CN109913445B

CN109913445B - 一步洗涤磁珠法血液dna提取试剂盒

Info

Publication number: CN109913445B
Application number: CN201910208558.1A
Authority: CN
Inventors: 周杰锋
Original assignee: Ningbo Ajcore Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Ajcore Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109913445A

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。一种血液DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液；其特征在于，其中裂解液包含Tris、EDTA、NaCl、NaDC、十二烷基‑N‑甜菜碱、NLS、GuHCl、TritonX100、NH₄Cl、巯基乙醇；结合液包括异丙醇、PEG 8000、Brij 58；洗涤液包括GuHCl、Tris、乙醇、碳酸氢钠；洗脱缓冲液包括Tris、EDTA。申请通过配制含较高浓度的碳酸氢钠（碱性略强于醋酸钠和氯化钠）的洗涤液同时兼顾离子平衡和提供碱性的作用，并配合使用两性离子型去垢剂CHAPS，构建了仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。

Description

一步洗涤磁珠法血液DNA提取试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。

背景技术

核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本。目前已知的酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于血液DNA提取的主要有吸附柱法和磁珠法，其中吸附柱法提取效果和所提取DNA浓度上都有明显不足，磁珠法属于固相抽提法，是采用磁珠为载体的分离技术。由于磁珠法提取核算操作简单，快速，重复性好，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。相比传统的DNA提取方法，磁珠法无需离心和大量检材，也无需接触酚/氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化操作，基于磁珠法的核酸提取具备传统DNA提取无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重要方向。

磁珠法在操作简易性（如CN201611240409、CN201810169271、CN201610848178、CN201110105238等的磁珠法提取DNA中均要经过2-4次不等的洗涤，不仅消耗时间，而且洗涤后吸取上清时需要较为精细的操作，容易产生污染/不适合实验室外现场操作）和提取效果上也有很多待改进之处，有必要开发一种操作更为简单的磁珠DNA提取方法以提高提取效率/满足筛查、法医调查等用途中现场快速处理样本的需要。

发明内容

在先前血液DNA提取试剂盒配方研究的基础上，申请人发现对洗涤次数难以减少的原因主要在于洗涤液较弱的碱性对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率问题，本发明的目的是提供一种仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。

为了实现上述的目的，本发明本申请提供了一种血液DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液；裂解液包含Tris 、EDTA、NaCl、SDS、CHAPS、NLS、GuHCl、月桂酸钠、NH₄Cl和巯基乙醇；结合液包括异丙醇、PEG 8000和Brij 58；蛋白酶K溶液包括蛋白酶K；洗涤液包括GuHCl、Tris 、乙醇、碳酸氢钠；洗脱缓冲液包括Tris和EDTA。

作为进一步改进，所述的裂解液包含Tris 50-100mM、EDTA 10-20mM、NaCl 0.5-1.0M、SDS 0.1%-0.8%、CHAPS 0.1-0.3%、NLS 0.5%-1.0%、GuHCl 65%-80%、CHAPS 1%-5%、NH4Cl 0.10%-0.30%、巯基乙醇 0.5%-2.0%，pH为7.0-8.5；

结合液包括异丙醇 65%-90%、PEG 8000 2%-10%、Brij 58 3%-5%，pH为7.0-8.5；

蛋白酶K溶液包括蛋白酶K 17-22mg/ml；

洗涤液包括GuHCl 2-7M、Tris 12-20mM、乙醇40%-60%、碳酸氢钠30-60mM,pH为8.5-9.0；

洗脱缓冲液包括Tris 10-20mM、EDTA 0.1-0.3mM，pH为8.5-9.0。

作为进一步改进，所述的裂解液包含Tris 60-800mM、EDTA 12-18mM、NaCl 0.6-0.8M、SDS 0.2%-0.6%、CHAPS 0.15-0.25%、NLS 0.6%-0.8%、GuHCl 70%-75%、CHAPS 2%-4%、NH4Cl 0.15%-0.25%、巯基乙醇 0.8%-1.5%。

作为进一步改进，所述的结合液包括异丙醇 70%-85%、PEG 8000 4%-8%、Brij 583.5%-4.5%。

作为进一步改进，所述的洗涤液包括GuHCl 2-7M、Tris 15-18mM、乙醇45%-55%、碳酸氢钠35-55mM；洗脱缓冲液包括Tris 12-18mM、EDTA 0.15-0.25mM。

