CN110438120A - 一种从血液中提取微生物基因组dna的试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从血液中提取微生物基因组DNA的试剂盒及其方法，涉及分子生物学技术领域，试剂盒包括L1溶液、L2溶液、L3溶液、W1溶液、W2溶液、Eluent溶液，DNA吸附柱；L1溶液中包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、0.1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶，25mM Tris‑HCl、10mM EDTA，pH8.0‑8.5；L2溶液中包括：0.2M NaOH、1％SDS，pH 12‑14；L3溶液中包括：4M NH4Ac‑HAc，pH4.5‑4.8；W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M；W2溶液中包括：10mM Tris‑HCl(pH8.0)，80％v/v EtOH；Eluent溶液中包括：10mM Tris‑HCl，1mM EDTA，pH8.0‑8.5。本发明利用该方法可以快速提取出血液中病原微生物的基因组，并且有效去除血液中细胞、蛋白质、无机盐等干扰因素。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种从血液中提取微生物基因组DNA的试剂盒及其方法。
背景技术
DNA提取纯化是分子生物学研究中的一项基础操作，提取得到的DNA可进一步用于基因检测、基因分型、PCR、酶切、分子杂交和文库构建等。以基因检测为例，基因检测是指对血液、其他体液、或细胞中的DNA序列进行分析，可获得所含有的基因类型和基因缺陷等，可用以诊断疾病、疾病风险的预测等。
由于DNA在分子生物学实验中的应用日益广泛，提取DNA所消耗的时间又会直接影响接下来的实验或检测的进程，因此，提高DNA提取的效率很有必要。
人类正常健康血液处于无菌状态，当细菌入侵人体血液循环系统，可引起血流感染。血流感染严重时会导致患者休克、多重器官衰竭、弥漫性血管内凝血，甚至死亡。而进行血流感染疾病诊断最有效的方法则是进行分子诊断。因此需要克服从血液样品中提取细菌基因组的劣势和不足，研发了一种快速、简单和高效的提取基因组DNA方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从血液中提取微生物基因组DNA的试剂盒及其方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种从血液中提取微生物基因组DNA的试剂盒，包括L1溶液、L2溶液、L3溶液、W1溶液、W2溶液、Eluent溶液，DNA吸附柱；
所述L1溶液中包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、0.1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶，25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH8.0-8.5；
所述L2溶液中包括：0.2M NaOH、1％SDS，pH 12-14；
所述L3溶液中包括：4M NH4Ac-HAc，pH4.5-4.8；
所述W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M；
所述W2溶液中包括：10mM pH8.0的Tris-HCl，80％v/v EtOH；
所述Eluent溶液中包括：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0-8.5。
一种从血液中提取微生物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
A、取新鲜血液样品100μL，并与L1溶液等体积混合混匀，37度孵育15分钟；所述L1溶液包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶、25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH 8.0-8.5；
B、酶裂解液处理的血液样品与L2溶液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；所述L2溶液包括：0.2M NaOH，1％SDS，pH 12-14；
C、裂解处理后的血液样品与L3溶液按体积比为2：1混合，加入L3溶液后立即混匀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；所述L3溶液包括：4M NH4Ac-HAc，pH 4.5-4.8；
D、轻轻吸取上清液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；
E、向DNA吸附柱内加入500μL体积的W1溶液，12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；所述W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M；
F、再向DNA吸附柱内加入700μL体积的W2溶液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；所述W2溶液中包括：10mM pH8.0的Tris-HCl，80％v/v EtOH；
G、重复步骤F1次。
H、DNA吸附柱离心3-5分钟，舍弃2ml离心管，将DNA吸附柱套在1.5ml离心管中；
I、向DNA吸附柱膜中央加入20-50μL Eluent洗脱，静置1-2min；离心1-2min，收集洗脱下来的基因组DNA；所述Eluent溶液中包括：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0-8.5。
优选地，步骤D中，以12000转/分钟离心1分钟。
优选地，步骤H中，DNA吸附柱12000转/分钟离心3-5分钟。
优选地，步骤I中，12000转/分钟离心1-2min。
本发明的有益效果是：
本发明技术方案立足血液病原菌的临床检测实际，建立了快速高效的血液中病原菌基因组的提取方法。利用该方法可以成功提取出血液中病原微生物的基因组，并且有效去除血液中细胞、蛋白质、无机盐及人类基因组DNA等干扰因素。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种从血液中提取微生物基因组DNA的试剂盒，包括L1溶液、L2溶液、L3溶液、W1溶液、W2溶液、Eluent溶液，DNA吸附柱；
L1溶液中包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、0.1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶ClyH、10mg/mL溶菌酶，25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH8.0-8.5；
L2溶液中包括：0.2M NaOH、1％SDS，pH 12-14；
