘干去除残余乙醇，从而得到纯净的核酸。此种方法虽然能够有效去除蛋白、排除某些影响PCR反应的抑制剂的影响，并且能一定程度的浓缩核酸，但是其缺点也是不可忽视的，首先就是操作繁琐，并且在有机溶剂抽提后取上清的过程中必须小心谨慎，通常的小体积操作时很容易吸到或碰到导致实验失败的分层处的蛋白及有机溶剂；为了浓缩核酸，往往要加入一定量的助沉淀剂，有时会造成或大或小的影响；乙醇的洗涤过程仍属小心操作，以免沉淀的丢失；整个实验过程中需要多次离心，它极大地限制了单位时间内可处理的样品数，而某些步骤需要的精心操作，不仅限制了单位时间内可处理的样品数，增大了操作人员的劳动强度，而且使得实验的稳定性受到威胁。并且当大批量操作时可能还会存在交叉污染情况发生。
目前核酸提取试剂盒中，常用的国外的提取试剂盒为凯杰(QIAGEN)公司生产的新型粪便基因组快速提取试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)，(货号51604)；国内的提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司生产的粪便基因组DNA提取试剂盒(货号DP328)。此外，还有非商业的常用方法-异硫氰酸胍/二氧化硅基质法。现有技术文献(Mcorist A L,Jackson M,Bird A R.A comparison of five methods for extractionof bacterial DNA from human faecal samples[J].Journal of MicrobiologicalMethods,2002,50(2):0-139)中使用四种商用试剂盒(FastDNA kit，Bio 101；NucleospinRC+Tkit，Macherey-Nagal；Quantum PrepR Aquapure Genomic DNA isolation kit,Bio-Rad；QIAamp DNA stool mini kit，Qiagen)和非商业异硫氰酸胍/二氧化硅基质法对人类粪便样本中的细菌基因组进行提取，并比较了提取效果，并指出，QIAamp试剂盒是最有效的提取方法，该试剂盒具有更好的下游核酸扩增性能。
综上所述，开发一种具有高效、污染少、操作简单方便等优势的DNA快速提取的裂解液及方法具有非常大的意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，使用该裂解液可实现简单快速提取粪便样本中的细菌DNA。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，所述裂解液包括金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。
在本发明所述的裂解液中，所述金属离子螯合剂为EDTA；优选地，所述EDTA的浓度为1-3mM；更优选地，浓度为2mM。
在本发明所述的裂解液中，所述缓冲溶液为Tris-HCl(pH 8.0)，所述Tris-HCl的浓度为10-20mM；更优选地，浓度为15mM。
在本发明所述的裂解液中，所述表面活性剂为Tritonx-100，优选地，所述Tritonx-100的体积百分比为1％-3％；更优选地，体积百分比为2％。
在本发明所述的裂解液中，优选地，所述糖苷水解酶为溶菌酶，所述溶菌酶的浓度为0.1-0.5mg/mL；更优选地，浓度为0.3mg/mL。
本发明还提供了所述裂解液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂、糖苷水解酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得；
优选地，所述水为超纯水；
优选地，所述酸为HCl；
优选地，所述碱为NaOH；
优选地，所述方法包括以下步骤：
将1-3mM EDTA、10-20mM Tris-HCL(pH 8.0)、1％-3％(体积百分比)Tritonx-100、0.1-0.5mg/mL溶菌酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得。
本发明的另一目的在于提供一种用于粪便中细菌DNA快速提取试剂盒，其包含本发明所述的裂解液。
本发明的另一目的在于提供一种用于粪便中细菌DNA快速提取的方法，其包括以下步骤：
(1)获取粪便样本，
(2)将所述裂解液加入步骤(1)获得的粪便样本中，并提取DNA。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)吸取粪便样本，离心并取上清液，将所述上清液离心并收集沉淀，即为粪便样本；
(2)将所述的裂解液加入步骤(1)获得的粪便样本中，并提取DNA；
或使用所述的DNA提取试剂盒提取DNA；
其中，所述步骤(1)中的上清液与步骤(2)中的裂解液的体积比为4:1～4；优选地为4:2。
根据本发明所述的方法，其中，所述步骤(1)包括：吸取1.2mL粪便样本至1.5mL EP管中后2000rpm、2min离心，在不吸取到沉淀的前提下将所有上清转移到新的1.5mL EP管，涡旋混匀后，取200μL上清12000rpm、2min离心弃上清，收集沉淀。
优选地，所述步骤(2)包括：
