CN113736772A - 一种唾液dna提取的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种提取纯化唾液DNA的方法，包括以下步骤：1)预处理：将唾液与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质，得到粗裂解液；2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，形成含有磁性纳米微球‑DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球‑DNA的复合体；3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球‑DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA。本发明提供的方法提取DNA的效率可达90％，提取的DNA可应用于STR复合扩增、DNA测序、DNA定量等下游。

Description

一种唾液DNA提取的方法
技术领域
本发明属于DNA检测领域，具体涉及一种唾液DNA提取的方法。
背景技术
核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本，但采血一方面需要专业人员使用无菌采血设备，成本和复杂程度较高，另一方面采血会给患者带来直接的疼痛和恐惧，受到很多人的排斥；由于以上原因，以血液样本进行分子生物学检测在许多情形下，特别是大范围筛查或鉴定中有诸多不便。有必要开发使用容易获取的样本，如头发、唾液等提取DNA用于分子生物学检测的方法。
唾液属于可以无损伤轻易提取的生物样品，其成分与血清、血浆中存在较大差异，难以使用相同或类似的试剂盒完成DNA提取：唾液为无色、无味、无嗅的液体；PH约6～7；唾液中含有淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶、粘蛋白、粘多糖、磷脂等物质；其中的大量粘蛋白、粘多糖使得唾液粘稠度达到水的仅20倍，这些成分也是唾液DNA提取中需要解决的主要问题、需要去除的主要物质。目前已知的酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于唾液DNA提取的主要有吸附柱法和磁珠法，其中吸附柱法提取效果和所提取DNA浓度上都有明显不足，所以有必要开发一种操作简单的磁珠DNA提取方法以提高提取效率、满足筛查、法医调查等用途中现场快速处理样本的需要。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明研发提供了一种简单、快速、高效的唾液DNA提取方法，适用于从在保护液中保存的唾液中提取DNA。
一种唾液DNA提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)：预处理：取唾液于离心管中，加入裂解液和蛋白酶K溶液混匀，将离心管放入56℃水浴锅中孵育15min；
(2)核酸吸附：向离心管中加入磁珠悬浮液与DNA结合液，涡旋震荡后室温静止5min；
(3)洗涤：将步骤(2)获得的混合物置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后，弃溶液，用洗涤液1和洗涤液2洗涤，最后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA。
进一步地，步骤(1)中裂解液包含Tris 40-60mM，EDTA 10-20mM，NaCl 0.1-0.9M，十二烷基-N-甜菜碱0.1％-0.3％，GuHCl 60％-75％，NLS 0.6％-0.9％，TritonX100 3％-5％，NH4Cl 0.15％-0.24％、巯基乙醇0.5％-2.5％。优选地，裂解液包含Tris 55mM，EDTA15mM，NaCl 0.3M，十二烷基-N-甜菜碱0.2％，GuHCl75％，NLS 0.6％，TritonX100 3％，NH4Cl 0.18％、巯基乙醇1％。
进一步地，步骤(1)中蛋白酶K溶液的浓度为1.7-2.2mg/mL，优选浓度为2mg/mL。
进一步地，步骤(2)中DNA结合液为乙醇，异丙醇或乙二醇。优选65％-90％异丙醇。
进一步地，步骤(2)中磁珠悬浮液为为包被硅基的直径为50-1000nm的磁性微球水溶液。
进一步地，步骤(3)中洗涤液1为pH8.0、含50mM的Tris-HCl，200mM的氯化钠50％的乙醇溶液；洗涤液2为70-80％的乙醇溶液。
进一步地，步骤(3)的洗脱液为pH8.0的TE缓冲液，含有10mM Tris-HCl，1mM EDTA。
在高盐存在时，DNA结合于硅基包被的磁珠表面。漂洗后，高纯度的DNA被洗脱于洗脱液或去离子水中。DNA的得率与样品中细胞数量，储存条件、时间有很大关系。纯化得到的DNA纯度好，完整度高(大于15kb)，可用于二代测序、芯片检测、PCR检测等下游实验。
本发明的唾液DNA提取方法的具体步骤包括：(1)将唾液样本上下颠倒5次混匀，静置5min；(2)取500ul唾液转移至新的1.5ml离心管中,之后向新的离心管加入20μl蛋白酶K和300μl裂解液,涡旋震荡混匀后，将离心管放入56℃水浴锅中孵育15min；(3)配置加有磁珠的DNA结合液：磁珠充分混匀后，取20μL加入300μL的DNA结合液(可提前按本比例同时配置本次实验所需混合液)；(4))向步骤(2)中得到的混合物中继续加入320μL加有磁珠的DNA结合液，涡旋振荡5s后，室温放置5min；(5)将离心管放于磁力架上静置1分钟，待磁珠吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液；(6)向离心管中加入750μL洗涤液1将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5s，再置于磁力架上静置2min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；(7)向离心管中加入750μL洗涤液2，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5s，再置于磁力架上静置2min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠；(8)重复步骤(7)一次；(9)将步骤(8)得到的结合有DNA的磁珠在室温下静置10min，晾干，加入50μL洗脱液或去离子水，涡旋振荡混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，静置5min；(10)再次将离心管置于磁力架上静置2min，转移洗脱液至新的离心管中-20℃保存备用。
本发明提供的唾液DNA提取方法与常规DNA提取方法相比较有如下优点：整个操作流程方法简单、快捷，整个提取流程可在1小时内完成；步骤需离心操作比较少，实验流程可用于工作站自动提取。
附图说明
图1为实施例中部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,示意图，其中M：DNAmarker，1-7依次为样本1-8。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
唾液DNA提取具体步骤如下：
1.取8位志愿者唾液各1mL置于有唾液保护剂的收集管中，将唾液样本上下颠倒5次混匀，静置5min。
2.取500ul唾液转移至新的1.5ml离心管中,之后向新的离心管加入20μl蛋白酶K和300μl裂解液,涡旋震荡混匀后，将离心管放入56℃水浴锅中孵育15min。
3.将离心管从水浴锅中取出，室温放置5分钟后短暂离心使溶液回流于离心管底部向离心管中加入300μl充分混匀的异丙醇(300μl)与Magbeads(20μl)混合物。
4.将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
5.将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入750μL洗涤液1将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5s，再置于磁力架上静置2min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠。
6.向离心管中加入750μL洗涤液2，将离心管从磁力架上取下涡旋振荡5s，再置于磁力架上静置2min后，吸弃洗涤液，同时避免接触磁珠。
7.重复步骤(6)一次。
8.保持离心管固定于磁力架上，用移液器去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发干净，加入50μL洗脱液或去离子水，涡旋振荡混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中，静置5min。
9.将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads充分吸附于离心管侧壁后用移液器将溶液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
实施例2
唾液DNA提取的质检结果
采用普通琼脂糖凝胶电泳鉴定实施例1中获得的DNA样品的质量检测。
进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：凝胶浓度0.8％；0.5×TAE电泳缓冲液；在电压150v条件下电泳20min。电泳结果均显示一条尖锐的高分子量条带，表明所提取的DNA样品纯度高，质量好。电泳图见图1所示。