L3溶液中包括：4M NH4Ac-HAc，pH4.5-4.8；
W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M；
W2溶液中包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，80％v/v EtOH；
Eluent溶液中包括：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0-8.5。
实施例2：
从患有血流感染的病人，抽取其静脉血100μL，并按照以下步骤进行基因组DNA提取，提取出的基因组DNA可以用于后续PCR检测。
本方法包括以下步骤：
(1)从病人静脉抽取100uL血液；
(2)向其中加入100μL L1溶液(酶裂解液)，37℃孵育15分钟。L1溶液包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶ClyH、10mg/mL溶菌酶、25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH 8.0-8.5。
(3)再加入200μL L2溶液(碱裂解液)，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟。L2溶液包括：0.2M NaOH，1％SDS，pH 12-14。
(4)再加入200μL L3溶液(去杂液)，立即混匀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟。L3溶液包括：4M NH4Ac-HAc，pH 4.5-4.8。
(5)轻轻吸取上清液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱。
(6)向DNA吸附柱内加入500μL体积的W1溶液(W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M)。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱。
(7)再向DNA吸附柱内加入700μL体积的W2溶液(W2溶液中包括：10mM Tris-HCl(pH8.0)，80％v/v EtOH)。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱。
(8)重复步骤(7)一次。
(9)空DNA吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将DNA吸附柱转移至1.5mL离心管内。
(10)向空DNA吸附柱膜中央加入30μL 10mM Tris-HCl和1mM EDTA的混合液(Eluent溶液，溶液中Tris-HCl的浓度为10mM，EDTA的浓度为1mM)，pH8.0-8.5。12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组DNA。
(11)洗脱出的DNA可进行微量DNA测量仪检测，并进行后续的PCR反应。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种从血液中提取微生物基因组DNA的试剂盒，其特征在于，包括L1溶液、L2溶液、L3溶液、W1溶液、W2溶液、Eluent溶液，DNA吸附柱；
所述L1溶液中包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、0.1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶，25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH8.0-8.5；
所述L2溶液中包括：0.2M NaOH、1％SDS，pH 12-14；
所述L3溶液中包括：4M NH4Ac-HAc，pH4.5-4.8；
所述W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M；
所述W2溶液中包括：10mM pH8.0的Tris-HCl，80％v/v EtOH；
所述Eluent溶液中包括：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0-8.5。
2.一种从血液中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、取新鲜血液样品100μL，并与L1溶液等体积混合混匀，37度孵育15分钟；所述L1溶液包括：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶、25mMTris-HCl、10mM EDTA，pH 8.0-8.5；
B、酶裂解液处理的血液样品与L2溶液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；所述L2溶液包括：0.2M NaOH，1％SDS，pH 12-14；
C、裂解处理后的血液样品与L3溶液按体积比为2：1混合，加入L3溶液后立即混匀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；所述L3溶液包括：4M NH4Ac-HAc，pH 4.5-4.8；
D、轻轻吸取上清液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；
E、向DNA吸附柱内加入500μL体积的W1溶液，12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；所述W1溶液为KI溶于异丙醇中，KI的浓度为0.4M；
F、再向DNA吸附柱内加入700μL体积的W2溶液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；所述W2溶液中包括：10mM pH8.0的Tris-HCl，80％v/v EtOH；
G、重复步骤F1次。
H、DNA吸附柱离心3-5分钟，舍弃2ml离心管，将DNA吸附柱套在1.5ml离心管中；
I、向DNA吸附柱膜中央加入20-50μL Eluent洗脱，静置1-2min；离心1-2min，收集洗脱下来的基因组DNA；所述Eluent溶液中包括：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0-8.5。
3.根据权利要求2所述的从血液中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤D中，以12000转/分钟离心1分钟。
4.根据权利要求2所述的从血液中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤H中，DNA吸附柱12000转/分钟离心3-5分钟。
5.根据权利要求2所述的从血液中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤I中，12000转/分钟离心1-2min。
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