CN106047868B - 一种口腔咽拭子细菌宏基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法，包括口腔咽拭子的前处理、细菌裂解、DNA的分离和杂蛋白的去除，硅胶膜纯化柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱这五个步骤提取口腔咽拭子细菌基因组DNA。本发明特殊的样本处理方式，可以大大提高得率。同时，使用超声波破碎裂解结合酶裂解，利用恰当的破壁时间和温和的条件，使革兰氏阴性菌和阳性菌及其他细菌适当破壁，又能使基因组DNA不受过强的物理因素导致断裂。本发明仅用1.5h就可以提取口腔咽拭子细菌宏基因组DNA，且细菌宏基因组得率更高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法。
背景技术
宏基因组是指生境中全部微生物基因的总和，它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和。人类生活在一个微生物的世界，作为一个完整的人体，真核细胞仅占细胞总数的10％，而90％是原核细胞，因此诺贝尔奖获得者Lederberg 提出人体是由真核细胞与体内共生的原核细胞共同组成的“超级生物体(Super organism)”。
人体口腔咽部为细菌提供了良好的栖息环境，菌群一旦失衡，会影响全身健康。学者们提出，一些慢性疾病的病因可能是细菌群落。细菌宏基因组研究的对象是特定环境中的总DNA，所以，DNA的提取是细菌宏基因组研究成功关键步骤。口腔咽拭子细菌宏基因组DNA的提取，不仅要尽可能地提取所有细菌的基因组，还要保持片段的纯度和完整度。
目前所开发的口腔咽拭子提取方法，往往只能针对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的一类，缺乏通用性，因此提取出来的宏基因组DNA丰度不好。另外，有些方法虽然能够更好地提取口腔咽拭子细菌的基因组DNA，但却存在成本高、得率低、操作繁琐的弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA 的提取方法，本发明提供的方法能够提高丰度、片段完整性、得率和纯度，且操作简单，成本较低。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所采用的操作步骤为：
（1） 用超声波细胞破碎仪对口腔咽拭子及其保存液中的细菌进行初步裂解；
（2）向拭子样品中加入裂解液和酶液进行裂解；
（3）向步骤（2）的样品中加入酚-氯仿-异戊醇混合液，震荡离心取上清液；
(4)将步骤（3）中的上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液混匀，离心取上清液。
（5）向步骤（4）的上清液中加入乙醇；
（6）将步骤（5）的上清液移入硅胶膜纯化柱，离心弃滤过液；
（7）在步骤（6）的硅胶膜纯化柱中加入去蛋白液，离心弃滤过液；
（8）在步骤（7）的硅胶膜纯化柱中加入漂洗液，离心弃滤过液；
（9）用洗脱液将步骤（8）硅胶膜上的DNA洗脱下来。
步骤（1）是指口腔咽拭子采集后应立即操作或于-80℃冰箱中冷冻保存后进行提取。口腔咽拭子充分震荡，以使口腔咽拭子上的细菌充分脱落到拭子保存液中（1xPBS）。并且，拭子保存液和口腔咽拭子均进行裂解，以便将口腔咽拭子上余下的细菌裂解，释放出DNA，从而提高细菌宏基因组DNA得率。
步骤（2）中的裂解液的用量为500 μl，包含浓度为100 mM的Tris，浓度为20 mM的EDTA，质量浓度3%的 SDS，pH=8.0；酶液包含50 mg/ml 溶菌酶和 25 mg/ml蛋白酶K，用量为50μl。
步骤（3）中的酚-氯仿-异戊醇混合液的用量为500 μl，其成分酚-氯仿-异戊醇体积比为25：24：1。
步骤（4）中的氯仿-异戊醇混合液的体积比为24：1。
步骤（5）中的乙醇质量浓度为82%，用量为步骤（4）中上清液体积的两倍。
步骤（6）的硅胶膜纯化膜购自上海捷瑞生物工程有限公司。
步骤（7）的去蛋白液包含浓度9 mM Tris，浓度 8 mM盐酸胍，pH=7.0，使用前需要加乙醇，使得最终去蛋白液中无水乙醇质量浓度为35%。
步骤（8）的漂洗液包含浓度 8 mM Tris，浓度 17 mM NaCl，pH=8.0，调整pH之后加入无水乙醇，使漂洗液中乙醇质量浓度为90%。最终去蛋白液用量为500 μl。
步骤（9）的洗脱液用量为40-80μl，包含浓度 8 mM Tris，浓度 2 mM EDTA，pH=8.0。
本发明的优点在于：本发明采用以上的方法，包括口腔咽拭子的前处理、细菌裂解、DNA的分离和杂蛋白的去除，硅胶膜纯化柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱这五个步骤提取口腔咽拭子细菌基因组DNA。本发明特殊的样本处理方式，可以大大提高得率。同时，使用超声波破碎裂解结合酶裂解，利用恰当的破壁时间和温和的条件，使革兰氏阴性菌和阳性菌及其他细菌适当破壁，又能使基因组DNA不受过强的物理因素导致断裂。与传统的口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法相比，本发明仅用1.5 h 就可以提取口腔咽拭子细菌宏基因组DNA，且细菌宏基因组得率更高。不仅节约了大量的提取时间，同时试剂耗材易获得且简化了步骤，能够高效、快速、经济地提取口腔咽拭子细菌宏基因组DNA。
附图说明
图1本专利方法提取的DNA PCR产物电泳图。
图2常规方法提取的DNA PCR产物电泳图。
具体实施方式
实施例1
一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法，需用到所述硅胶膜纯化柱及以下试剂组成：
裂解液：浓度为100 mM的Tris，终浓度为20 mM的EDTA，质量浓度3% 的SDS,PH=8.0；
酶液：50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K；
酚-氯仿-异戊醇混合液：酚-氯仿-异戊醇体积比为25：24：1；