将100μL所述的裂解液加入到步骤(1)所收集的沉淀中，充分混匀，置于37℃金属浴中加热20min，加热完成后涡旋混匀后置于100℃金属浴中煮沸10min，将煮沸后的液体冷却后12000rpm、2min离心，所得上清即为分离获取的DNA。
本发明所述的裂解液中，金属离子螯合剂EDTA能螯合二价金属并抑制DNA酶的活性，Tris-HCl能保证反应液PH值稳定在一定范围内，非离子型表面活性剂Tritonx-100以及能使细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解的溶菌酶在加热和煮沸的条件下使细菌中的DNA释放出来，并可直接用于DNA扩增。
本发明所述的用于提取粪便中细菌DNA的方法不需要磁珠、硅藻柱等的参与即可简单快速、高效提取到DNA，并且由于不需要洗脱等操作，也能大大减少DNA提取过程中的核酸损耗，从而大大提高DNA提取量。利用该方法对粪便样品进行处理，由于操作简单快速，因此操作的均一性较好，从而提高了实验的稳定性，使由于操作引起的假阴性率大大降低，因此对于实验人员实验操作能力要求也不高。且不会存在由于反复离心、吸附及洗脱等的步骤，减少了样本中交叉污染的概率。该方法不需要分批次加入多种不同功能反应液混合液，从而使单位时间内样品处理数得以提高，为大批量标本的处理提供了可能性，通量可以显著提高。该方法中不引入tRNA等辅助核酸，从而避免了对实验潜在的影响。该方法的操作时间比常规处理的方法大大缩短，所提取的核酸可以直接作为核酸扩增反应的模板，进行扩增，使得实验结果能更早得到，进一步体现出核酸扩增的优越性。该方法适用于肠道菌群的DNA提取，从而仅进行一次处理，可同时进行肠道内多种细菌的DNA提取。将该方法联合核酸扩增技术，可以为感染性腹泻等胃肠道相关疾病的快速诊断提供方便。
本发明操作简单方便、快速、成本低，可以为核酸扩增检测提供基础，为快速诊断胃肠道相关疾病提供支持，也减少了在确诊过程中的时间成本、经济成本，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为产毒艰难梭菌检测图。
图2示出了不同配方的核酸裂解液的扩增效率。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
实施例1本发明方法对比两种市面上常用DNA提取试剂盒对于所提取DNA浓度值进行比较
从临床样本(样本来自湘雅医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)中随机选取五个样本，每份样本均分别用以下方法提取DNA：采用本发明的提取DNA的方法、采用天根生化科技(北京)有限公司的粪便基因组DNA提取试剂盒(货号DP328)提取DNA的方法、以及采用凯杰(QIAGEN)公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen，货号51604)提取DNA的方法。
从腹泻病人采集粪便样本(稀便或者水样便)2-8mL，装入一次性大便采集标本盒中，迅速盖好盖子。首先吸取1.2mL粪便样本到1.5mL EP管中，在室温，2000rpm、2min离心，吸取700μL上清充分混匀后，迅速分装200μL上清至3个新的2mL EP管并置于冰上。
方法一：本发明的提取DNA的方法包括以下步骤：
1.将上述装有200μL上清的2mL EP管在12000rpm、2min离心弃上清，加入100μL本发明中的裂解液到所收集的沉淀中，充分混匀，置于37℃金属浴中加热20min，并在加热过程中涡旋3-4次，加热完成后再一次涡旋混匀后置于100℃金属浴中煮沸10min；
2.稍微冷却后12000rpm、2min离心，所得上清即为可用于核酸扩增的DNA溶液。
其中，所述裂解液的成分为：2mM EDTA、15mM Tris-HCL(pH 8.0)、2％(体积百分比)Tritonx-100、0.3mg/mL溶菌酶以及超纯水；此外还存在微量被用于调节PH的HCl或者NaOH。
方法二：采用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒提取DNA的方法包括以下步骤：
使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，缓冲液GFA中加入异丙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1.取出之前分装好后置于冰上的装有200μL粪便样本的2mL EP管。
2.向管中加入500μl缓冲液SA、100μl缓冲液SC、15μl蛋白酶K，0.25g的研磨珠间歇振荡1min至样本充分混匀或使用TG rinder H24组织研磨均质仪(OSE-TH-01)混匀(6M/S的速度振荡30s，间隔30s，共2个循环)。若缓冲液SA或SC中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并摇匀后使用。
3.70℃孵育15min，孵育期间震荡2-3次。
注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可将温度提高至95℃以促进裂解。
4.涡旋15sec，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，转移上清液至新的离心管中，加入10μl的RNase A，震荡混匀后室温放置5min。