作为一个具体的实施方式，裂解液包括Tris 60mM、EDTA 15mM、NaCl 0.6M、SDS0.3%、CHAPS 0.2%、NLS 7%、GuHCl 72%、月桂酸钠 3%、NH₄Cl 0.2%、巯基乙醇1.0%，pH为7.1；结合液包括异丙醇 70%、PEG 8000 8%、Brij 58 3%，pH为7.0；蛋白酶K溶液：蛋白酶K 20mg/ml；洗涤液包括GuHCl 7M、Tris 15mM、乙醇50%、碳酸氢钠 40mM，pH为9.0；洗脱缓冲液包括Tris 20mM、EDTA 0.2mM，pH为8.5。

另一方面，本申请提供了使用上述血液DNA提取试剂盒提取血液DNA的方法。

进一步地，方法具体包括：

（1）取血液于离心管中，加入裂解液与结合液的混合液,再加入蛋白酶K溶液，最后加入磁珠；

（2）将离心管加热震荡，置于磁力分离架上，移走全部上清液；

（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入洗涤液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；

（4）加入洗脱缓冲液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，用将上清液移至另一离心管中；

（5）回收得到的DNA。

进一步地，方法具体包括：

（1）取200ul的新鲜血液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液1:1的混合液,再加入20ul蛋白酶K溶液，最后加入10ul磁珠；

（2）将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；

（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul 洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；

（4）加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；

（5）回收得到的DNA，保存于-20℃。

另一方面，本申请提供了上述血液DNA提取试剂盒在制备PCR检测试剂盒中的用途。

进一步地，所述PCR检测试剂盒还包括PCR反应所用的试剂。

另一方面，本申请提供了上述血液DNA提取试剂盒在基因筛查和法医鉴定中的应用。

上述技术方案中所使用的试剂如Tris、EDTA、NaCl、SDS 、CHAPS、NLS、GuHCl、CHAPS、NH₄Cl、巯基乙醇、Brij 58、碳酸氢钠、EDTA、乙醇、异丙醇、PEG 8000，磁珠可以根据需要和产品性能选用进口或国产的各种型号。

本申请的试剂盒可以手动操作，也可以使用本领域公知的技术制备成多孔板自动操作的形式以进一步提高效率。

申请人发现对洗涤次数难以减少的原因主要在于洗涤液较弱的碱性对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率问题，本申请通过配制含较高浓度的碳酸氢钠（碱性略强于醋酸钠和氯化钠）的洗涤液同时兼顾离子平衡和提供碱性的作用，并配合使用两性离子型去垢剂CHAPS，构建了仅需要一步洗涤的磁珠法血液DNA提取试剂盒。经过实际验证证明，效果不亚于进口或国产的类似的需多次洗涤的试剂盒。

可以根据PCR检测对DNA样本的要求，可以在本申请试剂盒基础上加入各种PCR反应试剂，包括但不限于引物、探针、聚合酶、MgCl₂、dNTPs、PCR缓冲液等组成各种诊断或非诊断目的的PCR检测试剂盒，也可以将本申请的试剂盒可以与各种诊断或非诊断目的的PCR检测试剂盒配套使用。

附图说明

图1，本申请试剂盒与enriching血液/拭子DNA提取试剂盒提取效果比较（左条带为本申请试剂盒，右条带为enriching血液/拭子DNA提取试剂盒）。

图2，本申请试剂盒提取效果示意图，#285-#288为同一血液，从左至右血液样本的量依次为50ul、100ul、150ul、200ul。

图3为本申请试剂盒和国产某一试剂盒提取的效果图比较。

具体实施方式

主要试剂和仪器

Tris、EDTA、NaCl、SDS、NLS、GuHCl、月桂酸钠、NH₄Cl、巯基乙醇、Brij 58、碳酸氢钠、DPTA由sigma生产；

乙醇、异丙醇、PEG 8000由国药集团生产；

CHAPS由亚科科技股份有限公司提供；

本申请检测方法中所用磁珠由Qiagen生产（取自Magattract DNA Kit，enriching试剂盒中的磁珠为试剂盒自带）；

Qubit®检测仪以及配套的试剂盒由Thermofisher 生产；

血液/拭子DNA提取试剂盒由enriching生产。

检测样本来源

由于需要样本量较少，为简便起见，验证本申请试剂盒DNA提取效果时使用的血液样本直接采集自申请人公司工作人员志愿者；

实际PCR检测时的样本来源来自合作医疗检测机构正常采集的样本。

实施例1 试剂配制和基本提取过程

按照以下配方配制提取试剂1：

裂解液：Tris 60mM、EDTA 15mM、NaCl 0.6M、SDS 0.3%、CHAPS 0.2%、NLS 7%、GuHCl72%、月桂酸钠 3%、NH₄Cl 0.2%、巯基乙醇1.0%，pH为7.1；