氯仿-异戊醇混合液：氯仿-异戊醇体积比为24：1；
乙醇：质量浓度为82%；
硅胶膜纯化柱：购自上海捷瑞生物工程有限公司；
去蛋白液：浓度9 mM Tris，8 mM盐酸胍，pH=7.0，使用前需要加乙醇，使得最终去蛋白液中乙醇质量浓度为35%；
漂洗液：8 mM Tris，17 mM NaCl,pH=8.0,调整PH之后加入乙醇，使漂洗液中乙醇质量浓度为90%；
洗脱液：8 mM Tris，2 mM EDTA，pH=8.0。
所述提取方法，包括以下步骤:
1）口腔咽拭子的前处理：取新鲜采集的或者储存于-80℃的口腔咽拭子，溶解后在高频率震荡器上，充分震荡10 min，使拭子上的细菌脱落到拭子保存液(1xPBS）中。
2）细菌细胞的初裂解：取上述口腔咽拭子保存液及口腔咽拭子，置于装有冰块的烧杯中，用清洗过的超声波细胞破碎仪变幅杆，插入保存液中。在135 w条件下，超声5 s ，间隔3 s ，循环40次。
3）细菌细胞的裂解：取上述口腔咽拭子保存液400μl及口腔咽拭子于干净的2ml离心管中，加入500μl裂解液及50μl酶液，混匀后36℃干浴20 min。之后震荡10sec，56℃干浴10 min。
4）DNA的分离与杂蛋白的去除：在上述溶液中加入500 μl 酚-氯仿-异戊醇混合液，震荡器震荡15 s 后，14000 rpm 离心5 min。将上清液转移到新的无菌离心管中，并加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀离心，取上清液。
5）硅胶膜纯化柱吸附DNA及杂质的去除：往上述的上清液中，加入2倍体积的82%的乙醇，震荡混匀后，加入硅胶膜纯化柱的硅胶膜上，14000 rpm 离心1 min ，丢弃滤过液，加入500 μl 去蛋白液，14000 rpm 离心1 min ，丢弃滤过液，然后加入500 μl 漂洗液，14000rpm 离心3 min ，丢弃滤过液。将硅胶膜纯化柱的盖子打开，置于干浴器上，56 ℃ 干浴2min。
6）DNA洗脱：往吸附柱加入60μl 的洗脱液，14000 rpm 离心1 min 。
7）聚合酶链式反应扩增：PCR扩增细菌16S rDNA V3-V4 区，得到的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以此确定细菌总DNA的质量；其中的引物为：
319F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'
反应条件如下：
结果如表1和图1，从中可以看出，实例样得到的浓度较高，且纯度也较高。实例样目的条带清晰，提取出的细菌宏基因组DNA的量较多。
表1
采用常规方法提取口腔咽拭子细菌宏基因组DNA，采用相同方法检测DNA浓度，结果如下：
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门基源医疗科技有限公司
<120> 一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法
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Claims (1)
1.一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1） 用超声波细胞破碎仪对口腔咽拭子及其保存液中的细菌进行初步裂解；
（2）向拭子样品中加入裂解液和酶液进行裂解；
（3）向步骤（2）的样品中加入酚-氯仿-异戊醇混合液，震荡离心取上清液；
(4)将上述步骤（3）中的上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液混匀，离心取上清液；
（5）向步骤（4）的上清液中加入乙醇；
（6）将上述步骤（5）的上清液移入硅胶膜纯化柱，离心弃滤过液；
（7）在上述步骤（6）的硅胶膜纯化柱中加入去蛋白液，离心弃滤过液；
（8）在上述步骤（7）的硅胶膜纯化柱中加入漂洗液，离心弃滤过液；
（9）用洗脱液将上述步骤（8）硅胶膜上的DNA洗脱下来；
步骤（1）中的样品为400 μl口腔咽试子保存液及口腔咽拭子；步骤（2）中的裂解液的用量为500 μl，包含浓度为100 mM的Tris，浓度为20 mM的EDTA，质量浓度3%的SDS，pH=8.0；酶液包含50 mg/ml 溶菌酶和 25 mg/ml蛋白酶K，用量50μl；
步骤（3）中的酚-氯仿-异戊醇混合液的用量为500 μl，其成分酚-氯仿-异戊醇体积比为25：24：1；
步骤（4）中的氯仿-异戊醇混合液的体积比为24：1；
步骤（5）中的乙醇质量浓度为82%，用量为步骤（4）中上清液体积的两倍；
步骤（7）的去蛋白液包含浓度9 mM Tris，浓度8 mM、pH=7.0盐酸胍，使用前需要加乙醇，使得最终去蛋白液中无水乙醇质量浓度为35%；最终去蛋白液用量为500 μl；
步骤（8）的漂洗液包含浓度 8 mM Tris，浓度 17 mM NaCl，pH=8.0，加入无水乙醇使漂洗液中乙醇质量浓度为90%；漂洗液用量为500 μl；
步骤（9）的洗脱液用量为40-80 μl，包含浓度 8 mM Tris，浓度 2 mM EDTA，pH=8.0。
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| Detection of epstein-Barr virus in salivas and throat washings in healthy adults and children;Kazufumi Ikuta et al.;《Microbes and infection》;20000229;115-120 |
| 超声-酶-碱法提取啤酒废酵母β-1,3-葡聚糖的研究;马森 等;《酿酒科技》;20091231;摘要，第96页左栏第二段至右栏第一段 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106047868A (zh) | 2016-10-26 |
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