5.加入200μl缓冲液SH，震荡混匀，置冰上5min。
6.12,000rpm(～13,400×g)离心3min。
7.将上一步所得上清液转移至新的1.5mL离心管，加入等体积缓冲液GFA(使用前请先检查是否已加入异丙醇)。
8.将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。
9.向吸附柱CR2中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。
10.向吸附柱CR2中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。
11.重复操作步骤10。
12.将吸附柱CR2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
产品链接：
http://www.tiangen.com/asset/imsupload/up0390627001544772143.pdf
方法三、采用凯杰(QIAGEN)公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取DNA的方法包括以下步骤：
开始前的准备工作：
将水浴或是金属浴加热到70℃，以备第3步和第8步使用。
所有离心步骤都在室温(15～25℃)、20000×g(～14000rpm)条件下进行。
如果在缓冲液AL(Buffer AL)和去除抑制剂缓冲液(InhibitEX Buffer)中出现沉淀物，请通过加热混匀使其溶解
使用前请先在缓冲液AW1(Buffer AW1)和缓冲液AW2(Buffer AW2)中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上标签。
请在使用前混匀所有缓冲液。
准备工作完成后，进行以下操作：
1.取出之前分装好后置于冰上的装有200μL粪便样本的2mL EP管。
2.加入1mL去除抑制剂缓冲液(InhibitEX Buffer)至样品中，涡旋混匀1min直至粪便样本彻底均质。
3.70℃加热悬液5min。难以破碎的细胞可将温度提升到95℃。涡旋15s。
4.离心样本1min至成为粪球。
5.吸取25μL蛋白酶K到新的1.5mL EP管的底部(不提供)。
6.吸取600μL第4步所得上清到加入了蛋白酶K的1.5mL EP管中。
7.添加600μL缓冲液AL(Buffer AL)并且涡旋15s。
注意：不能直接添加蛋白酶K到缓冲液AL(Buffer AL)中。
8.在70℃孵育10min。
9.添加600μL酒精(96～100％)到溶解产物(第8步处理后所得混合液)中，涡旋混匀。
10.将第9步中的混合物小心转移600μL至凯杰所提供的离心柱，盖上盖子后离心1min，转移离心柱到一个新的2mL收集管，将滤液连同使用过的收集管丢弃。
重复步骤10直到所有溶解产物都附着在柱子上。
11.小心打开离心柱，加入500μL缓冲液AW1(Buffer AW1)，离心1min，转移离心柱到一个新的2mL收集管，将滤液连同使用过的收集管丢弃。
12.小心打开离心柱，加入500μL缓冲液AW2(Buffer AW2)，离心3min，将滤液连同使用过的收集管丢弃。
13.转移离心柱到一个新的2mL收集管，离心3min，将滤液连同使用过的收集管丢弃。
14.转移离心柱到一个新的标记好的1.5mL EP管(不提供)，并直接在离心柱膜上加入200μL缓冲液ATE(Buffer ATE)，室温孵育1min，离心1min，洗脱DNA。
提取的DNA用Qubit 4.0荧光计(Thermo Fisher)进行定量，测定的各粪便样本DNA浓度结果如下表1。
表1
Figure BDA0002271261310000081
由上述三种方法对比发现，相对于市面上或者传统过柱法，本发明方法2步就可完成核酸提取，操作上简单快速，大大减少了由于操作复杂、反复离心转移而带来的假阳性样本的产生；操作时间上约1小时可完成提取，相对后两种方法需要2-3h，时间成本大大降低；由于成分简单，所以也缩短了经济成本。本发明方法在操作简单、提取时间短的基础上，更重要的是，本发明方法避免了过柱法带来的核酸被吸附后洗脱不完全而导致核酸大量损失的弊端，从而使得核酸提取效率大大提高。
实施例2所提DNA用于产毒素B艰难梭菌的LAMP检测
相较于革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌DNA提取更为困难，艰难梭菌作为革兰氏阳性菌的一种，属于粪便样本中DNA提取难度较高的一类菌。本实施例中选取艰难梭菌作为参考；随机选取3个产毒艰难梭菌阴性样本A1号、A2号、A3号和3个产毒艰难梭菌阳性样本B1号、B2号、B3号(样本来自湘雅医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)，采用实施例1所述的本发明的提取DNA的方法进行核酸提取，以RNase-free water为阴性对照，以具有tcdB毒素基因的艰难梭菌产毒株(来自湘雅医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)为阳性对照，并且协同LAMP方法进行扩增得出毒素B基因的扩增情况，其中，用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1(F3)与引物2(B3)；第二组引物对：引物3(FIP)与引物4(BIP)；第三组引物对：引物5(LF)与引物6(LB)；所述各引物序列如下：