结合液：异丙醇 70%、PEG 8000 8%、Brij 58 3%，pH为7.0；

蛋白酶K溶液：蛋白酶K 20mg/ml；

洗涤液：GuHCl 7M、Tris 15mM、乙醇50%、碳酸氢钠 40mM，pH为9.0；

洗脱缓冲液：Tris 20mM、EDTA 0.2mM，pH为8.5。

对照试剂2按照试剂1的配方配制（以醋酸钠 10mM替换碳酸氢钠）

对照试剂3按照试剂1的配方配制（不含CHAPS，含NaDC 0.6%）

按照以下步骤进行DNA提取：

（5）回收得到的DNA，保存于-20℃。

实施例2 本申请试剂盒配方的效果验证

1 碳酸氢钠和DPTA的作用

使用实施例1中的试剂1-3和DNA提取方法提取同一份血液样本，使用Qubit®（基于荧光染料法）检测仪以及配套的试剂盒检测所提取的DNA浓度并检测OD A260/280，结果如下：

多个样本中的重复结果类似。我们推测，洗涤液中的酸碱/带电情况对粘蛋白水解物的洗涤效果影响很大，实验的多种配方中只有碱性稍强的碳酸氢钠能达到有效去除蛋白而基本不影响DNA稳定的效果；两性离子表面活性剂的加入的使用有利于充分裂解细胞溶解蛋白，并使得蛋白在洗涤时更容易去除。

本申请一步洗涤试剂盒与现有试剂盒的比较

以实施例1中的试剂1和提取方法以及enriching血液/拭子DNA提取试剂盒(磁珠法，3次洗涤，按照说明书在96孔板上自动操作)提取同一份血液样本后电泳检测验证，结果如图1所示，可见两者效果基本相当。

为进一步验证，使用Qubit®（基于荧光染料法）检测仪以及配套的试剂盒检测所提取的DNA浓度并检测OD A 260/280，并在来自多人的多份血液样本中验证。

可见本申请试剂盒和enriching试剂盒提取的DNA质量均较为理想可以满足检测基本需要，本申请试剂盒所提取的DNA浓度普遍略高于enriching试剂盒，结合操作简易程度（同为手动/自动操作时由于洗涤程序少，操作时间大约是enriching的一半稍多）本申请的试剂盒是替代现有市售血液DNA提取试剂盒的良好选择。

图3为本申请试剂盒和国产某一试剂盒提取的效果图比较。

实施例3 使用本申请试剂盒进行实际检测

使用本申请的试剂盒提取4对8位待测者血液（与血液样本同步采集）DNA用于亲子鉴定中的STR基因座分型（Promega Power Plex16，16个位点,ABI9700 PCR 仪器），与血液中提取的DNA所作的分型相比较，8位待测者全部128的位点的分型情况完全相同。初步证明了本申请的试剂盒提取的样本可用于后续的分子生物学检测。

Claims

1.一种血液DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液；其特征在于，裂解液包括Tris 60mM、EDTA 15mM、NaCl 0.6M、SDS 0.3%、CHAPS 0.2%、NLS7%、GuHCl 72%、月桂酸钠 3%、NH₄Cl 0.2%、巯基乙醇1.0%，pH为7.1；结合液包括异丙醇70%、PEG 8000 8%、Brij 58 3%，pH为7.0；蛋白酶K溶液：蛋白酶K 20mg/ml；洗涤液包括GuHCl 7M、Tris 15mM、乙醇50%、碳酸氢钠 40mM，pH为9.0；洗脱缓冲液包括Tris 20mM、EDTA0.2mM，pH为8.5。

2.使用根据权利要求1所述的血液DNA提取试剂盒提取血液DNA的方法。

3.根据权利要求2的方法，具体包括：

1）取血液于离心管中，加入裂解液与结合液的混合液,再加入蛋白酶K溶液，最后加入磁珠；

2）将离心管加热震荡，置于磁力分离架上，移走全部上清液；

3）将离心管从磁力分离架中取出，加入洗涤液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；

4）加入洗脱缓冲液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，用将上清液移至另一离心管中；

5）回收得到的DNA。

4.根据权利要求3的方法，具体包括：

1）取200ul的新鲜血液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液1:1的混合液,再加入20ul蛋白酶K溶液，最后加入10ul磁珠；

2）将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；

3）将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul 洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；

4）加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；

5）回收得到的DNA，保存于-20℃。

5.根据权利要求1所述的血液DNA提取试剂盒在制备PCR检测试剂盒中的用途。

6.根据权利要求5的用途，其中所述PCR检测试剂盒还包括PCR反应所用的试剂。

7.根据权利要求1的血液DNA提取试剂盒在法医鉴定中的应用。