Claims (10)

1.一种唾液DNA提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)：预处理：取唾液于离心管中，加入裂解液和蛋白酶K溶液混匀，将离心管放入56℃水浴锅中孵育15min；
(2)核酸吸附：向离心管中加入磁珠悬浮液与DNA结合液，涡旋震荡后室温静止5min；
(3)洗涤：将步骤(2)获得的混合物置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后，弃溶液，用洗涤液1和洗涤液2洗涤，最后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA。
2.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(1)中裂解液包含Tris 40-60mM，EDTA 10-20mM，NaCl 0.1-0.9M，十二烷基-N-甜菜碱0.1％-0.3％，GuHCl 60％-75％，NLS0.6％-0.9％，TritonX100 3％-5％，NH4Cl 0.15％-0.24％、巯基乙醇0.5％-2.5％。
3.如权利要求2所述的提取的方法，其特征在于，所述裂解液包含Tris 55mM，EDTA15mM，NaCl 0.3M，十二烷基-N-甜菜碱0.2％，GuHCl 75％，NLS 0.6％，TritonX100 3％，NH4Cl 0.18％、巯基乙醇1％。
4.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(1)中蛋白酶K溶液的浓度为1.7-2.2mg/mL。
5.如权利要求4所述的提取的方法，其特征在于，蛋白酶K的浓度为2mg/mL。
6.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(2)中DNA结合液为乙醇，异丙醇或乙二醇。
7.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(2)中磁珠悬浮液为包被硅基的直径为50-1000nm的磁性微球水溶液。
8.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(3)中洗涤液1为pH8.0、含50mM的Tris-HCl，200mM的氯化钠50％的乙醇溶液。
9.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(3)中洗涤液2为70-80％的乙醇溶液。
10.如权利要求1所述的提取的方法，其特征在于，步骤(3)的洗脱液为pH8.0的TE缓冲液，含有10mM Tris-HCl，1mM EDTA。
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