F3：TGCAGTTGTAGCTGTTGTT(SEQ ID NO:1)
B3：ATGCAGCCAAAGTTGTTG(SEQ ID NO:2)
FIP：
GTTGCAATTACAGGTAATCCTTCAGGTATCAACTGCATTAGATGAAACT(SEQ ID NO:3)
BIP：
TTAGGTGCAGCAATCAAAGAGCTGCCATTATACCTATCTTAGCTTCT(SEQ ID NO:4)
LF：ATGTAGGAAGTAAGTC(SEQ ID NO:5)
LB：AGTGACCCATTATTAAGAC(SEQ ID NO:6)
图1为产毒艰难梭菌检测图。图中，从左至右S型曲线依次为：阳性对照、B2号、B3号、B1号，非S型曲线为阴性对照、A1号、A2号、A3号的样品。结果判定：S型曲线表示艰难梭菌毒素B基因阳性，为产毒艰难梭菌；非S型曲线表明艰难梭菌毒素B基因阴性，为非产毒艰难梭菌。由图1可见，产毒艰难梭菌阳性样本B1号、B2号和B3号对应的曲线分别为d、b、和c，为S型曲线，产毒艰难梭菌阴性样本A1号、A2号和A3号，对应的曲线分别为f、g和h，为非S型曲线，表明本发明的方法所提取的DNA作为核酸扩增模板是普遍可行的。
实施例3本发明试剂混合物与其他类型试剂混合物的对比
虽然裂解液释放核酸的效率主要取决于离液盐的浓度、表面活性剂的类型和数量，但是裂解液成分同样会影响核酸纯度，成分不合理也会对核酸扩增反应产生抑制作用。本实施例运用不同配方的核酸裂解液提取同一阳性临床样本后的核酸进行核酸扩增，其中所述临床样本为随机抽取的某例产毒素B艰难梭菌的粪便样本(来自湘雅医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)，核酸扩增实验为LAMP检测，以RNase-free water为阴性对照，其中用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为实施例2中所用引物。
以2mM EDTA、15mM Tris-HCl(pH 8.0)、2％(体积百分比)Tritonx-100和超纯水配成的混合液作为基础裂解液，在该基础裂解液中添加0.3mg/mL溶菌酶、0.4mg/mL蛋白酶K、1％(质量百分比)SDS中的一种或几种，研究不同成分或浓度的核酸裂解液对核酸扩增的影响。核酸裂解液配方如表2所示：
表2核酸裂解液配方
Figure BDA0002271261310000101
注：上述各组分均取其各自适宜浓度范围中间值。
获取核酸提取样本的操作步骤如下：
从腹泻病人采集粪便样本(稀便或者水样便)2-8mL到一次性大便采集标本盒中，迅速盖好盖子。首先吸取1.8mL粪便样本到2mL EP管中，在室温，2000rpm、2min离心，吸取1200μL上清充分混匀后，迅速分装200μL上清至5个新的2mL EP管并置于冰上。
提取DNA的方法包括以下步骤：
1.将上述装有200μL上清的5个2mL EP管12000rpm、2min离心弃上清，分别加入100μL上述5种裂解液到所收集的沉淀中，充分混匀，置于37℃金属浴中加热20min，加热完成后涡旋混匀后置于100℃金属浴中煮沸10min；
2.稍微冷却后12000rpm、2min离心，所得上清即为可用于核酸扩增的DNA溶液。
利用5种核酸裂解液配方提取的DNA的扩增效率如图2所示。由图2可见，在5种核酸裂解液中，在基础裂解液(配方1)中仅添加溶菌酶(配方4)是核酸扩增效率最高的一组，在基础裂解液中仅添加SDS是扩增效率最差的一组(配方5)；在基础裂解液中添加蛋白酶K(配方2)或在基础裂解液中添加溶菌酶和SDS这两种组分(配方3)的效果均不如仅添加溶菌酶(配方4)，表明配方4即本发明方法为优选配方。
实施例4三种方法所提DNA分别应用于产毒素B艰难梭菌的LAMP检测
随机选取20个产毒艰难梭菌阳性样本，分别命名为1-20号(样本来自湘雅医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)，按实施例1，采用本发明提取DNA的方法以及用另外两个商品化试剂盒(粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP328)、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen，货号51604))根据说明书进行核酸提取，以RNase-free water为阴性对照，以具有tcdB毒素基因的艰难梭菌产毒株(来自湘雅医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)为阳性对照，并且协同LAMP方法进行扩增得出毒素B基因的阳性情况。检测结果如下表3所示。
表3不同方法的检测结果
Figure BDA0002271261310000111
Figure BDA0002271261310000121
由表3可见，相较于市面通用的核酸提取方法，本发明提取DNA的方法核酸提取效率高，能够在一定程度上减少假阳性结果的产生。本发明提取DNA的方法对于样本具有普适性，可广泛运用于不同粪便样本核酸提取。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 湖南融健基因生物科技有限公司
<120> 一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液及方法
<130> DIC19110046
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagttgta gctgttgtt 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcagccaa agttgttg 18
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgcaatta caggtaatcc ttcaggtatc aactgcatta gatgaaact 49
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaggtgcag caatcaaaga gctgccatta tacctatctt agcttct 47
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtaggaag taagtc 16
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgacccat tattaagac 19

Claims (11)

1.一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，所述裂解液包括金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。
2.根据权利要求1所述的裂解液，所述金属离子螯合剂为EDTA；优选地，所述EDTA的浓度为1-3mM；更优选地，浓度为2mM。
3.根据权利要求1或2所述的裂解液，所述缓冲溶液为Tris-HCl，所述Tris-HCl的浓度为10-20mM；更优选地，浓度为15mM。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的裂解液，所述表面活性剂为Tritonx-100，优选地，所述Tritonx-100的体积百分比为1％-3％；更优选地，体积百分比为2％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的裂解液，所述糖苷水解酶为溶菌酶，所述溶菌酶的浓度为0.1-0.5mg/mL；更优选地，浓度为0.3mg/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项的所述的裂解液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂、糖苷水解酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得；
优选地，所述水为超纯水；
优选地，所述酸为HCl；
优选地，所述碱为NaOH；
优选地，所述方法包括以下步骤：
将1-3mM EDTA、10-20mM Tris-HCL(pH 8.0)、1％-3％(体积百分比)Tritonx-100、0.1-0.5mg/mL溶菌酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得。
7.一种用于粪便中细菌DNA快速提取的试剂盒，其包含权利要求1-5中任一项所述的裂解液。
8.一种用于粪便中细菌DNA快速提取的方法，其包括以下步骤：
(1)获取粪便样本，
(2)将权利要求1-5中任一项所述的裂解液加入步骤(1)获得的粪便样本中，并提取DNA；
或使用如权利要求7所述的DNA提取试剂盒提取DNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括以下步骤：
(1)吸取粪便样本，离心并取上清液，将所述上清液离心并收集沉淀，即为粪便样本；
(2)将权利要求1-5中任一项所述的裂解液加入步骤(1)获得的粪便样本中，并提取DNA；
或使用如权利要求7所述的DNA提取试剂盒提取DNA；
其中，所述步骤(1)中的上清液与步骤(2)中的裂解液的体积比为4:1～4；优选地为4:2。
10.根据权利要求9所述的方法，所述步骤(1)包括：
吸取1.2mL粪便样本至1.5mL EP管中后2000rpm、2min离心，在不吸取到沉淀的前提下，将所有上清转移到新的1.5mL EP管，涡旋混匀后，取200μL上清12000rpm、2min离心弃上清，收集沉淀。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，所述步骤(2)包括：将100μL根据权利要求1-5中任一项所述的裂解液加入到步骤(1)所收集的沉淀中，充分混匀，置于37℃金属浴中加热20min，加热完成后涡旋混匀后置于100℃金属浴中煮沸10min；将煮沸后的液体冷却后12000rpm、2min离心，所得上清即为分离获取的DNA。
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